Summary
El objetivo de este protocolo es ilustrar cómo utilizar cardiomiocitos neonatales de ratón como modelo para analizar cómo diversos factores pueden alterar el consumo de oxígeno en el corazón.
Abstract
Mitocondrias y metabolismo oxidativo son críticos para mantener la función del músculo cardiaco. Investigaciones han demostrado que la disfunción mitocondrial es un factor importante que contribuye al deterioro de la función cardiaco en insuficiencia cardíaca. Por el contrario, la restauración de la función mitocondrial defectuosa puede tener efectos beneficiosos para mejorar la función cardiaca en el corazón de la falla. Por lo tanto, estudiar los mecanismos de regulación y la identificación de nuevos reguladores de la función mitocondrial pueden proporcionar la penetración que podría utilizarse para desarrollar nuevos blancos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades del corazón. Aquí, la respiración mitocondrial del miocito cardiaco se analiza mediante un sistema de cultivo de célula única. En primer lugar, se ha optimizado un protocolo para aislar rápidamente y cultura alta viabilidad neonatal ratón cardiomiocitos. Entonces, un analizador de flujo extracelular de formato de 96 pozos se utiliza para evaluar la tasa de consumo de oxígeno de estos cardiomiocitos. De este protocolo, optimizar las condiciones de siembra y demostró que tasa de consumo de oxígeno de cardiomiocitos de ratón neonatal puede evaluarse fácilmente en un analizador de flujo extracelular. Por último, observamos que nuestro protocolo se puede aplicar a un tamaño más grande de la cultura y análisis de la función de otros estudios, como la señalización intracelular y contráctil.
Introduction
Para mantener una función contráctil cardiaca continua, cardiomiocitos deben mantener un suministro constante de energía celular principalmente en forma de ATP1. En el corazón, se genera aproximadamente el 95% de ATP por las mitocondrias, principalmente a través de la fosforilación oxidativa, mostrando que las mitocondrias desempeñan un papel crucial de la bioenergético en la función cardiaca2,3. Apoyo a esta noción es que la desregulación de la función mitocondrial puede conducir a cardiomiopatía e insuficiencia cardíaca4,5. Por el contrario, restauración de la función mitocondrial se ha demostrado para mejorar la función cardiaca de la falla del corazón6,7. Por lo tanto, estudiar el mecanismo de la bioenergética mitocondrial y la identificación de nuevos reguladores de la función mitocondrial en los cardiomiocitos no sólo revela ideas mecanicistas de la producción energética cardiaca pero también pueden proporcionar la penetración que desarrollo de nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades del corazón6,8.
Comparado con el corazón entero, que contiene una mezcla de miocitos y miocitos no9, cultivos de cardiomiocitos son extremadamente puro, con la mínima contaminación de no miocitos del corazón, tales como fibroblastos y células endoteliales10. Además, aislar los cardiomiocitos de los cachorros neonatales permite cultivar un gran número de células en una pequeña cantidad de tiempo, comparado con el aislamiento de las células de corazones adulto10,11. Lo más importante, ratón adulto culto primario cardiomiocitos tienen supervivencia corta veces (p. ej. 24 h) y en tiempo de puntos de diferencian. Cardiomiocitos neonatales ratón pueden sobrevivir y ser manipulada por más de 7 días en cultivo, lo que es ideal para probar los efectos de los compuestos de drogas y manipulación de genes en la función de la mitocondria en cardiomiocitos10. Por supuesto, existen diferencias biológicas importantes entre las células de adulto y neonatales, pero la duración más larga disponible para el cultivo de células neonatales los hace apropiados para diferentes tipos de estudios, los de la función mitocondrial incluidos.
Hasta la fecha, cardiomiocitos neonatales cultivados primarias de la rata y ratón se han utilizado como modelos para estudiar bioenergética cardíaca12,13. En los últimos años, estudios utilizan un analizador de flujo extracelular para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y evaluar la capacidad oxidativa en ratón y rata cardiomiocitos neonatales14,15. Mientras que en comparación con las ratas, la viabilidad celular de cardiomiocitos neonatales de ratón es menor y tiene una mayor variabilidad16. Además, la capacidad para el estudio de células a partir de modelos de ratón modificados genéticamente hace muy importante el modelo de célula de ratón. Dado que estudios de OCR son tan sensibles a la célula número y densidad de siembra, es necesario el desarrollo de un protocolo simple, reproducible y confiable para lograr la viabilidad y rendimiento constante de la célula.
Aquí, Divulgamos un protocolo optimizado que se ha desarrollado que utiliza ratón cultivados cardiomiocitos neonatales junto con un analizador de flujo extracelular 96-bien-formato para el análisis de OCR. Este protocolo aumenta la reproducibilidad del ensayo. Además, el Protocolo no sólo proporciona un método reproducible para el análisis de OCR y novela, sino que también podría adaptarse a una cultura más grande de tamaño para propósitos experimentales, como la que puede ser necesario estudiar las funciones miofibrilar e intracelular vías de señalización.
