Summary
Mutagenesi sito-diretta è una tecnica usata per introdurre specifiche mutazioni in acido deossiribonucleico (DNA). Questo protocollo viene descritto come eseguire la mutagenesi sito-diretta con un passaggio 2 e 3-passo catena della polimerasi (PCR) base di approccio, che è applicabile a qualsiasi frammento di DNA di interesse.
Abstract
Mutagenesi sito-diretta è una tecnica usata per introdurre specifiche mutazioni nel DNA per studiare l'interazione tra piccole molecole di acido ribonucleico (sRNA) di non-codificazione e destinazione RNA messaggeri (mRNA). Inoltre, mutagenesi sito-diretta viene utilizzata per mappare i siti di legame della proteina specifica a RNA. Una 2-step e step 3 Introduzione PCR basata delle mutazioni è descritto. L'approccio è rilevante per tutte le proteine-RNA e studi di interazione di RNA-RNA. In breve, la tecnica si basa sulla progettazione degli iniettori con la mutazione desiderata e attraverso 2 o 3 passaggi di PCR sintetizzando un prodotto PCR con la mutazione. Il prodotto PCR viene quindi utilizzato per la clonazione. Qui, descriviamo come eseguire mutagenesi sito-diretta con entrambi l'approccio 2 - e 3-step per introdurre mutazioni il sRNA, McaS e il mRNA, csgD, per studiare le interazioni RNA-proteine e RNA-RNA. Applichiamo questa tecnica per studiare le interazioni RNA; Tuttavia, la tecnica è applicabile a tutti gli studi di mutagenesi (ad es., interazioni della DNA-proteina, amminoacido sostituzione/eliminazione/aggiunta). È possibile introdurre qualsiasi tipo di mutazione tranne per basi non naturali, ma la tecnica è applicabile solo se un prodotto PCR può essere usato per applicazione a valle (ad es., clonazione e modello per ulteriore PCR).
Introduction
DNA è spesso definito come il progetto di una cellula vivente, poiché tutte le strutture della cellula sono codificate nella sequenza del suo DNA. Replica esatta e meccanismi di riparazione del DNA garantiscono che solo molto bassi tassi di mutazioni si verificano, che è essenziale per sostenere le funzioni corrette dei geni codificati. Modifiche della sequenza del DNA possono influire sulle successive funzioni a diversi livelli a partire con il DNA (riconoscimento di fattori di trascrizione e gli enzimi di limitazione), poi RNA (base-accoppiamenti complementarità e alterazioni di struttura secondaria) e/o proteine (aminoacidi acide sostituzioni, omissioni, aggiunte o telaio-turni). Mentre molte mutazioni non influiscano significativamente funzione del gene, alcune mutazioni nel DNA possono avere implicazioni enormi. Così, la mutagenesi sito-diretta è uno strumento prezioso per studiare l'importanza dei siti specifici di DNA a tutti i livelli.
Questo protocollo descrive un approccio di mutagenesi mirata utilizzato per introdurre mutazioni specifiche. Il protocollo si basa su due diverse strategie di PCR: un passaggio 2 o un 3-passo PCR. La PCR 2-step è applicabile se la mutazione desiderata è vicino l'estremità 5' o estremità 3' del DNA di interesse (< 200 paia di basi (bp) dalla fine) e la PCR-step 3 è applicabile in tutti i casi.
L'approccio di PCR 2-step, 3 iniettori sono stati progettati, in cui un set di primer è progettato per amplificare il DNA di interesse (primer 1 e 3, avanti e indietro, rispettivamente) e un singolo primer è progettato per incorporare la mutazione. La mutazione introducendo primer (primer 2) dovrebbe avere un orientamento inverso se la mutazione è vicino l'estremità 5' e un orientamento anteriore se la mutazione è vicino all'estremità 3'. Nel primo passaggio PCR, primer 1 + 2 o 2 + 3 amplifica un piccolo frammento vicino l'estremità 5' o 3' estremità, rispettivamente. Il prodotto PCR risultante viene quindi utilizzato come primer nel passaggio due con primer 1 o 3, con il risultato di un prodotto PCR con una mutazione nel DNA di interesse (Figura 1A).
Nella PCR 3 fasi, 4 iniettori sono stati progettati, in cui un set di primer è progettato per amplificare il DNA di interesse (primer 1 e 4, avanti e indietro, rispettivamente) e un set di primer è progettato per incorporare specifiche mutazioni con sovrapposizione di complementarità (primer, 2 e 3, invertire e inoltrare, rispettivamente). Al passo uno e due, primer 1 + 2 e 3 + 4 amplificare l'estremità 5' e 3'. Nel passaggio 3, i prodotti PCR ottenuti da passo uno e due sono utilizzati come modelli e amplificati con i primer 1 + 4. Così, il prodotto PCR risultante è il DNA di interesse con la mutazione desiderata (Figura 1B).
