Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Для изучения бактериальный ген регулирование в инфицированных тканях метод, основанный на флуоресцирования

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/59055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Georgetown University

Summary

Описанные здесь — это метод для анализа экспрессии генов бактерий в животных тканях на клеточном уровне. Этот метод предоставляет ресурс для изучения фенотипического разнообразия, происходящих в пределах бактериальная популяция в ответ на ткани окружающей среды во время инфекции.

Abstract

Генов вирулентности бактерий, часто регулируются на уровне транскрипционный анализ многочисленных факторов, которые реагируют на различные экологические сигналы. Некоторые факторы действуют непосредственно на генов вирулентности; другие управления патогенеза, регулируя выражение течению регуляторов или накопление сигналов, которые влияют на активность регулятор. В то время как регулирование широко изучен во время роста в пробирке , относительно мало известно о как выражение гена корректируется во время инфекции. Такая информация имеет важное значение, когда продукт определенного гена является кандидатом для терапевтического вмешательства. Транскрипционный анализ подходов, как количественных, реальном времени RT-PCR и РНК-Seq мощных способов изучения экспрессии генов на глобальном уровне, но страдают от многих технических проблем, включая низкий обилие бактериальной РНК, по сравнению с принимающей РНК и пример деградация, полиадениновый. Оценки регулирования с использованием флуоресцентных Репортеры сравнительно легко и может быть мультиплексированием с флуоресцентных белков с уникальными спектральных свойств. Метод позволяет для одной ячейки, пространственно-временных анализ экспрессии генов в тканях, которые демонстрируют сложные трехмерные архитектуры и физико градиенты, которые влияют на бактериальных регулирования сети. Такая информация теряется, когда данные усредняются над населением оптом. Здесь мы описываем метод количественной оценки экспрессии генов в бактериальных патогенов в situ. Метод основан на обработке простой ткани и прямого наблюдения флуоресценции белков репортер. Мы продемонстрировать полезность этой системы путем изучения выражение стафилококк thermonuclease (КНУ), чей продукт гена необходим для иммунной уклонения и полное вирулентности ex vivo и in vivo. Мы покажем, что nuc-gfp сильно выражена в почечной абсцессов и частично разглашать гетерогенных ген выражение из-за очевидной пространственных регулирования деятельности промоутер КНУ в гнойнички, полностью занимается иммунного ответа. Этот метод может применяться к любой бактерии с манипулируемой генетическую систему и модель любой инфекции, предоставляя ценную информацию для доклинических исследований и разработки лекарств.

Introduction

Бактерии реагировать на меняющиеся физиологические условия и изменения в состоянии питания их окружающей среды дифференциально выражением генов, необходимых для адаптации и выживания. К примеру оппортунистических патогенов колонизировать тела поверхностей при относительно низкой плотности и зачастую безвредны. Однако после бактерии проникли физические и химические барьеры, он должен бороться с принимающей иммунных клеток борьбе с оборону и ограниченного наличия питательных веществ1. Например золотистый стафилококк колонизирует приблизительно одну треть населения бессимптомно, но также является причиной разрушительных кожи и инфекций мягких тканей, остеомиелит, эндокардит и бактериемии2. Успех S. aureus как возбудитель часто приписывают его метаболические гибкость, а также целый арсенал Факторы вирулентности связанных с поверхности и выделяется, позволяющие бактерии бежать кровоток и реплицировать в периферических тканях 34,,5. Потому что хост смерть из-за стафилококковых болезней является эволюционным тупик и ограничивает передачу новых хостов6, приверженность производства фактор вирулентности должен тщательно контролироваться.

Комплекс нормативных сети белков и некодирующих RNAs реагирует на различные экологические стимулы, включая ячейки плотности, фазы роста, нейтрофилов связанных факторов и наличия питательных веществ, чтобы обеспечить, что генов вирулентности выражаются в Точное время и место в пределах узла ткани7,8,9,10,11,12,13. Например два компонента системы SaeR/S (TCS) регулирует выражение нескольких факторов вирулентности через датчик киназы (SaeS) и ответ регулятор (SaeR)14. SaeS является autophosphorylated на сохранение гистидина остатков в ответ на принимающей сигналы (например, человеческих нейтрофилов пептидов [HNPs], calprotectin)8,,1516. Фосфорила группа затем передается аспартат остатков на SaeR, активация его как ДНК связывающих белков (SaeR ~ P)17. TCS SaeR/S регулирует более 20 генов, которые способствуют патогенеза, включая белки, связывающие фибронектина (FnBPs), лейкоцидины и ванкомицина14,18,19,20. Цели могут быть классифицированы высокоспецифичные и низкого сродства гена цели, которые, вероятно, индуцированной как уровень SaeR ~ P поднимается при контакте с его сигналы21. SaeR/S деятельность контролируется другими регуляторами экспрессии генов, например системы ДЗЗ кворума СМА, репрессор токсинов белка (Rot), и альтернативная Сигма фактор B (SigB)22,23,24.

