Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

المتقدمة التصوير من الرئة صاروخ موجه الخلايا الليمفاوية البشرية في التجريبية في نموذج فيفو للالتهاب التحسسي استناداً إلى ورقة الخفيفة الميكروسكوب

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/59043
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

Summary

يسمح البروتوكول أدخل هنا وصف قدرة الرئة صاروخ موجه من الخلايا الليمفاوية البشرية الأولية المجراة في ظروف التحريضية. تسلل الرئوية أدوبتيفيلي نقل الخلايا المناعية البشرية في نموذج ماوس للالتهاب التحسسي يمكن تصويرها وكمياً بالفحص المجهري الفلورية الضوء-ورقة من أنسجة الرئة المطهرة كيميائيا.

Abstract

الساحقة تراكم الأنسجة للغاية تنشيط الخلايا المناعية يمثل سمة مميزة لمختلف الأمراض المزمنة التحريضية، وبرزت بوصفها هدفا جذاباً علاجية في المعالجة السريرية للمرضى المتضررين. من أجل مواصلة تحسين استراتيجيات تهدف إلى تنظيم العلاجية من تسلل الخلايا المناعية برو-التهابات أنسجة مرضية غير متوازن، ستكون ذات أهمية خاصة لتحقيق رؤى تحسن في حدة المرض والجهاز صاروخ موجه خصائص الخلايا اللمفية الطرفية. يسمح البروتوكول التجريبي المبين هنا لرصد تراكم الرئة من الخلايا الليمفاوية البشرية المسماة فلوريسسينتلي ونقلت أدوبتيفيلي في سياق التهاب الرئوي الناجم عن غراء. وعلى النقيض من فحوصات في المختبر القياسية استخداماً لتحليل الهجرة الخلية المناعية وانزيمية، الإعداد المجراة في أدخلت الآن يأخذ في الحسبان الجوانب الخاصة بالرئة من الأنسجة المنظمة وتأثير المجمع التحريضية السيناريو تجري في الحي مورين. وعلاوة على ذلك، التصوير المجهري الفلورية الضوء-ورقة مقطعية ثلاثية الأبعاد لا توفر البيانات الكمية فقط على التسلل إلى الخلايا المناعية، ولكن أيضا يصور نمط الخلية المناعية التعريب داخل الرئة الملتهبة. وعموما، نحن قادرون على الأخذ تقنيات مبتكرة ذات قيمة عالية للبحوث المناعية في مجال الأمراض المزمنة التهاب الرئة، والتي يمكن تطبيقها بسهولة باتباع البروتوكول خطوة بخطوة المتوفرة.

Introduction

الكلاسيكية اضطرابات التهاب في الرئة، مثل حساسية الربو ومرض انسداد الشعب الهوائية المزمن (COPD)، معروفة جيدا يكون مدفوعا توظيف المتزايد لتنشيط الخلايا الليمفاوية في أنسجة الرئة1،2. صدر اللمفاويات السيتوكينات (مثلاً، وايل-4، وايل-5، 9 إيل، إيل-13، IFN-γ وتنف-α) مواصلة تعزيز إنزيمية للخلايا المناعية الفطرية وقابلة للتكيف، والحث على إعادة عرض مجرى الهواء تليفية أو أضرار مباشرة في لحمه الرئة2. وحتى الآن، الآليات الأساسية المسؤولة عن تراكم المرضية للخلايا الليمفاوية داخل أنسجة الرئة لا بعد فهم فهما كاملا. قياسا إلى الطباعة النسيج انتقائية تي خلية وصفت لصاروخ موجه القناة الهضمية والجلد، الخلايا الجذعية الرئوية (DCs) قادرة ومن الواضح أن رئيس الوزراء خلايا تي الطرفية لتسلل الرئة تفضيلية، على الأقل جزئيا عن طريق تنظيم دورات تعريفية للتعبير CCR4 على سطح الخلايا الليمفاوية3. بالإضافة إلى CCR4، وخلايا تي التسلل إلى مجرى الهواء تتميز أيضا بتعبير لا سيما زيادة مستقبلات chemokine CCR5 و CXCR3 بالمقارنة مع خلايا T داخل الدم الطرفية1،،من45. البيانات الشاملة، القائمة تتسق مع مفهوم أن صاروخ موجه الرئة من الخلايا اللمفية تي تحت ظروف فسيولوجية أو تحريضية ينطوي على عدد من مستقبلات تشيموكيني مختلفة وعلى يغاندس كل منهما وهكذا حاسمة يتوقف على عن كثب التحكم في التعاون بين الخلايا المناعية الفطرية والتكيف1. خصوصا، خلال المرحلة الأولى من التعرض للعوامل الممرضة أو المسببة للحساسية، خلايا نظام المناعة الفطرية الاستجابة للتحفيز TLR أو لفريق الخبراء الحكومي الدولي بوساطة العابرة للربط بالإفراج الفوري عن تشيمواتراكتانتس المختلفة، مثل لتب4، CCL1، CCL17، CCL22، CCL20، CXCL10، و PGD21،،من67. كمثال، التفاعل بين PGD2 ومستقبلات تشيمواتراكتانت CRTh2 ومن المعروف أن تكون ذات أهمية خاصة بالنسبة إنزيمية خلايا Th2 وهكذا يبدو الهدف العلاجي كما تبشر بالخير في الإدارة السريرية للربو. وفي الواقع، مرضى الربو المعتدل أظهرت تحسنا في الأعراض وزيادة كبيرة في حجم الزفير القسري في ثانية واحدة (FEV1) بعد العلاج مع خصم CRTh2 انتقائية مقارنة مع مجموعة الغفل8 ،9. في حالة أكثر تقدما من الاستجابة الالتهابية، خلايا تي المعينين أصلاً قادرة على تضخيم زيادة تراكم اللمفاويات الرئوي عن طريق الإفراج عن إيل-4، وايل-13 كمحفزات قوية لوحدات تحكم المجال Dc الرئوية. في وقت لاحق، هذه الخلايا الفطرية النقوي المشتقة يصل-تنظيم التعبير عن CCL17 و CCL22 في STAT6-تعتمد على طريقة1،،من1011.  على الرغم من أن الطابع المعقد للسيناريو الذي وصف لا يزال يعوق فهم كامل للرئة الخلية تي صاروخ موجه، ويقدم مجموعة كبيرة أهداف الجزيئية لعنصر تحكم علاجية المحتملة أمثل لأمراض الجهاز التنفسي التهابات أو حساسية. ولذلك، هناك حاجة ملحة للتقنيات التجريبية المبتكرة، التي قادرة على تعميق وتكمل معرفتنا في مجال إنزيمية خلية تي والرئة صاروخ موجه.