En particular, este protocolo describe un procedimiento de un día para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón en una placa de cultivo celular de 96 pozos. Además, describe el procedimiento para medir el consumo de oxígeno usando un analizador de flujo extracelular. Todas las soluciones utilizadas son estériles o filtrado estéril. Todas las herramientas son esterilizadas por el etanol del 75%. Le ofrecemos una Tabla de materiales para diferentes partes del procedimiento. Para el cultivo de cardiomiocitos, todos los procedimientos y pasos se llevan a cabo en una campana de la cultura de célula estándar. Este protocolo está desarrollado para el aislamiento de corazones de ratón neonatal de una camada (aproximadamente 8-10 crías). Sin embargo, el protocolo también puede adaptarse para aislar cardiomiocitos de camadas múltiples.
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Protocol
Para el trabajo con ratones neonatales, se refieren al conjunto de pautas locales Instituto adelante por los programas de cuidado de los animales y se adhieren a la institucional y otras regulaciones apropiadas. Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por la UC San Diego Animal cuidado institucional y el Comité uso (IACUC) y adhieran a regulaciones federales y estatales.
1. preparación de reactivos
- Preparar 25 mL de solución de digestión previa: HBSS (sin Ca2 + y Mg2 +) complementada con tripsina (0.5 mg/mL). Esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 μm y mantener en hielo hasta su uso. Hacer solución de digestión previa en el día del experimento.
Nota: Es fundamental utilizar HBSS sin Ca2 + y Mg2 +, Ca2 + y Mg2 + hará que la contracción del miocito y la muerte subsecuente de la célula durante el aislamiento. - Preparar 30 mL de tampón de digestión colagenasa: colagenasa (0,8 mg/mL, aproximadamente 350 U/mL) disuelto en tampón HBSS (sin Ca2 + y Mg2 +). Esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 μm y mantener en hielo hasta su uso. Hacer solución de digestión de colagenasa en el día del experimento.
- Preparar 500 mL de medio de cultivo de cardiomiocitos (medios de cultivo): se mezclan 375 mL de DMEM, 125 mL de M-199, 25 mL de suero de caballo y 12,5 mL de SBF. Suplemento con penicilina de 1% y 1% solución de estreptomicina.
- Preparación de medio de prueba de estrés mitocondrial: hacer 200 mL de DMEM basado en prueba de esfuerzo suplementado (DMEM sin NaHCO3, véase Tabla de materiales) con piruvato de sodio 1 mM, 2 mM L-glutamina y glucosa 10 mM y 2 mM Hepes.
Nota: Hacer 1 L de medio con DMEM sin piruvato de sodio, L-glutamina, glucosa y Hepes, filtro estéril y almacenar a 4 ° C. Preparar el medio de prueba de esfuerzo en el día del ensayo mediante la adición de otros reactivos. Con DMEM medio sin NaHCO3 es fundamental. - Ajustar el pH de los medios de prueba de estrés mitocondrial a 7.4 en el día de uso. Medios de comunicación tibia a 37 ° C antes de usar.
- Preparar oligomycin: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.
- Preparar FCCP: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.
- Preparar la antimicina A: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.
- Preparar la rotenona: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.
Nota: Todos los reactivos y soluciones utilizadas en el presente Protocolo se enumeran en la tabla 1.
2. recolección y pre digestión de corazones de ratones neonatales (día 1)
- Autoclave tijeras, pinzas y una cuchara de Moria para esterilizar.
- Realizar todos los pasos en la campana de la cultura de célula para la esterilidad.
- 5 mL alícuota de HBSS (sin Ca2 +, Mg2 +) en cada pocillo de una placa de cultivo celular 6-bien; Coloque en hielo. Alícuota 10 mL de HBSS en una placa de cultivo celular de 10 cm.
- Prepare 20 mL de solución de la digestión de tripsina en un tubo cónico estéril de 50 mL. Mantenga todas las soluciones en el hielo.
- Rápidamente sumergir ratones recién nacidos (día 0) en la solución de etanol 70% para la esterilización.
- Decapitar a PUP utilizando tijeras estériles (recto) sin anestesia y luego abre el cofre a lo largo del esternón para permitir el acceso a la cavidad torácica y el corazón. (Figura 1A)
Nota: 1) es importante utilizar ratones neonatales P0 para lograr viabilidad celular alta. 2) este método de eutanasia está permitida para los recién nacidos con arreglo a las pautas de NIH y la Asociación Médica Veterinaria americana 17. - Extraer corazones del cuerpo con tijeras finas y transferencia inmediatamente en el plato de cultura de célula estéril con HBSS (sin Ca2 +, Mg2 +) (figura 1B).
- Eliminar cualquier tejido pulmonar residual, los buques más grandes, etc. (y atria, si lo desea). Lavar el corazón en la solución HBSS con agitación suave.
- Cortar cada corazón con unas tijeras finas en 8 pedazos y transferir todo el tejido de corazón con unas pinzas en un pozo de una placa de cultivo celular 6-bien con HBSS (figura 1C y 1D).
- Lavar los corazones mediante la transferencia de los corazones de bien a bien en la placa de 6 pozos con HBSS, con una cuchara de Moria (figura 1).
