Summary
O objetivo do método apresentado aqui é mostrar como Microarrays microambiente (MEMA) pode ser fabricado e usado para interrogar o impacto de milhares de microambientes combinatórios simples sobre o fenótipo de células cultivadas.
Abstract
Compreender o impacto do microambiente no fenótipo das células é um problema difícil devido à complexa mistura de fatores de crescimento solúvel e proteínas associadas à matriz no microambiente in vivo. Além disso, os reagentes prontamente disponíveis para a modelagem de microambientes in vitro utilizam tipicamente misturas complexas das proteínas que são definidas incompletamente e sofrem da variabilidade do grupo à lote. A plataforma do microarray do microambiente (Mema) permite a avaliação de milhares de combinações simples de proteínas do microambiente para seu impacto em fenótipos celulares em um único ensaio. Os MEMAs são preparados em placas de poço, o que permite a adição de ligantes individuais para separar os poços contendo proteínas de matriz extracelular (ECM) dispostas. A combinação do ligante solúvel com cada ECM impresso dá forma a uma combinação original. Um ensaio típico MEMA contém mais de 2.500 microambientes combinatórios únicos que as células são expostas em um único ensaio. Como um caso de teste, a linha celular MCF7 do cancro da mama foi chapeada na plataforma de MEMA. A análise deste ensaio identificou fatores que aumentam e inibem o crescimento e a proliferação dessas células. A plataforma MEMA é altamente flexível e pode ser estendida para uso com outras questões biológicas além da pesquisa de câncer.
Introduction
A cultura de linhagens de células cancerosas em plástico em monocamadas bidimensional (2D) continua sendo um dos principais cavalos de trabalho para pesquisadores de câncer. No entanto, o microambiente está sendo cada vez mais reconhecido por sua capacidade de impactar os fenótipos celulares. No câncer, o microambiente tumoral é conhecido por influenciar múltiplos comportamentos celulares, incluindo crescimento, sobrevida, invasão e resposta à terapia1,2. As culturas tradicionais da pilha do monocamada faltam tipicamente influências do microambiente, que conduziu ao desenvolvimento de uns ensaios tridimensionais (3D) mais complexos para crescer pilhas, incluindo extratos purificados comercialmente disponíveis da membrana do porão. No entanto, essas matrizes purificadas são tipicamente complicadas de usar e sofrem de problemas técnicos, como a variabilidade do lote3 e composições complexas3. Como resultado, pode ser difícil atribuir a função a proteínas específicas que podem estar afetando os fenótipos celulares3.
Para abordar essas limitações, desenvolvemos a tecnologia microarray (Mema), que reduz o microambiente até combinações simples de matriz extracelular (ECM) e proteínas de fator de crescimento solúvel4,5 . A plataforma MEMA possibilita a identificação de fatores microambientais dominantes que impactam o comportamento das células. Usando um formato de matriz, milhares de combinações de fatores de microambiente podem ser testadas em um único experimento. O MEMA descrito aqui interroates ~ 2.500 diferentes condições únicas de microambiente. As proteínas ECM impressas em placas de poço formam almofadas de crescimento sobre as quais as células podem ser cultivadas. Os ligantes solúveis são adicionados aos poços individuais, criando os microambientes combinatória originais (ECM + ligand) em cada ponto diferente a que as pilhas são expostas. As células são cultivadas por vários dias, em seguida, fixo, manchado, e imaged para avaliar fenótipos celulares como resultado da exposição a estas combinações específicas de microambiente. Desde que os microambientes são combinações simples, é direto identificar as proteínas que conduzem mudanças fenotípicas principais nas pilhas. As memas têm sido utilizadas com sucesso para identificar fatores que influenciam vários fenótipos celulares, incluindo aqueles que impulsionam as decisões de destino da célula e a resposta à terapia4,5,6,7. Essas respostas podem ser validadas em experimentos 2D simples e, em seguida, podem ser avaliadas em condições que recapitulam mais plenamente a complexidade do microambiente tumoral. A plataforma MEMA é altamente adaptável a uma variedade de tipos de células e endpoints, desde que estejam disponíveis bons biomarcadores fenotípicos.
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Protocol
Nota: Uma visão geral de todo o processo MEMA, incluindo o tempo estimado, é descrita no diagrama de fluxo mostrado na Figura 1. Este protocolo detalha a fabricação de MEMAs em placas de 8 poços. O protocolo pode ser adaptado para outras placas ou lâminas.
1. preparação de buffers de proteína, diluente e coloração
- Equilibrar frascos de ECMs, ligantes e citocinas à temperatura ambiente (RT) e centrifugar brevemente. Adicione o volume apropriado do buffer RT apropriado, conforme indicado na folha de dados do produto. Siga a recomendação do fabricante para concentrações de ações.