Mentre il DNA mutato può essere utilizzato per qualsiasi applicazione a valle, questo protocollo viene descritto come combinare nuovamente il DNA in un vettore di clonazione. L'uso di vettori di clonazione ha diversi vantaggi come la facilità di clonazione e applicazioni sperimentali specifiche a seconda delle caratteristiche del vettore. Questa caratteristica viene spesso utilizzata per studi di interazione di RNA. Un'altra tecnica per studi di interazione di RNA è strutturale di sondaggio del RNA in complesso con un altro RNA1,2 o proteina3,4. Tuttavia, sondando strutturale viene eseguita solo in vitro mentre mutagenesi sito-diretta e successiva clonazione permettono per studi di interazione in vivo.
Mutagenesi sito-diretta è stato ampiamente utilizzata per studi di interazione di RNA come presentato qui. Tuttavia, il metodo chiave per quanto riguarda 2 - o 3-step PCR è applicabile a qualsiasi pezzo di DNA e così non solo limitato agli studi di RNA-interazione.
Per esemplificare la tecnica e i suoi possibili usi, caratterizzazione delle regioni importanti per la regolazione post-trascrizionale del mRNA, csgD, di Escherichia coli (Escherichia coli) è usato. In e. coli, csgD è mirato di piccolo RNA non codificanti, McaS, in collaborazione con una proteina, Hfq, di reprimere l'espressione della proteina di CsgD2,4,5. La tecnica è utilizzata per introdurre le mutazioni nella regione di appaiamento tra csgD e McaS e per il sito di legame Hfq di CDLS. Il DNA ottenuto è quindi clonato in un vettore adatto per esperimenti successivi. Applicazioni a valle della tecnica includono gli esperimenti sia in vitro che in vivo. Per l'illustrazione, esempio 1 è caratterizzata in vivo usando un'analisi di western blot ed esempio 2 è caratterizzato in vitro utilizzando un'analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA). In entrambi i casi, è illustrata come mutagenesi sito-può essere utilizzata in combinazione con altre tecniche per rendere biologici conclusioni circa un gene di interesse.
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Protocol
1. selezione vettoriale
- Scegliere un vettore per eseguire esperimenti a valle con. Ogni vettore è applicabile per questo metodo PCR 2 - e 3-step.
- Sulla scelta del vettore di base, scegliere enzimi di restrizione appropriati per la clonazione.
2. primer design per sito diretto mutagenesi
- Decidere tra la strategia PCR 2-passaggio o 3 (2-step è solo per le mutazioni < 200 bp da entrambe le estremità del DNA di interesse). Per la PCR 2-step, andare al passaggio 2.2 e la PCR-step 3 Vai al punto 2.3.
- Disegnare primers per PCR 2-step.
- Disegno primer 1 e 3 per amplificare il DNA di interesse e con un 5' sporgenza che contiene 4 nucleotidi (ad es., ATAT o AGCT) seguite dal sito di riconoscimento restrizioni pertinenti necessario per clonare nel vettore scelto.
- Disegno primer 2 per introdurre mutazioni presso le sedi del desiderato e fiancheggiano la mutazione con 10-15 nucleotidi complementari su entrambi i lati. Rendere il primer inverso se la mutazione è stato introdotto all'estremità 5' o in avanti se la mutazione è stato introdotto all'estremità 3'.
- Disegnare primers per PCR-step 3.
- Disegno primer 1 e 4 per amplificare il DNA di interesse e con un 5' sporgenza che contiene 4 nucleotidi (ad es., ATAT o AGCT) seguite dal sito di riconoscimento restrizioni pertinenti necessario per clonare nel vettore scelto.
- Disegno primer 2 e 3 di introdurre mutazioni presso sedi desiderata e fiancheggiano la mutazione da 10-15 nucleotidi complementari su entrambi i lati. Primer, 2 e 3 sono invertire complementari.
3. l'amplificazione di PCR di tipo selvaggio del DNA per la clonazione
Nota: Per informazioni dettagliate sulla PCR, vedere6.
- Eseguire PCR6 utilizzando primers 1 + 2 (2-step PCR) o 1 + 4 (3-step PCR) e utilizzare DNA wild type come modello per ottenere I. prodotto di PCR uso il programma PCR nella tabella 1.
- Convalidare PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio.
- Fare un'agarosi gel soluzione (2%) aggiungendo 2 g di agarosio per 100 mL di Tris-acetato-Acido etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) (TAE) tampone 1x. Sciogliere l'agarosio facendo bollire in un forno a microonde. Aggiungere il bromuro di etidio colorante macchiatura del DNA (a una concentrazione finale di ~ 0,5 µ g/mL) a agarose gel soluzione per la visualizzazione.
- Eseguire il cast del gel dell'agarosi, inserirlo in un'unità di elettroforesi e caricare campioni PCR (mescolati con tintura di caricamento del DNA) e una scala di DNA di dimensioni note. Eseguire campioni a 75 W per 45 minuti, o fino a quando le bande sono separate in modo adeguato e visualizzate le fasce a un tavolo di ultravioletti (UV) o con un gel sistema di imaging.
- Purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).
- Conservare il DNA purificato a-20 ° C (in tampone Tris-EDTA (TE) – stoccaggio a lungo termine) o a 4 ° C (in dH2O – deposito a breve termine) fino al momento utilizzato nel passaggio 5.
4. PCR per introdurre sito-diretta di mutazioni nel DNA
- PCR per 2-step PCR (Vedi punto 4.2 per PCR-step 3)
- Eseguire PCR6 utilizzando primers 1 + 2 se le mutazioni sono all'estremità 5' o 2 + 3 se le mutazioni sono in 3' fine e utilizzare DNA wild type come modello per ottenere il prodotto di PCR II (Vedi tabella 1 per programma PCR).
- Convalidare PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.
- Purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).
- Archivio purificato del DNA a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O) fino a quando usato nel passaggio 5.
- Eseguire PCR6 utilizzando il prodotto di PCR II come l'iniettore con primer 3 se le mutazioni sono nell'estremità 5' o primer 1 se le mutazioni sono in estremità 3' e utilizzano come modello per ottenere il prodotto di PCR III il DNA wild-type (Vedi tabella 1 per programma PCR).
- Convalidare PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.
- Purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).
- Archivio purificato del DNA a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O) fino al passo 5.
- PCR per PCR-step 3
- Eseguire PCR6 utilizzando primers 1 + 2 e 3 + 4 in reazioni separate e utilizzare DNA wild type come modello per ottenere il prodotto di PCR II e III (vedere tabella 1 per programma PCR).
- Convalidare PCRs mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.
- Purificare i prodotti di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).
- Archivio purificato del DNA a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O).
- Eseguire PCR6 utilizzando primers 1 + 4 e utilizzare 2-5 ng di entrambi i prodotti PCR II e III come i modelli (nella stessa reazione) per ottenere IV del prodotto PCR (Vedi tabella 1 per programma PCR).
- Convalidare PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.
Nota: Non è insolito ottenere diverse bande non corretti (a volte può essere ridotto utilizzando meno modello). Tuttavia, i prodotti di PCR non corretti possono essere ignorati se la band correttamente dimensionata è asportata e gel-estratta. - Se è corretta, purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione del gel (Tabella materiali) e misurare la concentrazione di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali).
- Archivio purificato del DNA a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O) fino al passo 5.
5. ricombinazione di wild type e mutanti versioni del DNA nel vettore selezionato
Nota: Per informazioni dettagliate sulla procedura, vedere7.
- Digest purificato i prodotti di PCR I e III (da 2-step PCR) e/o IV (da 3-step PCR) usando gli enzimi di restrizione pertinenti.
- In 20 µ l di tampone di digestione 1x con 1 µ l di ciascun enzima di restrizione, digest 200 ng del prodotto PCR a 37 ° C per 30-60 min.
- Purificare il prodotto di PCR digerito di estrazione del gel-utilizzando un kit di estrazione del gel (Tabella materiali), misurare la concentrazione di DNA di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali) e conservare a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2 O) fino a quando non utilizzato per passo 5.6.
- Digerire purificata vettoriale con enzimi di restrizione pertinenti e trattare con fosfatasi alcalina per diminuire vettoriale ri-legatura eventi. Non trattare i prodotti di PCR con fosfatasi alcalina.
- In 30 µ l di tampone di digestione con 1 µ l di ciascun enzima di restrizione e 1 µ l della fosfatasi alcalina, digest 1.000 ng del vettore a 37 ° C per 30-60 min 1x.
- Vettore digerito separato dal DNA dei rifiuti (ad es., uncut vettoriale e cut-out DNA) mediante elettroforesi su gel di agarosio come descritto al punto 3.2.1 e 3.2.2.
- Purificare il vettore digerito con estrazione del gel-utilizzando un kit di estrazione del gel (Tabella materiali), misurare la concentrazione di DNA di DNA purificato con uno spettrofotometro (Tabella materiali) e conservare a-20 ° C (nel buffer di TE) o a 4 ° C (in dH2O) fino a quando non utilizzato per passo 5.6.
- Lega i prodotti di PCR digeriti nel vettore digerito con le reazioni specificate nella tabella 2.
- Incubare a temperatura ambiente per 2 h o una notte a 16 ° C.
- Trasformare ceppo destinatario (ad es., Escherichia coli K12) con reazioni di legatura.
- Crescere il ceppo a OD600= 0.3-0.5 e trasferimento un 1 mL della coltura come molti nelle provette da 1,5 mL come reazioni ligasi.
- Spin a 3.500 x g per 5 min e gettare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 200 μL di tampone di trasformazione (10 mL di brodo di Lisogenesi (LB) con 0,1 g/mL in polietilene glicole 3350, 5% dimetil solfato e 20 mM MgCl2).