КНУ это гена вирулентности Sae зависимых в золотистый стафилококк и кодирует thermonuclease (КНУ), которая необходима для побега от neutrophilic extracellular тударять (сетки), а также для распространения во время курс инфекции25,26. Выражение КНУ также сильно косвенно репрессирован Коди присутствии разветвленных аминокислот и ГТУ27и непосредственно репрессирован стафилококковых аксессуар регулятор белка Сара28,29 , деятельность которой находится под влиянием кислорода (окислительно-восстановительного состояния) и рН30. Учитывая, что sae и КНУ мутантов ослабленных в моделях мыши инфекции, есть интерес к разработке химического вмешательства, которые препятствуют их соответствующие мероприятия26,31. Несмотря на это нет никакой информации относительно их регулирования во время инфекции.

Флуоресцентный Репортеры были использованы для мониторинга и количественной оценки экспрессии генов на уровне одной ячейки. Здесь мы представляем метод количественной оценки S. стафилококк экспрессии генов во время инфекции, когда в паре с в пробирке транскриптом анализ и мощные методы визуализации как магнитно-резонансная томография (МРТ) и магнитно-резонансная спектроскопия (MRS), можно выявить как бактериальный Физиология регулируется в естественных условиях и относительного обилия питательных веществ в определенных нишах. Этот метод может применяться для любых бактериальных патогенов с шансов справиться с возникающими генетической системы.

Обзор генома интегративной вектора.

PRB4 интегративной вектор геном содержит 500 низкопробных пар из вышестоящих и нижестоящих регионов Псевдогены S. aureus USA300 SAUSA300_0087 для облегчения гомологичная рекомбинация. pRB4 является производным от чувствительных к температуре pMAD вектор позвоночник содержащий эритромицин сопротивления кассеты (ermC) и термостабильные бета галактозидазы гена bgaB отбора синий/белый рекомбинантов32. Инженерии репортер конструкции также содержит маркер сопротивления Хлорамфеникол (кошка) для выделения после интеграции генома и плазмиды ликвидации, а также EcoRI и ссии сайты предохранитель регулирования региона, представляющих интерес для superfolder зеленый флуоресцентный белок (sGFP) (рис. 1). Известно, что выбор рибосома привязки сайта (RBS) влияет на деятельность журналиста и часто требует эмпирической оптимизации33. Таким образом больших двоичных объектов не поддерживается. Здесь родной рибосома привязки сайт используется для предоставления для шаблона более естественный экспрессии генов, но другие сайты могут быть использованы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Джорджтаунского университета.

