Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מדריך טיפול אנושי תא צורב הערמונית הראשי ולאחר מכן מציע נקודות קצה כדי להעריך פנוטיפ. זריעה, תרבות תחזוקה, התאוששות מטריקס ג'ל, כימות מורפולוגיות, הטבעה, חלוקתה, חלוקתה FFPE, כולה-הר מכתים, ויישום של מבחני מסחרי מתוארים.
Abstract
מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט תלת מימדי (3D) culturing, טיפול של הערכה של האדם organoids הערמונית העיקרי. התהליך כרוך זריעה של תאים אפיתל בדלילות בג'ל מטריקס תלת-ממד ב- microplate 96-ובכן עם שינויים מדיה לטפח הרחבה לתוך organoids. מורפולוגיה ואז מוערך על-ידי כל-טוב לכידתו של תמונות z-מחסנית. דחיסה של z-במחסן יוצר תמונה בפוקוס יחיד שממנו נמדדים organoids לכמת מגוון של פלטי, לרבות מעגליות, המעוגלות ואזור. ניתן לאסוף DNA, RNA, וחלבונים מן organoids התאוששה הג'ל מטריקס. תא אוכלוסיות עניין יכול להיות מוערך על ידי תא צורב דיסוציאציה, לזרום cytometry. פורמלין-קיבוע-פרפין-הטבעה (FFPE) ואחריו חלוקתה משמש עבור הערכה היסטולוגית ונוגדן מכתים. צביעת immunofluorescent כולה-הר משמר תא צורב מורפולוגיה ואסטמה ומקילה על תצפיות של חלבון לוקליזציה organoids בחיי עיר. מבחני מסחרי אשר משמשים באופן מסורתי עבור תאים חד שכבתי 2D יכול להיות שונה עבור organoids תלת-ממד. נעשה שימוש יחד, הטכניקות של פרוטוקול זה לספק ארגז כלים חזקים לכמת גידול הערמונית תא צורב, תכונות מורפולוגיות, ביטוי של סמני בידול.
Introduction
Organoids הם כלי חשוב ללמוד organogenesis ומחלות. הם מספקים אלטרנטיבה פחות יקר חייתיים, החולה, נגזר organoids מתפתחים כאסטרטגיה רפואה אישית1,2,3. מערכת תלת-מימדי (3D) תרבות זו כרוכה זריעת תאי גזע או קדמון (שנקטפו רקמות או המושרה בתאי גזע pluripotent) לתוך ג'ל של מטריצה חוץ-תאית רכיבים (מטריצה ג'ל)4. התאים להתרבות, להבדיל, וכתוצאה מכך מבנים organotypic לסכם את ההיררכיה הסלולר ואת המורפולוגיה של איבר יחידה פונקציונלית של ריבית. Organoids כבר גדלו באמצעות תאים שמקורם במגוון של איברים, כולל את בלוטת הרוק הקיבה, המעי, הכבד, ערמונית, הריאות, המוח4. אמנם ישנם פרוטוקולים רבים המתארת בצעדים כדי להגדירך הערמונית organoids5,6, זה מאתגר למצוא שיטות מספיק מפורטת על איך להשיג נקודות קצה כמותית של organoids. מאמר זה מסכם את שיטות שפותחו עבור תאי הערמונית ראשי אדם ומפרט סדרה של נקודות קצה המוצע כדי להעריך את פנוטיפים תא צורב. טכניקות אלה עברו אופטימציה להצגה organoids הערמונית וייתכן החלים על תרבויות אחרות תא תלת-ממד.
תא צורב הערמונית תרבויות שהתגלו לאחרונה מודל ערך במבחנה חסר את המגבלות של טפט תרבויות באמצעות שנקבעו שורות תאים מונצח. שפירים אפיתל הערמונית וסרטן הערמונית הוא מאתגר דגם במבחנה באמצעות שורות תאים מונצח. מספר שורות תאים שפירים מוגבל, עברו כל שינוי עם oncogenes7. ראשי תאים אפיתל הערמונית monolayers לא להבדיל לתוך התאים luminal וחסרי קולטני אנדרוגן8. הרוב המכריע של שורות תאים סרטן הערמונית אין קולטני אנדרוגן פונקציונלי, מתווך משמעותית בתחילת המחלה, והמדינה חוסר שינויים גנטיים מפתח כי נמצאו גידולים החולה9. תא צורב הערמונית תרבויות ניתן לגדל בקלות מן שפירים אפיתל, הם בעלי ערך רב בלימוד מאפייני תא גזע, ובתאים, בידול ואפקטים של שינויים ניסיוני4,microenvironment5. סרטן הערמונית organoids ניתן לגדל כחלק בגישה רפואה דיוק דוגמנות מחלת המטופל והתגובה טיפולים10.
פרוטוקול זה נאסף מן הפרוטוקולים הקיימים המשתמשות סוגי תאים שונים, אבל זה הותאם כאן לשימוש בתאי הערמונית ראשי אדם. אוהב את המגבעת פרוטוקולים המתוארים על ידי סויירס, Clevers שן5,6 לתאר צמיחה, passaging, שדה בהיר הדמיה, הקפאה קריוגנית, ובידוד RNA ו- DNA של הערמונית עכבר ו- organoids האנושית. פרוטוקול כולה-הר משתנה מקונסטנס. et al. 11, מי כאשר משתמשים במערכת העיכול organoids אפיתל חיים הדמיה וקפואים, שעוות פרפין הטבעה. . Borten et al. 12 תיאר את הניתוח של השד, המעי הגס, סרטן המעי הגס מורפולוגיה תא צורב של שדה בהיר הדמיה. בנוסף, ריצ'רדס ואח. 13 לשימוש שיטה להערכת מורפולוגיות organoids הערמונית. לבסוף, Hu. et al. 14 תיאר שיטה של הערמונית הקפדה organoids לשקופית קאמרית לילה לפני ההכתמה immunofluorescent להתבונן תאים בודדים, פיזור של הספירות לניתוח cytometry זרימה.
המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים באופן מפורט השיטות טכנית מאתגר כמו פרוטוקול אחד, כולל תא זריעה; מטריקס ומדיה ג'ל תחזוקה; אוסף של תאים עבור cytometry זרימה; RNA DNA, חלבונים החילוץ; הערכת מורפולוגיות מניתוח בהיר-שדה z-מחסנית; הטבעה, עיבוד, חלוקתה עבור צביעת היסטולוגית; כל-הרכבה עבור מבחני בדיקה immunofluorescence או פלורסנט. הרלוונטיות ביולוגי ופרשנות של נקודות קצה שונים אלה משתנים בין הנבחנים נוגדנים המשמש לניתוח. דרך הניצול של פרוטוקול זה, המשתמשים צריך להרגיש מוכנים לבנות ניסוי עם ערכת כלים של נקודות קצה.