يرجع ذلك إلى حقيقة أن صاروخ موجه الرئة من الخلايا الليمفاوية داخل جسم الإنسان يتأثر ب معلمات الخلوية وخلطيه ومادية متعددة1، معظم الأساليب التجريبية الحالية ليست قادرة على نموذج كامل مدى تعقيد هذه العملية المناعية. بدلاً من ذلك، يركز العديد من البروتوكولات القياسية لتحليل الرئة صاروخ موجه بشكل انتقائي على جانب محدد تشارك في سلسلة من جاذبية اللمفاويات والالتصاق، والهجرة والاحتفاظ بها. وإلى جانب تحديد وصفية بحتة لنمط التعبير مرناً أو البروتين مستقبلات إينتيجرينس وتشيموكيني في الخلايا اللمفية الطرفية أو التسلل إلى الرئة وقياس مستويات كل منها تشيموكيني في الدم، مكملة للفيسيولوجيا الغسل (بال) أو أنسجة الرئة12،13،،من1415، ثقافة راسخة الخلايا في المختبر فحوصات السماح لتوصيف وظيفي لالتصاق الخلايا اللمفاوية أو إنزيمية عند تعريف الظروف التجريبية16،،من1718. من حيث المبدأ، رصد فحوصات التصاق في الأنابيب ثابت قدرة الربط لمفاوية مثقف لأحادي الطبقة غشائي أو شرائح زجاجية مغطاة بجزيئات الالتصاق غشائي المؤتلف (مثلاً، مادكام-1، VCAM-1)، بينما المعيار في المختبر عادة ما يتم تطبيق فحوصات إنزيمية من أجل قياس قدرة الخلايا الليمفاوية ترحيل على طول تدرج تشيموكيني في نظام ترانسويل19. كلا الإعدادات في المختبر تمكن من التكيف التي تسيطر عليها والتحوير للظروف التجريبية، ولكن من ناحية أخرى تفتقر إلى متغيرات هامة تعرف بالغة الأثر على إنزيمية في الحية والتصاق الخلايا الليمفاوية. يغلب عليها الطابع، تجاهل تأثير قوي القص الناتجة عن تدفق الدم الدائمة19 فحوصات الثقافة الخلية ثابت ويحتمل أن إهمال مشاركة الوسط المناعية المحيطة والمتفاعلة الخلايا المناعية غير اللمفاويات، كل هذا في حي. وللتغلب على هذه القيود، تفسير النتائج المكتسبة في ثابتة في المختبر فحوصات إنزيمية أو الانضمام تحتاج إلى مزيد من التحقق من الصحة في تجارب التصاق الحيوية تحت ظروف تدفق20،21 وفي فيفو نماذج من أمراض التهابات الجهاز19. في الواقع، يمكن استخلاص استنتاجات بشأن تنظيم الرئة الخلية تي صاروخ موجه تحت ظروف التهابات أو حساسية من الدراسات الحيوانية الهامة تحليل وراثيا تعديل الفئران في نماذج محددة لمختلف الأمراض الرئوية3، 22 , 23-مقارنة كمية من التسلل إلى الخلايا الليمفاوية بين wildtype الفئران والفئران مع نقص جين معين من الفائدة يمثل أداة راسخة والمستخدمة على نطاق واسع لتحديد أثر الخلوية خاصة الرئة المسارات أو مستقبلات على نمط توزيع T خلية يحركها المرض. ومع ذلك، خلافا لقبل مناقشة الثقافة الخلايا في المختبر فحوصات، تصميم دراسة استناداً إلى نماذج حيوانية الكلاسيكية يفتقر إلى القدرة على تحليل ورصد خلايا تي البشرية الأولية المستمدة مباشرة من الدم أو بال للمرضى الذين يعانون من التهابات الرئة المرض. وهكذا، فإنه لا يزال تحديا وظيفيا التحقق من صحة ما إذا كان مرض الرئة دياجنوستيكالي محدد قادرة على بصمة الخلايا الليمفاوية البشرية انتحاء الرئة تفضيلية ومدى المعلمات السريرية قد يؤثر على هذا السيناريو. ومؤخرا، تم إدخال نهج المجراة في أنيقة جداً في سياق أمراض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين)، التي تمكنت من التغلب على معظم هذه القيود وفتح آفاقاً جديدة لدراسات متقدمة متعدية الجنسيات في اللمفاويات المعوية صاروخ موجه24 . الاستفادة من البروتوكولات لإزالة النسيج المستندة إلى المذيبات تليها مجهرية مستعرضة ورقة الضوء الفلورية كأداة قوية لتصوير، كان من الممكن تصور تسلل وتوزيع الخلايا البشرية المنقولة أدوبتيفيلي في الأمعاء من الفئران العوز كوليتيك24. على وجه الخصوص، تطبيق هذا الإعداد التجريبية اثنان من الابتكارات الرئيسية: يمكن تحليل الخلايا المناعية البشرية الأولية (1) تحت ظروف المجراة في تجريبيا محددة؛ (2) منطقة كبيرة بدلاً من الجهاز المريضة (حوالي 1.5 × 1.5 سم) يمكن تصويرها بجودة عالية الدقة، تليها 3D-التعمير. وعلاوة على ذلك، العديد من الدراسات الأخيرة نجحت في إنشاء استخدام النسيج المستندة إلى المذيبات المقاصة والأسفار الضوء-ورقة الفحص المجهري كأدوات هامة للرئة المتقدمة التصوير،من2526. من أجل الاستفادة من هذا التقدم التكنولوجي في مجال علم المناعة الرئوية، ونحن الآن اعتمد النظام لتحليل الرئة صاروخ موجه.

يوفر البروتوكول المعروضة هنا مقدمة خطوة بخطوة كيفية تنقية والتسمية تي البشرية الأولية الخلايا لنقل في الفئران مع التهاب رئوي المستحث، وعلاوة على ذلك، يصف بالتفصيل عملية لاحقة للضوء--ورقة فلوريسسينتلي التصوير المجهري الأسفار، بما في ذلك إعداد الجهاز ومعالجة الصور. وعموما، نأمل لدعم الدراسات متعدية الجنسيات في المستقبل في مجال أمراض الرئة التهابات أو حساسية بإدخال متطورة، لكن نموذج مجدية، والتجريبية لرصد صاروخ موجه الرئة اللمفاويات البشرية بناء على ظروف المجراة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت التجارب التي تنطوي على الحيوانات وفقا لبروتوكولات معتمدة من قبل السلطات المحلية ذات الصلة في ارلنجن (ريجيرونج فون اونترفرانكين، فورتسبورغ، ألمانيا). تم إيواء الفئران تحت شروط معينة خالية من مسببات الأمراض. جمع الدم البشري أقرته اللجنة الأخلاقية المحلية ومجلس المراجعة المؤسساتية لجامعة ارلنجن نورنبيرغ. وأعطى كل مريض الموافقة الخطية.

1-الحث على التهاب الرئة التحسسي في الفئران

ملاحظة: كما ورد في دراسات سابقة27، الإجراء التجريبي التالي يسمح حمل التهاب مجرى الهواء الحساسية في الفئران، وتبعاً لذلك، يؤدي تراكم الخلايا المناعية الفطرية والتكيف في ال. البروتوكول وصف قد أنشئت في الفئران C57BL/6J، ولكن ينبغي أن يكون اعتماد للسلالات الفطرية القياسية الأخرى الممكنة.

انظر الشكل 1ألف للاطلاع على موجز للإجراءات التجريبية المجراة.

  1. تخدير الفئران بالحقن داخل من الكيتامين/إكسيلازيني.
    ملاحظة:     فقط استخدام الفئران C57BL/6J كبار السن من 6 أسابيع ومع وزن جسم على الأقل 16 g.
    1. إعداد الحل الكيتامين/إكسيلازيني في برنامج تلفزيوني (الكيتامين 12 مغ/مل؛ xylazine 1.6 ملغ/مل) وتحديد وزن الجسم الدقيق للفئران.
    2. حقن الفأرة الأولى مع تمارين ميليلتر/ز 8 من الكيتامين/إكسيلازيني حل إينترابيريتونيلي وتأكيد التخدير العميق عبر غياب منعكس قرصه مخلب قبل الشروع في الخطوة 1، 3.
  2. إعداد طازجة 5 ملغ/مل غراء في برنامج تلفزيوني. ببطء "الماصة؛" 10 ميليلتر (50 ميكروغرام) من الحل غراء إلى الآنف. ترصد بدقة الماوس حتى الصحوة.
  3. كرر الخطوات من 1.1 و 1.2 لجميع الفئران المدرجة في هذه التجربة. نفذ الخطوات 1.1-1.3 في ثلاثة أيام متتالية.

2-تنقية وتسمية فلوريسسينتلي البشرية CD4 الدم الطرفية+ "خلايا تي"

ملاحظة: عملية الخلايا تحت ظروف معقمة.