Nota: Transferencia de los corazones de bien a bien es suficiente para lavar la sangre. Puesto que la sangre interfiere con la digestión enzimática es importante lavar los corazones con HBSS y sacar sangre. - Transferir el corazón con una cuchara de Moria en un tubo cónico que contiene 20 mL de tripsina (0.5 mg/mL) e incubar con agitación suave a 4° C por 4 h (Figura 1E).
3. prepare una placa de cultivo de 96 pocillos (día 1)
- Preparar 5 mL de solución de recubrimiento: PBS con 0,5% gelatina (autoclave antes de su uso) y fibronectina solución al 1%. (por ejemplo, 5 mL de solución de gelatina y 50 μl de solución de fibronectina)
- Alícuota de 50 μl de solución de recubrimiento en cada pocillo de la placa de cultivo celular de 96 pozos (véase Tabla de materiales). Si las burbujas están presentes, eliminarlos utilizando una pipeta de 20 μl para aspirar las burbujas hacia fuera.
Nota: Es importante cubrir toda la superficie de cada pocillo con la solución de recubrimiento. - Incube la placa en una incubadora de cultura de célula de 37 ° C durante 1 h o más para permitir el secado de la capa de matriz.
- Aspirar cualquier solución de capa residual antes de sembrar de cardiomiocitos.
4. enzimática digestión y galjanoplastia de células (día 1)
- Caliente previamente la solución de digestión de colagenasa en un baño de agua de 37 ° C.
Nota: Este paso es importante para lograr la digestión enzimática eficiente. - Mover el tubo cónico que contiene corazones y solución de digestión antes de 4 ° C a una campana de cultivo celular. (Figura 1F)
- Deja que el corazón se hunde hasta el fondo del tubo y retirar la solución de la digestión mediante el uso de una pipeta serológica de 10 mL (1 a 2 mL del medio de aislamiento puede permanecer en el tubo).
- Añadir 10 mL de HBSS en el tubo. Vuelva a suspender los corazones con HBSS 2 - 3 veces a lavar con una pipeta serológica de 10 mL de tripsina. Aspirar HBSS (1 a 2 mL puede permanecer en el tubo).
- Añadir 10 mL de solución de digestión con colagenasa en el tubo con el corazón. (Figura 1)
- Incubar el tubo con el corazón en un baño de agua de 37 ° C durante 10 minutos sin agitación (1 º digestión).
- Después de la 1 º digestión, mueva el tubo a la campana de la cultura de célula. Suavemente triturate corazones por volver a suspender los corazones dentro del tubo suavemente 10 veces usando una pipeta serológica de 10 mL. Esto permitirá que corazones para dispersar y células liberadas del tejido cardíaco. (Figura 1 H)
Nota: Cardiomiocitos son frágiles, trituración suave es importante para lograr alta viabilidad. - Que el tejido no digerido fregadero, transferencia digerido solución enriquecida en cardiomiocitos (aproximadamente 9-10 mL) a un tubo cónico nuevo y añadir la misma cantidad de medios de cultivo celular para detener la digestión de la colagenasa.
- Añadir 10 mL de solución de digestión de colagenasa en el tubo que contiene el tejido restante del corazón sin digerir.
- Incubar el tubo con tejido cardíaco en un baño de agua de 37 ° C durante 10 min (2 º digestión).
- Repita el procedimiento 4.7 y 4.8.
Nota: Si hay tejido todavía mucho no digerida, repita una vez más la digestión. Sin embargo, en la mayoría de los casos, dos digestiones son suficientes para dispersar la mayoría de las células de los tejidos del corazón. - Coloque un filtro de células estéril (malla de nylon de 100 μm) en un tubo cónico estéril 50 mL nuevo. Humedezca previamente el filtro de la célula con 2-3 mL de medio de cultivo celular y pasar las células a través de la coladera de la célula. Enjuague el colador celular con 2-3 mL de medio de cultivo celular. (Figura 1I)
- Centrifugar el tubo cónico que contiene cardiomiocitos durante 5 min a 180 x g (Figura 1J). Aspirar el sobrenadante (figura 1 K), que contienen restos de tejidos celulares y Resuspenda el precipitado de células en 10 mL de medio de cultivo celular (figura 1 L).
- Resuspender las células y las células de la placa sobre una placa de cultivo celular de 10 cm (sin ningún tipo de recubrimiento de plástico) e Incube por 1 h en una incubadora de cultivo celular (pre-placas 1) (figura 1 M). Este paso de la pre-galjanoplastia permite no cardiomiocitos, como fibroblastos y células endoteliales, a adherirse a la placa de cultivo de células sin recubrimiento.
Nota: En este punto, cardiomiocitos son típicamente una forma redonda y aparecen brillantes bajo el microscopio. (Figura 1N). - Después de la incubación de 1 h, suavemente agite la placa, lave las células no adherentes (enriquecidas en cardiomiocitos) de la placa de cultivo de 10 cm y Resuspenda las células mediante pipeteo repetidamente el medio de cultivo celular sobre el plato con una pipeta serológica de 10 mL. Luego, transferir las células no adherentes (enriquecidas en cardiomiocitos) en una nueva placa de cultivo celular de 10 cm (sin ningún recubrimiento de plástico) e incubar durante una 1 h adicional en una incubadora de cultivo celular (placas previos 2 º).