האדם העיקרי הערמונית (קדם) בתאי אפיתל הוקמו במעבדה על-ידי הפרוטוקול המתואר על-ידי15,Peehl16 ומתוחזק למספר מוגבל של מעברים (עד ארבעה) כפי שתואר לעיל17, אבל הם גם ולמשקאות מסחרי. Hepatocyte ללא סרום מבוסס מדיה6, המבוסס על KSFM13ו R-spondin ממוזגים-15 מדיה מתפרסמים כל כמו שיש בהצלחה המיוצר organoids. מבוסס על KSFM דורש את המספר הנמוך ביותר של תוספים, אז זה מתואר כאן.
Protocol
להלן כללי התנהגות אופטימלי באמצעות ראשי הערמונית אפיתל תאי אדם מן הרקמה החולה ב אוניברסיטת אילינוי שיקגו בבית החולים. לכל רקמות אנושיות המשמש עבור ניסויים אלה היו שנרכשו דרך מוסדיים המנהלים שאושרו על-ידי פרוטוקול ו/או פטור ב אוניברסיטת אילינוי בשיקגו. בזמן התנאים תרבות ישתנו בהתאם לסוג התא עניין, ניתן ליישם את נקודות הקצה organoids של רקמות אחרות.
1. זריעת תאי אפיתל לתוך מטריצה ג'ל ושינוי מדיה
- לאסוף את החומרים הדרושים: האדם העיקרי הערמונית תאים אפיתל (מראש), מטריקס ג'ל על קרח, microplate 96-ובכן, תקין ללא סרום מדיה (KSFM) על קרח, פחם הפשיטו סרום שור עוברית (FBS) ולאחר דיהידרוטסטוסטרון (DHT).
- היכונו מדיה מבוססי KSFM תא צורב על ידי שילוב 47.5 מ של KSFM עם 2.5 מ של פחם FBS הפשיטו ואת דיהידרוטסטוסטרון (DHT) ריכוז סופי של 10 ננומטר DHT, אז המילואים על קרח.
- צלחת תאים לתוך מטריצה תלת-ממד בשכונה תרבות תא בטכניקה סטרילי.
- בעדינות קר תמהיל מדיה מבוססי KSFM תא צורב עם ג'ל מטריקס כקרח כדי לקבל מטריצה 50% ג'ל תערובת מאת לאט pipetting למעלה ולמטה, הימנעות בועות.
הערה: מטריקס ג'ל צריך להיות הקרת בן לילה ב 4 ° C, שמרה על קרח במידת האפשר. זה עפור במהירות בטמפרטורת החדר (RT). - טרום רטוב טיפ פיפטה תוך קר התקשורת והעברת 40 – 50 μL של מטריקס 50% ג'ל על גבי כל הבאר כדי לשמש על צלחת 96-ובכן. מעיל בתחתית הבאר כדי ליצור שכבת הבסיס.
הערה: לא מלא מדבקות/ברקודים אל התחנה השנייה על פיפטה, כמו זה יכול ליצור בועות. - למקם את הצלחת 96-ובכן חממה 37 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות שבמהלכו שכבת הבסיס.
הערה: לא לוחית רישוי לתאי האפיתל על גבי שכבת הבסיס עד זה התחזק, או תאים עשויים ליפול דרך המטריקס אל החלק התחתון של הלוח, ינבכ טפט. - מערבבים בתאי אפיתל מושעה בתקשורת מבוססת-KSFM תא צורב עם מטריקס ג'ל כדי להשיג ריכוז הסופי של μL תאים/100 100 – 1000 ו- 33% מטריקס ג'ל. תאים אפיתל צלחת על גבי בסיס שכבות באמצעות μL 100 של מטריקס 33% ג'ל תא תערובת לכל טוב.
הערה: ניסויים קודמים הראו כי זריעת תאי אפיתל גם בצפיפות ב- 3D להגביל את גודל תא צורב צמיחה, בעוד זריעה יכול לגרום גם בדלילות תשואה נמוכה מאוד13. חשוב למטב את התנאים זריעה עבור סוג התא של עניין, המבוסס על יעילות היווצרות תא צורב החולה הספציפי.
- בעדינות קר תמהיל מדיה מבוססי KSFM תא צורב עם ג'ל מטריקס כקרח כדי לקבל מטריצה 50% ג'ל תערובת מאת לאט pipetting למעלה ולמטה, הימנעות בועות.
- הכנס את הצלחת 96-ובכן חממה 37 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות לאפשר את הג'ל מטריקס לגבש, ואז בעדינות להוסיף 100 μL של מדיה מבוססי KSFM תא צורב על גבי תאים על-ידי pipetting לאט כנגד הקצה של הבאר.
- לשנות את המדיה כל 2-3 ימים. Pipetting כנגד הצד של הבאר עם רווח בין הג'ל מדיה, מטריקס, בזהירות להסיר את μL 50 של מדיה והחלף μL 50 של מדיה חדשה.
הערה: עבור תרבות לטווח ארוך, הג'ל מטריקס צריך להיות שונה כל 2-3 שבועות. אם התרבות ג'ל ' מטריקס ' מופיעה לא יציב ומציגה את הקמטים שקוף מתחת למיקרוסקופ, לאחר מכן הג'ל מטריקס התקלקלה, צריך להחליף.
2. אוסף של Organoids של מטריצה ג'ל
הערה: אוסף של organoids הוא הכרחי עבור מטריצה ג'ל שינויים, passaging או נקודות קצה של החילוץ-RNA, הפקת דנ א, חלבון החילוץ cytometry זרימה.
- חם neutral פרוטאז פרוטאז, הנקס מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) בתוך אמבט מים 37 º C.
- הסר בזהירות מדיה מבארות מבלי לשבש את פעולת הג'ל מטריקס.
- להוסיף ~ 200 μL של neutral פרוטאז פרוטאז מכל קידוח ב ~ 1:2 יחס של מטריקס ג'ל: נייטרלי פרוטאז דגירה כעשרים דקות ב 37 º C.
- מכנית מביצועם התערובת פרוטאז ג'ל: נייטרלי מטריקס על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
- תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 º C.
- להעביר את התערובת ג'ל-תא פרוטאז נייטרלי-מטריקס microcentrifuge צינור או צינור חרוטי, בהתאם לנפח. צנטריפוגה ב x 300 גרם למשך 3-5 דקות הצניפה תאים.
הערה: אם אין גלולה תא מופיע, הג'ל מטריקס עשוי לא להיות לגמרי הפומבית, להיות visualized בתור שלב שקוף בחלק התחתון של צינור שונה מזו תגובת שיקוע ורוד. להסיר את תגובת שיקוע, להוסיף פרוטאז ניטרלי יותר ביחס של 1:2 מטריקס בגדר ג'ל, תקופת דגירה של עוד 20-40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, וחזור צנטריפוגה ב x 300 גרם. - כאשר נרכש של גלולה תא צורב, להסיר את תגובת שיקוע. להמשיך עם passaging (ראה שלב 2.7.1), פירוק תא צורב לחילוץ RNA, דנ א או חלבון (ראה שלב 2.7.2), עיבוד חד תאים על ידי cytometry זרימה, תא בודד רצף (ראה שלב 2.7.3).