  1. جمع 18 مل دم البشري الكامل من أحد الأوردة المحيطية. أداء هيباك فيكل التدرج الطرد المركزي من أجل تحديد جزء صغير خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMC).
    ملاحظة: جمع وتحليل المواد البشرية الأساسية تحتاج إلى موافقة السلطات الأخلاقية المحلية. مسموح فقط لشخص ذي تأهيل طبي الكافي لجمع الدم من أحد الأوردة المحيطية.
    1. جمع الدم في حمض الإيثيلين (يدتا)-التي تحتوي على مونوفيتيس (1.6 ملغ يدتا مليلتر من الدم) لتفادي تجلط الدم.
      الاختياري: استخدام الدم معطف بافي، نتاج ثانوي للتبرع بالدم أثري في الكريات البيضاء، بدلاً من الدم الوريدي كاملة.
    2. نقل الدم في أنبوب 50 مل مخروطية وتمييع 1:2 في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). أضف 10 مل من فيكل المتوسطة بعناية (كثافة 1.077 g/mL) كطبقة أسفل إطار الدم المخفف. الطرد المركزي العينة (800 x ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون الفرامل).
    3. بعناية إزالة الأنبوب من أجهزة الطرد المركزي ونقل في الطور البيني المحتوية على ببمك في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد. تجاهل الطبقة السفلي والعلوي. ملء الأنبوب الذي يحتوي على ببمك مع برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي (300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية). إزالة المادة طافية.
      ملاحظة: بشكل اختياري، إذا لزم الأمر، إجراء تحلل الكريات الحمراء المتبقية. بعناية أضف 3 مل من كلوريد الأمونيوم-البوتاسيوم (ACP) تحلل من المخزن المؤقت (كلوريد الأمونيوم عيار 155 مم؛ 19 مم البوتاسيوم الهيدروجين يدتا كربونات ومم 0.68؛ الرقم الهيدروجيني 7.27) بيليه حراكه الخلية ودوامه العينة. هز الأنابيب لمدة 3 دقائق. لإزالة المخزن المؤقت تحلل ACP، إضافة 40 مل برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي (300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية.
  2. تنقية خلايا CD4 خلايا+ تي عبر ميكروبيدس CD4.
    ملاحظة: بشكل عام، هناك عدة موزعي ميكروبيدس المغناطيسي لتطهير البشرية CD4+ الخلايا، التي ينبغي أن يسفر عن مستويات مماثلة من النقاء الخلية. ينبغي أن يستند اختيار المنتج إلى التفضيلات الفردية. يتم ضبط الخطوات التالية للبروتوكول (2.2.2–2.2.7) لتعريف منتج ميكروبيد CD4 وأعمدة فصل كل منهما كما ورد كذلك في الجدول للمواد. قد يكون مطلوباً إدخال بعض التعديلات البروتوكول في حالة أنه تم تحديد منتج ميكروبيد CD4 بديلة.
    1. ريسوسبيند بيليه PBMC في الحد أدنى من برنامج تلفزيوني ميليلتر 80 التي تحتوي على 0.5% مصل بقرى الجنين (FBS) و 2 مم يدتا (برنامج تلفزيوني/FBS/يدتا-المخزن المؤقت) كل 107 ببمك. استخدام سكان بدءاً من حوالي 30 × 106 ببمك أجل في نهاية المطاف مع حوالي 3 × 106 إلى 6 × 106 تنقية CD4 البشرية+ تي الخلايا.
    2. إضافة 20 ميليلتر من ميكروبيدس CD4 كل 107 ببمك، خلط بلطف واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني/FBS/يدتا-العازلة (تبريد وصولاً إلى 4 درجة مئوية) وأجهزة الطرد المركزي (300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية). إزالة المادة طافية.
    3. ضع عمود فصل في حقل مغناطيسي. شطف العمود مع 3 مل من برنامج تلفزيوني/FBS يدتا-المخزن المؤقت. ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني/FBS/يدتا-العازلة (تبريد وصولاً إلى 4 درجة مئوية) ونقل تعليق خلية على العمود الفاصل مشطوف يوضع ضمن حقل مغناطيسي.
    4. شطف العمود فصل ثلاث مرات مع 3 مل من برنامج تلفزيوني/FBS/يدتا-العازلة (تبريد وصولاً إلى 4 درجة مئوية) والتخلص من النفايات السائلة.
    5. إزالة العمود فصل من المجال المغناطيسي ووضعه في أنبوب 15 مل. الوتي CD4+ جزء الخلية في 5 مل من برنامج تلفزيوني/FBS يدتا-المخزن المؤقت باستخدام المكبس.
    6. ملء الأنبوب ببرنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي (300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية). إزالة المادة طافية. كرر هذه الخطوة الغسيل مرتين.
    7. تحديد عدد الخلايا أثمرت بأسلوب قياسي للاختيار (مثلاً، الدائرة نويباور).
  3. قم بتسمية CD4+ تي الخلايا مع صبغة انتشار خلايا فلورسنت.
    1. ريسوسبيند CD4 الخلايا+ تي في برنامج تلفزيوني (ما يصل إلى 107 خلايا/مل؛ لا تستخدم أقل من 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني).
    2. تعد حلاً 6 ميكرومتر من تكاثر الخلايا الضوء الأحمر منفعل صبغ (انظر الجدول للمواد) في برنامج تلفزيوني (قبل تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة). خلط هذا الحل 1:2 مع قبل إعداد تعليق خلية ودوامه دقة (3 ميكرومتر التركيز النهائي).
    3. احتضان لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية (محمية من الضوء). وبعد ذلك إضافة خمسة مجلدات متوسطة ربمي الذي يحتوي على 10% FBS واحتضان لمدة 5 دقائق على الجليد (محمية من الضوء).
    4. أغسل المسماة الخلايا ثلاث مرات في ربمي المتوسطة التي تحتوي على 10% FBS (أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية). ريسوسبيند الخلايا المسماة في برنامج تلفزيوني، وتخزين على الجليد وحماية من الضوء حتى الاستخدام.
      ملاحظة: تخزين للخلايا لفترات طويلة (> 60 دقيقة) قد يؤثر سلبا على بقاء الخلية.
      الاختياري: تحديد نقاء CD4+ الخلية الكسر وفعالية الإجراءات التي وصفها بالتدفق الخلوي. ريسوسبيند 0.5 × 106 و 1 × 106 خلايا CD4+ الخلايا في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت (1% FBS، 2 مم يدتا في برنامج تلفزيوني)، وإضافة جسم الإنسان المضادة CD4 مقترنة بصبغة فلورسنت الاختيار. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. أضف 1 مل المخزن المؤقت والطرد المركزي (300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية. المضي قدما في تدفق سيتوميتريك قياس العينة (نتيجة الممثل هو مبين في الشكل 1،ب، ج).

3-أدوبتيفيلي نقل البشرية CD4 الخلايا+ تي في غراء يتعرض ميسي المستفيدة

ملاحظة: انظر الشكل 1ألف للاطلاع على موجز المجراة في تنفيذ الإجراءات التجريبية. إجراء نقل خلية يوم واحد بعد آخر إدارة داخل الآنف غراء.

  1. ضبط تعليق CD4 البشرية المسماة فلوريسسينتلي+ تي الخلايا (الخطوة 2.3.4) بتركيز 1 × 107 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني. ملء 100 ميليلتر من تعليق خلية في 1 مل/30 غرام-المحاقن.
  2. بعناية ضع الماوس C57BL/6J المعرضة غراء الأول (خطوات 1.1-1.3) في جهاز ضبط النفس لحقن الوريد الذيل. استخدام المحاقن (الخطوة 3.1) مستعدة للثقب في السياق الذيل وحقن ببطء 100 ميليلتر من تعليق خلية تحتوي على 1 × 106 المسماة CD4 البشرية+ الخلايا. لا فورا سحب الإبرة بعد الحقن، ولكن الانتظار لمدة 5 ثواني إضافية بغية منع حدوث تفريغ تعليق خلية.
  3. حرر زر الماوس من جهاز ضبط النفس والمضي قدما مع هذا الحيوان القادم. الحفاظ على الحيوانات المعرضة غراء واحد على الأقل، التي لا تخضع لنقل الخلايا المسماة فلوريسسينتلي بمثابة مراقبة سلبية للأسفار الضوء-ورقة الفحص المجهري.

4-تعد أنسجة الرئة لورقة الضوء "الفلورية مجهرية"

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية ح 3 بعد نقل المسمى فلوريسسينتلي الخلايا البشرية (الخطوة 3، 2). وصف الإجراءات التجريبية بما في ذلك الحصاد لانسجة الرئة، التثبيت والنسيج المستندة إلى المذيبات المقاصة كانت مقتبسة من البروتوكولات وصف حاليا24،28.

