Summary
Dit artikel bevat een methode voor het isoleren van pure embryonale weefsels van kwartel en kip embryo's die kunnen worden samengevoegd tot ex vivo chimeer organen.
Abstract
De capaciteit om te isoleren van embryonale weefsels was een essentiële stap voor de vaststelling van de kwartel-kip chimera-systeem, dat op zijn beurt heeft verstrekt onbetwiste bijdragen aan de onthulling belangrijke processen in Ontwikkelingsbiologie.
Hierin is een geoptimaliseerde manier om zich te isoleren van embryonale weefsels van kwartels en kippen door microchirurgie en enzymatische spijsvertering met behoud van de biologische eigenschappen beschreven. Na isolatie, weefsels van beide soorten zijn met elkaar verbonden in een organotypic in vitro assay voor 48 h. kwartel en kip weefsels kunnen worden gediscrimineerd door verschillende nucleaire functies en moleculaire merkers waardoor de studie voor de cellulaire cross-talk tussen heterospecific vereniging van weefsels. Deze aanpak is dus een nuttig instrument voor de studie van interacties van de complexe weefsel in ontwikkelings processen met hoogdynamische ruimtelijke wijzigingen, zoals die welke voorkomen tijdens faryngaal genuitdrukking en de vorming van de voordarm Endoderm afkomstige organen. Deze experimentele aanpak was aanvankelijk ontwikkeld om te bestuderen van de epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de vroege stadia van de formatie van de thymus. In de prospectieve serie grondbeginselen endoderm afkomstige en mesoderm afkomstige mesenchym, werden geïsoleerd van kwartel en kip embryo's, respectievelijk.
De capaciteit van de omliggende weefsels tot organen kan verder te worden getest door ze te enten op het chorion membraan (CAM) van een embryo van de kip. De CAM biedt voedingsstoffen en gas uitwisseling aan het transplanteren weefsels. Na 10 dagen in ovo ontwikkeling, kunnen de chimeer organen in de geoogste explantaten door conventionele morfologische methodes worden geanalyseerd. Deze procedure staat ook weefsel-specifieke bijdragen tijdens orgel vorming, uit haar eerste ontwikkelen (in vitro) studeren de laatste fasen van de organogenese (in ovo ontwikkeling).
Tot slot, de verbeterde isolatie-methode biedt ook ruimtelijk (3D) bewaard embryonale weefsels, die kunnen ook worden gebruikt voor hoge resolutie topografische analyse van genexpressie-weefsel-specifieke patronen.
Introduction
In de vroege jaren 1970, werd een elegante kwartel-kip chimera-systeem ontwikkeld door Le Douarin, opening van nieuwe wegen om te begrijpen van de rol van cel migratie en cellulaire interacties tijdens ontwikkeling1,2. Het model is ontwikkeld op de vooronderstelling dat cel uitwisseling tussen de twee soorten embryogenese, later bevestigd wanneer gebruikt bij het bestuderen van tal van ontwikkelings processen, met inbegrip van de vorming van het zenuwstelsel en de hematopoietische niet aanzienlijk zou storen systemen1. De laatste als voorbeeld nemen, de cyclische golven van hematopoietische progenitorcellen koloniseren de serie epitheliale grondbeginselen werd het eerst waargenomen met behulp van de kwartel-kip chimera systeem3. Daarvoor was het toekomstige grondgebied van de zwezerik, de endoderm van de derde en vierde faryngaal zakjes (3/4PP), mechanisch en enzymatisch geïsoleerd van kwartel (q) embryo's in 15 tot 30 - Somiet stadium [embryonale dag (E) 1.5-E2.5]. Deze fasen overeen met kip, Hamburger en Hamilton4 (HH) - fasen 12-17. De isolatie procedures gestart met het gebruik van tripsine enzymatisch verwerpen de endoderm uit de bijgevoegde mesenchym. De geïsoleerde endoderm was geënt op de somatopleura-regio van een embryo van de kip (c) host op E3-E3.5 (HH-etappes 20-21). Deze heterologe mesenchym werd beschouwd als "tolerant" serie epitheel ontwikkeling ook bijdragen aan de vorming van orgel3. Daarna opeenvolgende golven van kip host bloed overgedragen voorlopercellen geïnfiltreerd de kwartel donor serie epitheliale tegenhanger bij te dragen tot thymus vorming in de host embryo3.