- לתרבות לטווח ארוך, בעדינות resuspend organoids שלם ב- 33% מטריקס טריים ג'ל וצלחת על-ידי ביצוע השלבים המתוארים בשלבים 1.1-1.5. מביצועם organoids ו replate כמו תאים בודדים, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של אנזימים תא חם-דיסוציאציה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות, לשטוף פעם עם 5 מ של HBSS, לוחית רישוי מחדש הג'ל מטריקס טריים בעקבות צעדים 1.1-1.5.
- Resuspend בגדר תא צורב ב מאגר פירוק המתאים עבור החילוץ-RNA, הפקת דנ א או חלבון החילוץ, כפי שמפורט בטבלה של חומרים ופעל הפרוטוקול של היצרן.
- Resuspend organoids ב 1 מ"ל של אנזימים תא חם-דיסוציאציה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות לבטל את organoids לתוך תאים בודדים. לשטוף פעם עם 5 מ של HBSS והמשך עם פרוטוקול לזרום cytometry5 או תא בודד רצף18.
הערה: מביצועם לתוך תאים בודדים בריכוזים נמוכים של מטריקס ג'ל, neutral פרוטאז פרוטאז לא ייתכן שיהיה צורך, אנזימי התא-דיסוציאציה יכול להיות מיושם ישירות אל הבאר לאחר שלב 2.2.
3. ייבוא תמונות שלם-ובכן וניתוח של מורפולוגיה תא צורב
- לרכוש תמונות כל-טוב z-מחסנית באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך המשודרת עם ממונע X / Y לסריקה הבמה (זרימת עבודה מאויר באיורים איור 1 א').
- עם המיקום מוקד מותאם לתחתית הבאר, מתחילים תוך התמקדות כלפי מעלה עד תא צורב הראשון, אשר יהיה במרכז הבאר עקב מניסקוס של שכבת הבסיס. הגדר z המישור התחתון בעמדה זו.
- המשך התמקדות כלפי מעלה עד תא צורב האחרון יהיה בפוקוס, אשר יהיה בפריפריה של הבאר. הגדר המישור העליון z בעמדה זו.
הערה: לאחר הגדרת העליון והתחתון של הערימה-z, ודא כי תפקידים אלה ללכוד את organoids בתוך כל בארות הנותרים ולהתאים את העליון/תחתון כנדרש. דבר זה מאפשר z-טווח שישמש עבור סריקה אחת הכוללת את כל תא צורב בתוך כל טוב. - לכידת 15 – 35 z-מטוסים לכל טוב, באמצעות מספר גדול יותר עבור רזולוציה גדולה יותר. לכידת התמונה כולה היטב, מיזוג ולאסוף הגזרות או סעיפים קטנים במידת הצורך.
הערה: מומלץ לקחת z-מישורים מרובים להבדיל יחיד z-המטוס, כמופיע ב איור 1B שבה organoids הם מחוץ לפוקוס בעת לכידת z-מטוס אחד בלבד. - שמור תמונות z-מחסנית לניתוח במורד הזרם.
- ניתוח תמונות באמצעות תמונה תוכנה עם יכולות ציור צורה חופשית.
- פתחו תמונה מטוס ה-z יחיד של שלב 3.1.4.
- אם יש צורך, אריח את התמונות שצולמו כל בודדים של z-מטוס לתמונה בודדת, כל-טוב. לשמור את התמונה החדשה כקובץ נפרד. חזור על תהליך זה עבור כל מטוס-z רכשה.
- באמצעות תמונה תוכנה, לפתוח את התמונה כולה-ובכן עבור כל מטוס ה-z מבאר יחיד וליצור של עומק שדה (EDF) התמונה המורחבת מתוך הערימה של z-מטוסים.
הערה: תמונה מסוג זה תביא לבחירת האזור המוקד הטוב ביותר של כל מטוס-z כדי ליצור תמונה אחת בפוקוס של הבאר. - קבע את קנה המידה של פיקסל של התוכנה הבר קנה המידה של התמונה שנמדד.
- באמצעות כלי הציור צורה חופשית של התוכנה תמונה, להתחקות אחר ההיקף של כל תא צורב בבאר.
- להשיג את המדדים מדידה עבור תא צורב עקיבה ההיקפים של התוכנה תמונה.
הערה: פרמטרים מומלצים הם אזור מעגליות, יחס מקסימום/מינימום רדיוס. התוצאות נציג הממחישות את היישום של מדדים אלה מוצגים באיור 1C. אזור מחושבת של המצולע שהוגדרו על-ידי ההיקף של תא צורב. מעגליות הוא היחס של האזור של תא צורב לאזור של עיגול עם חמוס המרבי קוטר שווה תא צורב של, כאשר 0 הוא פחות עגול ו 1 הוא יותר עגול. יחס מקסימום/מינימום רדיוס הוא היחס בין הרדיוס המרבי מינימום רדיוס תא צורב לעקוב אחריו.
מעגליות =
יחס רדיוס =
4. פורמלין קיבעון, פרפין ההטמעה של Organoids עבור נקודות קצה היסטולוגית
- להכין אספקה ההטבעה: HBSS, 2% אגר פתרון, צבע סימון היסטולוגית, היסטולוגיה ג'ל, פיפטה עצה עובש, קלטת, משאבת מזרק אינסולין 1 סמ ק, שקית קרח, קלטות, 10% פורמלין במאגר נייטרלי (NBF), עיפרון, 75% אתנול כיתה היסטולוגית (EtOH).
- להכין שני צינורות microcentrifuge של 2% אגר פתרון. דגירה באמבט מים או על גוש חום ב 100-110 מעלות צלזיוס כדי לשמור על אגר בצורת נוזל. להוסיף 1-2 טיפות של היסטולוגית סימון צבע באחד הפתרונות אגר 2%, אשר מציינות העליון של אגר חבר ולסייע בשמירה על התמצאות במהלך ההטמעה. מערבבים היטב.
- לחמם את הג'ל היסטולוגיה בבלוק מים באמבטיה או חום-55-65 מעלות צלזיוס.
- באמצעות טיפ פיפטה 1000 μL, ליצור תבניות על ידי חיתוך קטע קטן של קצה פיפטה לעשות גליל המחזיקה ~ 50 μL. צור תבנית השני, רחב יותר אשר עוטף התבנית הראשונה.
- ליצור בלוק קר על ידי עטיפת שקית קרח עם קלטת (דבק בצד למעלה) והקפדה בתבניות בקלטת.
- צור פומפה על-ידי הסרת הבוכנה מזרק אינסולין 1 סמ ק.
- להטביע את organoids פקק ג'ל היסטולוגיה לעיבוד, בעקבות זרימת העבודה מצטיירת איור 2A.
- לבטל את הג'ל מטריקס, גלולה organoids על-ידי ביצוע השלבים 2.1 – 2.7.
- רחץ בגדר תא צורב פעם אחת עם 1 מ"ל של HBSS, גלולה מחדש על-ידי ספינינג למשך 3-5 דקות ב x 300 גרם והסרה של תגובת שיקוע.
- מחדש להשעות בגדר תא צורב ב 30 – 50 μL של ג'ל נוזלי כלים. מערבבים בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה לאט. להעביר את התערובת ג'ל/תא צורב היסטולוגיה לתוך תבנית על הבלוק קר ולאפשר את הדגימה לחזק לתוך פקק וחותכים.