Nota: Uma lista completa dos ligantes e ECMs com suas ações e concentrações finais são fornecidas na tabela 1 e na tabela 2. Os ligantes e os ECMs são usados tipicamente na concentração a mais elevada da escala recomendada pelo fabricante que provoca um efeito biológico em ensaios padrão da cultura de 2 dias. Manuseie as proteínas suavemente e em armários de biossegurança fluxo laminar para evitar a contaminação. - Incubar frascos com balanço suave em RT para 1 h. Não vórtice proteínas como isso pode causar-lhes a desnaturar.
- Proteínas alíquotas para armazenamento de longo prazo para que todas as alíquotas sejam de uso único apenas para evitar a degradação com ciclos repetidos de congelamento/descongelação. Armazene as proteínas liofilizadas a-80 ° c (salvo indicação em contrário) até que seja necessário. Tome cuidado para coletar todos os metadados para referência futura, tais como: (i) nome da proteína, (II) data preparada, (III) número lote/lote, (IV) fornecedor, (v) número do catálogo, (vi) concentração, (VII) volume, e (VIII) preparador.
- Prepare o tampão diluente contendo 20% (v/v) glicerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 e esterilizar filtro. Mantenha este tampão estéril e armazene em RT.
- Prepare o tampão de coloração contendo 2% (p/v) BSA, 1 mM MgCl2e 0, 2% Nan3 em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Filtrar e armazenar a 4 ° c.
2. preparação de uma placa de origem ECM
- Remova estoques aliquotados de proteínas ECM a serem impressos e descongelar no gelo. Registre todos os números de lote para rastreamento de metadados.
- Flick tubos de proteínas descongelados suavemente para garantir a ressuspensão adequada e girar para baixo em uma centrífuga.
-
Faça misturas de impressão ECM (EPMs) e uma fonte fluorescente para ser usada por um robô de manuseio de líquidos que criará as placas de origem 384-well aleatórias.
Nota: as placas de fonte 384-well serão usadas por uma impressora da disposição do pino do toque para criar as matrizes impressas em 8 placas do poço.- Rotule tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada EPM e o
- Prepare cada EPM combinando 125 μL de tampão diluente (ver passo 1,4) com o volume adequado de estoque de ECM e leve a mistura até um volume total de 250 μL com PBS. As concentrações finais em cada tubo EPM serão 1x proteína ECM, 5 mM EDTA, 10% glicerol, e 100 mM Tris.
- Prepare uma solução fluorescente, dissolvendo-a no tampão apropriado especificado pelo fabricante e transfira 250 μL para um tubo de transmissão rotulado.
3. criação da placa de origem usando um manipulador de líquidos
- Projete um layout de placa 384-well que randomize as posições dos ECMs e seja otimizado para a cabeça do pino da impressora matriz que está sendo usada. Projete a colocação do material de forma que ele será impresso na linha 1, coluna 1 posição de cada poço para auxiliar na orientação da matriz.
Nota: Um total de 14 − 15 repetições de cada ECM é usado para assegurar dados robustos. Inclua réplicas adicionais de colágeno ou outro ECM que produz um acessório robusto para avaliação da uniformidade de ligação. O layout pode precisar utilizar várias placas 384-well, dependendo do número de ECMs de interesse. - Transfira tubos EPM para um manipulador líquido, mantendo os tubos a 4 ° c com um rack de tubo resfriado ou usando um robô de manuseio de líquidos localizado em uma sala fria.
- Usando o software do manipulador de líquidos, execute um programa para transferir 15 μL de cada EPM e a base para os poços pré-designados dentro da placa de origem 384-well (s).
- Pipet PBS em qualquer poços não utilizados para aumentar a umidade e proteção contra a dessecação durante o processo de impressão.
Nota: Consulte a Figura 2 para obter um exemplo de um conjunto de placas de origem 384 bem otimizado para uma cabeça de pino de 4 x 7 e inclui um bloco de colágeno I e PBS. - Placa (s) de vedação e mantenha a 4 ° c até estar pronto para imprimir.
4. imprimindo MEMAs usando um robô de impressão de matriz
Nota: A parte seguinte do protocolo descreve especificamente a preparação e o uso de MEMA para investigar o impacto de diferentes proteínas do microambiente no crescimento e proliferação de células MCF7. No entanto, o protocolo pode ser facilmente adaptado para usar diferentes ligantes, ECMs e células para estudar outras linhas celulares e pontos de extremidade de interesse.
-
Usando uma impressora de pinos de toque, imprima EPMs e pontos de identificação em 8 placas de poços. Imprima várias repetições de cada condição de ECM para garantir a reprodutibilidade.
Nota: outros formatos de chapa ou lâminas podem ser usados para impressão, mas a otimização de buffer pode ser necessária para alcançar a formação ideal do ponto.- Imprima os ECMs para o MEMA usando pinos do diâmetro de 350 μm arranjados em uma configuração da cabeça de cópia 4 x 7. Imprima as matrizes nas placas de 8 poços como 20 colunas por 35 linhas, para um total de ~ 700 pontos. As matrizes maiores são possíveis nestas placas mas vêm com um trade-off de efeitos aumentados da borda na ligação e na mancha da pilha.