  1. التضحية الماوس باستنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون (C02).
  2. نتخلل الرئة في الموقع مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 5 مم يدتا.
    1. فتح الصدر عن طريق قطع على طول القص لفضح القلب. الشروريه البطين الأيمن مع قنية ز 21 متصلاً قسطرة.
    2. فتح البطين الأيسر بقطع ومما يسمح سائل الدم ونضح للخروج. نتخلل الرئة مع 20 مل من برنامج تلفزيوني المثلج يحتوي على 5 مم يدتا عن طريق القسطرة ببطء.
  3. من أجل القيام بالتثبيت في الموقع في الرئة، لا تقم بإزالة القسطرة من البطين الأيمن. نتخلل ببطء في الرئة مع 2 مل من المثلج 4% بارافورمالدهيد (PFA) تحل في برنامج تلفزيوني. إزالة القسطرة والقنيه.
    ملاحظة: التثبيت في الموقع على أساس منهاج عمل بيجين لانسجة الرئة يمثل تقنية راسخة من أجل تحضير أنسجة الرئة مورين للتحليل المجهري اللاحقة29،30.
    تنبيه: منهاج عمل بيجين هو السامة والتعامل معها تحت غطاء محرك السيارة مع الرعاية.
  4. ملء الرئة مع 0.75% [اغروس] في الموقع.
    1. إعداد [اغروس] 0.75% في برنامج تلفزيوني وإبقائه صلبا في 50 درجة مئوية في حرارية-شاكر حتى الاستخدام. إزالة الغدد اللعابية للماوس وقص العضلات ستيرنوهيويد وفضح القصبة الهوائية بانزلاق ملقط تحتها.
    2. نقط القصبة الهوائية المكشوفة بإبرة 30 جرام واستبدله قسطرة 30 جرام حادة منع المزيد من الضرر من القصبة الهوائية أسفر عن تسرب غير مرغوب فيها من [اغروس]. إغلاق مفترق الطرق بين القسطرة المدرج والقصبة الهوائية باستخدام حامل إبرة.
      الاختياري: تجمع هنا وصف الإجراء مع مجموعة ال لتحليل الخلايا البشرية تسلل في البال مؤخرا ووصف بالتفصيل31 (انظر الشكل 2ه لنتائج تمثيلية).
    3. شغل بعناية الخطوط الجوية مع [اغروس] 0.75% (تبريده إلى درجة حرارة الجسم) عن طريق القسطرة حتى تتكشف كاملة في الرئة؛ الانتظار حتى التجميد الكامل [اغروس]. إزالة القسطرة والحصاد بعناية في الرئة في أنبوب 2 مل مظلمة مليئة بنسبة 4 في المائة منهاج عمل بيجين.
  5. لتثبيت إضافية احتضان العينة في 4% حل منهاج العمل في برنامج تلفزيوني عن ح 2 في 4 درجات مئوية تحت التناوب المستمر (31 لفة في الدقيقة).
  6. يذوي الأنسجة التي تفرخ العينة تحت التناوب المستمر (31 لفة في الدقيقة) في وقت لاحق في 4 درجات مئوية في الإيثانول 50% (pH 9)، 70% إيثانول (pH 9) والإيثانول 100%؛ كل خطوة على الأقل 4 ح. في النهاية، أداء حضانة ثانية في الإيثانول 100% جديدة ح 4.
  7. إجراء المقاصة على أساس مذيب الأنسجة استخدام إيثيل سينامات (ECi). لذلك، نقل العينة إلى القياسي. تبني بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (في إطار التناوب المستمر) حتى تظهر الأنسجة شفافة (انظر الشكل 1د للصور التمثيلية).
    ملاحظة: العينات المخزنة في القياسي في درجة حرارة الغرفة (محمية من الضوء) مستقرة على مدى عدة أسابيع إلى شهور.

5-تنفيذ الورقة الضوء الفلورية مجهرية من فصوص الرئة الفاري فولي

ملاحظة: يرجى الاطلاع على الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل في المجهر ورقة الضوء الفلورية وبرنامج المقابلة، التي تستند إليها الخطوات التالية. أنظمة قابلة للمقارنة بغيرها من الشركات المصنعة، ولكن يمكن استخدامها كذلك مع التعديلات الخاصة بالمطور للبروتوكول التالي. قبل البدء، الحصول على دراية بدليل التشغيل الخاصة بالمجهر واتبع التعليمات التقنية بالشخص المسؤول عن الموقع.

  1. إعداد المجهر ورقة الضوء.
    1. قم بتشغيل المجهر الورقة الضوء وفتح المناظرة التصوير البرمجيات على جهاز الكمبيوتر. ملء نموذج الدائرة مع القياسي الذي تم تصفيته (تصفية 100 ميكرومتر) ووضعه في موضعه بين أشعة الليزر.
    2. استخدم قطره صغيرة من الغراء مستقرة المذيبات العضوية لعصا في الرئة لصاحب العينة. للاحتفاظ بعمق الاختراق المطلوب للضوء-الأوراق صغيرة بقدر الإمكان، بتعيين الفص الرئة منتصبة. بعد ذلك، وضع صاحب العينة في دائرتها.
    3. تعيين الانكسار الهدف إلى 3.5 عند استخدام القياسي كمسح كاشف.
  2. ضبط إعدادات في المجهر ورقة الضوء للكشف عن الخلايا البشرية في سياق الجهاز كله.
    1. حدد المطلوب من أشعة الليزر (عامل تصفية لقياس > تنشيط خانات الاختيار المطلوبة الليزر) واختر كثافات مناسبة في برامج التحكم (ليزر لمراقبة انتقال > استخدام مربع التمرير لتعيين بالليزر كثافة > تطبيق). استخدام إثارة الطول موجي 488 نانومتر (525/50 فلتر) للكشف عن أنسجة الرئة أوتوفلوريسسينت و 640 نانومتر (680/30 فلتر) لإثارة الخلايا البشرية المسمى مع fluorophore تلويثاً في الطيف الأحمر.
    2. التركيز على عينة متحمس في 488 نانومتر والتكيف مع التركيز عن طريق أداة 'تصحيح لوني' في الطول الموجي الإثارة من 640 نانومتر (استخدام مربع التمرير لتعيين تصحيح لوني > تطبيق).
    3. اختر عامل تكبير مناسبة؛ استخدام نظرة تكبير منخفض (مثلاً، 6.3 x) لتحديد التوزيع العام للخلايا المسماة داخل أنسجة الرئة وصور مكبرة (مثلاً، 32 س) للتعريب مفصلة.
    4. حدد عرض ورقة موحدة توضيح الجهاز كامل أو مقطع معين من الفائدة (البصريات > استخدم شريط التمرير لتعيين عرض ورقة؛ وعادة ما بين 20-40%). تحدد الفتحة العددية ورقة (غ) مع نا أعلى خلق الصور أكثر وضوحاً (البصريات > استخدم شريط التمرير لتعيين NA ورقة؛ فص الرئة مورين توسيع حجمه الفسيولوجية يمكن غالباً استخدام نا 0.025%).
    5. حدد عدد الأوراق الضوء لاستخدامها تحت 'إعدادات قياس متقدمة'. في حالة الإضاءة ثنائي الاتجاه، دمج أوراق الضوء على اليسار واليمين لخلق صورة مضيئة المتجانس (متقدمة > دمج لايتشيتس > تحديد مزيج وضع > استخدام مربعات التمرير لتحديد التداخل بين كلا الضوء-أوراق).
      ملاحظة: من المستحسن للاستفادة من الإضاءة ثنائي الاتجاه للعينة مع ثلاثة الضوء-أوراق كل.
      الاختياري: لزيادة جودة الصورة، استخدم عملية التركيز الحيوي. وهذا يسمح لنقل التركيز في اتجاه x أثناء الحصول على الصور.
    6. تحديد بداية ونهاية مواقف z-المكدس قياسها وتعيين حجم الخطوة إلى 5 ميكرومتر (xyz-الجدول Z > مسح مجموعة).
      ملاحظة: مواقع بداية ونهاية z-مكدس تعتمد على الحجم والموضع للفص الرئة داخل الدائرة بعينه. ومع ذلك، تكتسب حوالي 300 إلى 800 z-مداخن عادة فص الرئة واحد (5 حجم الخطوة ميكرومتر).
    7. حفظ الملفات باستخدام 'إعدادات الحفظ التلقائي' وبدء القياس لالتقاط الصور. بعد الانتهاء من الحصول على البيانات، تنظيف حامل العينات الملوثة القياسي وغرفة تحت الماء الجاري.
      ملاحظة: استخدام نفس إعدادات الصورة في عدة فصوص الرئة التي من المفترض أن تكون المقارنة بعد ذلك.