- השתמש פומפה לדחוף את הפקק מתוך כייר קטן, לתבנית גדולה יותר. פיפטה אגר 2% ברורה סביב התקע כדי למלא את התבנית גדול יותר.
- פיפטה היסטולוגית ציפוי צבע 2% אגר על גבי התקע לציון העליון של המדגם.
- לאחר מקורר, להשתמש פומפה להעביר את התקע לתוך קלטת כפפות. לתייג את הקלטת באמצעות קלטת עיפרון ומקום לתוך 10% NBF עבור קיבוע בין לילה.
- להעביר את הקלטת מ- 10% NBF לכיתה היסטולוגית 70% EtOH.
- תהליך הג'ל היסטולוגיה מתחברים באמצעות פרוטוקול ביופסיה שנקבע מראש על מעבד, אם הם זמינים. אם מראש אינה זמינה, קלט את רצף הבאות ואת אורך: 70% EtOH במשך 6 דקות, 70% EtOH במשך 10 דקות, 80% EtOH למשך 10 דקות, 95% EtOH 2 כפול 10 דקות, 100% EtOH 3 פעמים במשך 10 דקות, קסילן 3 פעמים למשך 15 דקות , ואת פרפין 3 פעמים במשך 15 דקות לסטות המומלץ רצף העיבוד יכול לגרום קרע organoids (איור 3 א).
- להטביע את התקע ג'ל היסטולוגיה עם החלק צבעוניים פונה כלפי מעלה, כמו זה יאפשר את החלק דהוי המכיל את organoids כדי להיות למחלקה לתוך הראשון.
- סעיף היסטולוגיה FFPE ג'ל רחובות:
- לאסוף במצרכים: היסטולוגיה FFPE ג'ל בלוקים, היסטולוגיה עט, רקמת ציפה תנורים, דלי קרח עם קרח, מיקרוטום, להבים מיקרוטום, הטבעה תחנת עבודה, טעונה באופן חיובי שקופיות מיקרוסקופ, תנור מעבדה.
- מילוי המים הרותחים עד מאוד מלאה, מוגדר כ- 40 ° C, אז מעבדה חמה מראש תנור ל- 45-50 מעלות צלזיוס.
- להכין דלי קרח, ואז למלא עם קרח, מוסיפים מים ליצירת של slurry קרח-מים. מקררים הבלוקים על הקרח עד שהם מאוד קר.
הערה: ניתן להגדיר גושי קרח עד 1 ליום, אבל אם נשאר ללון, הבלוקים להפוך להתייבש יצטרכו להיות reprocessed. - הכנס בלוק מיקרוטום קלטת קלאמפ, להוסיף את הלהב המחזיק סכין, ולפתוח כל אמצעי נעילה הגנה על המכונה.
- להתחיל זמירה את הפנים של בלוק פראפין (מול)-עובי 10 מיקרומטר. ברגע מקטע עולה המכיל אזור הכנס, תחנת זמירה, לנעול הרוטור מיקרוטום, וכן להעביר את הבניין בחזרה אל הקרח ולהירגע. אם מספר גושי בניינים כדי להיות למחלקה, הפנים-off כל לחסום לפני המעבר לשלב 4.5.6.
- להזיז את הלהב לחלק חדש ולא משומש, להעביר את גוש בחזרה המלחציים. לפתוח את המכשיר ולהתחיל חיתוך ב 5 μm לכל סעיף.
הערה: 5 μm מומלץ לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אך גם מקובל μm 3 – 10. - באמצעות פינצטה, להעביר את המקטע האמבט במים 40 ° צלזיוס ולאפשר את המקטע להפיץ. להעביר את המקטע לשקופית בטבילת אנכית לתוך המים.
הערה: טובלים בזווית יכול להעביר בועות בתחתית האמבט בסעיף ולגרום לעיוות של המדגם. - דמיינו את המקטע תחת מיקרוסקופ (איור 2Bג).
הערה: אם נוכח תא צורב הוא יופיע הדומה החץ האדום איור 2B. בועות (איור 2B, חץ כחול) יכול מופיעים דומים organoids, קל יותר להבחין בשקופית טריים כמו organoids יבשה מופיעים שקוף (איור 2C). ואם organoids לא קיימים, סעיף נוסף לתוך הרחוב.
- כאשר שקופיות המכילה organoids שרכשו, להקיף את האזור סביב הסעיף בצד האחורי של שקופיות עם היסטולוגיה עט, אופים במשך הלילה ב- 45-50 מעלות צלזיוס.
- לאסוף את השקופיות והמשך H & E (ראה שלב 4.9.1), immunohistochemical (ראה שלב 4.9.2), או immunofluorescent מכתים (ראה שלב 5).
הערה: תוצאות נציג מוצגים באיור 3B.- כדי לבצע H & E מכתים, לקבל ערכת מהרשימה חומרים ופעל במפרטי היצרן.
- כדי לבצע נוגדן, להשיג קיט עם נוגדן ראשוני מתוך רשימת חומרים ופעל במפרטי היצרן.
5. immunofluorescent מכתים של FFPE ו- Organoids משרטוטי
- לאסוף אספקה: שקופית אפוי משלב 4, קסילן, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH יונים (DI H2O), מים coplin צנצנות, 1 x אנטיגן אחזור פתרון (מאגר סודיום ציטרט או EDTA-טריס מאגר), באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), 5% סוס רגיל סרום ( NHS) עם חומר ניקוי ללא יונית 0.1% ב- PBS, 1% שור אלבומין (BSA) עם חומר ניקוי ללא יונית 0.3% ב- PBS, צביעת ארון תקשורת, מכתימה את המנה, למגינים קאמרית, עט הידרופובי המכשול, לחות קאמרית, 1 ° ו 2 ° נוגדנים של עניין, counterstains של ריבית.
- Deparaffinize, נתרענן השקופיות על-ידי חיטט coplins מלא את הפתרונות הבאים: קסילן (3 מטבלים, 5 דקות), 100% EtOH (מטבלים 2, 3 דקות כל אחד), 95% EtOH (מטבלים 2, 3 דקות כל אחד), 70% EtOH (מטבלים 2, 3 דקות כל אחד), ו- DI H2O (2 מטבלים 3 דקות).
- למלא את הצלחת מכתימים עם אנטיגן אחזור פתרון וחום קדם למגינים קאמרית עד 100 ° C.
- לבצע אחזור אנטיגן במועט מחליק לתוך המנה מכתימים מחומם מראש וכן תקופת דגירה של 5 – 10 דקות ב- 100 מעלות צלזיוס. לאחר המחזור יושלם, לאפשר תא decloaking לשבת 20 דקות לפני פתיחת המכסה.
- לאחר המנה שקופית יש מקורר RT, במקום המנה מכתימים תחת זורמים DI H2O לשטוף את השקופיות במשך 5 דקות.
- להסיר את השקופיות המנה מוכתמים, מעגל סביב הדגימה עם עט הידרופובי המכשול, ולהניח על השקופית על תא לחות.