- Após a impressão, guarde as chapas num dessecador durante um período mínimo de 3 dias antes da utilização.
5. criação de placas de tratamento de ligantes
- Projete uma disposição da placa do 96-well que inclui ligantes do interesse. Para facilitar o tratamento de muitas placas MEMA ao mesmo tempo, projetar esta placa com espaçamento que permite o uso de um Pipet multi-canal com 4 pontas espaçadas para transferir líquidos entre os poços de 8-bem MEMAs e uma placa 96-well.
Nota: Neste protocolo, são utilizados o conjunto completo de ligandos listados na tabela 2 . - Thaw ligantes no gelo. Momentaneamente Flick e gire para baixo cada tubo.
- Diluir os ligantes para um estoque de trabalho de 200x usando o buffer recomendado pelo fabricante (tipicamente PBS).
- Pipet 10 μL de cada estoque do ligante 200x no poço correspondente dentro da placa 96-well.
- Selar e armazenar chapas a-20 ° c.
Nota: Faça placas de tratamento de ligantes em lotes, capturando todos os metadados para análise a jusante.
6. cultivando células em MEMAs
- Bloco MEMAs por 20 min com 2 mL por poço de tampão de bloqueio não incrustante contendo 1% de agente de bloqueio não incrustante (tabela de materiais) em água destilada dupla (DDH2O).
- Aspirar o tampão de obstrução e os poços triplos da enxaguadura com PBS. Para evitar a dessecação, deixe o volume final de PBS em poços até estar pronto para a plaqueamento celular.
Nota: É extremamente útil ter dois trabalhadores do banco para etapas da cultura da pilha em MEMAs. Um trabalhador do banco pode executar etapas da aspiração, quando o segundo executar etapas da adição. Recomenda-se usar um Pipet multicanal de 1 mL com pontas espaçadas para coincidir com a placa de 8 poços para pipetagem e um divisor de Y com duas pipetas Pasteur para aspirar vários poços de uma só vez. - Sementes 2 x 105 MCF7 células por poço em 2 ml de Dulbecco ' s modificado médio de Eagle ' s médio (DMEM) contendo 10% soro fetal bovino (FBS).
Nota: Antes de um experimento MEMA completo, realize uma experiência de titulação de célula para otimizar números de células, de forma que os pontos MEMA tenham números de células altas (mas não são confluentes) no final da duração experimental desejada. - Após 2 − 18 h de adesão, aspirado a meio e substituir com 2 mL de meio de crescimento reduzido (DMEM com 0,1% FBS).
Nota: Soro reduzido (por exemplo, 0,1% FBS) ou condições de fator de crescimento empobrecido podem ser usados neste momento para isolar o impacto estimulatório de ligantes específicos. - Descongelar uma placa de tratamento de ligantes no gelo. Placa de centrifugação descongelada a 200 x g durante 1 min.
- Transferir 200 μL de meio de cada poço na placa de cultura para o poço adequado na placa de tratamento. Pipet para cima e para baixo para misturar o volume do ligante com o meio e para transferir esta mistura de volta ao poço apropriado na placa de Mema.
- Levemente rocha à mão e devolva as placas MEMA à incubadora. Cultura para a duração do experimento na presença da combinação ligand/ECM a 37 ° c e 5% CO2.
Nota: Um experimento MEMA típico é executado por 72 h; os experimentos de longa duração podem requerer a reposição de meio e retratamento com ligantes. - Os poços MEMA do pulso em 71 h com 100x 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) para uma concentração final de 10 μM. Incubar em condições experimentais com EdU para 1 h em 37 ° c e 5% CO2.
Nota: Outros tratamentos de células ao vivo também podem ser usados neste momento.
7. fixação e coloração MEMAs
- Após 72 h e quaisquer tratamentos de células ao vivo, aspiram poços. Fix MEMAs em 2 mL por poço de 2% paraformaldeído (PFA) por 15 min em RT.
- Aspirar a PFA. Permeabilize com 2 mL por o poço do surfactante nonionic de 0,1% por 15 minutos.
- Aspirar o surfactante não iônico e lavar com 2 mL por poço de PBS. Aspirar PBS. Lave com 2 mL de PBS com 0, 5% de polissorbato 20 (PBS-T).
Nota: A superfície de MEMA é hidrofóbica, e a falha lavar com PBS-T antes que a incubação da mancha e do anticorpo conduzirá à formação de vazios nos poços durante etapas da incubação e dê origem aos artefatos de coloração. - Aspirar PBS-T. Adicionar reagentes de reação de detecção EdU. Incubar por 1 h em RT, balançando e protegido da luz. Após 1 h incubação, saciar a reação com o tampão de têmmata comercial fornecido.
Nota: A deteção de EdU e as etapas da mancha/anticorpo podem ser executadas em 1,5 mL por o poço para reduzir o custo. - Aspirar o tampão de têmmata e lavar com PBS-T antes de incubação com manchas ou anticorpos.