Meer recentelijk, een gewijzigde versie van deze aanpak werd ook bewezen als belangrijk voor de studie van epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de vroege stadia van zwezerik vorming5. In dit opzicht waren de weefsels die betrokken zijn bij de vorming van de ectopische thymus in chimeer embryo's3 geïsoleerd, zowel van de donor- en ontvangende embryo's, en bijbehorende ex vivo. Een verbeterde protocol is gebruikt voor het isoleren van de kwartel 3/4PP endoderm (E2.5-E3) en de kip somatopleura mesoderm (E2.5-E3). Kort, embryonale weefsels werden geïsoleerd door microchirurgie en onder voorbehoud van de in vitro Pancreatine spijsvertering. Ook werden de voorwaarden van enzymatische spijsvertering, temperatuur en tijd van incubatie geoptimaliseerd volgens weefseltype en ontwikkelingsstadium (tabel 1).
Vervolgens werden de geïsoleerde weefsels geassocieerd in een organotypic in vitro systeem voor 48 h, als eerder gemeld5,6. De in vitro vereniging van weefsels bootst de lokale cellulaire interacties in het embryo, het overwinnen van enkele beperkingen van de in vivo manipulatie. Dit systeem is met name nuttig zijn te onderzoeken van cellulaire interacties in complexe morfogenisch gebeurtenissen, zoals de ontwikkeling van het faryngaal apparaat.
De bijdrage van elk weefsel in de thymus histogenesis, alsmede het vermogen van de vereniging van de heterospecific voor het genereren van een thymus kan worden verder onderzocht met behulp van de CAM methodologie, eerder gedetailleerde5,7,8. Bondig, waren de gekweekte weefsels geënt op de nok van cE8 embryo's en kunnen ontwikkelen in ovo voor 10 dagen. Thymus vorming werd vervolgens door morfologische analyse in de geoogste explantaten beoordeeld. Zoals in de klassieke studies van kwartel-kip3, werd de kwartel serie epitheel gekoloniseerd door hematopoïetische voorlopercellen (HPCs), afgeleid van het embryo van de kip, die later werd aangetoond bij te dragen tot orgel ontwikkeling9,10 . De HPCs migreerden vanuit het embryo aan de ectopische chimeer zwezerik tot en met de zeer gevacuoliseerd CAM5,7,-8. Kwartel afgeleide serie epitheel kan worden geïdentificeerd door immunohistochemistry met soortspecifieke antilichamen (dat wil zeggen, QCPN - MAb kwartel PeriNuclear), het overwinnen van de noodzaak van weefsel-specifieke moleculaire merkers.
Deze experimentele methode kunt als de aanpak in twee stappen gemeld in vorige publicatie8, u de modulering van de seingeving trajecten door regelmatige toediening van farmacologische agenten tijdens in vitro en in ovo ontwikkeling. Ook, explantaten geoogst kunnen worden op elk tijdstip van de cursus van het experiment8.
Tot slot, het protocol van de isolatie hier gedetailleerde staat het behoud van de natuurlijke eigenschappen en 3D-architectuur van embryonale weefsels, met name nuttig voor de detaillering ter plaatse van de genexpressie-patronen van embryonale gebieden anders ontoegankelijk door conventionele methoden. Transcriptome analyse benaderingen, met inbegrip van RNA-seq of microarrays, kunnen daarnaast ook worden toegepast in geïsoleerde weefsels zonder genetische tellers terwijl het verstrekken van een weefsel-specifieke hoge-doorvoer "omics" analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al deze experimenten volgen de verzorging van de dieren en de ethische richtsnoeren inzake de Centro Académico de Medicina Lisboa.