- Aggiungere la reazione di legatura e posizionare le provette in ghiaccio per 30 min.
- Shock termico per 2 min a 42 ° C.
- Aggiungere 1 mL di LB le provette da 1,5 mL e permettere l'espressione fenotipica della resistenza agli antibiotico per almeno 45 min a 37 ° C.
- Girare le cellule a 3.500 x g per 5 min, scartare 1 mL di surnatante e risospendere le cellule nel surnatante rimanente.
- Le cellule sulle piastre del piatto con gli antibiotici adatti e incubare per una notte a 37 ° C.
- Identificare trasformanti che harboring vettori con successo integrazione dell'inserto di DNA (ad esempio, mediante PCR utilizzando primers specifici del vettore e inserto).
- Convalidare la sequenza del DNA di sanger sequenziamento.
Attenzione: Non utilizzare il primer stesso per la sequenza come usato per passo 5.9.
6. utilizzando vettori costruiti per gli esperimenti in vitro o in vivo
- Esperimento in vivo
Nota: Questo è un esempio di utilizzo di un vettore per esprimere il tipo selvaggio/mutato RNA per caratterizzare la regolazione post-trascrizionale. Per ulteriori dettagli su macchiarsi occidentale, Vedi8.- Crescere di ceppi di Escherichia coli K12 con vettori costruiti su mezzo adeguato e indurre l'espressione se necessario. Raccolta campioni mediante centrifugazione.
- Preparare i campioni per elettroforesi del gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) sciogliendo il pellet cellulare in 1x tampone campione SDS (62,5 mM Tris-HCl a pH 6.8, 2,5% SDS, 0,002% di blu di bromofenolo, β-mercaptoetanolo 5%, 10% glicerolo) e far bollire a 95 ° C per 5 min.
Nota: È possibile eseguire il cast un gel o utilizzare un gel prefabbricato disponibile in commercio. Quest'ultimo è stato utilizzato i risultati presentati in Figura 3 (Tabella materiali). - Caricare 107 cellule di ogni campione in pozzetti separati (includere una scala di proteine) ed eseguire gel a 200 V, fino a quando le proteine sono separate (circa 45 min).
- Macchia le proteine su una membrana di cellulosa di trasferimento semi-secco a 80 mA per 1 h.
- Bloccare la membrana con una miscela di proteine (per esempio, 5% latte in polvere sciolto in 1 x Tween 20-Tris-buffered saline tampone (Immunotyping)).
- Aggiungere anticorpo primario (disciolto in 1 x TTBS buffer) che la proteina di interesse (ad es., GFP, bandiera o proteina HIS-Tag) di destinazione e incubare per 1 h con agitazione delicata.
- Lavare la membrana in 1 x TTBS per 10 min per rimuovere gli anticorpi non legati. Ripetere due volte più.
- Aggiungere anticorpo secondario (disciolto in 1 x TTBS buffer) che gli obiettivi gli anticorpi primari e consentire il rilevamento (ad es., perossidasi di rafano (HRP)-coniugato anticorpi secondari. Incubare per 1 h con agitazione delicata.
- Lavare la membrana in 1 x TTBS per 10 min per rimuovere gli anticorpi non legati. Ripetere due volte più.
- Visualizzare la membrana con una tecnica compatibile con gli anticorpi secondari (per esempio, da imaging dopo incubazione con una chemiluminescenza luminol-derivato, se è stato utilizzato un anticorpo secondario coniugato HRP).
- Esperimento in vitro
Nota: Questo è un esempio di utilizzo il vettore come un modello per trascrizione in vitro di RNA per caratterizzare le interazioni RNA-proteina. Per ulteriori dettagli su EMSA, vedere9.- Rendere le trascrizioni in vitro utilizzando un T7 in vitro trascrizione kit (Tabella materiali) e vettori dal passaggio 5 come modelli.
- Separare i trascritti di RNA di pagina su un 4,5% 7m urea denaturante gel ed estrarre RNA direttamente dal gel di electro eluizione con tubi di dialisi (Tabella materiali).
- Etichetta di RNA (ad es., radiolabeling con γ -32P-ATP utilizzando chinasi di polinucleotide T4 (Tabella materiali) e purificare nuovamente con colonne (Tabella materiali).
Attenzione: Prima di lavorare con materiale radioattivo, consultare il responsabile della sicurezza di radiazione locale. - Mescolare etichettati-RNA con aumento delle concentrazioni di proteina in reazioni separate in un 1x buffer obbligatorio (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT)).
Nota: nei risultati presentati (Figura 4), 2 nM di radiomarcato csgD mRNA è stato mescolato con una sfumatura di proteina Hfq di 0 a 2 µM (concentrazione di monomero). - Consentire di proteine e RNA per ibridare prima di caricare la miscela di ibridazione su un gel di poliacrilammide non-denaturante ed eseguire il gel per 1,5 h a 200 V.