Nota: Las células que se adhieren a la placa sin revestimiento son dominantemente no cardiomiocitos: fibroblastos y células endoteliales, que pueden visualizarse bajo el microscopio (figura 1O). - Después de 2 º pre-galjanoplastia, suavemente agitar la placa, lave las células no adherentes (cardiomiocitos) de la placa de cultivo de 10 cm, luego transferir los cardiomiocitos en un nuevo tubo cónico de 50 mL.
5. recuento de células y células de revestimiento en una placa de cultivo celular de 96 pozos (día 1)
- Contar las células usando un hemocitómetro.
- Las células de la placa en una placa de cultivo celular de 96 pozos matriz extracelular revestido con una densidad entre 10 – 30 x 103 células/pocillo utilizando una pipeta multicanal en un volumen final de 200 μl (figura 1 P). Utiliza pozos A1, A12, H1 y H12 para fondo: Añadir 200 μL de medio de cultivo como otros pozos en estos pozos (sin células). Incube la placa en una incubadora de 37 ° C de la célula cultura.
Nota: En este estudio, el consumo de oxígeno fue probado mediante el uso de densidades de diferentes células como 10 x 103, 20 x 10330 x 103 células/pocillo. (Figura 2A). También, como arriba, cardiomiocitos inmediatamente después del aislamiento suelen ser una forma redonda y aparecen brillantes bajo el microscopio. Células viables se aplanen en 16-24 h de cultivo.
6. oxígeno consumo ensayo utilizando un analizador de flujo extracelular de formato de 96 pozos (día 2)
Nota: Ensayo de consumo de oxígeno puede llevar a cabo un día después de las células de la galjanoplastia o posterior. Cardiomiocitos neonatales cultivados utilizando este protocolo puede sobrevivir hasta 7 días post aislamiento.
- Un cartucho de sensor de flujo analizador del hidrato (véase Tabla de materiales) durante al menos 3 horas, pero ideal para un día completo, antes de la prueba. Añadir 200 μL de solución Calibrant (véase Tabla de materiales) en cada pocillo de la placa de la utilidad, el cartucho de sensor vuelva a colocar la placa de la utilidad e incubar en una incubadora de 37 ° C sin CO2 o O2 suplementación.
- Cambiar los medios de cultivo celular al medio de prueba de estrés de las mitocondrias una hora antes del ensayo. Cardiomiocitos son frágiles. Por lo tanto, suavemente quitar los medios de cultivo celular mediante una pipeta multicanal y lavan las células con 200 μL de los medios de prueba de estrés mitocondrial precalentado dos veces. Después del segundo lavado, añadir 175 μl de los medios de prueba de estrés con las mitocondrias y las células en una incubadora de 37 ° C sin CO2 o O2 suplementos de la cultura.
- Preparar compuestos de prueba concentrado. Para prueba de esfuerzo de las mitocondrias, preparar 3,0 mL de 16 oligomycin μm, μm 9 FCCP y una mezcla de 20 rotenona μm y 20 μm antimicina A, todo en medio de la prueba de estrés mitocondrial.
Nota: Cada compuesto en la concentración que se describe ha sido probado. Sin embargo, es necesario valorar la concentración de cada compuesto en laboratorio propio. - Carga 25 μl de cada compuesto en los orificios del inyector del cartucho sensor utilizando una pipeta multicanal (figura 1Q). El volumen y la concentración final se describen en la tabla 2.
- Configurar el protocolo de ensayo de flujo extracelular. El programa se describe en tabla 3.
- Inicie el programa. En primer lugar, ponga el cartucho de sensor en la máquina de calibración (figura 1R). Reemplazar el calibrant para la placa de ensayo una vez hecho el paso de calibración.
Nota: Utilizando el software proporcionado por el fabricante, indican grupos de pozos y cada uno de ellos y el puerto. - Si lo desea, después del ensayo, deseche cuidadosamente todo medio de ensayo usando una pipeta multicanal y almacenar la microplaca de la cultura de célula a-20 ° C para la normalización de la futura célula usando análisis de proteína.
- Medir el contenido de proteína. Añadir 50 μl de solución de lisis de la célula RIPA estándar (véase Tabla de materiales). Incubar la placa de hielo durante 30 minutos completamente Lyse las células. Transferir todo el material para una nueva placa de ensayo bien fondo claro plano 96.
- Medir la concentración de proteína por ensayo BCA según protocolo del fabricante.
Nota: Recubrimiento del pozo con matriz extracelular resulta en una concentración de proteínas en cada pozo. Por lo tanto, restar la cantidad de pozos fondo (sin células) para obtener la concentración de la proteína de la célula real. La concentración de proteína derivada de células es baja en una placa de cultivo de 96 pozos. Además, la concentración de proteína puede variar de pozo a pozo debido a la capa de matriz extracelular. Por lo tanto, se sugiere usar numero de celular para normalizar el OCR.