1. bevrucht kwartel en kip ei incubatie
- Plaats bevruchte eieren van Japanse kwartel (Coturnix coturnix japonica) in een bevochtigde incubator van 38 ° C gedurende 3 dagen. Incubeer de eieren (ei botte uiteinde) naar boven in de luchtkamer.
Opmerking: Het bevochtigde milieu wordt bereikt door het plaatsen van een watercontainer onderin de incubator. - Bevruchte eieren van kippen (Gallus gallus) 2.5 dagenlang in een bevochtigde incubator van 38 ° C incuberen. Incubeer de eieren in een horizontale positie en markeer de bovenzijde met behulp van een stukje houtskool te identificeren van de locatie van het embryo.
Opmerking: Beginnen met 40 kwarteleitjes en 60 kippeneieren, bij de vaststelling van dit experiment.
2. isolatie van kwartel endoderm met het potentiële domein van de serie grondbeginselen
Opmerking: Gebruik een horizontale laminar flow hood en gesteriliseerde instrumenten en materialen voor ei manipulatie procedures onder steriele omstandigheden.
- Verwijder de embryonale regio met het vermoedelijke grondgebied van serie grondbeginselen, de faryngaal boog regio met de 3rd en 4th bogen (3/4PAR), als beschreven7,8.
- Vul een kom groot borosilicaat glas (100 x 50 mm; 100 cm3) met 60 mL koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Met de hulp van gebogen schaar, tik op en een gat circulaire in de shell van een kwartel ei dat gedurende 3 dagen heeft zijn geïncubeerd. Maak het gat aan de andere kant van het ei botte en de dooier (met het embryo) overbrengen in de kom met koud PBS.
- Verwijder het embryo uit de dooier door het snijden van het vitelline membraan extern voor extra embryonale vaartuigen met gebogen schaar.
- Met de hulp van dunne pincet, het embryo transfer een kleine kom (60 x 30 mm; 15 cm3) gevuld met 10 mL koude PBS.
- Met een schuimspaan, het embryo te bewegen tot een 100 mm petrischaal met een zwarte basis (Zie Tabel van materialen) waarin 10 mL koude PBS en plaats deze onder een stereomicroscoop.
- Ontleden de 3/4PAR, als eerder beschreven8.
- Aspirate de 3/4PAR en overdracht aan een glazen schotel driekwart gevuld met koude PBS met behulp van een precisiepipet van 2 mL steriele Pasteur.
- Isoleren van de het vermoedelijke grondgebied van serie grondbeginselen (de 3/4PP endoderm) bevattende enzymatische spijsvertering met Pancreatine endoderm.
- Met de hulp van de spatel en dunne Tang, de 3/4PAR overdracht aan een glazen schotel driekwart gevuld met koude Pancreatine (8 mg/mL; 1:3 verdunning van 25 mg/mL met koude PBS).
- Incubeer gedurende 1 h op ijs voor enzymatische spijsvertering.
Opmerking: De tijd van de enzymatische spijsvertering hangt af van de fase van ontwikkeling (tabel 1). - Zet de glazen schotel onder de stereomicroscoop (40 x-60 x vergroting) te isoleren van de endoderm uit de 3/4PAR.
Opmerking: Houd alle oppervlakken en oplossingen koud tijdens deze procedure. Wijzigen in een nieuwe koude Pancreatine oplossing als een lange tijd neemt om te ontleden de weefsels (> 15 min). Gebruiken als een bron van verlichting, LED-verlichting in de stereomicroscoop of opgenomen in de optische vezels, gelet op de beperkte warmtebelasting. - Om te isoleren van de endoderm uit de omliggende weefsels, twee RVS microscalpels in pin houders te gebruiken.
Opmerking: Gebruik microscalpels met een diameter tussen 0,1 mm en 0,2 mm en nikkel pin houders met een kaak opening diameter van 0 mm tot 1 mm.- Verwijder eerst de neurale buis en mesoderm aangesloten op het dorsale oppervlak van de faryngaal endoderm.