- Visualizzare il gel con una tecnica compatibile con l'etichettatura dal punto 6.1.3. (ad es., da phosphoimaging se radiomarcatura è stato applicato).
- Quantificare l'intensità relativa delle bande spostate con una programma di elaborazione delle immagini e forma una curva (sigmoidale) ai dati utilizzando un grafico e il software di analisi dati (Tabella materiali). Basato sulla curva componibile, valori (Kd) costanti di dissociazione possono essere determinati automaticamente con il software.
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Representative Results
Per indagare le interazioni RNA per quanto riguarda la regolazione post-trascrizionale di CDLS, è stata scelta una configurazione doppia vettoriale: uno per esprimere la csgD mRNA e un altro per esprimere il piccolo RNA non codificante, McaS. CDLS è stato clonato in pBAD33, che è un plasmide di medio-copia inducibile di arabinosio con resistenza al cloramfenicolo e McaS è stato clonato in mini pNDM220 R1, che è un plasmide di viscoelastica copia basso isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) con resistenza all'ampicillina. Wild type csgD era PCR amplificato utilizzando primer 1A e 4A (4A include una bandiera-sequenza) per produrre IA di prodotto PCR, mentre wild-type McaS era PCR amplificato utilizzando primer 1B e 4B per produrre il prodotto di PCR IB. La strategia PCR-step 3 è stata utilizzata per introdurre le sostituzioni della regione di appaiamento previsto di CDLS e McaS. Nei due primi passi, i prodotti di PCR IIA e IIIA sono stati sintetizzati utilizzando primer 1A + 2A e 3A e 4A, rispettivamente. Nel terzo passo, prodotto di PCR IVA è stato sintetizzato utilizzando prodotti di PCR IIA e IIIA come modello e 1A e 4A come primer (Figura 2A). Allo stesso modo, mutazioni sito-diretta complementari sono state introdotte in McaS, utilizzando primer 1B, 2B, 3B e 4B per produrre prodotti di PCR IIB, IIIB nei primi due passi e IVB nella terza fase (Figura 2A). pBAD33 e prodotti di PCR IA e IVA sono stati digeriti con BamHI e PstI e il digerito IA e IVA sono stati legati in pBAD33 digerito. Costrutti risultante sono stati denominati pBAD-csgDbandiera e pBAD-csgD63-66FLAG (mutato posizione 63-66 relativo al sito di inizio trascrizionale). pNDM220 e prodotti di PCR IB e IVB sono stati digeriti con AatII e BamHI e digerito IB e IVB erano legati in pNDM220 digerito. Risultante costrutti sono stati denominati pNDM-mcaS e pNDM-mcaS42-45 (mutato posizione 42-45 relazione sito trascrizionale iniziale).
Per analizzare l'effetto delle mutazioni, ceppi di Escherichia coli che harboring il pBAD-csgDFLAG o pBAD-csgD63-66FLAG e pNDM220, pNDM-importi compensativi monetari o pNDM-McaS42-45 sono stati coltivati in M9 minimal supplementato con 0,2% glicerolo a OD 450 di 0,4. Espressione dai vettori di pNDM quindi è stata indotta per 10 min con aggiunta di 1 mM IPTG seguita da 5min induzione dei pBAD-vettori con aggiunta di arabinosio 1 mM. A questo punto, sono stati raccolti campioni e analisi western blot è stato effettuato con i campioni raccolti. Mentre l'espressione di tipo selvaggio McaS impedisce la traduzione di tipo selvaggio CsgD, introduzione di mutazioni in CsgD o McaS allevia la repressione osservata. Tuttavia, quando le mutazioni sono integrate nella repressione traduzionale CsgD sia McaS di CsgD viene ripristinata (Figura 3; per volta da2). Così, l'approccio di mutational sito diretta sostiene l'ipotesi che McaS e CDLS -paia di basi a questa regione.
Il vettore di pBAD33 è stato scelto per l'esperimento in vivo e fu usato anche per l'introduzione di mutazione sito-diretta per indagare Hfq-associazione per la csgD mRNA in vitro. Le mutazioni sito-diretto sono stati introdotti con la strategia PCR 2-step per generare csgD mutante RNAs con strutture primarie e/o secondari alterati durante la trascrizione. Primer 1 + 2 C, 2D, 2E, 2F e 2G sono stati utilizzati per amplificare e introdurre mutazioni all'estremità 5' del csgD. I prodotti PCR ottenuti (IIC, IID, IIE, IIF e IIG) sono stati utilizzati come modelli con primer 3 per amplificare e introdurre mutazioni per l'intero csgD DNA (Figura 2B). I prodotti PCR ottenuti (IIIC, IIID, IIIE, IIIF e IIIG) sono stati clonati in pBAD33 come descritto in precedenza. Le trascrizioni in vitro sono state trascritte con il RNA-polimerasi di T7: in primo luogo, i prodotti di PCR sono stati sintetizzati con primer 5A, 5C, 5D, 5E, 5F o 5 + 6 utilizzando i vettori costruiti come modello. I prodotti PCR ottenuti sono stati utilizzati come modelli per la T7 RNA-polimerasi. In vitro trascritto csgD wild type e mutanti RNAs erano purificate, radioattive e miste con concentrazioni crescenti di Hfq purificata. Le reazioni di ibridazione sono stata analizzate su gel non denaturante e visualizzate. L'aumento di Kd-valori degli alleli mutanti dimostra che Hfq si lega in modo meno efficiente per i mutanti. Inoltre, Hfq ha diversi siti di legame su csgD che è indicato da 3 turni osservati per il tipo selvaggio RNA. Tuttavia, si osservano solo 2 siti di legame per il mutante differente RNA (Figura 4; per volta da4). Così, l'approccio di mutational sito diretta identifica strutture primarie e/o secondarie di csgD mRNA che sono importanti per un legame completo di Hfq.