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Representative Results
Mediante el protocolo descrito, corazones fueron aislados de los cachorros neonatales día 0. se obtuvieron 5 x 105 células/pup y cardiomiocitos fueron sembrados a densidades de 10 x 103, 20 x 103o 30 x 103 células/pocillo, en placas bien 96 (figura 2A). Después de la cultura durante la noche, se encontraron cardiomiocitos bien adheridos a la superficie recubierta de plástico y había muy pocas células sueltas (las células todavía aparece como redonda y brillante, en comparación con las células sanas, adjuntadas que son spreadout) () Figura 2A y B). En este punto, cardiomiocitos espontáneamente contratantes eran fácilmente visibles. Una densidad de siembra de 30 x 103 células/pozo mostró confluencia un día después de la siembra, propagación de las células. Como el número de células redondas (muertos) era muy bajo, estos resultados mostraron que el protocolo da viabilidad celular alta de cardiomiocitos. Cardiomiocitos immunostained con un anticuerpo contra el espectro α-actinina, un marcador específico de cardiomiocitos18 como prueba de esta afirmación. Como se muestra en la figura 2, la mayoría de células demostró la coloración positiva de α-actinina que muestra la pureza del aislamiento del cardiomiocito.
Un esquema de una prueba de estrés mitocondrial típico se muestra en la figura 3. La prueba mitocondrial de estrés comienza con una medición de línea de base de la tasa de consumo de oxígeno (OCR). Esto es seguido por la inyección de oligomycin, que inhibe la ATPasa. La diferencia antes y después de oligomycin inyección muestra el OCR vinculados a la producción de ATP. Luego, se inyectó el agente Desacoplador FCCP para medir la tasa de consumo máximo de oxígeno. Capacidad respiratoria puede ser calculada como la diferencia entre la basal y la máxima OCR. Finalmente, con la inyección de dos inhibidores complejo de transporte de electrones (antimicina A y rotenona), pare la respiración mitocondrial, y OCR disminuye a su nivel más bajo. Mediante el bloqueo de la actividad mitocondrial, a este nivel, el consumo de oxígeno es no mitocondrial. Respiración basal, la fuga de protones y la respiración máxima pueden calcularse como la diferencia entre la respiración no mitocondrial (OCR en presencia de antimicina A y rotenona) y medición de línea de base, OCR en presencia de oligomycin y OCR en la presencia de FCCP, respectivamente.
En este estudio, se realizó análisis de OCR mediante un sistema de analizador de formato de 96 pocillos flujo extracelular un día después del aislamiento de células. Además, para probar el efecto de la inanición de suero en OCR, tres horas antes del ensayo, los medios de cultivo celular fueron cambiados a medios de crecimiento del cultivo celular regular con suero, o sin el suero. Después de la carrera, datos de medición de OCR 1 al 12 para cada uno, fueron exportados a una hoja de cálculo para llevar un registro y posterior análisis. Características metabólicas se determinan como sigue:
La respiración no mitocondrial = promedio OCR (10, 11, 12)
Respiración basal = promedio de OCR (1, 2, 3).-promedio de OCR (10, 11, 12)
Producción de ATP = promedio de OCR (1, 2, 3).-promedio de OCR (4, 5, 6)
Escape de protones = promedio de OCR (4, 5, 6) - promedio de OCR (10, 11, 12)
Respiración máxima = promedio de OCR (7, 8, 9) - promedio de OCR (10, 11, 12)
Como se muestra en la Figura 4A, fácilmente se analizaron valores de OCR, y los efectos de los compuestos inyectados eran también evidentes. Lo importante es la variación de pozo a pozo era pequeño como se muestra por el error estándar. Aumentar en la celda número dio lugar a la medición basal mayor, Oligomycin y respiración FCCP-tratados. En comparación con las células del suero de hambre, OCR fue mayor en las células analizadas que habían sido incubadas con medios de crecimiento. Como se muestra en la Figura 4B, el OCR se muestra como la respiración basal, pérdida de protón (Oligo) y máxima respiración (FCCP) por 1 x 104 células. OCR por 10 x 103 células fue superior en la densidad de siembra de 20 K y 30 K células/pozo de 10 K las células/pozo. Como se muestra en la figura 4, expresando OCR en relación a la respiración basal, la relativa pérdida de OCR de protón (Oligo) y máxima (FCCP) muestran valores similares entre los medios de crecimiento y suero de hambre a grupos. Estos resultados sugieren que la densidad de siembra no afecta la capacidad oxidativa de la fuga y máxima del protón relativa.
En general, mediante este protocolo, excelentes rendimientos de cardiomiocitos neonatales de ratón fueron correctamente aislados y cultivados. OCR puede evaluarse mediante el uso de estos miocitos en un analizador de flujo extracelular. Los resultados también muestran que densidad de siembra no afectó significativamente OCR calculado por el número de células. Sin embargo, el hambre de corto plazo (3 h) suero disminuye OCR. La información es útil para probar el ratón cardiomiocitos neonatales OCR con diversas condiciones experimentales.