- Met de dorsale zijde omhoog, los en verwijder voorzichtig het mesenchym tussen de faryngaal bogen en bloot de faryngaal zakjes. Voer deze procedure uit op beide zijden van de 3/4PAR.
- Verwijder de buis van het hart en het mesenchym rondom de anterior zakjes.
- Met de ventrale zijde omhoog, knip het ectoderm van de 2nd en 3rd faryngaal bogen en verwijder voorzichtig het mesenchym gekoppeld aan het zakken. Herhaal deze procedure aan de andere kant van de 3/4PAR. In dit stadium moet de grondbeginselen van de schildklier zichtbaar zijn.
- Verwijder eventuele resterende mesenchymale cellen gekoppeld aan de faryngaal endoderm met de twee microscalpels.
- Maken van een transversale afgesneden tussen de 2nd en 3rd PP, distantieert de faryngaal endoderm met de 3rd en 4th zakjes van het voorste deel van de met de grondbeginselen van de schildklier en 2nd endoderm faryngaal etui.
- Met de hulp van de spatel en dunne Tang, de geïsoleerde 3/4PP endoderm overdracht aan een glazen schotel driekwart gevuld met 100% koude foetale runderserum (FBS).
- Houd het glas schotel met de geïsoleerde weefsels op ijs tijdens de voorbereiding van in-vitro-assay. Als alternatief, de geïsoleerde weefsels ruimtelijk kunnen worden bewaard en ter plaatse geanalyseerd voor gen-expressie.
3. isolatie van kip somatopleura mesoderm
Opmerking: Uitvoeren ei manipulatie procedures onder steriele omstandigheden met behulp van een horizontale laminar flow hood en gesteriliseerde instrumenten en materialen.
- Verwijder het embryonale grondgebied met het mesoderm somatopleura op het niveau van somieten 19-24 (ss19-24).
- Verwijder de kip-ei uit de incubator na 2,5 dagen incubatie.
- Open met een gebogen schaar, een klein gaatje in de shell. Invoegen van een naald en 2 mL albumine gecombineerd met een 10 mL spuit te verlagen van albumine volume binnen het ei en voorkoming van beschadiging van het embryo (gevestigd onder de gemarkeerde regio van de shell). Gooi de aanzuiging albumine.
- Een circulaire gesneden (maximaal tweederde van de bovenste oppervlakte) gat in de gemarkeerde regio van de shell met gebogen schaar.
- Snijd het vitelline membraan extern aan de extraembryonic schepen terwijl het embryo met een dunne Tang.
- Onder een stereomicroscoop, plaats het embryo in een 100 mm petrischaal met een zwarte basis met 10 mL koude PBS.
Opmerking: Gebruik een stereomicroscoop vanaf dit punt naar voren voor geleidelijke vergroting van microchirurgie procedures. - Gebruik vier dunne insect pins te houden van het embryo naar de onderkant van de plaat. Plaats de pinnen in de extraembryonic regio die een vierkante vormen.
- Het uitvoeren van twee sneden tussen de somieten 19 en 24 dwars op de as van het embryo en over het grondgebied van alle embryo's, met behulp van wecker oog schaar.
- Ontgrendel de embryo-sectie, ss19-24, door snijden marginale embryonale randen.
- Aspirate de ss19-24-weefsels en transfer naar een glazen schotel driekwart gevuld met koude PBS met behulp van een precisiepipet van 2 mL steriele Pasteur.
- De laterale mesoderm uit somatopleura regio (ss19-24) isoleren door enzymatische spijsvertering met Pancreatine (8 mg/mL; 1:3 verdunning van 25 mg/mL met koude PBS).
- Met de hulp van dunne Tang, spatel en overdracht schotel de ss19-24-weefsels met een glas driekwart gevuld met koude Pancreatine oplossing.
- Incubeer gedurende 30 min op ijs voor enzymatische spijsvertering.
- Onder de stereomicroscoop, isoleren het mesoderm uit de omliggende weefsels met behulp van twee microscalpels in een houder.