Preso insieme, è possibile eseguire la mutagenesi sito-diretta con un approccio PCR di 2 o 3 passi in combinazione con dosaggi a valle per rendere biologiche conclusioni sulla regolazione genica a livello post-trascrizionale, nonché di interazioni proteina-RNA .
| Passo | Temperatura | Tempo |
| Denaturazione iniziale | 98° C | 2 min |
| Denaturazione | 98° C | 10 s |
| Ricottura | 55° C | 10 s |
| Estensione | 72° C | 15 s |
| (30 cicli) | ||
| Estensione finale | 72° C | 5 min |
| Tenere premuto | 4 ° C |
Tabella 1: Programma PCR
| Reagente | Reazione di controllo | 20 fmol reazione | reazione di fmol 100 |
| ligasi tampone 10x | 2 Μ l | 2 Μ l | 2 Μ l |
| Digerito il DNA del vettore | 10 fmol | 10 fmol | 10 fmol |
| Prodotto di PCR digerito | fmol 0 | 20 fmol | fmol 100 |
| H2O | A 19 µ l | A 19 µ l | A 19 µ l |
| Ligasi | 1 Μ l | 1 Μ l | 1 Μ l |
Tabella 2: Reazioni di legatura
| Nome di primer | Sequenza | Utilizzato per - mutazioni | ||
| 2-1A o 3-1A | GCGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGA TGTAATCCATTAGT |
2 - 3-round e PCR su csgD | ||
| 2-3A o 4A-3 | CCGCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC | 2 - 3-round e PCR su csgD | ||
| 3-2A | CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC | 3 colpi PCR su csgD – sostituisce 4 nt | ||
| 3-3A | GATTTATTACTACACACAGCTCACCAACATCTGTCAGTACTTCTG | 3 colpi PCR su csgD – sostituisce 4 nt | ||
| 3-1B | CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC |
3 colpi PCR su McaS | ||
| 3-4B | ETQCGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC | 3 colpi PCR su McaS | ||
| 3-2B | CTCTACAGTACACACAGCTCACCATCCGCGTCTTAAATC | 3 colpi PCR su McaS – sostituisce 4 nt | ||
| 3-3B | GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG | 3 colpi PCR su McaS – sostituisce 4 nt | ||
| 2-2C | CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG | 2 colpi PCR su csgD – Elimina 11 nt | ||
| 2-2D | CAGCCCTAAATGGGTAAAACiarlaAAACTAATGGATTACATCTG | 2 colpi PCR su csgD – sostituisce 4 nt | ||
| 2-2E | CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG | 2 colpi PCR su csgD – Elimina 11 nt | ||
| 2-2F | GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG | 2 colpi PCR su csgD – Elimina 9 nt e sostituti 7 nt | ||
| 2-2G | CTGCTGTGTGTAGTAATCCATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG | 2 colpi PCR su csgD – Elimina 9 nt e sostituti 7 nt | ||
| 5A | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC | T7 PCR | ||
| 5C | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG | T7 PCR | ||
| 5D | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC | T7 PCR | ||
| 5E | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC | T7 PCR | ||
| 5F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG | T7 PCR | ||
| 5G | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG | T7 PCR | ||
| 6 | GTATGACCATGAATACTATGG | T7 PCR | ||
Tabella 3: Primer usati per mutagenesi sito-diretta e T7 modello sintesi
Grassetto: siti di riconoscimento degli enzimi di limitazione (BamHI, PstI e AatII)
Sottolineato: mutazioni nucleotidiche
Figura 1: strategia PCR per mutagenesi. A) tre primer sono utilizzati nell'approccio 2-step PCR per introdurre mutazioni sito-diretta ad un gene di interesse. Gli iniettori 1 e 3 amplifica il gene (prodotto di PCR ho), mentre primer 2 introduce mutazioni specifiche (*). Coppie di primer 1 + 2 amplifica un piccolo frammento ad entrambe le estremità del DNA di interesse per sintetizzare il prodotto di PCR II (passaggio 1). Il prodotto PCR risultante viene quindi utilizzato come primer insieme con primer 3 di sintetizzare il prodotto di PCR III con la mutazione del luogo diretto incorporata (passaggio 2). B) quattro iniettori vengono utilizzati nell'approccio PCR 3-passo per introdurre le mutazioni sito-diretta ad un gene di interesse. Gli iniettori 1 e 4 amplifica il gene (prodotto di PCR ho), mentre gli iniettori 2 e 3 introduce mutazioni specifiche (*). Coppie di primer 1 + 2 e 3 + 4 vengono utilizzate nei due primi passi della PCR per sintetizzare il prodotto di PCR II e III (fase 1 & 2). Nella terza fase, i prodotti di PCR II e