6-الصورة بعد المعالجة، والتقدير الكمي للخلايا البشرية المتراكمة الرئة

ملاحظة: الرجاء مراجعة الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل عن البرنامج بعد انتهاء التصوير لتحليل ثلاثي الأبعاد، الذي تستند إليه الخطوات التالية. ومع ذلك، يمكن استخدام بديل ما بعد التصوير البرمجيات كذلك.

  1. تحميل الصورة الأولى من كدسة z (تنشيط الزر تفوق، ملف > فتح > حدد الصورة) من أجل الشروع في فتح جميع الصور الأخرى المختارة z-المكدس وإعمارها 3D التلقائي.
  2. لضمان العرض الصحيح ل x، تحقق من أحجام فوكسل أبعاد y و z، وتعديلها إذا لزم الأمر (تحرير > صورة خصائص > يدوياً بإدخال حجم فوكسل). لحجم فوكسل z، قم بإدخال الحجم-الخطوة المختارة بين صورتين (هنا 5 ميكرومتر).
  3. عرض كل قناة بلون مميزة (تحرير > إظهار تعديل عرض). انقر على كل قناة واحدة تلو الأخرى لتحديد لون للاختيار (في الشكل 2أ، ب، ج، د إشارة أوتوفلوريسسينسي هو عرض في الرمادي والمسمى البشرية CD4 الخلايا+ باللون الأحمر).
  4. ضبط كثافة ومستوى الأسود والتباين لكل قناة (تحرير > إظهار عرض التعديل) باستخدام المثلثات في الحانات القناة أو إدخال الأرقام المحدد في إعدادات القناة. لضبط كثافة، استخدم ضلعي مثلث قائم الزاوية. لتعديل مستوى الأسود، استخدام المثلث الأيسر وتعديل التباين، استخدام المثلث الأوسط.
    ملاحظة: استخدام الرئة المستمدة من الماوس التحكم دون نقل الخلية (الخطوة 3، 3) للتمييز بين إشارات المستمدة من الخلايا البشرية المحددة والخلفية غير محدد.
  5. لقياس استخدام الخلايا المسماة داخل أنسجة الرئة 'إضافة بؤر جديدة' في شريط الأدوات، وحدد 'تخطي الإنشاء التلقائي، تحرير يدوياً' للعد اليدوي الخلية.
    ملاحظة:     بدلاً من ذلك، استخدام الخلية التلقائي عد أداة تحت 'النقاط'. ومع ذلك، العد اليدوي يسمح بالتفريق بين إشارات محددة وغير محدد أكثر دقة.
    1. لمقارنة تراكم الخلايا البشرية عبر عينات مختلفة، قم بتعريف مكعب الرئة مع وحدة تخزين محددة باستخدام أداة القطع ثلاثية الأبعاد (تحرير > المحاصيل 3D) (هنا 813 ميكرو x 813 ميكرو x 1,000 ميكرومتر).
    2. عد الخلايا المتراكمة حدد القناة 640 nm وتحديد 'نطاق دائرة نصف قطرها' من 10 ميكرون. ثم، انقر فوق 'تحرير'، والتحقق من 'تحديد' في قائمة مؤشر ووضع علامة على كل خلية مع نقطة عن طريق التحول-انقر بزر الماوس الأيمن. البحث عن العدد الإجمالي للخلايا التي تم جردها المعروضة في الإحصاءات.
      ملاحظة: يوصي بشدة لعد عدة مكعبات كل الفص الرئة (خمسة هنا) للتأكد من موثوقية النتائج وتعويض عالم تعتمد على اختيار حجم الرئة معدود (نتائج استراتيجية والممثل الكمي هي صورت في الشكل 2D).
  6. التقاط صورة باستخدام أداة 'اللقطة' و/أو أخذ فيديو باستخدام الأداة 'الحركة'. احفظ تعديل الملفات كملفات.ims (ملف > تصدير).
    ملاحظة: لأغراض التمثيلية، إظهار أو إخفاء الإطار بالتحقق من أو إلغاء تحديد الإطار في شريط الأدوات. وباﻹضافة إلى ذلك، عرض الصور أما بالإسقاط الكثافة القصوى (MIP) (شريط الأدوات > حجم > وضع > التحقق من خطة التأمين الطبي) أو استخدام 'وضع السطح' (شريط الأدوات > إضافة أسطح جديدة). وقد وضع السطح لتفعيلها بشكل منفصل لكل قناة لتسليط الضوء على هندسة الأنسجة و/أو الهيئات الخلية (الصور التمثيلية تظهر في الشكل 2ج).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البروتوكول قدم وصف لنموذج ماوس تجريبية، والذي يسمح برصد وقياس تراكم أدوبتيفيلي المنقولة لمفاوية T البشرية في الرئة عن طريق المجهري الفلورية الضوء-ورقة. الشكل 1 A لمحة تخطيطي الخطوات المجراة في الجدول الزمني التجريبي. من أجل ضمان نتائج موثوقة، أنها ذات أهمية كبيرة لضمان نوعية جيدة من عزلة وفلوريسسينتلي المسماة CD4 البشرية+ تي الخلايا التي ستنقل بعد ذلك في الفئران. كما يصور بالإسم في الشكل 1ب، ج، والإجراء الموصوفة أعلاه لتخصيب خلية على أساس ميكروبيد واللاحقة fluorescence العلامات عادة تحديد النتائج في سيتوميتريكالي تدفق CD4+ نقاء خلية T > 95% ونجاح وضع العلامات الفلورية من خلايا CD4 جميع+ تي الخلايا. الجودة واختراق عمق الفلورية الضوء-ورقة الفحص المجهري نقديا يعتمد على الصف مناسب لإزالة الأنسجة. كما هو موضح في الشكل 1د، البروتوكول المطبق هنا للنسيج المستندة إلى رقم قياسي لتكلفة تطهير كانت قادرة على ضمان مستوى عال من الشفافية الجهاز، تشير إلى مطابقة الانكسار ناجحة. أخيرا، ونتيجة العام ممثل للبروتوكول التجريبي المبين في شكل صور مجهرية المجهزة تماما ورقة الضوء الفلورية يتجلى في الشكل 2ب، ج، د و الفيديو التكميلية. إشارة أوتوفلوريسسينت (عرض باللون الرمادي) يوفر أداة مفيدة لتصوير هيكل التشريحية في الرئة. المتراكمة الرئة يمثل إشارة حمراء CD4 البشرية+ تي الخلايا. التحديد الكمي للتصوير المجهري الفلورية الضوء-ورقة يسمح تحديد مجمل تراكم عدد من الرئة البشرية CD4 الخلايا+ تي في منطقة محددة من أنسجة الرئة الملتهبة. استراتيجية للتحديد الكمي لتسلل خلية بشرية تتجلى في الشكل 2ه. كشف سيتوميتريك تدفق (اختياري) المسمى فلوريسسينتلي الخلايا داخل بال الفئران المستفيدة، كما هو مبين في الشكل 2و، يمكن استخدامها كتقنية تكميلية من أجل تأكيد هجرة الأنسجة ناجحة أدوبتيفيلي نقل خلايا CD4+ تي الخلايا. وعلاوة على ذلك، نقل الخلايا البشرية لتراكم انتقائيا في أنسجة الرئة الملتهبة في هنا وصف الإعداد التجريبية أنه يفضل مواصلة دعم من الحقيقة أن البشرية CD4+ ر لا يمكن استرجاع الخلايا في مخاطية الأمعاء من المستفيد من الحيوانات كما يصور في الشكل 2ب (اللوحة اليمنى).