Opmerking: Houd alle oppervlakken en oplossingen koud tijdens deze procedure. Wijzigen in een nieuwe koude Pancreatine oplossing als een lange tijd neemt om te ontleden de weefsels (> 10 min.). Gebruiken als een bron van verlichting, LED-verlichting in de stereomicroscoop of opgenomen in de optische vezels, gelet op de beperkte warmtebelasting. - Tijdens mesoderm isolatie, verwijdert u eerst het ectoderm aan de oppervlakte gevolgd door zorgvuldige detachement van de weefsels ventrally gelegen splancnopleura.
- Los het recht laterale mesoderm van de somatopleura in een parallel beweging te snijden aan de neurale buis.
- Herhaal het mesoderm scheiding van de linkerkant van het embryo.
Opmerking: Zorg dat langzame microscalpel bewegingen tijdens deze procedure. De blootgestelde extra-cellulaire matrix eiwitten vasthouden aan weefsels en instrumenten vloeiende bewegingen te voorkomen. - Met behulp van een spatel en dunne pincet overdracht de geïsoleerde mesoderm naar een glazen schotel driekwart gevuld met koude FBS.
- Houd het glas schotel met de geïsoleerde weefsels op ijs tijdens de voorbereiding van in-vitro-assay.
4. In vitro organotypic assay: heterospecific vereniging van kwartel 3/4PP endoderm en mesoderm van kip somatopleura
- Bereid het kweekmedium met RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS en 1% Pen/Strep3,5.
- Het plaatsen van een metalen rooster in een 35 mm petrischaal met 5 mL gestolde voedingsbodem.
Opmerking: Verwijder de overmaat vloeistof niveau de middellange oppervlak met de bovenkant van het raster. - Met de hulp van dunne Tang, dompel een membraanfilter in het kweekmedium en plaats het op de bovenkant van het raster dat één oppervlak in contact met lucht.
Opmerking: Een kwart van het gebied van de membraan (met de diameter van 13 mm) is geschikt voor de vereniging van weefsel. - Onder de stereomicroscoop, associëren de geïsoleerde weefsels op de bovenkant van het membraanfilter. Eerst de 3/4PP endoderm (stap 2) van de glazen schotel overbrengen door zachte glijden met behulp van een transplantatie lepel of spatel, en dun pincet. Herhaal deze procedure voor de geïsoleerde mesoderm (stap 3).
Opmerking: Met de hulp van een microscalpel, meng de weefsels te maximaliseren van de vereniging. - Zorgvuldig plaatst de omliggende weefsels in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2 voor 48 h. gekweekte weefsels kunnen worden geënt op het chorion membraan (CAM).
Opmerking: Ectopische orgel vorming in de CAM was eerder gedetailleerde8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol gegevens een methode om te isoleren van aviaire embryonale weefsels in verschillende cellulaire en ontwikkelingsbiologie biologie technische benaderingen moeten worden gebruikt. Deze methode was eerder werkzaam te bestuderen van epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de vroege stadia van zwezerik vorming5. Hierin worden nieuwe resultaten getoond in Figuur 1 en Figuur 2, met behulp van soortgelijke benaderingen.
Figuur 1 . Representatieve resultaten van genexpressie studie van ruimtelijk bewaard faryngaal endoderm met het vermoedelijke grondgebied van de grondbeginselen van de thymus. Schematische weergave van de faryngaal apparatuur en geïsoleerde endoderm 2PP, 3PP en 4PP (bij cE3.5 of qE3) (A). Geheel-mount kruising in situ met BMP7 (B) en Sonic Hedgehog (C) van geïsoleerde endoderm op cE3.5. Sterke kruising signalen van BMP7 en Sonic Hedgehog opvingen door witte pijlpunten in endoderm 2PP en 3PP (B) en centrale keelholte (C), respectievelijk. A, anterior; cE, kip embryonale dag; L, links; P, posterieure; PP, faryngaal zakje; qE, kwartel embryonale dag; R, rechts. Schaal van bars, 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 1 is een schematische tekening van de endoderm geïsoleerd van de farynx bij qE3 (en cE3.5) (figuur 1A) en de in situ uitdrukking van twee endoderm-gerelateerde genen, sonic hedgehog11,12 en BMP713 in het geïsoleerde weefsel. Het geheel-mount kruising in situ procedures werden uitgevoerd zoals eerder beschreven5,7. De expressie van BMP7 gevonden in de endoderm 2PP en 3PP en uitgesloten van de Centraal keelholte en 4PP (sonde werd vriendelijk geleverd door Elisabeth Dupin) (figuur 1B). Omgekeerd, sonic hedgehog gevonden in de endoderm van de centrale farynx en uitgesloten van de zakjes7 (figuur 1 C).