III vengono utilizzati come modello con coppia di primer 1 + 4 per sintetizzare IV del prodotto PCR con la mutazione sito-diretta incorporata (passaggio 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: i prodotti di PCR da mutagenesi. PCRs sono stati effettuati con primer e modelli come descritto nel testo. I prodotti di PCR sono stati analizzati su un gel di agarosio 2% con bromuro di etidio (~ 0,5 µ g/mL) con 1 µ g di DNA ladder mix (Tabella materiali). Bande di dimensioni corrette sono contrassegnate con un quadrato rosso. A) nella maggior parte delle reazioni di PCR è visibile solamente una banda di dimensioni corrette. Tuttavia, la reazione di PCR IVB ha due bande visibili di cui la banda superiore (appena di sopra di 300 bp) è la lunghezza corretta. Come previsto, la somma della lunghezza dei prodotti di PCR II e IIIC uguale alla lunghezza dei prodotti di PCR I e IV (r: csgD PCR prodotti, b: McaS PCR, I: tipo selvaggio csgD/McaS amplificato utilizzando primer 1A/B + 4A/B, II + III: PCR prodotti intermedi amplificato utilizzando primer 1A/2A + B/B e B/B + 4A/3A, rispettivamente, IV: mutato prodotto di PCR amplificato utilizzando primer 1A/B + 4A/B con i prodotti PCR intermedi II e III come modelli). In tutte le reazioni di PCR è visibile solamente una banda di dimensioni corrette. In questo caso, quasi tutte le molecole dei prodotti PCR che II aggiunto a reazioni di PCR III sono state utilizzate per sintetizzare i prodotti di PCR III. Solo per PCR IIIE è prodotto di PCR IIE ancora visibile (IA: prodotto di PCR di tipo selvaggio csgD amplificato utilizzando primer 1A + 3A, IIC-g: prodotti intermedi di PCR amplificati utilizzando primer 1A + 2C-G, IIIC-g: mutato PCR prodotti amplificati usando primer 3A con prodotti di PCR IA e IIC-G come modelli). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: esperimento In vivo con CDLS sito-diretta e mutanti McaS. Analisi Western blot dei ceppi che harboring vettori indicati. Ceppi sono stati cresciuti a fase esponenziale e indotta per 10 min con 1 mM IPTG (McaS) seguita da induzione 5 min con arabinosio 1 mM (csgD). Α-bandiera anticorpi sono stati utilizzati per indirizzare la bandierina-etichettate CsgD e α-GroEL anticorpi sono stati utilizzati per indirizzare la proteina pulizia GroEL (diluito 10.000 e 50.000 volte, rispettivamente). Topo e coniglio coniugato HRP anticorpi sono stati utilizzati come anticorpi secondari (diluiti 2.000 volte). Questa figura è stata modificata da2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: In vitro esperimento con mutanti sito-diretta CDLS . EMSA csgD trascritto in vitro wild type (WT) e RNAs mutante (pannello C-G) per quanto riguarda Hfq associazione. Gli alleli csgD (WT e mutante C-G) erano radioattivi e mescolati con 0, 0.25, 0.5, 1 o 2 µM monomerico Hfq. reazioni di ibridazione sono state eseguite su non-denaturante del gel di poliacrilammide. L'intensità relativa delle bande spostate è stato quantificato ed una curva sigmoidea è stata montata ai dati. Valori (Kd) costanti di dissociazione sono stati determinati utilizzando SigmaPlot. Questa figura è stata modificata da4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Mutagenesi sito-diretta ha una vasta gamma di applicazioni diverse, e qui, risultati rappresentativi da un esperimento in vitro ed una in vivo sono stati inclusi come esempi di come fare conclusioni biologici usando la tecnica. Mutagenesi sito-diretta ha per lungo tempo lo standard d'oro per gli studi di interazione di RNA. La forza della tecnica risiede nella combinazione di introdurre rilevanti mutazioni con dosaggi a valle ed esperimenti (ad es., macchia occidentale o EMSA) per trarre conclusioni sui siti specifici del DNA e la loro importanza nelle funzioni dei prodotti genici in domanda. Quando si decide di fare la mutagenesi sito-diretta, la progettazione degli iniettori deve essere accuratamente pianificata per sfruttare al massimo la tecnica (ad esempio quali siti di mutare); Assicurarsi di includere la corrette strapiombi e siti di restrizione e prestare attenzione le caratteristiche del primer/modello.