- Incubar os poços de MEMA com anticorpos contra a histona H3K9me3 (1:1000) e fibrillarina (1:400) em tampão de coloração contendo 2% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA), 1 mM MgCl2 e 0, 2% Nan3 durante a noite a 4 ° c.
Nota: Realize titulações de anticorpos para determinar as concentrações ideais antes de usá-las em um conjunto MEMA completo. - Após a incubação preliminar do anticorpo ou da mancha, lave os poços 2x com PBS e uma vez com PBS-T.
- Adicionar anticorpos secundários (asno anti-rato IgG e asno anti-coelho IgG, ambos 1:300) e 0,5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI). Incubar por 1 h na RT no escuro.
- Lave os poços 2x com 2 mL por poço de PBS, deixando-os no final 2 mL PBS.
- Proceda à imagem ou armazene MEMAs manchadas para a imagem latente mais atrasada no PBS em 4 ° c protegido da luz.
8. imagem latente de MEMAs
- Imagem MEMA em um sistema automatizado da imagem latente com os canais de deteção fluorescentes apropriados.
- Saída de dados de imagem resultante para um sistema de gerenciamento de imagem. Segmentar células e calcular níveis de intensidade usando o CellProfiler8.
9. análise de dados
Nota: A análise de dados consiste em normalização, correção de variação e compactação dos dados brutos do CellProfiler. Nesta instância, o R-Environment com código personalizado é usado para executar todas as etapas. No entanto, qualquer ambiente estatístico ou programa de software pode ser utilizado para executar as ações equivalentes. Um exemplo do código personalizado de fonte aberta para o ambiente de R para análise está disponível em: https://www.Synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
- Pré-processar e normalizar os dados de imagem segmentada.
- Determine a contagem de células Spot usando os núcleos corados DAPI.
- Intensidade de EdU de porta automática para rotular células como EdU+. Medir a proliferação usando a proporção de células EdU+ em cada local.
- A mediana resume as manchas citoplasmáticas e as medições da morfologia nuclear no nível Spot.
- Realize a remoção da normalização indesejada de variação (RUV) nos dados para melhorar a qualidade dos dados9.
Nota: Essa abordagem é aplicada a cada sinal de intensidade e morfologia independentemente como uma matriz com matrizes usando as linhas e pontos como as colunas como descrito anteriormente9. - Aplique a normalização de loess bivariada aos resíduos normalizados RUV usando a linha de matriz e a coluna de matriz como as variáveis independentes para corrigir efeitos espaciais ou de intensidade relacionados.
- Uma vez que a normalização é terminada, a mediana resume as repetições para cada condição do microambiente para relatar e uma análise mais aprofundada.
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Representative Results
Para simplificar os impactos microambientais no crescimento e proliferação celular e identificar condições que promoveram ou inibiram o crescimento e proliferação celular, a linha celular de câncer de mama MCF7 foi semeada em um conjunto de oito MEMAs de 8 poços, conforme descrito no protocolo. Este ensaio expôs as células a 48 diferentes ECMs e 57 ligantes diferentes, para um total de 2736 condições microambientais combinatórias. Após 71 h na cultura, as pilhas foram pulsada com EdU, fixo, permeablized, e manchado com DAPI, a reação para a deteção de EdU, um anticorpo do anti-fibrillin, e um anticorpo H3K9me3. As pilhas foram imaged em um microscópio elevado do índice. As imagens foram carregadas para um servidor Omero10, segmentada usando cellprofiler8, e normalizada e analisada em R9. Os resultados descritos abaixo se concentram nos sinais DAPI e EdU.
A plataforma de análise de imagem de memas produz alguns resultados semelhantes aos disponíveis a partir de abordagens de citometria de fluxo, tais como parcelas de conteúdo de DNA mostrando frações 2n e 4n para células tratadas com um determinado ligante (Figura 3a), com base no DAPI intensidade e área. Essas parcelas fornecem evidências para condições que promovem a ciclagem ativa da célula versus como indicado por picos bimodais claros correspondentes às células nas fases G1 ou G2 versus células presas ao crescimento, o que mostraria mudanças nos picos em relação às condições de controle. Utilizamos o número de células e os dados de intensidade de coloração para resumir os dados, onde o impacto do microambiente (ligantes em um eixo, ECM no segundo eixo) no número de células (Figura 3B) e incorporação de EdU (Figura 3C) pode ser mais facilmente visto como mudanças na cor e intensidade do heatmap. Como visto nestas parcelas, muitos dos efeitos são ligand-driven, porque a condição do ECM não impacta fortemente o número de pilha ou o positivity de EdU. Nidogen-1 é uma exceção desobstruída, porque a presença desta molécula do ECM inibe a ligação e o crescimento da pilha de MCF7. Os ligantes tais como FGF6 e NRG1α (NRG 1.1 em parcelas) melhoram o número da pilha e têm taxas elevadas da incorporação de EdU, quando os ligantes tais como o AREG e o NRG1-SMDF (NRG 1.10 em parcelas) inibem a ligação da pilha e/ou o crescimento das pilhas. Esses achados são apoiados pelas imagens das células que crescem nos pontos, onde uma clara diferença no número de células e na positividade do EdU é evidente (ver exemplo na Figura 3D).