- לחסום כל נוגדן שאינם ספציפיים צביעת על-ידי החלת NHS 5% עם סבון ללא יונית 0.1% ב- PBS למעגל הידרופוביות בסביבת המדגם (μL כ-30 נדרש כדי לכסות את הדגימה).
- שטיפת בשקופיות coplins מלא PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
- הוסף את הנוגדנים 1° (טבלה של חומרים) מדולל ב 1% BSA עם דטרגנט ללא יונית 0.3% ב- PBS למעגל הידרופוביות בסביבת המדגם (μL בערך 30 אמור לכסות את הסעיף), ואז תקופת דגירה של h 1 ב RT או ללון ב 4 מעלות צלזיוס בתא לחות.
- לשטוף את השקופיות ב coplins מלא עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
- הוספת הנוגדן 2° מדולל ב 1% BSA עם דטרגנט ללא יונית 0.3% ב- PBS למעגל הידרופוביות בסביבת המדגם (μL כ-30 יכסה את האזור), ואז תקופת דגירה של h 1 RT בתא לחות.
- לשטוף את השקופיות ב coplin מלא עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
- להוסיף דאפי, מדולל למפרטי היצרן, ב- 1% BSA עם סבון ללא יונית 0.3% ב- PBS למעגל הידרופוביות בסביבת המדגם, ולאחר מכן תקופת דגירה של 2-5 דקות ב RT בחושך (30 μL).
- לשטוף את השקופיות ב coplins מלא עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
- הר של השקופיות עם תקשורת הרכבה antifade, coverslip, ולאחר מכן להמחיש את התוצאות תחת מיקרוסקופ.
6. השלם-הרכבה של Organoids עבור צביעת Immunofluorescent
- לאסוף אספקה: שקופית קאמרית או צלחת קונאפוקלית, באגירה פוספט מלוחים (PBS), מקבע, 50 מ מ NH4Cl ב- PBS, דטרגנט ללא יונית 0.1% ב- PBS, 5% NHS עם סבון ללא יונית 0.1% ב- PBS, 1% BSA עם סבון ללא יונית 0.3% ב- PBS, 1 ° ו 2 ° נוגדנים של עניין, counterstains עניין.
- הסר בזהירות כמה שיותר מדיה ככל האפשר מבלי לשבש את פעולת התרבות תא צורב על-ידי pipetting כנגד הצד של, ובכן, עוזב את החלל בין מדיה, מטריקס ג'ל.
- באמצעות קיצצה, טרום רטוב עם מדיה או PBS, עצה 1,000 μL פיפטה, לצייר על טיפת דם אחת (25-50 μL) של מטריקס ג'ל המכיל את organoid(s) של עניין, לוותר על אמצע קאמרית שקופית טוב או קונאפוקלית תבשיל.
הערה: 33% מטריקס ג'ל אינו מוצק... זה נוזל ז'לטין שמטפל דומה ג'לי זה לא הגדיר באופן מלא. טיפ פיפטה החתוך עם חור גדול ימנע organoids שבירת במהלך העברות. - אם organoids נשארים בתרבות האב, החלף המדיה מדיה מבוססי KSFM חמים.
- בעין או היקף ויבתר, וארוקן את הג'ל מטריקס ומדיה עודף משקופית קאמרית עם פיפטה פיין-טיפ (200-10 μL).
הערה: זה אופציונלי pretreat את השקופית קאמרית עם ריאגנט הדבקות. - צלחת אמצעי שווה של מטריקס ג'ל לבאר הריק השקופית הקאמרית בתור פקד אופציונלי כדי לצפות autofluorescence של שאריות של מטריקס.
- מקום השקופית הקאמרית חממה 37 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות על מנת לקדם את תא צורב לדבוק הזכוכית ולמנוע אובדן של דגימות במהלך שטיפת מדרגות.
- Pipetting באיטיות כדי למנוע ניתוק שקופיות, לשטוף את organoids עם μL 200 ל- PBS 1 x עבור 5 דקות ב RT תוך מנענע בעדינות.
- הסר את 1-PBS ותיקון עם 200 μL של 4% paraformaldehyde למשך 30 דקות ב- RT תוך מנענע בעדינות. ודא כי הג'ל מטריצה מופיע ברור לאחר שלב זה.
הערה: קיבוע מתנול או פורמלין הינן גם אפשריות. צריך להיות ממוטב שיטת קיבוע נוגדנים ספציפיים כמו שיטות קיבוע מסוימות עשוי crosslink האנטיגנים של עניין או להרוות פלורסנט-תיוג-חלבונים עניין. - הסרת מקבע את ולשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
הערה: האורך של שטיפת מדרגות צריך להיות מוטבת תלוי בגודל תא צורב. חמש דקות הוא נקודת התחלה מספיק, אבל יכול להיות מאורכים השלב הכביסה בהתאם לצורך. - להרוות את autofluorescence עם μL 200 של 50 מ מ NH4Cl ב- 1 x PBS למשך 30 דקות ב- RT תוך מנענע בעדינות.
הערה: שלב זה להרוות autofluorescence פסולת לומן של תא צורב ומן ביטוי חלבון פלואורסצנטי (כגון GFP) שעלול להציג עיצוב ניסיוני. זה צריך להיות כלול אם זה רצוי להשתמש fluorophore בערוץ 488 אך ניתן לדלג במידת הצורך כדי לשמר את האות ה-GFP. - הסר NH4קלרנית, לשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
- Permeabilize organoids ב μL 200 של 0.1% ללא יונית דטרגנט ל 100 1 x PBS למשך 30 דקות ב- RT תוך מנענע בעדינות.
- להסיר את 0.1% ללא יונית דטרגנט-100 1-PBS ולשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x עבור 5 דקות בזמן מנענע בעדינות.
- בלוק עם 5% NHS עם 200 μL של 0.1% סבון ללא יונית X-100 ב- PBS, תקופת דגירה של 60 דקות ב RT תוך מנענע בעדינות.
- הסר את המאגר חסימה, לשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
- לדלל הנוגדן 1° ב 1% BSA עם 0.3% טריטון X-100 ב 1 x PBS, להוסיף 200 μL של השקופית קאמרית ולאחר מכן תקופת דגירה של 1-3 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס.
- להסיר את הנוגדן 1°, לשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
- לדלל הנוגדן 2° ב 1% BSA עם 0.3% טריטון X-100 ב 1 x PBS, להוסיף 200 μL של השקופית קאמרית ולאחר מכן תקופת דגירה של 1-3 ימים ב 4 ° C בחושך.
הערה: משך הדגירה פעמים צריך להיות ממוטב וגודל תא צורב נוגדן. כמה ידרוש זמן רב יותר כדי לחדור דרך תא צורב. ריכוז נוגדן יהיה גם צורך ניתן למטב. באופן כללי, 2 x ריכוז המשמש עבור מקטעים FFPE מתאים 1° נוגדנים, ריכוז זהה עבור מקטעים FFPE מתאים 2° נוגדנים. - להסיר את הנוגדן 2°, לשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
- Counterstain של אקטין עם phalloidin והגרעין עם דאפי או Hoescht, מדולל לפי המלצות היצרן ב- 1% BSA עם 0.3% טריטון-X ב- 1 x PBS. להוסיף 200 μL קאמרית שקופית ולאחר מכן תקופת דגירה-RT של 40 דקות בחושך.