Figure 1
الشكل 1 : نظرة عامة التخطيطي لسير العمل التجريبية المجراة في. (أ) التهاب الرئة التحسسي حملت في الفئران C57BL/6J باستنشاق غراء (50 ميكروغرام/الماوس) في ثلاثة أيام متتالية (d0, d1 و d2). اليوم التالي (d3)، طازجة معزولة والمسمى فلوريسسينتلي CD4 البشرية+ تي أدوبتيفيلي نقل الخلايا في الفئران عن طريق حقن الوريد الذيل. وبعد ثلاث ساعات أخرى، ضحى الفئران، تليها التروية في الموقع والتثبيت من الرئتين. وأخيراً، كانت اكسبلانتيد الرئتين وكذلك تحليل السابقين فيفو بالأسفار الضوء-ورقة الفحص المجهري. بشكل اختياري، يمكن جمعها بال قبل اكسبلانتيشن الرئة القيام بتوسيع السابقين فيفو تحليلات للخلايا البشرية اكسترافاساتيد والتي تم ترحيلها بنجاح. الرسم البياني الممثل (ب) يؤكد نقاء CD4 المعزولة+ الكسر خلية T كما يحددها التدفق الخلوي. يتم عرض الخلايا الملون السيطرة جسم أو ايستب CD4 المضادة الإنسان الأسود والرمادي، على التوالي. (ج) الممثل يؤكد نجاعة fluorescence التسمية للبشرية CD4 الرسم البياني+ الخلايا قبل نقل التبني. (د) صور الممثل للفص الرئة موريني perfused قبل وبعد تطهير مع القياسي. فأي، شدة الأسفار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تحليل الممثل لتراكم الرئة البشرية CD4 الخلايا+ في سياق التهاب الرئة المجراة في. خلايا CD4 البشرية+ الخلايا كانت معزولة من الدم الطرفية استخدام الكثافة تليها الطرد المركزي التدرج خطوة تنقية مغناطيسي على أساس ميكروبيد. خلايا CD4 البشرية+ الخلايا المسماة باستخدام صبغة انتشار الضوء الأحمر منفعل خلية وحقن الوريد في الفئران المعرضة غراء C57BL/6J. وبعد ثلاث ساعات، ضحى الفئران لجمع وتحليل أنسجة الرئة عن طريق المجهري الفلورية الضوء-ورقة أخرى. (أ) نظرة عامة ممثل التعمير 3D أنسجة الرئة مورين، يتعرض غراء (رمادي) ثلاث ساعات بعد الحقن الوريدي من خلايا CD4 البشرية المسمى+ خلايا مجهرية (الأحمر) كما هو مسجل بالورقة الضوء الفلورية. (ب) أنسجة الرئة بالماوس المتلقي ثلاث ساعات بعد نقل الخلية سيظهر كنظرة عامة أو تضخم عالية الجزء (اللوحة اليمنى). استرداد CD4 البشرية+ يمكن تصور الخلايا كإشارات حمراء وكانت أما صورت في تراكب مع إشارة أوتوفلوريسسينسي لانسجة الرئة أو كصورة قناة واحدة. من أجل تأكيد الطابع الخاص للكشف عن إشارة، كأنسجة الرئة التحكم دون نقل الخلية عن طريق الحقن الوريدي المراقبة السلبية (الفريق الأوسط). وعلى النقيض من أنسجة الرئة، لا خلايا CD4 البشرية المسمى+ يمكن أن يتم الكشف عن الخلايا (أحمر) في الدقاق الماوس المتلقي نفسه (اللوحة اليمنى). (ج) وظيفة معالجة الصور يتيح تحليل شرائح مفردة من أنسجة الرئة، فضلا عن جيل من إعادة البناء ثلاثي الأبعاد للجزء المتعلق بالجهاز كله أن يمكن أن تكون أما ممثلة الإسقاط الكثافة القصوى (MIP) أو في وضع السطح. يصور الصور التمثيلية. (د) القياس الكمي تتضح استراتيجية القبض في نفس الرئة كما سبق صورت في الشكل 2أ. اختيرت مكعبات المحددة للجزء المتعلق بتحليل الرئة وعدد خلايا CD4 البشرية+ الخلايا (أحمر) وكان كمياً لكل مكعب. ترد نتائج تحديد كمي المؤداة في وقت لاحق (المكعب ميكرومتر µm x 1,000 مكم x 813 الأحداث/813) كمتوسط ± sem. (ه) كخيار إضافي، يمكن أن يكون تدفق سيتوميتريك الكشف عن الخلايا البشرية المسمى فلوريسسينتلي في البال الحيوانات المستفيدة إجراء من أجل تأكيد الهجرة الناجحة الأنسجة من خلايا CD4 البشرية المتراكمة+ تي الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Video
فيديو التكميلية: إظهار تسلسل الفيديو التمثيلي المتراكمة CD4 البشرية+ الخلايا داخل أنسجة الرئة مورين. التعمير 3D عرض الرئة موريني المتراكمة CD4 البشرية+ الخلايا (أحمر) في سياق النسيج الرئوي (رمادي) ثلاث ساعات بعد الحقن الوريد الذيل. تظهر الصور كخطة التأمين الطبي في البداية وفي وضع السطح في نهاية المطاف. المكتسبة عن طريق المجهري الفلورية الضوء-ورقة الصور ومعالجتها بواسطة برنامج التصوير بعد لتحليل ثلاثي الأبعاد. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الإعداد التجريبية الموصوفة هنا يوفر الفرصة لرصد قدرة الرئة صاروخ موجه من الخلايا المناعية البشرية الأولية المجراة في ظروف التحريضية، ومما الناقوس يكمل كلاسيكي التصاق في الأنابيب وانزيمية فحوصات. على أن تراعي الهيئة التشريحية محددة الخصائص في الرئة، جوانب هامة من الخلايا المناعية صاروخ موجه (بما في ذلك توزيع إنزيمية وخلية داخل الجهاز الهدف) فضلا عن أهميتها السريرية وإمكانية نقل البيانات المكتسبة، اتخذنا استفادة ميزات الرئيسية التقنية الثلاثة: (1) تحليل الخلايا البشرية الأولية داخل حي مورين؛ (2) التعريفي غراء بوساطة من الالتهاب الرئوي؛ ومجهرية الفلورية الضوء ورقة (3) أنسجة الرئة المطهرة.

على الرغم من أن الدراسات الفنية لنقل أدوبتيفيلي البشرية الخلايا المناعية داخل حي مورين قد تكون محدودة في بعض الجوانب بسبب عدم التوافق المحتملة ذات الصلة في مستقبلات-يجند-التفاعلات بين الفئران والرجال، والمفهوم العام نماذج الماوس أنسنة قد أنشئت بنجاح كأداة تجريبية هامة في مجال الطب متعدية الجنسيات خلال آخر العقود24،32،،من3334،35 . بالمقارنة مع نماذج حيوانية الكلاسيكية، دراسات في الفئران أنسنة توفر ميزة لتحليل الخلايا المناعية المستمدة من المريض في سيناريو المجراة في مباشرة ومن ثم تحديد التعديلات الفنية مطبوع ب مرض معين32، ،من 3637. فيما يتعلق بأهمية عدم التطابقات المحتملة بين تعريف مستقبلات على سطح الخلايا المناعية البشرية وعلى يغاندس مورين كل منها أو العكس بالعكس، بينت الدراسات السابقة فعلا أن الإنسان CD4+ تي تكون قادرة على التفاعل كفاءة الخلايا مع جزيئات الالتصاق مورين مادكام-1 VCAM-1، التي تمثل يغاندس حاسمة ل صاروخ موجه بوساطة إنتغرين اللمفاويات32. تبعاً لذلك، هجرة خلايا المناعية البشرية إينترافاسكولارلي المحولة إلى أنسجة القناة الهضمية مورين يمكن بنجاح أن سدت المجراة في المعاملة مع α4β7 المستخدمة سريرياً إنتغرين جسم فيدوليزوماب32. ومع ذلك، حتى في حالة أن وجود مستقبلات-يجند-تفاعل محددة ذات صلة قد تبين عدم تطابق الإنسان/الفاري كاملة، يفترض أن الممكن للتغلب على هذا القيد بالهندسة الوراثية، وعلى سبيل المثال، overexpression المعدلة وراثيا يجند كل البشرية، وعامل النمو، سيتوكين أو مستقبلات داخل الكائن الحي مورين33،35.