Figura 1: aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratones recién nacidos día 0. (A) recién nacidos son sacrificados y se diseca el corazón del tórax. (B) corazones se lavan en HBSS (sin Ca2 +, Mg2 +). (C) cada corazón es cortada en 8 pedazos. (D) corazones se mueven a una placa de 6 pozos con HBSS. Corazones se lavan utilizando una cuchara de Moria para transferirlos de pozo a pozo. (E) corazones están previamente digeridos en HBSS tripsina a 4 ° C con agitación suave. (F) Predigested tejido del corazón después de 4 h de incubación a 4 ° C. (G) los tejidos del corazón después de la digestión de colagenasa de 10 minutos. Colagenasa (H) digiere los tejidos son triturados corazón. () Isolated cardiomyocytes se filtraron a través de un tamiz celular. (J) cardiomiocitos son peleteados por centrifugación. Colagenasa (K) y medios de cultivo se extraen por aspiración. (L) cardiomiocitos se suspende de nuevo en medio de cultivo fresco. Cardiomiocitos (M) se cultivan en un plato de plástico de 10 cm para la pre-galjanoplastia. (N) A imagen representativa de cardiomiocitos (células redondas y brillantes) después de 1 h de la pre-galjanoplastia. (O) después de la galjanoplastia y luego retiro de cardiomiocitos no adherente, restante células normalmente fibroblastos y células endoteliales son accesibles. (P) de la galjanoplastia cardiomiocitos en una placa de 96 pocillos. (Q) reactivos de carga en puertos de inyección del cartucho de sensor. (R) poner el cartucho sensor en una máquina del analizador de flujo extracelular. Barra de escala = 0,1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cultivo de cardiomiocitos en placa de 96 pocillos de analizador de flujo extracelular. (A) imágenes representativas de cardiomiocitos en placas de 96 pocillos con densidades de célula indicada, inmediatamente después de la siembra (fila superior) o 18 h post siembra (fila inferior). (B) una mayor imagen de aumento de cardiomiocitos 18 h post siembra a una densidad celular de 10 x 103 células/pocillo. (C) cardiomiocitos fueron manchados con anticuerpo anti-sarcomeric α-actinina (verde) y DAPI (como una tinción nuclear) (azul). Barra de escala = 0,1 mm. Los métodos utilizados para la inmunotinción pueden encontrarse en nuestra anterior publicación18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Representación esquemática de la prueba de estrés mitocondrial. Parámetros bioenergéticos, incluyendo basales, respiración no mitocondrial, máxima y ATP-ligado como capacidad respiratoria y fuga de protones, se describen en el rastro con efectores mitocondriales correspondientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de estrés mitocondrial. (A) representante seguimiento de índices de consumo de oxígeno (OCR, en pMoles/min) de cardiomiocitos neonatales de ratón. En el indicado momento, oligomycin (Oligo, 1 μm), FCCP (800 nM), y se inyectaron RAA (rotenona y antimicina A, 1 μm). Para cada medición, se presenta la media y error estándar de la media (SEM) de 10 pocillos individuales. OCR (B) se calcula como respiración Basal, Oligo (escape de protones) y FCCP (máxima respiración) por 10 x 103 células. OCR (C) se expresa en relación a la respiración basal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre del reactivo y solución | Preparación | Notas |
| Solución de la digestión de tripsina | Disolver tripsina en HBSS (sin Ca2 + y Mg2 +). Concentración final es de 0,5 mg/mL. Esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 μm y mantener en hielo hasta su uso. | Hacer solución de digestión previa en el día del experimento. |
| Solución de digestión de colagenasa | Disolver tripsina en HBSS (sin Ca2 + y Mg2 +). Concentración final es de 0,5 mg/mL. Esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 μm y mantener en hielo hasta su uso. | Hacer solución de digestión de colagenasa en el día del experimento. |
| Medios de cultivo de cardiomiocitos | Se mezclan 375 mL de DMEM, 125 mL de M-199, 25 mL de suero de caballo y 12,5 mL de SBF. Suplemento con penicilina de 1% y 1% solución de estreptomicina. | Medios de cultivo de cardiomiocitos puede efectuarse antes del experimento y almacenarse a 4 ° C durante un mes. |
| Medio de prueba de estrés mitocondrial | En primer lugar, hacer 1 L de medio con DMEM sin cualquier piruvato de sodio, L-glutamina, glucosa y Hepes, filtrar para esterilizar y almacenar a 4 ° C. En el día de ensayo, agregar Hepes, piruvato de sodio, L-glutamina y glucosa. Ajustar el pH a 7.4 antes de usar (no se requiere esterilización). | Concentración final de suplementos son los siguientes: piruvato de sodio (1 mM), L-glutamina (2 mM), glucosa (10 mM) y Hepes (2 mM) |