Desde que a plataforma de MEMA é uma tecnologia mais nova, os resultados foram validados em ensaios separados. MCF7 células foram semeadas em placas de 24 poços revestidas com colágeno I em meio DMEM com 10% FBS. Após 18 h, os meios foram trocados para o meio de crescimento reduzido (DMEM com 0,1% FBS) e as pilhas foram tratadas com NRG1α, FGF6, ou AREG e cultivadas para 72 h. EdU foi adicionado 1 h antes da fixação. As células foram coradas com DAPI e para incorporação de EdU, imaged, segmentada e analisada. De forma semelhante aos resultados obtidos na plataforma MEMA, FGF6 e NRG1α deram origem a maiores números de células (Figura 4a) e taxas de incorporação de EdU (Figura 4B) comparadas às células tratadas com AREG, Validando nossas observações em os experimentos originais da MEMA.
Figura 1 : Fluxograma mostrando o fluxo de trabalho e a linha do tempo para as diferentes fases de um experimento MEMA típico. Uma vez que os MEMAs são impressos, eles podem ser armazenados em temperatura ambiente dessecado por vários meses antes do uso. Tipicamente, a fase experimental dura 3 − 4 dias, mas algumas células primárias de crescimento lento foram cultivadas em MEMAs por até 2 semanas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Layout da placa de origem ECM para impressão de matriz. O bloco de colágeno é impresso na MEMA como uma grade, que fornece um conjunto altamente repetitivo de condições que permitem uma normalização mais robusta entre os poços. Os poços cheios de PBS fornecem a umidade para ajudar na prevenção da evaporação durante o processo de impressão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Exemplos de dados gerados a partir de um experimento MEMA típico. (A) perfis de ciclo celular de valores de intensidade de DAPI Binned versus contagens de células de uma placa de 8 poços tratada com diferentes ligantes, mostrando a intensidade de DAPI bifásica indicando células na fase de ciclo celular G1 versus G2. (B) heatmap mostrando contagens de células Spot normalizadas agrupadas por similaridade usando clusters hierárquicos. Vermelho indica maior número de células, e azul é menor número de células. Os ligands estão no eixo x, os ECMs estão no eixo y. (C) heatmap mostrando incorporação normalizada de edu, com indicação de vermelho maior e azul indicando menor incorporação de edu. Os ligands estão no eixo x, os ECMs estão no eixo y. (D) exemplo de células MCF7 crescendo em um local Mema tratado com NRG1-α mostrando altas taxas de incorporação de EdU (núcleos rosa). Mancha verde é a máscara celular e azul é DAPI. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Validação de MEMA resulta em cultura celular. (A) quantificação do número de células resultante do tratamento de MCF7 com diferentes ligantes. Os números equivalentes de MCF7 pilhas foram chapeados em placas multifolha tratadas então com o AREG, o FGF6, ou o NRG1α. Os poços tratados com o AREG tiveram significativamente menos pilhas do que aquelas tratadas com FGF6 (* * que indica valores de p do t-teste do estudante menos do que 0, 1) ou NRG1α (* indica um valor de p de 0, 5) no tratamento do borne do ligante de 72 h. (B) quantificação do nível de incorporação de edu em MCF7 devido ao tratamento com diferentes ligantes, como no painel A. O tratamento de AREG resulta em uma proporção significativamente menor de células que incorporam EdU do que as células tratadas com FGF6 (* *, p < 0, 1) ou NRG1α (* **, p = 0, 1). As barras de erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nome da proteína | ID de uniprot | Estoque Concentração (μg/mL) |
Final Concentração (μg/mL) |
ANGPT1 | 1 | Q15389 | 1 | 100 | 0, 4 |
ANGPT2 | 1 | O15123 | 1 | 100 | 0,2 |
Areg | P15514 | 100 | 0, 2 |
BMP2 | P12643 | 100 | 0,1 |
BMP3 | P12645 | 1000 | 0,1 |
BMP4 | P12644 | 100 | 0,1 |
BMP5 | 1 | P22003 | 1 | 100 | 0,1 |
BMP6 | P22004 | 100 | 0,1 |
BMP7 | P18075 | 100 | 0,1 |
CSF2 | P04141 | 100 | 0, 2 |