La mutagenesi effettiva descritta in questo protocollo si basa sulla PCR. La parte più importante del protocollo è quindi le condizioni per questo. Ci sono diversi modi di ottimizzazione di PCR, tra cui le sfumature delle concentrazioni di Mg2 + , la concentrazione di DMSO e temperature del passo ricottura. Per ulteriori dettagli, Vedi3. Oltre a ottimizzazione della reazione PCR stessa, due cose sono vale la pena fare sicuro quando facendo mutagenesi sito-diretta: modelli di alta qualità e accuratamente progettato gli iniettori.
Avere un modello di alta qualità per la PCR spesso fa la differenza tra una PCR riuscita e non riuscita. Mentre è possibile utilizzare un lysate delle cellule per fornire il modello di DNA, DNA di purificato (genomica-, vector - o PCR-DNA) è sempre preferibile. Inoltre, quando si tratta di quantità di modello, spesso meno è meglio; soprattutto nell'ultimo passaggio della PCR 3-step (passo 4.2.5). Ad esempio, provare una serie di diluizioni di 10 x del modello per trovare la soluzione ottimale se necessario.
Disegno dell'iniettore ottimale dipende dalle caratteristiche del DNA di interesse e della polimerasi. Quando possibile, sempre provare a disegnare primers di conseguenza. Tuttavia, in molti casi primer deve essere progettata in un sito specifico e pertanto potrebbe non essere progettato secondo criteri specifici. In questi casi, potrebbe essere necessario fare di più condizioni invece di ottimizzazione della PCR (Vedi sopra e protocollo PCR6), ma con le giuste condizioni anche difficili PCRs sono solito successo.
Diversi metodi alternativi per sito-diretta mutagenesi sono disponibili, come metodo10 di Kunkel, intero plasmide mutagenesi11, cassetta mutagenesi12, sintesi de novo del gene e CRISPR13,14.
Metodo di Kunkel e mutagenesi intero plasmide si basa sul DNA di interesse essendo già in un plasmide (vettore) e utilizza gli iniettori di sintetizzare un filo singolo o doppio filamento di DNA mutato, rispettivamente. In entrambe le tecniche, l'intero plasmide viene sintetizzata e usata per la trasformazione, considerando che 2 - o 3-step PCR sintetizza solo il pezzo di DNA di interesse. Uno svantaggio del 2 - o 3-step PCR, è che il DNA di interesse deve essere sintetizzato in due volte, aumentando il rischio di mutazioni in esso. D'altra parte, il plasmide non deve essere sintetizzato, abbassando così il rischio di mutazioni qui invece. Inoltre, utilizzando il 2 - o 3-step PCR, una variante di tipo selvaggio non deve necessariamente essere clonato in un vettore in anticipo, riducendo così il tempo di clonazione da diversi giorni.
Mutagenesi di cassetta non si basa sull'uso di primer o polimerasi. Invece, un piccolo frammento di DNA è de novo sintetizzato e incorporati nel DNA di interesse con l'uso degli enzimi di restrizione. Questo metodo, tuttavia, si basa sulla presenza di siti di restrizione adatti nei pressi del sito di destinazione, che non è sempre presente. Questo approccio richiede anche la variante di tipo selvaggio per essere clonato nel vettore in anticipo, aumentando la clonazione tempo rispetto al metodo PCR 2 o 3 passi.
Con costi decrescenti di sintesi de novo del gene (grandi frammenti di DNA), sta diventando sempre più conveniente di introdurre mutazioni ordinando commercialmente la sequenza desiderata. Tuttavia, questo metodo è ancora costoso rispetto altri metodi menzionati. Al momento della stesura de novo sintesi sono circa 3 volte più costoso rispetto al metodo presentato qui.
Un'altra opzione emergente è il metodo CRISPR attesissimo per le alterazioni del genoma. Questo metodo è altamente efficiente e adattabile rispetto ad altre tecniche usate per le cellule eucariotiche. Tuttavia, con la relativa facilità e molte tecniche disponibili per la clonazione nell'organismo più semplice come i batteri, CRISPR raramente è più adatto di clonazione convenzionali. Così, l'utilità di CRISPR dipende in gran parte sull'organismo in fase di studio.
Quando si sceglie di fare la mutagenesi sito-diretta, è importante progettare accuratamente; sia per quanto riguarda le applicazioni a valle nonché la tecnica effettiva utilizzata. Il metodo PCR 2 - e 3-passo qui descritto è applicabile a quasi qualsiasi studio di mutazione e con il suo basso costo è adatto a qualsiasi budget di laboratorio.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare borse di studio di Università della Danimarca meridionale accesso aperto politica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
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- JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
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