| Oligomycin stock | Disolver oligomycin en DMSO. En primer lugar, preparar 5 mL de solución madre. Una vez oligomycin es totalmente disuelto en DMSO, hacer alícuotas μl 250, almacenar a-20 ° C. | En el día del ensayo, tomar una alícuota para utilizar. Evitar muchos ciclos de hielo-deshielo. |
| Stock FCCP | Disolver el FCCP en DMSO. En primer lugar, preparar 5 mL de solución madre. Concentración final es de 5 mM. Una vez FCCP es totalmente disuelto en DMSO, hacer alícuotas μl 250, almacenar a-20 ° C. | En el día del ensayo, tomar una alícuota para utilizar. Evitar muchos ciclos de hielo-deshielo. |
| Stock de Antimycin A | Disolver antimycin A en DMSO. En primer lugar, preparar 5 mL de solución madre. Concentración final es de 5 mM. Una vez que la antimicina A es totalmente disuelto en DMSO, hacer alícuotas μl 250, almacenar a-20 ° C. | En el día del ensayo, tomar una alícuota para utilizar. Evitar muchos ciclos de hielo-deshielo. |
| Stock de rotenona | Disolver la rotenona en DMSO. En primer lugar, preparar 5 mL de solución madre. Concentración final es de 5 mM. Una vez que la rotenona es totalmente disuelto en DMSO, hacer alícuotas μl 250, almacenar a-20 ° C. | En el día del ensayo, tomar una alícuota para utilizar. Evitar muchos ciclos de hielo-deshielo. |
| De la célula cultura placa recubrimiento solución | En primer lugar, hacer 200 mL de solución de gelatina 0,5%. Disolver la gelatina en PBS y autoclave. En el día del experimento, añada 50 μl de solución de fibronectina en 5 mL de solución de gelatina para hacer solución de recubrimiento. | 0.5% solución de gelatina puede almacenarse a temperatura ambiente hasta por 2 meses. |
Tabla 1: Reactivos y soluciones.
| Puerto de inyección | Compuestos y la concentración | Volumen inyectado durante la ejecución (μL) | Concentración final en el ensayo |
| A | 16 μm oligomycin | 25 | 2 ΜM |
| B | FCCP 9 ΜM | 25 | 1 ΜM |
| C | Rotenona de 20 μm (Rot) y 20 μm antimicina A (AA) |
25 | 2 μm de cada uno |
Tabla 2: Mezclas de inyección.
| Pasos y procedimientos | Mediciones y lazos |
| Calibración | - |
| Equilibrado | - |
| Medición de línea de base | 3 veces: mezcla 3 minutos, espere 2 minutos, medir 3 min |
| Inyectar (Oligomycin) el puerto | - |
| Mediciones de | 3 veces: mezcla 3 minutos, espere 2 minutos, medir 3 min |
| Inyectar el puerto B (FCCP) | - |
| Mediciones de | 3 veces: mezcla 3 minutos, espere 2 minutos, medir 3 min |
| Inyectar el puerto C (RAA) | - |
| Mediciones de | 3 veces: mezcla 3 minutos, espere 2 minutos, medir 3 min |
Tabla 3: Programa de analizador de flujo extracelular.
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Discussion
En este estudio, hemos establecido un protocolo simple para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón. Mediante el uso de estos cardiomiocitos, hemos optimizado también las condiciones para medir la tasa de consumo de oxígeno mediante un sistema de analizador de flujo extracelular. El protocolo permite utilizar cardiomiocitos neonatales de ratón como un modelo de sistema para examinar cómo diversos factores pueden alterar el consumo de oxígeno en las células principales del trabajo del corazón, similar a lo que se mediría en el órgano intacto. Nuestro protocolo es diferente de protocolos previamente publicados16,18. En primer lugar, para lograr viabilidad alta, sólo los cachorros inmediatamente al nacer son utilizados (es decir, P0), en lugar de días de cero a tres días de edad (cachorros de P0 a P3), que se utilizan comúnmente en otros protocolos16,19. En segundo lugar, para minimizar el tiempo del experimento, corazones fueron sólo previamente digeridos con tripsina durante 4 horas. Además, para simplificar el procedimiento y lograr resultados reproducibles, se empleó a un número mínimo de pasos, como se indica. Por ejemplo, nuestro protocolo utiliza sólo dos tipos de buffers, PBS y HBSS y sólo un tipo de medios de cultivo celular y no emplea agitación durante la digestión de la colagenasa.
Para lograr alta viabilidad de cardiomiocitos neonatales de ratón, que es importante para la repoductibilidad del análisis OCR, hay varios puntos críticos. En primer lugar, con cachorros recién nacidos P0 y realizar la digestión de la tripsina y colagenasa digestión en el mismo día son fundamental para lograr la alta viabilidad. En segundo lugar, durante la digestión de la colagenasa, se recomienda no agitar el tejido del corazón en el baño de agua de 37 ° C. Aunque la agitación es sugerida en muchos protocolos, encontramos que esto no es necesario ya corazones P0 son fáciles de ser digerido por la colagenasa. Por último, trituración suavemente tejido cardíaco es fundamental para disociar los cardiomiocitos después de la digestión de la colagenasa.