كتأثير كبير من التهاب مزمن في إفراز المستقطبات المحلية، لقد وصفت غشائي التعبير عن جزيئات التصاق وتراكم الخلايا الليمفاوية اللاحقة في عدة منشورات38،39 ،40، اختيار نموذج تجريبي مناسب لالتهاب رئوي تمثل خطوة حاسمة حين إنشاء وصف البروتوكول أعلاه وقد يكون تكييفه اعتماداً على سياق السريرية لكل دراسة فردية. الإعداد المحدد هنا لالتهاب الرئة التحسسي الناجم عن غراء يمثل نموذج تجريبي وصف جيدا، الذي يستند إلى قدرة غراء حوزتي سيستين التي تدار محلياً لتهيج مجرى الهواء ظهارة والزناد الإصدار التالي من الارمينس27،،من4142. من المثير للاهتمام، هو معروف المعرض العرضي غراء تسبب الربو التنمية في البشر ك جيدا43. اعتماداً على الجرعة المستنشقة من غراء، تظهر الفئران المعرضة تراكم الخلايا المناعية الفطرية وقابلة للتكيف، ومستويات مرتفعة من النوع 2 السيتوكينات في الرئة27. بينما تصاعد الجرعات تبين النتيجة في توسيع أجوائها (ظاهرة النسيجي الكلاسيكية لهذا المرض) وتدمير جدران الأوعية الدموية مع نزف اللاحقة، معتدلة الجرعات جداول ذهب جنبا إلى جنب مع فرط رئوي بارزة وهكذا تحاكي سمة نسيجية هامة من الربو البشرية27. كما لدينا يهدف إلى استخدام هذا النموذج التجريبي لإنشاء إطار تحريضية لتحليل الخلايا المناعية الرئوية صاروخ موجه، حاولنا بعناية لتجنب الأضرار التي يسببها غراء من الأوعية الدموية، مما قد يؤدي إلى خلاف ذلك في أونفيسيولوجيكال التسرب خلايا المناعية البشرية بسبب النزاهة غشائي الانزعاج. وبناء على ذلك، اخترنا جرعة متوسطة من 50 ميكروغرام من غراء كل الماوس يوميا في البروتوكول هو موضح أعلاه. على الرغم من أن وضع غراء الناجم عن التهاب مجرى الهواء كما يحدث في حالة عدم وجود ب والمعروف اللمفاويات T، الرئة التسلل إلى الخلايا المناعية التكيفية تؤثر تأثيراً كبيرا على مسار المرض27،42. على سبيل المثال، يمكن اعتبارها خلايا تي تنظيمية قوية المنظمين لمجرى الهواء الناجم عن غراء فرط27. في المنظور، المشاركة النشطة للخلايا اللمفية الرئوية في أمراض التهابات الفئران المعرضة غراء تورط أن البروتوكول هو موضح أعلاه قد تمكن بالإضافة إلى ذلك تحليل القدرة الوظيفية لنقل أدوبتيفيلي و المتراكمة بنجاح على الرئة البشرية الخلايا المناعية تعدل أمراض الرئة (مثلاً، عن طريق اقتناء سيتوميتريك تدفق من التهم اليوزيني في بال). وعلاوة على ذلك، قد تسمح إدارة المحدد المستقطبات البشرية ذات الصلة بالمرض قبل نقل الخلية داخل الأوعية داخل الآنف بالإضافة إلى ذلك يقوم لتحليل تأثير هذه الوسطاء خلطيه على عملية الرئة صاروخ موجه للإنسان المتميزة الخلايا المناعية والسكان في أجواء المجراة. وبالمثل، يمكن دراسة تأثير مثبطات على عملية صاروخ موجه الرئة، وفي وقت لاحق، في أمراض التهاب الرئة.

ميزة خاصة للإجراء التجريبي أدخل هنا هو تتبع دقيق والتعريب من الرئة التسلل إلى الخلايا المناعية البشرية بنوعية التصوير الراقية الفلورية الضوء-ورقة الفحص المجهري. أثبتت الدراسات الحديثة أن تقنية مجهرية الفلورية الضوء-ورقة تمثل أداة قيمة تجريبية لتحليل الخلية المناعية المعوية صاروخ موجه في البحوث بنك التنمية بين الأمريكتين متعدية الجنسيات وقادرة على التغلب على القيود الرئيسية الفلورة التقليدية مجهرية والتدفق الخلوي24،32. بينما تحليلات تستند إلى الفحص المجهري التقليدي وتقتصر عادة على صغيرة جداً ومنطقة يحتمل أن تكون غير ممثلة لقياس التدفق والجهاز لا تأخذ في الاعتبار الجانب المتعلق بتنظيم الأنسجة على الإطلاق، ورقة الضوء الفلورية الفحص المجهري الأنسجة المطهرة كيميائيا يتيح عمق زيادة تغلغل دون خسارة كبيرة للقرار وهكذا يمكن إعمار أقسام كبيرة بدلاً من الجهاز بشكل ثلاثي الأبعاد (ما يصل إلى 1.5 سم × 1.5 سم)24،،من2844. بالتأكيد، نوعية وصحة المكتسبة من عمليات إعادة البناء ثلاثي الأبعاد خطيرة تعتمد على أداء إزالة الأنسجة. في الإعداد هو موضح هنا، قمنا بتضمين نسخة قليلاً اعتمد بروتوكول نشر مؤخرا للنسيج المستندة إلى رقم قياسي لتكلفة التخليص44. مقارنة بغيرها من استراتيجيات راسخة للنسيج المستندة إلى المذيبات المقاصة26،45،46، البروتوكول القياسي القائم يجمع بين مزايا خصائص مركز ممتاز، سمية منخفضة لاستخدامها الكواشف وشرط وقت معتدل44. كقدرة مجهرية القياسية ورقة الضوء الفلورية حل أفضل الهياكل الأنسجة مثل التهاب الشعيرات الدموية لا تزال محدودة حتى تحت الأمثل تطهير28من الشروط، قد على نحو ما يكون من الصعب التفريق موثوق بها بين الخلايا المناعية داخل الأوعية والفعل اكسترافاساتيد. إدراج إضافية القياسية المستندة إلى الأسفار الدم سفينة تلطيخ في البروتوكول هو موضح هنا سيكون على الأرجح غير قادرة تماما على التغلب على هذا القيد. وهكذا، دراسات مع تركيز بوجه خاص على سلوك الخلايا المناعية داخل دوران الأوعية الدقيقة الرئوية أو على ديابيديسيس قد تفضيلي تأخذ في الاعتبار بروتوكول نشر مؤخرا وأنيقة جداً لتصوير الرئة إينترافيتال استناداً إلى 2-فوتون 47من الفحص المجهري. في هذا الإعداد التجريبية، تم زرع نافذة الصدر في الفئران تخديره والتهوية، يمكن من خلالها رصد الرئة استقرت قبل رنانة مسح وحدة الفحص المجهري 2-فوتون، مما يسمح الاستبانة التصوير في جميع أنحاء دورة الجهاز التنفسي عند الحفاظ على التهوية والتروية47،من48. هذا الأسلوب قد طبق بنجاح في مختلف الدراسات، وكان قادراً على تصور مثلاً نشوء حيوي الصفيحات الخزعات ومدخل الرئة تعميم ورم الخلايا49،50. ومع ذلك، إلى جانب اشتراط معدات متطورة مفيدة (مثل نظام التهوية الماوس) والحاجة إلى التلاعب الغازية واسعة النطاق في الحيوانات الحية (غرس نافذة الصدري والفحص المجهري إينترافيتال)، إلى القيد الرئيسي هذه الرئة الحية هو نظام الفحص المجهري اختراق محور ع المحصورة. فقط يسمح تصوير سطح الرئة أجرى تحليل ميكرومتر 100 الخارجي تحت الجنبة أنسجة الرئة47،48. تعتمد على السياق العلمي، قد يكون خيار قيمة لتنفيذ الفحص المجهري 2-فوتون في الرئتين اكسبلانتيد كإجراء إضافي في البروتوكول هو موضح أعلاه. تحليل الرئة نفسها أولاً 2-فوتون الفحص المجهري، وبعد ذلك الفلورية الضوء-ورقة الفحص المجهري قد تمثل استراتيجية للحصول على نظرة كمية التوزيع والترجمة للخلايا المناعية البشرية داخل (الرئة مورين ورقة الضوء الفلورية مجهرية)، وفي الوقت نفسه، كسب أفكاراً أكثر تفصيلاً في العمليات الخلوية أو ميكروفاسكولار (2-فوتون مجهرية). وفي الواقع، يمثل مجهرية 2-فوتون من مورين explants الرغامى أداة التقاط صور ثابتة لتحليل سلوك الخلايا المناعية في سياق التهاب الرئة المستحثة تجريبيا51،52. بدلاً من تصور الشعيرات الدموية الرئوية الصغيرة، يمكن أن يثبت أيضا تسلل أنسجة الرئة والتسرب ناجحة الخلايا تي البشرية المنقولة في نموذجنا التجريبي عن طريق الكشف عن الخلايا البشرية المسمى فلوريسسينتلي داخل بال المستلم الحيوانات عن طريق التدفق الخلوي القبض هو مبين في الشكل 2ه. وبصفة عامة، تمثل تحليلات لحجرة BAL الخلوية وسيلة راسخة لتحديد خصائص تدفق الخلايا المناعية الرئوية في سياق أمراض الجهاز التنفسي التهابات31. أخيرا، وصفت بالبندقية et al. (2005)53 تدفق سيتوميتريك استراتيجية أخرى للتحديد الكمي للتسرب الخلايا المناعية أدوبتيفيلي المنقولة داخل أنسجة الرئة ويمكن أن يحتمل أن تكون جنبا إلى جنب مع البروتوكول هو موضح هنا. في هذه الدراسة بالبندقية وآخرون، نقل حقن واحد من جسم CD8 المضادة مترافق الأسفار قبل وقت قصير أدت إلى استئصال الرئة الكامل والحصري وسم من قبل CD8+ تي الخلايا داخل الرئة حجرة الأوعية الدموية، بينما CD8 الفعل اكسترافاساتيد+ تي الخلايا داخل إينتيرستيتيوم الرئة وظل أونستينيد. وكانت التحليلات اللاحقة للخلايا المناعية الرئة المسمى المجراة في سيتوميتريكالي تدفق المؤداة بعد السابقين فيفو هضم أنسجة الرئة53. وبطبيعة الحال، عملية الهضم الأنسجة يعني أن يتم إلغاؤها فصل التشريحية بين داخلها وحجرة الرئة اكسترافاسكولار، وهكذا، هناك خطر عام لوضع العلامات إيجابية كاذبة من خلالي الخلايا المناعية بسبب تسرب جسم بين كل الأقسام. هذا الخطر يمكن فقط تقليل أداء هضم الأنسجة حضور تشبع كميات من الأجسام المضادة غير مسمى53 ، أو محتملة، بالاستعاضة عن تحليل تدفق سيتوميتريك بالفحص المجهري fluorescence ورقة الضوء، مما يجعل من الممكن لتجنب تدمير بنية الأنسجة تماما.