CTGF | 1 | P29279 | 1 | 100 | 0, 5 |
CXCL12 | Alfa | P48061 | 2 | 100 | 0, 1 |
CXCL12 | Beta | P48061 | 1 | 100 | 0, 3 |
CXCL1 | P09341 | 100 | 0, 4 |
CXCL8 | 1 | P10145 | 1 | 100 | 0,3 |
DLL1 | 1 | O00548 | 1 | 500 | 0,5 |
DLL4 | Q9NR61 | 200 | 0,6 |
EGF | 1 | P01133 | 1 | 500 | 0, 1 |
FASLG | 1 | P48023 | 1 | 10 | 0, 2 |
FGF2 | 3 | P09038 | 2 | 100 | 0, 1 |
FGF6 | P10767 | 100 | 0, 1 |
FLT3LG | 1 | P49771 | 1 | 50 | 0, 1 |
GPNMB | 1 | Q14956 | 1 | 100 | 0,5 |
HGF | 1 | P14210 | 1 | 50 | 0, 4 |
IGF1 | 1 | P05019 | 1 | 200 | 0, 1 |
IGFBP2 | P18065 | 100 | 0, 5 |
IGFBP3 | 1 | P17936 | 1 | 100 | 0,1 |
IL13 | P35225 | 100 | 0, 1 |
IL15 | IL15S48AA | P40933 | 1 | 50 | 0, 1 |
IL1B | P01584 | 25 | 0, 1 |
IL6 | P05231 | 100 | 0, 1 |
IL7 | 1 | P13232 | 1 | 100 | 0, 1 |
JAG1 | 1 | P78504 | 1 | 200 | 0,5 |
JAG2 | Longas | Q9Y219 | 1 | 100 | 0,5 |
KITLG | 1 | P21583 | 1 | 100 | 0, 5 |
KNG1 | HMW | P01042 | 1 | 100 | 0,2 |
Lep | P41159 | 1000 | 0, 2 |
LYVE1 | Q9Y5Y7 | 100 | 0, 5 |
NRG1 | 10 | Q02297 | 10 | 100 | 0, 1 |
NRG1 | 1 | Q02297 | 1 | 100 | 0, 5 |
NRG1 | 6 | Q02297 | 6 | 100 | 0, 1 |
O PDGFAB | go1990265 | 100 | 0, 5 |
PDGFB | 1 | P01127 | 1 | 100 | 0, 5 |
Ptn | P21246 | 100 | 0,5 |
SHH | Q15465 | 100 | 0,5 |
TGFB1 | | Cterminus | P01137 | Cterminus | 20 | 0, 1 |
TGFB1 | | Colo | P01137 | Colo | 100 | 0,15 |
TGFB2 | Um | P61812 | 1 | 20 | 0, 1 |
THPO | 1 | P40225 | 1 | 50 | 0, 2 |
TNFRSF11B | O00300 | 100 | 0, 2 |
TNFSF11 | 1 | O14788 | 1 | 100 | 0, 1 |
Tnf | P01375 | 100 | 0, 1 |
VEGFA | VEGF206 | P15692 | 1 | 100 | 0, 1 |
WNT10A | Q9GZT5 | 100 | 0,1 |
WNT3A | 1 | P56704 | 1 | 200 | 0,1 |
Wnt5a | 1 | P22725 | 1 | 100 | 0,1 |
Tabela 1: a lista completa de ligantes utilizados para os experimentos Mema. A identificação do uniprot, as concentrações de estoque, e as concentrações de trabalho finais são fornecidas.
Proteína ECM | O UniprotID | Concentração de estoque (μg/mL) |
Final Concentração (μg/mL) |
Notas |
ALCAM | 1 | Q13740 | 1 | 100 | 30 | |
CDH20 | Q9HBT6 | 300 | 80 | |
CDH6 | 1 | P55285 | 1 | 100 | 40 | |
CDH8 | P55286 | 100 | 20 | |
CD44 | 1 | P16070 | 1 | 100 | 30 | |
CEACAM6 | P40199 | 100 | 30 | |
COL1A1 | P02453 | 5000 | 200 | várias subunidades com vários IDs uniprot |
COL2A1 | 2 | P02458 | 2 | 1000 | 200 | |
COL3A1 | 1 | P02461 | 1 | 1000 | 200 | |
COL4A1 | 1 | P02462 | 1 | 1000 | 200 | várias subunidades com vários IDs uniprot |
COL5A1 | P20908 | 1000 | 200 | |
COL23A1 | 1 | Q86Y22 | 1 | 200 | 80 | |
DSG2 | Q14126 | 100 | 30 | |
CDH1 | 1 | P12830 | 1 | 100 | 40 | |
ECM1 | 1 | Q16610 | 1 | 100 | 40 | |
FN1 | 1 | P02751 | 1 | 1000 | 200 | |
GAP43 | 1 | P17677 | 1 | 158 | 40 | |
HyA-500K | 1000 | 200 | LOR-0005 | |
HyA-50K | 1000 | 200 | LOR-0007 | |
ICAM1 | P05362 | 400 | 80 | |
ALCAM | 1 | Q13740 | 1 | 100 | 30 | |
CDH20 | Q9HBT6 | 300 | 80 | |
CDH8 | P55286 | 100 | 20 | |
CD44 | 1 | P16070 | 1 | 100 | 30 | |
CEACAM6 | P40199 | 100 | 30 | |
DSG2 | Q14126 | 100 | 30 | |
CDH15 | P55291 | 100 | 20 | |
VCAM1 | 1 | P19320 | 1 | 1000 | 200 | |
LAMA1 | P25391 | 500 | 200 | várias subunidades com vários IDs uniprot |
LAMA3 | 2 | Q16787 | 2 | 130 | 40 | |
Lum | P51884 | 200 | 80 | |
CDH15 | P55291 | 100 | 20 | |
NID1 | 1 | P14543 | 1 | 100 | 9,3 μg/mL NID, 130 μg/mL Lam, 46,5 μg/mL COL4 | + COL4 e laminina |
Omd | Q99983 | 100 | 40 | |
SPP1 | Um | P10451 | 1 | 100 | 40 | |
CDH3 | 1 | P22223 | 1 | 100 | 40 | |
PECAM1 | Longas | P16284 | 1 | 150 | 40 | |
TNC | 1 | P24821 | 1 | 500 | 200 | |
VCAM1 | 1 | P19320 | 1 | 1000 | 200 | |
Vtn | P04004 | 100 | 40 | |
Bgn | P21810 | 100 | 40 | |
DCN | Um | P07585 | 1 | 300 | 80 | |
POSTN | 1 | Q15063 | 1 | 100 | 40 | |
Sparc | P09486 | 100 | 40 | |
THBS1 | 1 | P07996 | 1 | 100 | 40 | |
BCAN | 1 | Q96GW7 | 1 | 100 | 40 | |
ELN | 3 | P15502 | 3 | 1000 | 200 | |
FBN1 | P35555 | 254 | 80 |