Figuur 2 . Representatieve resultaten van ex vivo vorming van chimeer organen. Schematische weergave van de experimentele aanpak gebruikt voor het ontwikkelen van kwartel-kip chimeer thymi (A). Kortom, de geïsoleerde kwartel 3/4PP endoderm (qE3) was gekoppeld in vitro kip somatopleura mesoderm (cE2.5) voor 48 uur. De weefsels 48u gekweekt werden vervolgens geënt op de CAM (cE8) en kunnen ontwikkelen in ovo voor verdere 10 dagen. Seriële secties van CAM verkregen explantaten (B-G) werden geanalyseerd door conventionele histologie (B en C) en immunohistochemistry (D tot en met G). In de B en C (hogere vergroting van B), was de dia gekleurd met H & E. In D en E (hogere vergroting van D), de glijbaan was immunodetected met QCPN antilichaam en counterstained met Gill Haematoxyline. In F en G (hogere vergroting van F), de glijbaan was immunodetected met anti-Pan CK antilichaam en counterstained met Gill Haematoxyline. Zwarte pijl hoofden wijs sterke bruin immunokleuring van QCPN (E) en Pan CK (G). Zie Tabel van materialen voor overname beelddetails. CA, kraakbeen; EP, epitheel; PP, faryngaal zakje; SoM, gladde spieren. Schaal bars: 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 toont de proefopzet gebruikt om ex vivo kwartel-kip chimeer organen. De heterospecific vereniging van weefsels werden gekweekt in vitro voor 48 uur gevolgd door in ovo ontwikkeling gedurende 10 dagen (figuur 2A). Thymi in CAM verkregen explantaten gevormd werden geïdentificeerd door conventionele histologie. De zwezerik gepresenteerd normale morfologische kenmerken met goed ontwikkelde medulla en cortex compartimenten (figuur 2B, C). Seriële secties van de explantaten werden verder behandeld voor immunocytochemie (figuur 2D- G), als beschreven5,7. De MAb kwartel QCPN - perinuclear (figuur 2D, E) en anti-pan cytokeratin (CK) (figuur 2F, G) antistoffen werden gebruikt als markers voor kwartel (soortspecifieke) en epitheliale cellen, respectievelijk. De chimeer zwezerik toonde QCPN+ serie epitheliale cellen (figuur 2D, E), een reticulaire architectuur (figuur 2F, G) en kolonisatie door lymfoïde cellen (QCPN-) van donor oorsprong (kip).
| Geïsoleerde weefsel | Stadium van ontwikkeling | Concentratie | Temperatuur | Incubatietijd |
| Keelholte endoderm | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | Op het ijs | 45 – 60 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| q E3 | 8 mg/mL | Op het ijs | 60 - 90 min. | |
| c E3.5 | ||||
| q E4 | 8 mg/mL | Op het ijs | 90 min. | |
| c E4.5 | ||||
| Somatopleura mesoderm | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | Op het ijs | 30-50 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| c, kip; E, embryonale dag; q, kwartel. | ||||
Tabel 1: Gebruiksvoorwaarden enzymatische spijsvertering tijdens de embryonale weefsels isolatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De embryonale weefsels isolatie procedure hier is verbeterd van vorige technieken voor de productie van kwartel-kip chimeer embryo's in verschillende biologische contexten3,5,6.