- לעלות ב- 200 μL של טרי 1 x PBS או הרכבה מדיה על התמונה מיד (זריחה צריכה להישמר עד 5 ימים, אם לא יותר). התוצאות נציג מוצגים באיור 3C.
הערה: אזיד הנתרן יכולים להוסיף דוגמאות כדי למנוע זיהום אם דימות קונאפוקלית אינם זמינים. הוספת סוכן ניקוי יכול לשפר את ההדמיה.
7. שלם-הרכבה של Organoids עבור מבחני וזונדים פלורסנט
הערה: ישנם מבחני זמינים מסחרית, רגשים/צבעי פלורסנט (דוגמאות נכללים ברשימת החומרים) amendable לשימוש רכוב כל organoids לבחון מגוון רחב של נקודות קצה שימושי19. הפרוטוקול הבא הוא עבור מתויג fluorescently אדו התפשטות ערכת, אולם ורקמות. יכול להיות שונה לשימוש עם מדגם רכוב שלם.
- בזהירות להסיר את μL 50 של מדיה והחלף 50 μL של 20 μM 2 x עבודה אדו פתרון על-ידי pipetting כנגד הצד של, ובכן, עוזב את החלל בין מדיה, מטריקס ג'ל.
- דגירה ב 4 ° C 1 – 3 ימים (לאורך הרצוי של זמן עבור עידו התאגדות צריך להיות אופטימיזציה עבור סוג התא של הבחירה).
- בצע את שלבים 6.2 – 6.8 להעביר את organoids עניין קאמרית שקופיות או תבשיל קונפוקלי.
- הסר PBS ותקן עם 200 μL של 3.7% paraformaldehyde למשך 30 דקות ב- RT תוך מנענע בעדינות. להבטיח כי המטריקס ג'ל מופיעים ברורה לאחר שלב זה.
- הסרת מקבע את ולשטוף פעמיים עם μL 200 ל- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות. להסיר PBS ולהוסיף 200 μL של 0.5% ללא יונית דטרגנט-100 ב- 1 x PBS למשך 30 דקות ב- RT תוך מנענע בעדינות.
- להכין 1 x קוקטייל על פי מפרט היצרן פלורסנט התגובה.
- הסר דטרגנט ללא יונית 0.5%-100, לשטוף פעמיים עם 200 μL של BSA 3% ב- PBS 1 x במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות.
- הוסף תגובה קוקטייל, תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT בחושך.
- הסר התגובה פלורסנט קוקטייל, תשטוף פעם אחת עם 200 μL של BSA 3% 1 x PBS במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות. Counterstain ו הר על-ידי ביצוע השלבים 6.21 – 6.22 (דמות תלת-ממד).
Representative Results
על תרבות מוצלח של האדם organoids הערמונית העיקרי, מורפולוגיה ובידול יכול להיות מוערך באמצעות ניתוח שדה בהיר תמונות, FFPE, טכניקות צביעת כולה-הר.
התהליך של לכידת התמונה בהיר-שדה מודגם ב איור 1A. Organoids גדלו ב מטריצה תלת-ממד, התפזרו על פני מטוסים מוקד שונים. לצפות organoids בפוקוס על פני מטוסים רבים, הוא הציע להשתמש בתמונה חה כ (איור 1B, נכון) במקום z-מטוס בודד (איור 1B, משמאל). במעבדה, organoids גדלו בתנאים ניסיוני שונים עלולים לגרום לשינויים מורפולוגיה. שימוש באזור, מעגליות (המוגדר על-ידי תא צורב עד כמה דומה הוא מעגל), מקסימום/מינימום רדיוס (מידת אורך) לתת למשתמשים אינדיקציה תא צורב הגודל והצורה ומספקים readout לכימות של מורפולוגיה. כדי להדגיש את התועלת של אמצעים אלה, להחליפן בתמונות של organoids עם אזור דומות אבל שונות מורפולוגיה מוצגים באיור 1C, בו תא צורב ארוך להיות פחות מעגלית, יש יחס מקסימום/מינימום גדול יותר מאשר כדורית תא צורב.
הטבעת organoids עבור היסטולוגיה היא נקודת קצה של שימושי להתבונן הפנימי של דגימות ולהבטיח שנמק הזה אינו נוכח בתוך תוכו של תא צורב. זרימת עבודה עבור תהליך זה ואת התוצאות נציג של הדגימות וללא רבב, המחולקת למקטעים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר ניתנים איור 2AB, C. איור 3A מראה כושלת תא צורב (משמאל) בהשוואה כראוי מסר organoids איור 3A (מימין), דמות 3B. כדי לקבוע את המצב-הבידול של המדגם, מומלץ להסתכל על התאים הבזליים סמנים (cytokeratin 5 ו p63)8 יחד עם סמנים (cytokeratin 8) תא luminal8. אם זה רצוי כתם organoids בחיי עיר, כולה-הר מכתים היא אלטרנטיבה נוחה ומסופקים התוצאות נציג דמות 3Cד
איור 1: מורפולוגיה הערכה של organoids בתרבות תלת-ממד. (א) תמונת אוסף ודחיסה זרימת עבודה עבור האדם organoids הערמונית העיקרי שרכשה אור המשודרת הפוכה מיקרוסקופ עם ממונע X / Y לסריקה הבמה ותוכנות לוויה. (B) להחליפן בתמונות של z יחיד-מחסנית (משמאל) לעומת. תמונה חה כ (מימין) של מדגם כל-טוב של האדם organoids הערמונית העיקרי, מראה כי הם organoids יותר מיקוד כאשר z-אוספים מרובים משולבים לתמונה המוקרנת אחת (סולם בר = 1000 מיקרומטר). (C) להחליפן בתמונות עבור יחס שטח מעגליות, מקסימום/מינימום של מורפולוגית שונה אנושי ראשוני הערמונית organoids אשר יש באותו האזור (סולם בר = מיקרומטר 200). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תא צורב הטבעה זרימת העבודה ונציג חלוקתה תוצאות. (א) אנושי ראשוני הערמונית תא צורב הטבעה של זרימת עבודה. (B) תמונת הנציגה של שקופית וללא רבב, טריים המכילים האנושי organoids הערמונית הראשי תחת מיקרוסקופ שדה בהיר המתארים אגר (חץ ירוק), היסטולוגיה ג'ל (חץ שחור), בועה (חץ כחול), organoids (חצים אדומים) (סולם בר = 1000? מ')-(C) מוכתם. טרי חתוך שקופית (משמאל) לעומת. שקופית יבש וללא רבב (מימין), organoids (חצים אדומים) מופיעים שקוף כאשר יבש (סולם בר = 500 מיקרומטר), שקשה להבחין במיקרוסקופ שדה בהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: צביעת היסטולוגית על משרטוטי וטיפס על-ידי כל organoids. (א) H & E כתמים שבור אנושי ראשוני הערמונית תא צורב מן הנזק (pipetting אגרסיבי, הלא עיבוד פרוטוקול, משמאל) לצד תא צורב מהימנות (מימין) (סולם בר = 100 מיקרומטר). (B) אנושי ראשוני הערמונית תא צורב כי כבר פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע, למחלקה, ואת עם תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי (מוכתם הבזליים cytokeratin 5 או luminal cytokeratin 8 (למעלה) או הבזליים p63 ו luminal cytokeratin 8 (למטה) סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). (C) התלויות על כל אדם ראשי הערמונית תא צורב מוכתם הבזליים cytokeratin 5 או luminal cytokeratin 8, counterstained עם phalloidin, דאפי, עם תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי (סולם בר = 100 מיקרומטר). (D) תא צורב התלויות על כל ראשי הערמונית תאים אנושיים מוכתם fluorescently שכותרתו אדו, מונה צבעונית עם Hoescht, עם תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי (סולם בר = 500 מיקרומטר) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
Organotypic התרבות היא שיטה חדשה מרגשת עבור recapitulating רקמות עם הנוחות של סביבה במבחנה . כיום, מעבדות לגדול organoids מפני סוגים רבים של רקמות עבור נקודות קצה שונים. בשיטות המתוארות במאמר זה לסכם את נקודות הקצה שימושי וסמן טכניקות חדשות לאפיין באופן מלא תרביות תאים הערמונית ראשי תלת-ממד.
ישנם מגוון רחב של מתכונים מדיה לטפח את תאי הערמונית ראשי אדם organoids5,6,13. בעוד כל להשיג תוצאות דומות ובר קיימא, מדיה מבוססי KSFM13 משתמשת תוספים מינימלית כך הוא מתואר כאן. בנוסף, מאמרים פורסמו באמצעות ריכוזים מרובים עבור מטריצה ג'ל, מ 10% ל- 75% תרבות הערמונית organoids5,6,13. כי מטריקס ג'ל הוא מגיב יקר, 33% מטריקס ג'ל הוכח להספיק לטפח לטווח ארוך (2-3 שבועות), organoids קיימא, unclumped13, זהו הריכוז המומלץ ביותר. עם זאת, מטריקס ג'ל יכול להשתנות ריכוז חלבון בין מספרים הרבה, אז זה צריך לקחת בחשבון בעת ציפוי. כמו כן מומלץ לרכוש מטריצה ג'ל בצובר לשימוש לאורך ניסויים מרובים כדי להפחית את חוסר העקביות בין מגרשים. מעבדות נוספות פרסמו תבניות שונות עבור ציפוי ג'ל מטריקס, כגון טיפות במקום ציפוי צלחת 96-ובכן ובכן5. שתי השיטות בצורת organoids קיימא, אבל הפורמט המתוארים כאן מאפשר לתאים להיות מצופה יותר בדלילות, אשר הוכח כדי לקדם את התפשטות של תאים גדול יותר organoids13. עם זאת, ציפוי צפיפות צריך להיות מוטבת מבוסס על היווצרות החולה הספציפי יעילות. מטריקס ג'ל זמינה בתבניות רבות כולל ריכוז פקטורי גדילה-מופחתת, פנול אדום-חינם, גבוהה, וכו '. Growth factor-מופחתת מומלץ עבור מוגדרת תרבות תנאים, והיא נטולת פנול אדום מומלץ בעת עבודה עם תאים המבטאים GFP או בניסויים שכוללות לכידת תמונה z-מחסנית. זה קריטי כי שלבים ציפוי ג'ל מטריקס לבצע עם ריאגנטים קר כקרח, כמו מטריקס ג'ל עפור במהירות בטמפרטורת החדר.
Organoids גדל תחת טיפולים ניסיוניים שונים עשויים לגרום לשינוי צורה, כך שדה בהיר הדמיה נעשה שימוש נרחב ללמוד שנצפה פנוטיפים מורפולוגי. למרות זאת, ההקלטה וכימות באזור או צורה הוא אתגר משתי סיבות: הטיית בחירה 1) במהלך לכידת תמונה 2) החלת את פרמטר דו-ממדית כגון אזור מדגם תלת מימדי. אסטרטגיה אחת של לכידת תמונה כדי להקליט שדה אקראי ולמדוד את מספר קבוע מראש של organoids בתחום הזה, אבל דבר זה יכול ליצור הטיה במהלך הבחירה, כל organoids בשדה שנבחר ייתכן לא בפוקוס. ובכן כל הדמיה ממוטב עבור התבנית microplate 96-ובכן מבטלת זו דגימה מוטה על ידי איסוף האוכלוסייה תא צורב כל עניין. עם זאת, בהתאם המטרות מיקרוסקופ על היד, שדות מרובים ייתכן שתצטרך להיות שנאספו, אריחים כדי לקבל תמונה שלמה-. טוב. מעבדות כמה תיארו אזור מדידה מטוס ה-z יחיד12, אך כדי ללכוד כל organoids בפוקוס, מומלץ כדי לאסוף ערימת מישורים מרובים לתוך תמונת-חה כ יחיד13. במקרים מסוימים, מניסקוס הג'ל מטריקס עלול לגרום פינות כהות בתמונה, שיטות תיקון הרקע אולי צריך להיות מיושם באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. נפח המדויק הינו ממוקם באופן אידיאלי המידה המתאימה ביותר עבור גודל תא צורב; עם זאת, זה קשה להשיג בדיוק, אפילו עם מספר תמונות z-מחסנית. ממדים מורפולוגי שימושיים אחרים, כגון מעגליות, מקסימום/מינימום יחס, ניתן לחשב בקלות כל organoids בתמונת חה כ כל-טוב. יחד, השיטות להתגבר על דגימה אתגרים הסטייה ולאפשר מדידת פרמטרים 2D של עצמים תלת-ממדיים במרחב תלת-ממדי.
קיבוע פורמלין פרפין ההטמעה של organoids היא שיטה נפוצה כדי להשיג hematoxylin אאוזין (H & E), immunohistochemical (IHC) ואני (אם) immunofluorescent מכתים הדמיה וניתוח6,11, 20. עם זאת, פרסומים תיארו טכניקה זו חוסר פרטים מקיפים על תהליך ההטבעה. בנוסף, איתור organoids בתוך לבלוק פראפין יכול להיות מאתגר. מעבדות כמה כתם מראש organoids עם trypan כחול לפני הטמעת לסייע במיקום במהלך חלוקתה11. השיטה המתוארת כאן משלבת את השימוש צבע היסטולוגית לאוריינטציה של gelplug תא צורב/היסטולוגיה במהלך ההטמעה כדי לקדם את היעילות של חלוקתה. שקופיות H & E להקל על הבדיקה של נמק, מרקם גרעיני התפשטות, וכך זה צריך להיות נקודת קצה של חובה לתרבות תא צורב להבטיח כי תאים בריאים לאורך הספירה. חוזק של תרבות תא צורב הוא כי דוגמאות מורכבות של תערובת הטרוגנית של תאים הדומים יותר ויוו הרקמה החולה. ב. בבלוטת הערמונית, לדוגמה, התאים הבזליים והן luminal נמצאים organoids הערמונית5, תוך תאים גדל ב- 2D חוסר בידול luminal8. כדי להעריך בידול תא צורב, מומלץ כי החוקרים להעריך את סמני הבזליים כגון CK5 ו- p63 וסמנים luminal כגון קולטני אנדרוגן ו- CK88. כל החלבונים ניסיוני אחרים עניין שניתן גם ללמוד שיטות אלה מוכתמים.
למרות מקטעים FFPE תאפשר ויזואליזציה של תאים המתגוררים בשיטות התא הפנימי באמצעות היסטולוגית (H & E, אם, IHC), תמונות מוגבלות ל חתכי רוחב, תא צורב הצורה עשויה להשתנות על ידי תהליך ההטבעה. מכתים כל-הר מאפשר תא צורב להיות צבעונית ולא נצפתה ב באתרו, שימור פנוטיפים מורפולוגי ואישורים עבור תמונות של חלבון לוקליזציה. שלם-הרכבה הוא כלי מנוצל כתם דגימות כל רקמות או כל מוצרים מהחי, כגון העובר דג זברה או עכבר, והוא מותאם בקלות organoids. בטכניקה המתוארת כאן היה שונה מהסדר של ההליך על-ידי קונסטנס.et al. 11, אשר מפרט את הגידול הראשוני והתרבות של מערכת העיכול organoids ישירות על שקופית קאמרית עבור צביעת, והוא מחייב קיבעון של התרבות האב כולו. השיטה שמפורטות כאן כרוך בהעברת תא צורב יחיד (או organoids) עניין לשקופית קאמרית בזמנו של כתמים. פעולה זו מאפשרת את הבחירה של הפרט organoids לניתוח כולה-הר ב ניסוי מתמשך ללא קיבוע של התרבות האב. בעת ביצוע כל-הר מכתים, זה הכרחי כדי לייעל את permeabilization ואת זמן דגירה נוגדנים ראשיות ומשניות להבטיח חדירה ברחבי הדגימה (בכל מקום של יום אחד או יותר מומלץ). ברגע שעברה דימות באמצעות קונפוקלית, יכול להיות מיוצר הדמיות תלת-ממד כדי לאפשר ויזואליזציה ולוקליזציה של חלבון ספציפי ולחשב את מספר התאים באופן חיובי מוכתם הנוכח במדגם. Cytometry זרימה נקודת קצה של שימושי לכמת אוכלוסיות של הבסיס, luminal, או גזע תאים5,14. כדי לעשות זאת, התאים הם התאוששו הג'ל מטריקס, בעדינות חלופה מועדפת עבור צביעת. משתמשים עליך לבחור בקפידה סמני המתאים לפרידה בהתבסס על הספרות הנוכחי. עבור האדם העיקרי לתאי האפיתל הערמונית, CD26 ו- CD49f הם סמנים luminal ו הבזליים מתאימים, בהתאמה5,21.
לסיכום, פרוטוקול זה מפרט גדילה אנושי תא צורב הערמונית העיקרי, אוסף ונקודות קצה ניסיוני. ראוי לציין, הרכבה בטכניקה המתוארת ניתן ליישם מגוון של מבחני אחרים אשר מועסקים בדרך כלל עבור תאים 2D, כגון פלורסנט מבוסס על בדיקה ניסויים מסתכל על התפשטות19אפופטוזיס, אברון subcellular כתמים. בנוסף, שיטת איסוף של דיסוציאציה המתוארים כאן יכול להיות מנוצל כהכנה רצפי RNA בתא יחיד18. באופן קולקטיבי, מדגים את האפשרות למגוון רחב של הרומן, נקודות קצה אמינות גבוהה חוקרים ניתן למטב ולתור בעתיד.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים UIC Biorespository חברי, ד ר קלרה Valyi-נאגי, אלכס Susma, כמו גם את urologists, ד"ר מיכאל Abern, דניאל מוריירה, סימון Crivallero, ולקרבם רקמות רכישה עבור התרבויות התא הראשי. אנו מודים החולים UIC אורולוגיה על תרומת רקמות שלהם למחקר. עבודה זו מומן, בחלקו, על ידי את המחלקה של ההגנה הערמונית סרטן מחקר תוכנית בריאות םירעפ הרעיון פרס PC121923 (פנסיון) ואת המרכז UIC קלינית וחינוך תרגום מדעי Pre-doctoral עבור (קלינית Translational ומדענים. תוכנית PECTS) (McCray וריצ'רדס) על ידי מכוני הבריאות הלאומיים של המכון הלאומי לסרטן, גרנט מספרים U54CA202995, U54CA202997, U54CA203000, ידוע בשם שיקגו בריאות להון שיתופי (פנסיון ו ריצ'רדס). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים או ההגנה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells of interest | |||
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
| Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
| 5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
| Ice Bucket | |||
| Cell Culture Hood | |||
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
| Centrifuge | |||
| Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
| DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
| Organoids | |||
| Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
| Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
| Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
| Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
| Organoids | |||
| Ice pack | |||
| Masking tape | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Razor blade | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
| HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Pencil | |||
| "Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
| Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
| Container to hold fixative | |||
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water | |||
| Paraffin | Leica | various | |
| Tissue processor | |||
| Embedding workstation | |||
| Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
| Microtome | |||
| Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
| Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
| Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
| ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
| Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
| FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
| Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
| Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
| Deionized water (DI H2O) | |||
| Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
| Staining dish | IHC World | M900-12B | |
| Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
| Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
| 50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
| Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
| Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
| Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
| Confocal microscope | |||
| Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
| p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
| Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
| Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
| Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
| Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
| Organoids | |||
| Pipette tips (1000 μL) | |||
| Pipette tips (200 μL) | |||
| 8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
| Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline - PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
| Organoids | |||
| Ice bucket | |||
| Cell culture hood | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
| Microcentrifuge | |||
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
| Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| Cytokeratin 5 Antibody - FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
| Cytokeratin 8 Antibody - Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
| CD49f - Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
| CD26 - PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |
| Flow cytometer |
References
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 2. The Journal of Urology. 173 (2), 360-372 (2005).
- Uzgare, A. R., Xu, Y., Isaacs, J. T. In vitro culturing and characteristics of transit amplifying epithelial cells from human prostate tissue. Journal of Cellular Biochemistry. 91 (1), 196-205 (2004).
- Sobel, R. E., Sadar, M. D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines--part 1. The Journal of Urology. 173 (2), 342-359 (2005).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Mahe, M. M., et al.
- Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319 (2018).
- Richards, Z., McCray, T., Marsili, J., Zenner, M. L., Manlucu, J. T., Garcia, J., Murray, M., Voisine, C. M., Murphy, A. B., Abdulkadir, S. A., Prins, G. S., Nonn, L. Prostate stroma increases the viability and maintains the branching phenotype of human prostate organoids. iScience. , in press (2018).
- Hu, W. -Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial stem cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-Related Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).
- Peehl, D. M. Growth of prostatic epithelial and stromal cells in vitro. Methods in Molecular Medicine. 81, 41-57 (2003).
- Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. Journal of Biological Chemistry. 286 (52), 44503-44511 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Barrett, C. W., Short, S. P., Choksi, Y. A., Williams, C. S.
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