Tabela 2: a lista completa de proteínas e condições de ECM que são utilizadas nos experimentos Mema. A identificação do uniprot, as concentrações de estoque, e as concentrações de trabalho finais são fornecidas. Em alguns casos, a condição impressa representa um complexo proteico ou uma combinação de múltiplas proteínas, que é indicada na coluna notas.
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Discussion
A importância da "dimensionalidade" e do contexto tem sido um fator motivador no desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro como ferramentas na caracterização de células cancerosas através de sua interação com o microambiente11, e a capacidade de in vitro sistemas de cultura para imitar o ambiente in vivo é uma força motriz por trás da busca para melhorar esses sistemas de cultura. No entanto, os sistemas in vitro continuam a ser instrumentos significativos de investigação do cancro precisamente devido à sua capacidade de destilar a situação complexa in vivo até um modelo simplificado12.
Embora os sistemas 2D possam incluir ECMs e ligands, têm faltou tradicional as capacidades da taxa de transferência para interrogar um painel largo de pertubagens combinatória. Os extratos comerciais populares da membrana do porão permitem cultivando em 3D, mas faltam a proveniência de um painel com cuidado definido das proteínas. Os extratos comerciais geralmente sofrem de composição incompleta definida, o que pode confundir a análise e resultar em significativa variação de lote para lote3,13. A plataforma MEMA supera essas barreiras, permitindo o estudo de alterações nos fenótipos celulares, atividade metabólica, status de diferenciação e variações no crescimento e proliferação celular, à medida que são moduladas por endógenos específicos e definidos Fatores.
A plataforma MEMA é uma abordagem poderosa e de médio a alto rendimento para avaliar o impacto do microambiente (ECM e fatores solúveis) no fenótipo das células. A plataforma mostra grande flexibilidade para os tipos de ensaios e células para as quais ele pode ser utilizado. Nós podemos observar os efeitos dos ligantes solúveis e das proteínas do ECM a que as pilhas são expostas. De fato, descobrimos recentemente que os ligantes eram um importante fator de resistência aos inibidores do HER2, mas que esses efeitos poderiam ser modulados pelo ECM5. Uma variedade de células, incluindo células primárias e linhas celulares derivadas de diferentes tipos de células, incluindo pulmão, bexiga, próstata, mama e pâncreas, bem como células de tronco pluripotentes induzidas (iPS), foram cultivadas com sucesso na plataforma MEMA (ver exemplos nas referências5,7,14). O uso de diferentes manchas permite a leitura de múltiplos terminais celulares, incluindo o crescimento celular, diferenciação e metabolismo. Outros pesquisadores ampliaram a plataforma para interrogar o impacto da rigidez ou do módulo elástico, acrescentando uma dimensão adicional à plataforma MEMA15. Finalmente, a plataforma é favorável à realização de telas de drogas para identificação de condições de microambiente que melhoram ou inibem a eficácia dos fármacos, como nós e outros relataram recentemente5,14,15 .
Talvez o passo mais crítico para o sucesso de um experimento MEMA é otimizar a densidade do chapeamento de células. Otimizar a densidade das células garante que células suficientes estão presentes para fornecer dados robustos, mas não tantos que o local torna-se excessivamente confluente. Os pontos confluentes podem confundir significativamente os resultados, especialmente se a proliferação é usada como um EndPoint, o que torna impossível determinar se baixas taxas de proliferação são resultado de interações com fatores microambientais ou devido à inibição de contato de alta densidade celular. Os experimentos de titulação celular podem revelar esses problemas, pois os números médios de células por local demonstrarão um aumento linear com números crescentes de células chapeadas, mas eventualmente serão platinadas. O número de célula ideal deve ser escolhido no intervalo linear da curva.
Como mencionado acima, a plataforma MEMA é flexível e pode ser preparada em uma variedade de substratos com diferentes superfícies. Estes incluem corrediças de vidro e formatos da placa do multifolha. Em nossa experiência, nem todas as químicas de superfície são passíveis à impressão de Mema, porque nós observamos o destacamento do ponto em algumas superfícies devido às propriedades pobres da adesão e à incapacidade obstruir a adesão da pilha em outras superfícies elevadas da adesão. Além disso, a mudança entre diferentes substratos requer otimização de condições de buffer, pois o desempenho da impressão com o mesmo buffer de impressão pode variar dependendo da química de superfície.
O diâmetro dos pontos de ECM impressos desempenha um papel importante na qualidade dos dados. Em geral, recomendamos usar os pinos de impressão de maior diâmetro disponíveis para o arrayer em uso (atualmente usamos pinos de diâmetro de 350 μm). Os pontos de maior diâmetro permitem que um número maior de células ocupe um ponto, o que tende a resultar em dados mais robustos do que são gerados com pinos de diâmetro menor. Uma vez que a ligação das células é um processo estocástico, não tende a ser um alto grau de variabilidade nos dados que está relacionado com o número de células originalmente anexado a cada ponto. Assim, recomendamos a impressão de um grande número de repetições para cada condição de ECM. Nós imprimimos 10 − 15 ECM Replica em cada poço com nossas condições de impressão atuais para assegurar estatísticas robustas.
Nós observamos em nossos experimentos passados que, na maior parte, os efeitos de ligantes tendem a dominar sobre os efeitos de ECM. Isso pode ser em parte devido à nossa decisão de adicionar colágeno I a todos os pontos ECM, o que garante uma ligação robusta de células. No entanto, acreditamos que isso também pode homogeneizar os efeitos de ECM, como a maioria dos pontos tendem a se comportar de uma forma altamente semelhante ao colágeno I. alterando a composição do ponto para excluir o colágeno eu posso resultar em comportamento celular diferencial como resultado da interação com o O ECM, mas igualmente impacta significativamente a ligação da pilha, tendo por resultado muitos mais pontos desocupados. Os usuários devem adaptar sua composição ECM mantendo essas diferenças em mente, especialmente aqueles interessados em células tronco e progenitoras e diferenciação, onde a matriz pode ter um impacto significativo16.
Normalmente, realizamos os ensaios MEMA por períodos de tempo relativamente curtos (por exemplo, 72 h no máximo). Isso é porque as células são restritas para os pontos (o buffer de bloqueio não permite o crescimento fora dos pontos em nossa experiência). Com a rápida divisão de células, o crescimento maior do que 72 h levará ao crescimento excessivo do local, o que, por sua vez, complica a segmentação da imagem à medida que as células se aglomeram e se acumulam, e também podem impactar os dados à medida que a parada de crescimento pode ocorrer com inibição de contato. Nós executamos uns tratamentos mais longos com as pilhas preliminares de crescimento muito lentas (10 − 14 dias), mas o cuidado deve ser tomado nestes ensaios para mudar os meios e para reabastecer ligantes cada 3 − 4 dias.
Os esforços contínuos para desenvolver a plataforma MEMA estão focados em duas áreas de interesse, maximização da qualidade óptica para imagem e otimização dentro de embarcações de menor cultura. A qualidade óptica torna-se um fator crucial quando os pesquisadores necessitam de microscopia de alta resolução para identificar a localização subcelular de seus marcadores de interesse. As telas iniciais podem ser executadas em uma resolução mais baixa em microscópios de alta taxa de transferência, seguidos por imagens de pontos específicos de interesse em instrumentos de maior resolução, mas a qualidade da imagem pode ser comprometida se as propriedades ópticas do substrato forem ruins. A melhoria das propriedades ópticas do substrato permitiria que os pesquisadores realizem as telas iniciais em sistemas de imagens de alta resolução sem a necessidade de readquirir imagens selecionadas em maior resolução. Finalmente, a capacidade de realizar MEMAs em vasos de cultura menores, como placas de 96 poços, permitiria uma redução no volume de tratamento e uma expansão de ligantes e repetições interrogadas. Essa transição requer a otimização de interações substrato-tampão-proteína e impressão de matriz dentro de novas embarcações de cultura. Tais esforços contínuos melhorarão a plataforma de Mema e expandirão em cima de suas capacidades poderosas para identificar as proteínas microambientais relevantes que alteram fenótipos celulares para uma variedade de tipos da pilha, que podem então subseqüentemente ser investigados em ensaios confirmatórios.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela biblioteca de fundos comuns da NIH de assinaturas de rede celular (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H., e J. E. K).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Triton X100 | Sigma | T9284 | |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
BSA | Fisher | BP-1600 | |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
Vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
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