في ملخص، عرض هنا مزيج من المجراة في استضافة أكثر من الخلايا المناعية الأولية المسماة فلوريسسينتلي واللاحقة ورقة الضوء الفلورية مجهرية قادرة على تحديد موثوق بها وقياسها كمياً وتعريب الرئة تراكم الخلايا المناعية البشرية في نموذج تجريبي الماوس من التهاب رئوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

م. ف. نورث بمثابة مستشار بنتاكس، جولياني، MSD، أبفيي، يانسن، تأكيدا وبورنغير. الكتاب المتبقية لا تكشف عن أي صراع.

Acknowledgments

امتنان يعترف الكتاب تمويل مراكز البحوث التعاونية DFG SFB 1181 و 241 تر. بصري تصوير المركز ارلنجن (OICE) وخاصة رالف بالميسانو وفيليب Tripal وتينا Fraaß (Z2 المشروع من DFG CRC 1181) معترف بها لخبراء الدعم الفني للتصوير المجهري fluorescence الورقة الضوء.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose NEEO Ultra Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody BioLegend, San Diego, USA 304060
Ammonium chloride Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany K2981
Cannula 21 G Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 301300
Cell proliferation dye eflour670 eBioscience Inc., San Diego, USA 65-0840-85
CD4 MicroBeads, human Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 21066001
Ethly cinnamate (ECi) Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany 112372-100G
Ethanol ≥ 99.5% (EtOH) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany P40-47500
Filter 100 µm  VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany 732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 Bitplane AG, Zurich, Switzerland n.a.
ImspectorPro software Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany n.a.
Ketamin  Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany 3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany n.a.
MACS MultiStand Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-303
Multifly cannula 20 G Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 851638035
30 G needle B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9161502
Neubauer counting chamber neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany C-1003
Pattex Glue Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany PSK1C
LS column Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL) anprotec AC-AF-0018
Papain Merck 1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) Biochrom GmbH, Berlin, Germany L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 BioLegend, San Diego, USA 317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl BioLegend, San Diego, USA 400337
PFA (paraformaldehyde) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 0335.1
Potassium hydrogen carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany P7481
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 86.1254.001 
Syringe 1 mL B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9166017V
Syringe 5 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260067
Syringe 20 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260069
Tube 1.5 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,706,400
Tube 2 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72.695.400 
Tube 2 mL, brown Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,695,001
Tube 15 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.554.502 
Tube 50 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.547.254 
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-090-976
Xylazin (Rompun 2%) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany KPOBD32

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14 (21), 2250-2256 (2007).
  3. Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1855-1869 (2013).
  4. Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179 (3), 1901-1912 (2007).
  5. Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254 (6), 564-571 (2003).
  6. Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190 (9), 4500-4507 (2013).
  7. Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79 (2), 149-153 (2001).
  8. Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112 (2), 108-115 (2014).
  9. Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42 (1), 38-48 (2012).
  10. Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182 (1), 623-635 (2009).
  11. Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70 (11), 1440-1449 (2015).
  12. Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171 (3), 767-776 (2007).
  13. Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35 (1), 26-33 (2005).
  14. Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69 (3), 268-274 (2009).
  15. Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166 (4), 2842-2848 (2001).
  16. Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9 (12), 114604 (2014).
  17. Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158 (5), 1703-1711 (2001).
  18. Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57 (12), 1054-1059 (2002).
  19. Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14 (9), 641-666 (2005).
  20. Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (5), 1257-1267 (2008).
  21. Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  22. Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186 (1), 174-182 (2011).
  23. Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8 (4), 373-378 (2002).
  24. Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153 (4), 898-900 (2017).
  25. Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. , (2018).
  26. Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382 (2014).
  27. Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43 (1), 175-186 (2015).
  28. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450 (2017).
  29. Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38 (2013).
  30. Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72 (6), 314-315 (2005).
  31. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398 (2017).
  32. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  33. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  34. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  35. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. , (2018).
  36. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707 (2017).
  37. Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18 (2), (2017).
  38. Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95 (10), 3032-3043 (2000).
  39. Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14 (12), 1715-1735 (2008).
  40. Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (4), 617-627 (2017).
  41. Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36 (3), 451-463 (2012).
  42. Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190 (9), 4489-4499 (2013).
  43. Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32 (4), 302-307 (1975).
  44. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  45. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  46. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  47. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  48. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
  49. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  50. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  51. Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15 (4), 410-416 (2009).
  52. Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10 (3), 0118513 (2015).
  53. Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).

Tags

الطب، 146 المسألة، الرئة صاروخ موجه، خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى، الفلورية الضوء-ورقة الفحص المجهري، والتهاب الرئة التحسسي، تصوير الأبعاد الثلاثة
المتقدمة التصوير من الرئة صاروخ موجه الخلايا الليمفاوية البشرية في التجريبية في نموذج فيفو للالتهاب التحسسي استناداً إلى ورقة الخفيفة الميكروسكوب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schulz-Kuhnt, A., Zundler, S.,… More

Schulz-Kuhnt, A., Zundler, S., Grüneboom, A., Neufert, C., Wirtz, S., Neurath, M. F., Atreya, I. Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59043, doi:10.3791/59043 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter