Summary
والهدف من هذا البروتوكول لتوضيح كيفية استخدام الماوس cardiomyocytes حديثي الولادة كنظام نموذجي لفحص عوامل مختلفة كيف يمكن أن يغير استهلاك الأكسجين في القلب.
Abstract
الميتوكوندريا والايض الأكسدة حاسمة للحفاظ على وظيفة عضلة القلب. وقد أظهرت الأبحاث أن خلل mitochondrial عاملاً هاما في مساهمة لضعف وظيفة القلب في القلب. على النقيض من ذلك، استعادة الوظيفة المتقدرية المعيبة قد آثار مفيدة لتحسين وظيفة القلب في قلب الفشل. ولذلك، يمكن أن توفر دراسة الآليات التنظيمية وتحديد المنظمين رواية للوظيفة المتقدرية البصيرة التي يمكن استخدامها لوضع أهداف علاجية جديدة لعلاج أمراض القلب. هنا، يتم تحليل التنفس المتقدرية ميوسيتي القلب باستخدام نظام ثقافة خلية فريدة من نوعها. أولاً، تم وضع بروتوكول الأمثل لسرعة عزل والثقافة العالية الجدوى الماوس الولدان كارديوميوسيتيس. ثم يتم استخدام محلل الجريان خارج الخلية تنسيق 96-جيدا لتقييم معدل استهلاك الأكسجين من هذه كارديوميوسيتيس. لهذا البروتوكول، نحن الأمثل البذر الظروف وأثبت يمكن تقييم أن معدل استهلاك الأكسجين cardiomyocytes الماوس الأطفال حديثي الولادة بسهولة في محلل الجريان خارج الخلية. وأخيراً، نلاحظ أن لدينا بروتوكول يمكن تطبيقها على حجم أكبر لثقافة والدراسات الأخرى، مثل الإشارات داخل الخلايا وتقلص وظيفة التحليل.
Introduction
للحفاظ على وظيفة الهوس القلب مستمر، كارديوميوسيتيس يجب الحفاظ على إمدادات ثابتة من الطاقة الخلوية أساسا في شكل ATP1. في القلب، وتولد حوالي 95% ATP الميتوكوندريا، أساسا من خلال الفسفرة، تبين أن الميتوكوندريا دوراً حاسما الطاقة البيولوجية في وظيفة القلب2،3. دعم هذا المفهوم أن التقلبات وظيفة المتقدرية يمكن أن يؤدي إلى اعتلال عضلة القلب وفشل القلب4،5. على العكس من ذلك، ثبت استعادة الوظيفة المتقدرية لتحسين وظيفة القلب للفشل القلب6،7. ولذلك، دراسة إليه الاستقلاب mitochondrial وتحديد المنظمين رواية للوظيفة المتقدرية في cardiomyocytes لن تكشف فقط عن رؤى الميكانيكية لإنتاج الطاقة القلب ولكن يمكن أن توفر أيضا فكرة أن تؤدي لوضع أهداف علاجية جديدة لعلاج أمراض القلب6،8.
مقارنة بقلب كله، الذي يحتوي على خليط من ميوسيتيس وغير ميوسيتيس9، كارديوميوسيتي الثقافات الغاية الصرفة، مع الحد الأدنى من التلوث من غير ميوسيتيس من القلب، مثل الخلايا الليفية، وخلايا بطانية10. وباﻹضافة إلى ذلك، عزل كارديوميوسيتيس من المواليد الجراء يمكن استزراع عدد كبير من الخلايا في كمية صغيرة من الوقت، مقارنة بعزل الخلايا من قلوب الكبار10،11. الأهم من ذلك، cardiomyocytes الماوس الكبار مثقف الأساسي البقاء قصيرة الأوقات (مثلاً 24 ساعة) وفي وقت أطول النقاط دي تفرق. كارديوميوسيتيس الماوس حديثي الولادة يمكن البقاء على قيد الحياة والتلاعب بها لما يزيد عن 7 أيام في الثقافة، ويجعلها مثالية لاختبار آثار مركبات العقاقير والتلاعب بالجينات في الوظيفة الميتوكوندريا في cardiomyocytes10. وبطبيعة الحال، هناك اختلافات بيولوجية كبيرة بين خلايا البالغين والأطفال حديثي الولادة، ولكن مدة أطول متاح لثقافة خلايا الولدان يجعلها ملائمة لأنواع مختلفة من الدراسات، بما في ذلك وظيفة الميتوكوندريا.
وحتى الآن، استخدمت الأولية كارديوميوسيتيس الماوس وفار الولدان مثقف كنماذج لدراسة الاستقلاب القلب12،13. في السنوات الأخيرة، استخدمت الدراسات محلل تدفق خارج الخلية لقياس معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) وتقييم قدرة الأكسدة في الماوس وفار كارديوميوسيتيس حديثي الولادة14،15. بينما بالمقارنة مع الفئران، بقاء الخلية الماوس كارديوميوسيتيس حديثي الولادة أقل وزيادة تقلب16. القدرة على دراسة الخلايا من نماذج الماوس المهندسة وراثيا أيضا، يجعل نموذج الخلية الماوس هام جداً. نظراً لأن الدراسات التعرف الضوئي على الحروف حساسة جداً للخلية عدد وكثافة البذر، ثمة حاجة إلى تطوير بروتوكول استنساخه وموثوق بها، وبسيطة لتحقيق العائد خلية يتمشى وقدرتها على البقاء.
هنا، نحن تقرير بروتوكولا أمثل الذي تم تطويره الذي يستخدم الماوس مثقف cardiomyocytes الولدان جنبا إلى جنب مع محلل 96-جيدا-تنسيق الخلية التمويه تحليل التعرف الضوئي على الحروف. هذا البروتوكول يزيد كثيرا من إمكانية تكرار نتائج للمقايسة. وباﻹضافة إلى ذلك، البروتوكول يقدم الرواية والأسلوب استنساخه لتحليل التعرف الضوئي على الحروف، بل أيضا يمكن أن تتكيف مع ثقافة حجم أكبر لأغراض تجريبية أخرى، مثل تلك التي قد تكون بحاجة إلى دراسة وظائف ميوفيبريلار وداخل الخلايا مما يشير إلى الممرات.
على وجه الخصوص، وصف هذا البروتوكول إجراء يوم واحد للعزلة وثقافة cardiomyocytes الولدان الماوس في لوحة ثقافة خلية 96-جيدا. وباﻹضافة إلى ذلك، فهو يصف الإجراء لقياس استهلاك الأوكسجين باستخدام محلل الجريان خارج الخلية. جميع الحلول المستخدمة عقيمة أو تصفيتها العقيمة. يتم تعقيم جميع الأدوات من الإيثانول 75%. نحن نقدم الجدول للمواد لأجزاء مختلفة من الإجراءات. لاستزراع cardiomyocytes، يتم تنفيذ جميع الإجراءات والخطوات في غطاء ثقافة خلية قياسية. تم تطوير هذا البروتوكول لعزل قلوب الماوس الولدان من القمامة واحد (حوالي 8-10 الجراء). بيد البروتوكول يمكن تكييفها لعزل كارديوميوسيتيس من ليتر متعددة أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
للعمل مع الفئران حديثي الولادة، يرجى يرجى الرجوع إلى المبادئ التوجيهية المحلية جامعة ومعهد الوارد ببرامج رعاية الحيوان والتمسك بأحد مؤسسية وأخرى الأنظمة المناسبة. وافق عليها "جامعة كاليفورنيا سان دييغو رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) جميع الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول والتقيد باللوائح الاتحادية والولائية.
1-إعداد الكواشف
- إعداد 25 مل من محلول قبل الهضم: حبس (دون Ca2 + و Mg2 +) تستكمل مع التربسين (0.5 ملغ/مل). تعقيم الحل باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام. جعل الحل الهضم قبل يوم من التجربة.
ملاحظة: من الأهمية بمكان استخدام حبس دون Ca2 + و Mg2 +, ك Ca2 + و Mg2 + سوف يسبب انكماش ميوسيتي وموت الخلايا اللاحقة أثناء العزلة. - إعداد 30 مل كولاجيناز الهضمالمخزن المؤقت: كولاجيناز (0.8 mg/mL، حوالي 350 يو/مليلتر) حلت في المخزن المؤقت لحبس (دون Ca2 + و Mg2 +). تعقيم الحل باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام. جعل الحل الهضم كولاجيناز اليوم للتجربة.
- إعداد 500 مل كارديوميوسيتي ثقافةالوسائط (وسائط النمو): مزيج 375 مل دميم، 125 مل من M-199، 25 مل من مصل الحصان، و 12.5 مل من FBS. الملحق مع البنسلين 1% ومحلول ستربتوميسين 1%.
- إعداد اختبار الإجهاد المتقدرية المتوسطة: جعل 200 مل من دميم على أساس متوسط اختبار الإجهاد (دميم دون NaHCO3، انظر الجدول للمواد) تستكمل مع بيروفات صوديوم 1 مم، 2 ل الجلوتامين، والجلوكوز 10 ملم، و 2 ملم هيبيس.
ملاحظة: قم 1 لتر متوسطة مع دميم دون بيروفات صوديوم ولام الجلوتامين والسكر وحبيس، المدون العقيمة، وتخزينها في 4 درجات مئوية. إعداد وسيلة اختبار الإجهاد في اليوم للفحص عن طريق إضافة الكواشف الأخرى. استخدام دميم المتوسطة دون ناكو3 أمر بالغ الأهمية. - ضبط الأس الهيدروجيني لاختبار الإجهاد المتقدرية وسائل الإعلام إلى 7.4 في يوم الاستخدام. وسائط الحارة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- إعداد أوليجوميسين: إعداد 5 مل حل الأسهم 5 ملم في [دمس] وجعل 250 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إعداد فككب: إعداد 5 مل حل الأسهم 5 ملم في [دمس] وجعل 250 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إعداد أنتيميسين A: إعداد 5 مل حل الأسهم 5 ملم في [دمس] وجعل 250 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إعداد والروتينون: إعداد 5 مل حل الأسهم 5 ملم في [دمس] وجعل 250 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم سرد كافة الكواشف والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1.
2. الحصاد والهضم قبل القلوب من الفئران حديثي الولادة (اليوم الأول)
- اﻷوتوكﻻف المقص والملقط ملعقة موريا لتعقيم.
- تنفيذ كافة الخطوات في هود ثقافة الخلية للعقم.
- الكوة 5 مل من حبس (دون Ca2 +, Mg2 +) لكل بئر من صفيحة ثقافة الخلية 6-جيدا؛ ضع على الجليد. الكوة 10 مل من حبس في طبق ثقافة خلية 10 سم.
- إعداد 20 مل من التربسين هضم قبل الحل في أنبوب 50 مل مخروطية عقيمة. تبقى جميع الحلول على الجليد.
- وتراجع بسرعة الفئران حديثي الولادة (يوم 0) في الحل الإيثانول 70% للتعقيم.
- قطع رأس الجراء استخدام مقص معقم (مباشرة) دون تخدير، ثم قم بفتح الصدر على طول القص للسماح بالوصول إلى تجويف الصدر والقلب. (الشكل 1A)
ملاحظة: 1) من الأهمية بمكان استخدام P0 الفئران حديثي الولادة لتحقيق استمرارية ارتفاع الخلية. 2) هذا أسلوب القتل الرحيم مسموح لحديثي الولادة وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة والجمعية الطبية البيطرية الأمريكية 17. - استخراج قلوب من الجسم مع مقص غرامة ونقل فورا إلى الطبق الثقافة العقيمة خلية تحتوي على حبس (دون Ca2 +, Mg2 +) (الشكل 1B).
- إزالة أي أنسجة الرئة المتبقية، والسفن الأكبر حجماً، إلخ (والاذينين، إذا رغبت في ذلك). غسل القلوب في حبس الحل باستخدام التحريض لطيف.
- مقطعة 8 قطع كل قلب مع مقصات غرامة ونقل جميع أنسجة القلب بالملقط في بئر واحدة من صفيحة ثقافة الخلية 6-جيدا مع حبس (الشكل 1 و د 1).
- أغسل القلوب بنقل القلوب من بئر في لوحة 6-بئر مليئة بحبس، باستخدام ملعقة موريا (الشكل 1).
ملاحظة: نقل القلوب من بئر بما فيه الكفاية لتغسل الدم. منذ الدم يتداخل مع الهضم الأنزيمي من المهم أن تغسل القلوب مع حبس وإزالة الدم. - نقل القلوب مع ملعقة موريا في أنبوب مخروطي الشكل يحتوي على 20 مل التربسين (0.5 ملغ/مل) واحتضان مع الانفعالات لطيف في 4 درجات مئوية عن ح 4 (الشكل 1E).
3-إعداد لوحة ثقافة 96-جيدا (1 يوم)
- إعداد 5 مل من محلول طلاء: برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5% الجيلاتين (اﻷوتوكﻻف قبل الاستخدام) والحل فيبرونيكتين 1%. (مثل حل الجيلاتين مل 5 زائد 50 ميليلتر من حل فيبرونيكتين)
- الكوة ميليلتر 50 طلاء الحل إلى كل من لوحة الثقافة خلية 96-جيدا جيدا (انظر الجدول للمواد). في حالة وجود فقاعات إزالتها باستخدام ماصة 20 ميليلتر لامتصاص فقاعات بها.
ملاحظة: من المهم أن تغطي كل المساحة السطحية لكل بئر بمحلول طلاء. - احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية خلية ثقافة حاضنة ح 1 أو أكثر للسماح لتجفيف طلاء المصفوفة.
- نضح أي حل الطلاء المتبقية قبل البذر كارديوميوسيتيس.
4-الانزيمية الهضم والطلاء من الخلايا (1 يوم)
- قبل الحارة كولاجيناز الهضم الحل في حمام مائي 37 درجة مئوية.
ملاحظة: هذا هو خطوة هامة لتحقيق كفاءة الهضم الأنزيمي. - تحريك الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على قلوب والحل قبل الهضم من 4 درجة مئوية إلى غطاء ثقافة خلية. (الشكل 1F)
- اسمحوا القلوب تنزل إلى أسفل الأنبوب وإزالة الحل قبل الهضم باستخدام ماصة مصلية 10 مل من (1 إلى 2 مل الوسط العزلة قد تبقى في الأنبوب).
- أضف 10 مل حبس في الأنبوب. إعادة تعليق القلوب مع حبس 2-3 مرات تغسل التربسين استخدام ماصة مصلية من 10 مل. نضح حبس (1 إلى 2 مل قد تبقى في الأنبوب).
- أضف 10 مل من محلول الهضم كولاجيناز المعالجون مسبقاً في الأنبوب مع القلوب. (الشكل 1)
- احتضان الأنبوب بقلوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق دون الانفعالات (1st الهضم).
- بعد الهضم الأولى، نقل الأنبوب إلى هود ثقافة الخلية. بلطف تريتوراتي القلوب بإعادة تعليق القلوب داخل الأنبوب بلطف 10 مرات باستخدام ماصة مصلية من 10 مل. سيسمح هذا خلايا أن يفرج عنها من أنسجة القلب والقلوب لتفريق. (الشكل 1 ح)
ملاحظة: منذ cardiomyocytes هشة، المهم تريتوريشن لطيف لتحقيق جدوى عالية. - واسمحوا الأنسجة عسر الهضم بالوعة ونقل الحل هضمها أثري في cardiomyocytes (حوالي 9-10 مل) إلى أنبوب مخروطي الشكل جديد وإضافة مبلغ مساو من خلية ثقافة وسائل الإعلام لوقف عملية الهضم كولاجيناز فورا.
- أضف 10 مل من محلول الهضم كولاجيناز في أنبوب يحتوي على أنسجة القلب عسر الهضم المتبقية.
- احتضان الأنبوب مع أنسجة القلب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (2nd الهضم).
- كرر الإجراء 4.7 و 4.8.
ملاحظة: إذا كان هناك عسر الهضم لا يزال كثير من الأنسجة، كرر الهضم واحد مزيد من الوقت. ومع ذلك، في معظم الحالات، ديجيسشنز اثنين ما يكفي لتفريق معظم الخلايا من أنسجة القلب. - ضع عقيمة خلية-مصفاة (100 ميكرومتر النايلون مش) في أنبوب مخروطي عقيمة 50 مل جديدة. قبل الرطب مصفاة الخلية مع 2-3 مل من خلية ثقافة الإعلام وتمرير الخلايا من خلال الخلية-المصفاة. شطف الخلية المصفاة مع 2-3 مل من خلية ثقافة وسائل الإعلام. (1I الشكل)
- الطرد المركزي الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على كارديوميوسيتيس لمدة 5 دقائق في 180 x ز (1J الشكل). نضح المادة طافية (الشكل 1 K)، التي سوف تحتوي على خلايا الأنسجة الحطام وإعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من خلية ثقافة وسائل الإعلام (الشكل 1 لتر).
- بلطف ريسوسبيند الخلايا والخلايا طبق على طبق ثقافة خلية 10 سم (البلاستيك دون أي نوع من الطلاء) واحتضانها ح 1 في حاضنة ثقافة خلية (الطلاء قبل الأولى) (الشكل 1 م). تسمح هذه الخطوة ما قبل الطلاء غير cardiomyocytes، مثل الخلايا الليفية، وخلايا بطانية، على التمسك بالطبق ثقافة الخلية غير المصقول.
ملاحظة: عند هذه النقطة، كارديوميوسيتيس عادة شكل دائري وتظهر لامعة تحت المجهر. (الرقم 1N). - بعد الاحتضان ح 1، بلطف تحرض اللوحة وغسل الخلايا غير ملتصقة (التخصيب في cardiomyocytes) من طبق الثقافة 10 سم، وإعادة تعليق الخلايا بها مرارا وتكرارا بيبيتينج مستنبت الخلية على الطبق باستخدام ماصة مصلية من 10 مل. بعد ذلك، نقل الخلايا غير ملتصقة (التخصيب في cardiomyocytes) إلى 10 سم خلية ثقافة جديدة طبق (البلاستيك دون أي طلاء) واحتضانها ح 1 إضافية في حاضنة ثقافة خلية (الطلاء قبل الثانية).
ملاحظة: الخلايا التي تعلقها على اللوحة غير المغلفة المهيمن غير كارديوميوسيتيس: الخلايا الليفية، وخلايا بطانية، التي يمكن تصور تحت مجهر (1O الشكل). - بعد الطلاء قبل الثانية, بلطف تحرض اللوحة، تغسل الخلايا غير ملتصقة (كارديوميوسيتيس) من طبق الثقافة 10 سم، ثم نقل كارديوميوسيتيس في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد.
5-عد الخلايا والخلايا والطلاء في لوحة ثقافة خلية 96-جيدا (1 يوم)
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
- لوحة الخلايا في صفيحة مصفوفة خارج الخلية مغلفة ثقافة خلية 96-جيدا في كثافة بين 10 – 30 x3 10 خلايا/البئر باستخدام ماصة متعدد القنوات بحجم نهائي في 200 ميليلتر (الشكل 1 ف). استخدام الآبار A1 A12، H1 و H12 للخلفية: إضافة 200 ميليلتر من مستنبت آبار أخرى في هذه الآبار (لا الخلايا). احتضان اللوحة في حاضنة ثقافة خلية 37 درجة مئوية.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم اختبار استهلاك الأوكسجين باستخدام كثافات مختلفة الخلية مثل310 × 10 أو 20 × 103أو 30 × 103 خلايا/جيدا. (الشكل 2A). أيضا، كما ذكر أعلاه، كارديوميوسيتيس فورا بعد عزلة عادة شكل دائري وتظهر لامعة تحت المجهر. خلايا قابلة للحياة سوف تتسطح بها ضمن ح 16-24 من الثقافة.
6-الأكسجين استهلاك الإنزيم استخدام "محلل الجريان خارج الخلية" 96-جيدا-تنسيق (2 يوم)
ملاحظة: تحليل استهلاك الأكسجين يمكن القيام بها يوم واحد بعد طلاء الخلايا أو في وقت لاحق. الوليد cardiomyocytes مثقف استخدام هذا البروتوكول يمكن البقاء على قيد الحياة مدة تصل إلى 7 أيام بعد عزلة.
- هيدرات خرطوشة استشعار محلل التمويه (انظر الجدول للمواد) لمدة 3 ساعات على الأقل، ولكن من الناحية المثالية لمدة يوم كامل، قبل المقايسة. إضافة 200 ميليلتر لحل كاليبرانت (انظر الجدول للمواد) في البئر كل من لوحة الأداة، وضع خرطوشة استشعار يعيدوه لوحة الأداة، واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية دون CO2 أو س2 مكملات.
- تغيير وسائط الثقافة الخلية إلى الميتوكوندريا اختبار الإجهاد متوسط ساعة واحدة قبل المقايسة. كارديوميوسيتيس هشة. ولذلك، بلطف قم بإزالة وسائط الثقافة الخلية باستخدام ماصة متعدد القنوات وغسل الخلايا مع 200 ميليلتر لوسائل الإعلام قبل حرارة اختبار الإجهاد المتقدرية مرتين. بعد غسل الثانية، إضافة 175 ميليلتر من الميتوكوندريا دافئة قبل اختبار الإجهاد وسائل الإعلام والثقافة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية دون CO2 أو س2 مكملات.
- إعداد اختبار تتركز المركبات. لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا، وإعداد مل 3.0 كل 16 ميكرون أوليجوميسين، 9 ميكرون فككب وخليط من 20 ميكرومتر والروتينون و 20 ميكرومتر أنتيميسين A، الجميع في اختبار الإجهاد المتقدرية المتوسطة.
ملاحظة: تم اختبار كل مجمع في التركيز وصف. مع ذلك، من الضروري تركيز كل مجمع في مختبر واحد للمعايرة. - تحميل 25 ميليلتر لكل مجمع في موانئ حاقن خرطوشة استشعار استخدام ماصة من الأقنية (1Q الشكل). ويرد في الجدول 2حجم وتركيز النهائي.
- قم بإعداد بروتوكول تحليل الجريان خارج الخلية. ويرد وصف البرنامج في الجدول 3-
- بدء تشغيل البرنامج. أولاً، وضع خرطوشة استشعار إلى الجهاز للمعايرة (1R الشكل). استبدال كاليبرانت للوحة المقايسة حالما يتم الخطوة المعايرة.
ملاحظة: باستخدام البرمجيات التي توفرها الشركة المصنعة، تشير إلى مجموعات من الآبار وكل مجمع وميناء. - إذا رغبت في ذلك، بعد الفحص، بعناية تجاهل جميع المقايسة المتوسطة باستخدام ماصة متعدد القنوات وتخزين الميكروسكوبية ثقافة الخلية في-20 درجة مئوية لتطبيع الخليوي مستقبلا باستخدام مقايسة البروتين.
- قياس محتوى البروتين. إضافة 50 ميليلتر من حل تحلل الخلية ريبا القياسية (انظر الجدول للمواد). احتضان لوحة على الجليد لمدة 30 دقيقة الكامل الخلايا. نقل جميع المواد إلى لوحة فحص جيدا واضحة مسطحة قاع 96 جديدة.
- قياس تركيز البروتين بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
ملاحظة: طلاء جيدا مع المصفوفة خارج الخلية يؤدي تركيز عالية من بروتين في كل بئر. ولذلك، طرح مقدار well(s) الخلفية (لا الخلايا) للحصول على تركيز البروتين الخلايا الفعلية. تركيز البروتينات المشتقة من الخلايا منخفض في لوحة ثقافة 96-جيدا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تختلف تركيز البروتين من بئر بسبب طلاء المصفوفة خارج الخلية. ولذلك، يقترح استخدام رقم الخلية لتطبيع OCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام بروتوكول وصف، قلوب كانت معزولة من الجراء الولدان اليوم 0. وتم الحصول على 5 × 105 خلايا/ألجرو، وكانت تبذر cardiomyocytes كثافات من 10 × 103، 20 × 103أو 30 × 103 خلايا/حسنا، في لوحات جيدا 96 (الشكل 2A). بعد الثقافة بين عشية وضحاها، وعثر على كارديوميوسيتيس المرفقة جيدا على سطح البلاستيك المغلفة، وهناك عدد قليل جداً من الخلايا فاتحة (الخلايا فاتحة ستظهر لا يزال جولة ولامعة، مقارنة بخلايا صحية، المرفقة وسبريدوت) ( الشكل 2 ألف وب.) عند هذه النقطة، cardiomyocytes عفويا المتعاقدة كانت مرئية بسهولة. وأظهرت كثافة بذر 30 × 103 خلايا/بئر التقاء يوم واحد بعد البذر كما تنتشر الخلايا. كما عدد الخلايا (ميتا) جولة كانت منخفضة جداً، أظهرت هذه النتائج أن البروتوكول يعطي صلاحية خلية عالية كارديوميوسيتيس. وكانت كارديوميوسيتيس إيمونوستينيد مع جسم مضاد ضد ساركوميريك α-أكتينين، علامة محددة كارديوميوسيتي18 كدليل على هذا البيان. كما هو مبين في الشكل 2، أظهرت معظم الخلايا تلطيخ إيجابية من α-أكتينين عرض درجة نقاء عالية لعزل كارديوميوسيتي.
مخطط لاختبار الإجهاد المتقدرية نموذجي واحد يرد في الشكل 3. يبدأ اختبار الإجهاد المتقدرية مع قياس خط أساس من معدل استهلاك الأوكسجين (OCR). ويعقب هذا الحقن أوليجوميسين، الذي يحول دون ATPase. الفرق قبل وبعد الحقن أوليجوميسين يظهر التعرف الضوئي على الحروف المرتبطة بإنتاج ATP. ثم تم حقن عامل يفصل فككب لقياس معدل استهلاك الأكسجين الأقصى. يمكن حساب القدرة التنفسية قطع الغيار كالفرق بين القاعدية والتعرف الضوئي على الحروف أقصى حد. وأخيراً، مع حقن اثنين مثبطات الإلكترون النقل المعقدة (أنتيميسين A ووالروتينون)، توقف التنفس المتقدرية تماما، والتعرف الضوئي على الحروف يقلل إلى أدنى مستوى لها. عن طريق حظر نشاط المتقدرية، على هذا الصعيد، استهلاك الأوكسجين غير الميتوكوندريا. التنفس القاعدية، وتسرب بروتون والتنفس القصوى يمكن أن تحسب على أساس الفرق بين التنفس غير المتقدرية (التعرف الضوئي على الحروف حضور أنتيميسين أ ووالروتينون) وقياس خط الأساس، والتعرف الضوئي على الحروف حضور أوليجوميسين والتعرف الضوئي على الحروف في وجود فككب، على التوالي.
في هذه الدراسة، تم إجراء تحليل التعرف الضوئي على الحروف باستخدام نظام محلل الجريان خارج الخلية تنسيق 96-جيدا بعد عزل خلية يوم واحد. لاختبار تأثير المجاعة المصل على التعرف الضوئي على الحروف، ثلاث ساعات قبل الفحص، بالإضافة إلى ذلك، تم تغيير وسائل الإعلام ثقافة الخلية الخلية العادية الثقافة وسائط النمو مع المصل، أو دون المصل. بعد التشغيل، بيانات القياس الضوئي 1 حتى 12 لكل جيدا، تم تصدير إلى جدول بيانات لحفظ السجلات وإجراء مزيد من التحليل. الخصائص الأيضية حددت كما يلي:
التنفس المتقدرية عدم = متوسط التعرف الضوئي على الحروف (10، 11، 12)
تنفس القاعدية = متوسط التعرف الضوئي على الحروف (1، 2، 3)--متوسط التعرف الضوئي على الحروف (10، 11، 12)
إنتاج ATP = متوسط التعرف الضوئي على الحروف (1، 2، 3)--متوسط التعرف الضوئي على الحروف (4، 5، 6)
تسرب بروتون = متوسط التعرف الضوئي على الحروف (4، 5، 6)--متوسط التعرف الضوئي على الحروف (10، 11، 12)
التنفس القصوى = متوسط التعرف الضوئي على الحروف (7، 8، 9)--متوسط التعرف الضوئي على الحروف (10، 11، 12)
كما هو موضح في الشكل 4A، تم تحليل قيم التعرف الضوئي على الحروف بسهولة، وآثار حقن المركبات كانت واضحة أيضا. الأهم من ذلك، الاختلاف من بئر لكانت صغيرة كما هو موضح بالخطأ القياسي. زيادة في الخلية عدد أسفرت عن قياس خط الأساس زيادة، أوليجوميسين، ويعامل فككب التنفس. بالمقارنة مع خلايا مصل جوعاً، التعرف الضوئي على الحروف كان أعلى في خلايا تحليل قد تم المحتضنة مع وسائط النمو. كما هو موضح في الشكل 4 باء، التعرف الضوئي على الحروف هو موضح في التنفس القاعدية، وتسرب بروتون (اليغو)، والتنفس القصوى (فككب) الواحدة 1 × 104 خلايا. التعرف الضوئي على الحروف الواحدة 10 × 103 خلايا كان أعلى كثافة البذر 20 K و 30 ك خلايا/بئر ك 10 خلايا/جيدا. كما هو مبين في الشكل 4، بالإعراب عن التعرف الضوئي على الحروف بالنسبة للتنفس القاعدية، وتسرب "التعرف الضوئي على الحروف من بروتون" (اليغو) النسبية والقصوى (فككب) إظهار قيم مماثلة بين وسائط النمو والمصل المتعطشة للمجموعات. وتوحي هذه النتائج أن بذر الكثافة لا يؤثر بروتون النسبي تسرب والأعلى قدرة الأكسدة.
عموما، باستخدام هذا البروتوكول، غلال ممتازة للماوس كارديوميوسيتيس حديثي الولادة بنجاح معزولة ومثقف. ويمكن تقييم التعرف الضوئي على الحروف باستخدام هذه ميوسيتيس في محلل الجريان خارج الخلية. وأظهرت النتائج أيضا أن بذر الكثافة لا تؤثر تأثيراً كبيرا على التعرف الضوئي على الحروف محسوبة بعدد الخلايا. ومع ذلك، يقلل المجاعة المصل قصير (3 ح) التعرف الضوئي على الحروف. أن المعلومات مفيدة لاختبار cardiomyocytes الولدان التعرف الضوئي على الحروف الماوس مع مختلف الظروف التجريبية.
رقم 1: العزلة وثقافة كارديوميوسيتيس حديثي الولادة من الفئران حديثي الولادة اليوم 0- هي euthanized الولدان (A)، وهو تشريح القلب من الصدر. (ب) قلوب تغسل في هبس (دون Ca2 +, Mg2 +). (ج) كل قلب مقطعة 8 قطع. قلوب (د) يتم نقلها إلى لوحة 6-بئر مليئة بحبس. تغسل القلوب باستخدام ملعقة موريا لنقلها من بئر. (ﻫ) قلوب ما قبل هضمها في حبس التربسين في 4 درجات مئوية مع الانفعالات لطيف. (و) بريديجيستيد القلب الأنسجة بعد الاحتضان ح 4 في 4 درجات مئوية. (ز) القلب الأنسجة بعد 10 دقيقة كولاجيناز الهضم. كولاجيناز (ح) يهضم يسحق هي أنسجة القلب. تم تصفية كارديوميوسيتيس (أنا) المعزولة من خلال مصفاة خلية. (ي) كارديوميوسيتيس هم القريبون بالطرد المركزي. تتم إزالة كولاجيناز (K) وثقافة وسائل الإعلام بالطموح. كارديوميوسيتيس (L) إعادة معلقة في مستنبت الطازجة. كارديوميوسيتيس (م) تستزرع في طبق بلاستيك 10 سم لما قبل الطلاء. (ن) بصورة الممثل كارديوميوسيتيس (الخلايا جولة ولامعة) بعد ح 1 من الطلاء قبل. (س) بعد ما قبل الطلاء، ومن ثم إزالة cardiomyocytes غير ملتصقة، تبقى الخلايا التي عادة ما تكون الخلايا الليفية، وخلايا بطانية مرئية. (ف) الطلاء كارديوميوسيتيس في لوحة 96-جيدا. (س) تحميل الكواشف في منافذ حقن لاستشعار خرطوشة. (ص) وضع جهاز استشعار خرطوشة في جهاز محلل الجريان خارج الخلية. شريط المقياس = 0.1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: ثقافة cardiomyocytes على الجريان خارج الخلية محلل لوحة 96-جيدا- (أ) صور الممثل من كارديوميوسيتيس في لوحات 96-جيدا مع كثافة الخلية المشار إليها، مباشرة بعد البذر (الصف العلوي) أو ح 18 وظيفة بذر (الصف السفلي). (ب) صورة التكبير أعلى cardiomyocytes ح 18 وظيفة البذر في كثافة خلية من 10 × 103 خلايا/جيدا. كارديوميوسيتيس (ج) كانت ملطخة بالاضداد المضادة ساركوميريك α-أكتينين (الأخضر) و DAPI (كوصمة عار نووية) (أزرق). شريط المقياس = 0.1 ملم. يمكن الاطلاع على الأساليب المستخدمة في إيمونوستينينج في أعمالنا المنشور السابق18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. التمثيل التخطيطي لاختبار الإجهاد المتقدرية. معلمات الطاقة البيولوجية، بما في ذلك القاعدية والتنفس المرتبطة ATP والقصوى، وعدم المتقدرية، فضلا عن قطع الغيار قدرة الجهاز التنفسي وتسرب بروتون، يرد على التتبع مع المستجيبة المتقدرية المقابلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تحليل الإجهاد Mitochondrial. (أ) تتبع الممثل لمعدلات استهلاك الأوكسجين (التعرف الضوئي على الحروف، في بموليس بالدقيقة) للماوس الولدان كارديوميوسيتيس. على أشير مرات، أوليجوميسين (اليغو، 1 ميكرومتر)، فككب (800 nM)، وتم حقن RAA (والروتينون وأنتيميسين أ، كل 1 ميكرومتر). لكل قياس، ويرد يعني والخطأ المعياري للوسط (SEM) 10 آبار الفردية. (ب) التعرف الضوئي على الحروف يحسب كالتنفس القاعدية، اليغو (تسرب بروتون)، وفككب (التنفس القصوى) كل 10 × 103 خلايا. يتم التعبير عن التعرف الضوئي على الحروف (ج) بالنسبة للتنفس القاعدية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اسم الكاشف والحل | إعداد | وتلاحظ |
| التربسين هضم قبل الحل | حل التربسين في حبس (دون Ca2 + و Mg2 +). التركيز النهائي 0.5 ملغ/مل. تعقيم الحل باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام. | جعل الحل الهضم قبل يوم من التجربة. |
| الحل الهضم كولاجيناز | حل التربسين في حبس (دون Ca2 + و Mg2 +). التركيز النهائي 0.5 ملغ/مل. تعقيم الحل باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام. | جعل الحل الهضم كولاجيناز اليوم للتجربة. |
| كارديوميوسيتي ثقافة وسائل الإعلام | مل 375 مزيج من دميم، 125 مل من M-199، 25 مل من مصل الحصان، و 12.5 مل من FBS. الملحق مع البنسلين 1% ومحلول ستربتوميسين 1%. | يمكن كارديوميوسيتي ثقافة وسائل الإعلام قبل التجربة وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة شهر. |
| اختبار الإجهاد المتقدرية المتوسطة | أولاً، جعل 1 لتر من المتوسطة مع دميم دون أي بيروفات صوديوم ولام الجلوتامين، الجلوكوز، وحبيس، تصفية لتعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية. في يوم الفحص، إضافة بيروفات صوديوم ولام الجلوتامين والسكر وحبيس. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 قبل الاستخدام (التعقيم غير مطلوب). | التركيز النهائي للمكملات الغذائية هي التالية: بيروفات صوديوم (1 مم) ولام الجلوتامين (2 مم) والسكر (10 ملم) وحبيس (2 مم) |
| الأسهم أوليجوميسين | حل أوليجوميسين في [دمس]. أولاً، إعداد 5 مل من محلول الأسهم. حالما يتم حل أوليجوميسين تماما في [دمس]، جعل 250 ميليلتر مختبرين، تخزين في-20 درجة مئوية. | في يوم الفحص، تأخذ قاسمة واحد لاستخدام. تجنب كثير من تجميد أذاب دورات. |
| الأسهم فككب | حل فككب في [دمس]. أولاً، إعداد 5 مل من محلول الأسهم. التركيز النهائي 5 ملم. حالما يتم حل فككب تماما في [دمس]، جعل 250 ميليلتر مختبرين، تخزين في-20 درجة مئوية. | في يوم الفحص، تأخذ قاسمة واحد لاستخدام. تجنب كثير من تجميد أذاب دورات. |
| الأسهم A أنتيميسين | حل أ أنتيميسين في [دمس]. أولاً، إعداد 5 مل من محلول الأسهم. التركيز النهائي 5 ملم. بمجرد أنتيميسين A تماما يذوب في [دمس]، جعل 250 ميليلتر مختبرين، تخزينها في-20 درجة مئوية. | في يوم الفحص، تأخذ قاسمة واحد لاستخدام. تجنب كثير من تجميد أذاب دورات. |
| الأسهم والروتينون | حل والروتينون في [دمس]. أولاً، إعداد 5 مل من محلول الأسهم. التركيز النهائي 5 ملم. حالما يتم حل والروتينون تماما في [دمس]، جعل 250 ميليلتر مختبرين، تخزين في-20 درجة مئوية. | في يوم الفحص، تأخذ قاسمة واحد لاستخدام. تجنب كثير من تجميد أذاب دورات. |
| خلية ثقافة لوح طلاء الحل | أولاً، إجراء 200 مل محلول الجيلاتين 0.5%. حل الجيلاتين في برنامج تلفزيوني والاوتوكلاف. في يوم التجربة، إضافة 50 ميليلتر من حل فيبرونيكتين في 5 مل الجيلاتين الحل لجعل الحل الطلاء. | 0.5 ويمكن تخزين محلول الجيلاتين % عند درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى شهرين. |
الجدول 1: المواد الكاشفة والحلول.
| منفذ الحقن | المركبات وتركيز | حجم حقن أثناء التشغيل (ميليلتر) | التركيز النهائي في مقايسة |
| A | أوليجوميسين 16 ميكرومتر | 25 | 2 ميكرومتر |
| ب | فككب 9 ميكرومتر | 25 | 1 ميكرومتر |
| ج | والروتينون 20 ميكرومتر (Rot) و 20 ميكرومتر أنتيميسين A (أإ) |
25 | 2 ميكرومتر كل |
الجدول 2: حقن الخلائط.
| الخطوات والإجراءات | القياسات والحلقات |
| معايرة | - |
| الموازنة | - |
| قياس خط الأساس | 3 مرات: مزيج 3 دقيقة، انتظر 2 دقيقة، وقياس دقيقة 3 |
| حقن المنفذ (أوليجوميسين) | - |
| القياسات | 3 مرات: مزيج 3 دقيقة، انتظر 2 دقيقة، وقياس دقيقة 3 |
| حقن منفذ ب (فككب) | - |
| القياسات | 3 مرات: مزيج 3 دقيقة، انتظر 2 دقيقة، وقياس دقيقة 3 |
| حقن ميناء ج (RAA) | - |
| القياسات | 3 مرات: مزيج 3 دقيقة، انتظر 2 دقيقة، وقياس دقيقة 3 |
الجدول 3: الجريان خارج الخلية محلل البرنامج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، وقد أنشأنا بروتوكول بسيط لعزل واستزراع الماوس cardiomyocytes حديثي الولادة. باستخدام هذه كارديوميوسيتيس، نحن أيضا الأمثل الظروف لقياس معدل استهلاك الأكسجين باستخدام نظام محلل الجريان خارج الخلية. البروتوكول يسمح لأحد استخدام الماوس كارديوميوسيتيس حديثي الولادة كنظام نموذجي لفحص عوامل مختلفة كيف يمكن أن يغير استهلاك الأوكسجين في الخلايا العامل الرئيسي للقلب، وأقرب إلى ما سوف يمكن قياسه في الجهاز سليمة. يختلف لدينا بروتوكول من البروتوكولات نشرت سابقا16،18. أولاً، لتحقيق استمرارية عالية، الجراء فقط فورا عند الولادة المستخدمة (أي P0)، بدلاً من تلك من أيام صفر لمدة ثلاثة أيام عمر (P0 إلى P3 الجراء)، التي تستخدم عادة في16،البروتوكولات الأخرى19. وثانيا، لتقليل وقت التجربة، قلوب كانت فقط قبل يهضم مع التربسين ح 4. وبالإضافة إلى ذلك، جعل الإجراءات بسيطة وتحقيق النتائج استنساخه، استخدمنا أقل عدد من الخطوات، كما هو مبين. على سبيل المثال، لدينا بروتوكول يستخدم فقط نوعين من المخازن المؤقتة، وبرنامج تلفزيوني، وحبس، ونوع واحد فقط من خلية ثقافة وسائل الإعلام، وعدم توظيف الانفعالات أثناء الهضم كولاجيناز.
لتحقيق الجدوى العالية للماوس الولدان cardiomyocytes، هو أمر هام لإمكانية تكرار نتائج للمقايسة التعرف الضوئي على الحروف، وهناك العديد من النقاط الحرجة. أولاً، استخدام الجراء P0 الوليد وأداء التربسين قبل الهضم والهضم كولاجيناز في اليوم نفسه أمر حاسم لتحقيق جدوى عالية. ثانيا، خلال كولاجيناز الهضم، لا ينصح تحرض أنسجة القلب في حمام الماء 37 درجة مئوية. على الرغم من أن الانفعالات يقترح في العديد من البروتوكولات، وجدنا أن هذا ليس ضروريا كما قلوب P0 سهلة لأن يهضم كولاجيناز. وأخيراً، تريتوراتينج برفق أنسجة القلب أمر حاسم لتنأى في cardiomyocytes بعد الهضم كولاجيناز.
كما اختبرناها myocytes من أنسجة القلب ألجرو P1 و P2، استخدام البروتوكول نفسه. ومع ذلك، لهذه العينات القلب كبار السن، وجدنا أنه من الضروري إجراء التربسين قبل الهضم بين عشية وضحاها إلى تحقيق غلات خلية كافية (البيانات لا تظهر). وباﻹضافة إلى ذلك، بقاء الخلية ل cardiomyocytes P1 و P2 كان حوالي 60%, مماثلة إلى أن في أخرى نشرت دراسات16. هذه النتائج تشير إلى أن عضلة القلب P0 كميات أقل نسبيا من المصفوفة خارج الخلية من قلوب كبار السن، التي تمكن من أوقات أقصر الهضم قبل التربسين، أسفر عن بقاء الخلية أعلى وغلة من هذه القلوب الأصغر سنا.
تحليل الجريان خارج الخلية (XF) أصبحت وسيلة رئيسية وشعبية لقياس دالة الطاقة البيولوجية في خلايا و20،الميتوكوندريا المعزولة21. وحتى الآن، تستخدم الفئران حديثي الولادة cardiomyocytes عددا من الدراسات وقياس استهلاك الأوكسجين، باستخدام XF24 اجيلنت نظام22،،من2324 . وأجريت هذه الدراسات باستخدام خلايا الفئران بدلاً من الخلايا المشتقة من الماوس، يرجح أن خلايا الفئران عموما يكون أعلى الخلية جدوى وإمكانية تكرار نتائج الفحص، بالمقارنة مع myocytes القلب الماوس درس هنا. ونظرا لأن الحيوانات المحورة وراثيا تم إنشاؤها أساسا في خطوط الماوس، بروتوكول بسيط واستنساخه لتحليل وظيفة الطاقة البيولوجية في cardiomyocytes الولدان الماوس، ونحن نناقش في هذه المخطوطة، يوفر فرصاً للدراسة الوظيفة المتقدرية في الماوس myocytes القلب. هذا الأسلوب يمكن أن يترجم بسهولة أكبر للبيانات التي يمكن أن تؤدي إلى فهم آليات جديدة لتنظيم الطاقة البيولوجية في القلب، باستخدام الماوس الجديدة أو القائمة التلاعب وراثيا خطوط25،26.
في هذه الدراسة، ونحن اختبار أثر عدد الخلايا والكثافة على التعرف الضوئي على الحروف. كما هو موضح في الشكل 4 باء، والتعرف الضوئي على الحروف تقاس في الآبار مع310 × 10 و 20 × 103و 30 × 103 خلايا/جيدا، كانت مشابهة. وبالنظر إلى أن طلاء 30 × 103 خلايا/بئر أنتجت بئر المتلاقية خلال يوم واحد بعد البذر، نوصي بتقسيم الخلايا بين 10 × 103 إلى 30 × 103 خلايا/بئر في لوحة 96، حسنا، للمقايسة التعرف الضوئي على الحروف. من المثير للاهتمام أننا وجدنا ح 3 من المجاعة المصل انخفض التعرف الضوئي على الحروف. عوامل النمو معروفة لتنشيط تحلل وزيادة استهلاك الأكسجين27. وأفيد أيضا أن تعزز عوامل النمو عموما النشاط الخلوي وانكماش كارديوميوسيتيس3،28. يتطلب تقلص كارديوميوسيتي ATP الجيل2، الذي يعتمد على استهلاك الأوكسجين. ولذلك، تشير هذه البيانات إلى أن المجاعة المصل يقلل من استهلاك الأوكسجين من خلال المنظمة كارديوميوسيتيس. أننا نوصي باختبار تأثير المجاعة المصل على التعرف الضوئي على الحروف في الإعداد المرء التجريبية.
وكما ذكر، الميتوكوندريا دوراً رئيسيا في وظيفة القلب. ولذلك، تحديد المنظمين الرواية وسبل تنظيم استقلاب الأكسدة يمكن أن توفر وسيلة لتحديد الأهداف العلاجية رواية لعلاج فشل القلب. نظراً لتوفر تنسيقاً جيدا 96 للقدرة على اختبار عدد أكبر من اختبار ظروف مقارنة بشكل جيد 24، هذا البروتوكول أيضا يمكن أن تتكيف بسهولة مع شاشة عالية إنتاجية لتحديد رواية المنظمين الطاقة البيولوجية في cardiomyocytes29 . وهكذا، من خلال الجمع بين لدينا بروتوكول مع وراثيا التلاعب كارديوميوسيتيس حديثي الولادة، مثل تلك التي لديها طفرات الميتوكوندريا30، ويمكن أن توفر دراسات مثيرة للاهتمام لفحص آثار المركبات الكيميائية أو مكتبات كدنا، على التعرف الضوئي على الحروف في مقابل البرية من نوع. كارديوميوسيتيس أيضي معيبة.
ونحن ندرك أن كارديوميوسيتيس الأطفال حديثي الولادة والكبار لها العديد من الخصائص المختلفة والوظائف الأيضية31، بما في ذلك مستويات التعبير من الإنزيمات الاستقلابية الجلوكوز والأحماض الدهنية32. ولذلك مثالي لاستخدام cardiomyocytes المستزرعة في المختبر كنظام نموذجي للقلب سليمة، سيكون مهما لمواصلة تطوير بروتوكول لتحليل كفاءة التعرف الضوئي على الحروف في cardiomyocytes الكبار، حتى أن أحد يمكن أن يقارن قدرتها الأكسدة و الخصائص مع كارديوميوسيتيس الأطفال حديثي الولادة. الدراسات المستقبلية ستحتاج إلى اتباعها من أجل التكيف مع هذه المنهجية إلى نظام قابل لإعادة الإنتاج باستخدام myocytes القلب الكبار.
وخلاصة القول، نعرض بروتوكول بسيط واستنساخه لتحليل استهلاك الأكسجين باستخدام الماوس مثقف الأساسي الماوس الولدان كارديوميوسيتيس. باستخدام هذا البروتوكول، يمكننا بنجاح عزل والثقافة cardiomyocytes الولدان الماوس وإجراء هذا الفحص التعرف الضوئي على الحروف باستخدام نظام محلل الجريان خارج الخلية تنسيق 96-جيدا. لدينا بروتوكول يعطي صلاحية عالية، والأهم من ذلك، النتائج استنساخه باستمرار. على الرغم من أن الدراسة الحالية تركز أساسا على استهلاك الأكسجين واختبار الإجهاد المتقدرية، البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لتحليل أكسدة الأحماض الدهنية وتحلل في cardiomyocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
نود أن نشكر كل مختبر روس وأعضاء مختبر مورفي. هذا العمل معتمد من قبل "جمعية القلب الأمريكية" (14SDG17790005) للمعاهد الوطنية للصحة أ (HL115933، HL127806) وخامساً الجدارة (BX003260) إلى R.S.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L.
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T.
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S.
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