Deze aanpak is geschikt voor het isoleren van pure embryonale weefsels zonder genetische manipulatie of het gebruik van weefsel-specifieke markers, die vaak onbepaald zijn, beperking van het gebruik van genetisch gemodificeerde diermodellen. Het kan worden gebruikt om te studeren van epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de ontwikkeling, met de mogelijkheid om het isoleren van pure weefsels wordt de beperkende factor. Bijvoorbeeld, de voortgang van de ontwikkeling, weefsels worden dikker, compacter en hechten aan andere naburige weefsels zodat hun scheiding moeilijker is. Deze isolatie-procedure is daarom ongeschikt voor de latere stadia van ontwikkeling, namelijk eind-organogenese.
Deze methode is uniek om te studeren expressie van genen in embryonale weefsels 3D-bewaard. De 3D-om integriteit te waarborgen van de geïsoleerde weefsels, moeten instrumenten, materialen en oplossingen worden gehouden bij lage temperaturen gedurende het hele proces.
De procedure van de microdissection weefsel is ook een kritieke stap die afhankelijk is, niet alleen van de zorgvuldige invoering van de experimentele omstandigheden (zoals de temperatuur en duur van de enzymatische spijsvertering, als weergeven in tabel 1), maar ook op de tijdrovende praktijktraining. Deze procedure vereist geduld en oefening. Als de exploitant de referenties van de regio verliest te worden ontleed, zorgt verminderen de stereoscoop vergroting (20 x) voor een algemene opmerking die de volgende beslissing van de beweging helpen zullen.
De 48 h in vitro stap werd opgericht ter bevordering van de cellulaire interacties tussen verschillende embryonale weefsels, terwijl het in ovo weefsel geteeld in de CAM ondersteunt de ontwikkeling op lange termijn en chimeer orgel vorming van de heterospecific vereniging van weefsels 5. de verenigingen in vitro weefsels kunnen overwinnen enkele beperkingen van in vivo manipulaties. Bijvoorbeeld, lokale toediening van geneesmiddelen of groeifactoren (met behulp van kralen) in regio's van het embryo die anders ontoegankelijk in vivo, worden gemakkelijk uitgevoerd met behulp van deze in vitro aanpak. Dit heeft eerder getoond na te bootsen lokale weefsel interacties tijdens de formatie van het orgel in de faryngaal regio5.
Oogsten explantaten groeien in CAM5,7,8 neemt minder tijd in beslag en is een eenvoudige methode voor het bijhouden van explants in vergelijking met de methoden voor het verzamelen van weefsels geënt op de muur van het lichaam van chimeer embryo's3. Bovendien, CAM kan worden getransplanteerd met cellen en weefsels van andere niet-vogelsoorten, en het is met succes gebruikt in verschillende experimentele contexten, vanaf de ontwikkeling tot kanker14,15. Bijvoorbeeld, de CAM assay werd eerder toegepast in muizen-in-kip xenografts studies16 en wordt vaak gebruikt voor het testen van de invasieve capaciteit van menselijke tumoren cellen15.
Onlangs, heeft een elegante studie met de mens-in-kip xenograft het embryo van de kip als een model om te testen en onderzoeken van vroege menselijke ontwikkeling17gevalideerd. In de toekomst zal het interessant zijn om te verkennen van de methodologie die hierin beschreven met behulp van interspecies vereniging van weefsels, die de muis en de mens ontwikkelingsstoornissen studies aanvullende benaderingen kan leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn Isabel Alcobia dankbaar voor de kritische lezing van het manuscript, Mário Henriques voor video vertelling en Vitor Proa vanaf de betekening van de histologie van de Instituto de Histologia e Biologia doen Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, voor technische ondersteuning. Wij zijn met name dank verschuldigd Paulo Caeiro en Hugo Silva uit de Unidade de audiovisuais (Unit audiovisuele media), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa voor hun uitstekende inzet voor de productie van deze video. Wij erkennen Leica Microsystems voor het vriendelijk het verstrekken van een stereoscoop uitgerust met een video systeem en Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A om bij te dragen met kwartel eieren bevrucht. Dit werk werd gesteund door Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