También hemos probado miocitos del tejido de corazón de cachorro P1 y P2, utilizando el mismo protocolo. Sin embargo, para las mayores muestras de corazón, encontramos es necesario realizar la digestión de tripsina durante la noche para lograr rendimientos de células suficiente (datos no mostrados). Además, la viabilidad celular de cardiomiocitos P1 y P2 rondó el 60%, similar al que en otros publicados estudios16. Estos resultados sugieren que el miocardio P0 tiene relativamente menos cantidad de matriz extracelular que más corazones, que permite tiempos más cortos para la digestión de la tripsina, dando por resultado la mayor viabilidad de las células y los rendimientos de estos corazones jóvenes.
Análisis de flujo extracelular (XF) se ha convertido en un método importante y popular para medir la función bioenergética de las células y las mitocondrias aisladas de20,21. Hasta la fecha, un número de estudios utiliza cardiomiocitos neonatales de rata y mide el consumo de oxígeno, usando un sistema de Agilent XF2422,23,24 . Probablemente se realizaron estos estudios usando células de rata en contraposición a las células derivadas de ratón, como las células de rata generalmente tienen mayor viabilidad celular y reproducibilidad, en comparación con los miocitos cardiacos de ratón estudiados aquí. Dado que los animales genéticamente modificados se han generado principalmente en líneas de ratón, un protocolo simple y reproducible para el análisis bioenergética función en cardiomiocitos neonatales de ratón, como discutimos en este manuscrito, proporciona oportunidades de estudio función mitocondrial en miocitos cardiacos de ratón. Este método puede ser traducido más fácilmente a los datos que pueden llevar a la comprensión de nuevos mecanismos de regulación bioenergética en el corazón, mediante el uso de ratón manipulado genéticamente nuevos o existentes líneas25,26.
En este estudio, probamos el efecto del numero de celular y densidad en OCR. Como se muestra en la Figura 4B, OCR medido en los pozos de 10 x 10320 x 103y 30 x 103 células/pozo, fue similar. Dado que las placas de 30 x 103 células/pozo producción un pozo confluente dentro de un día después de la siembra, se recomienda dividir células entre 10 x 103 a 30 x 103 células/pocillo de una placa de 96 pozos, para el análisis de OCR. Curiosamente nos encontramos con 3 h de hambre suero disminuyó OCR. Factores de crecimiento son conocidos para activar la glucólisis y aumentar el consumo de oxígeno27. También se informó de que los factores de crecimiento mejoran en general la actividad celular y contracción de cardiomiocitos3,28. Contracción de cardiomiocitos requiere ATP generación2, que depende del consumo de oxígeno. Por lo tanto, estos datos sugieren que la inanición suero disminuye consumo de oxígeno a través de la inactivación de cardiomiocitos. Se recomienda probar el efecto de la inanición de suero en OCR en propio ajuste experimental.
Como se mencionó, las mitocondrias juegan papeles claves en la función cardíaca. Por lo tanto, identificar nuevos reguladores y caminos que regulan metabolismo oxidativo podría proporcionar un medio para identificar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. Desde un formato bien 96 prevé la posibilidad de probar un mayor número de condiciones en comparación con un formato bien 24 de prueba, este protocolo también podría ser fácilmente adaptado a una pantalla de alto rendimiento para la identificación de nuevos reguladores bioenergéticos en cardiomiocitos29 . Así, combinando nuestro protocolo con genéticamente manipulados cardiomiocitos neonatales, como las que tienen mutaciones mitocondriales de la30, podría proporcionar interesantes estudios para los efectos de compuestos químicos o las bibliotecas de cDNA, sobre OCR en la pantalla tipo salvaje vs. metabólico defectuoso cardiomiocitos.
Somos conscientes de que los cardiomiocitos neonatales y adultos tienen muchas diversas características y funciones metabólicas31, incluyendo niveles de expresión de las enzimas metabólicas de glucosa y ácidos grasos32. Por lo tanto, ideal para utilizar cardiomiocitos cultivados in vitro como modelo del corazón intacto, sería importante desarrollar un protocolo para analizar eficientemente OCR en cardiomiocitos adultos, por lo que uno podría comparar su capacidad oxidativa y características con cardiomiocitos neonatales. Estudios futuros tendrán que realizarse para adaptar esta metodología a un sistema reproducible con miocitos cardiacos adultos.
En Resumen, se muestra un protocolo simple y reproducible para el análisis de consumo de oxígeno utilizando cardiomiocitos de ratón neonatal primario de ratón cultivadas. Mediante este protocolo, podríamos con éxito aislar y cultura cardiomiocitos neonatales de ratón y realizar este análisis de OCR mediante un sistema de analizador de flujo extracelular de formato de 96 pozos. Nuestro protocolo da alta viabilidad y resultados consistentemente reproducibles. Aunque el estudio actual se centra principalmente en el consumo de oxígeno y una prueba de estrés mitocondrial, el protocolo podría adaptarse fácilmente para analizar la oxidación de los ácidos grasos y la glucólisis en los cardiomiocitos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a todo laboratorio Ross y miembros del laboratorio de Murphy. Este trabajo es apoyado por la Asociación Americana del corazón (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) y VA al mérito (BX003260) a R.S.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
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