1. поколение штамма флуоресцентные репортер

  1. Дайджест генома интегративной pRB4 вектор последовательно с EcoRI и ссии энзимов ограничения. После производителя протокол, создана ночь пищеварение с ссии, используя 1 мкг pRB4 при 25 ° C и затем продолжите второй пищеварение за 1 ч при 37 ° C, добавив EcoRI в реакционной смеси. Инактивации ферментов, инкубации при 65 ° C для 20 мин.
  2. PCR усиливает нормативной области интереса от геномной ДНК (в данном случае, ~ 350 пар ДНК фрагмент, содержащий thermonuclease [nuc] Промоутер региона), включающий места ограничения EcoRI 5' и 3' ссии ограничение сайта. Ссии признание последовательность должна быть в кадр с трансляционной начало кодон. В этом исследовании, ПЦР проводилось с использованием высокой верности ДНК-полимеразы в соответствии с рекомендациями изготовителя с oRB015 вперед грунт (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') и обратный (праймер) oRB016 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). Отжига температура была 53 ° C. Очищайте результирующий фрагмент с помощью ПЦР очистки комплект следуя инструкциям производителя.
  3. Дайджест результирующий продукт PCR с EcoRI и ссии как выполняется на этапе 1.1 и перевязать переваривается фрагмент ДНК же сайты pRB4 с помощью T4 ДНК лигаза как рекомендованный производителем для создания интегративной конструкции. Внедрить лигирование смесь в E. coli и подтвердите конструкции последовательности.
  4. Electroporate конструкция в S. aureus штамм RN4220 как описано34. Короче говоря, используйте 1 мкг плазмида с 70 мкл электро компетентных клеток (100 Ω, 25 МКФ и 2,3 кв) в бульоне B2 (1% [w/v] казеина гидролизат, 2,5% [w/v] дрожжевой экстракт, 2,5% [w/v] NaCl, 0.1% [w/v] K2PO4, 0,5% [w/v] глюкозы). Выберите для Эритромицин сопротивления (rEm) при температуре разрешительных (30 ° C) на tryptic соевый агар (TSA) дополнена Эритромицин (5 мкг мл-1) и 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Гал; 80 мкг мл-1). Полученный трансформантов синий благодаря кодировке плазмида β-галактозидазы активности.
    Примечание: Перевод ДНК в клинических изолятов крайне сложно из-за сильного ограничения модификация барьер35. Таким образом S. aureus RN4220 был использован как промежуточный получателя фьюжн конструкции потому, что это ограничение неудовлетворительных и крайне трансформер.
  5. Передача плазмида USA300 штамма S. aureus интерес с помощью электропорации или ФАГ опосредованной трансдукции36 разрешительной температуре. Короче говоря распространять11 бактериофага Φ частиц на штамм доноров, используя TSA пластины, содержащий 5 мм CaCl2 ночь в 30 ° C, а затем стерилизуют фильтрацией через фильтр шприц ацетат целлюлозы 0,45 мкм. Используйте лизатов передавать штамма S. aureus Лак для Emr.
    Примечание: LAC является широко используемым клинических изолировать, который был ранее сделанные Em чувствительных последовательный проход в среде TSB вылечить штамм pUSA03 родной плазмида, предусматривающим Emr 37,38.
  6. Интегрируйте конструкцию два последовательных гомологичная рекомбинация события в хромосоме, как описано выше32. Рекомбинантов, хлорамфеникол стойкие (смr) на тарелках TSA, содержащий 5 мкг мл-1 хлорамфеникола, эритромицина чувствительными (Erms) и не больше синего.
    Примечание: Когда это возможно, повторно ввести заметное сплавливание в USA300 через ФАГ опосредованной трансдукции, чтобы избежать накопления мутаций, связанных с в пробирке штамм проход39 и температуры сдвиги.

2. животных инфекции: Подготовка посевным материалом, системные инфекции и обработки тканей

  1. Подготовка бактериальных посевным материалом
    1. Полоска штаммов S. aureus , представляющих интерес для изоляции на плитах агара крови из запаса замороженных глицерина. Инкубировать при 37 ° C для 16-24 ч для подтверждения гемолитический фенотипов, основанные на их способности лизируют красных кровяных телец (эритроцитов) и формы снимите прозрачный зон.
    2. Инициировать ночь культур путем прививки единого колоний каждого штамма до 4 мл бульона (TSB) tryptic сои в стерильных стеклянных трубок. Поворот трубы при 37 ° C для 16 – 24 h в ролике трубки примерно 70° угол и 70 вращений в минуту [RPM].
    3. Использовать спектрофотометр для измерения оптической плотности на 600 Нм (600OD) культур от шага 2.1.2. Используйте стерильные среднего как оптический ссылка (пустой). Разбавлять эти клетки к ОД600 0,05 в 25 мл стерильного Tryptic соевый бульон (БСЭ) в отдельных, Делонг колбы (5:1 флакон соотношение объема) и инкубировать культур на водяной бане (для правильного теплообмена к культурам), 125 мл и тряски на 280 RPM и установить до 37 ° C.
      Примечание: Рост посевным материалом может производиться различными способами; представлен один метод для выращивания клеток к экспоненциальной фазе. Несмотря на это важно последовательно использовать тот же метод для подготовки клетки для прививки.
    4. ОД600 ~ 1, повторно разбавляют клетки в свежих средних начиная ОД600 0,05 обеспечить клетки достижения экспоненциальной фазе и что факторы, которые накапливаются в течение ночи инкубации были сокращены до уровня экспоненциальной фазе.
    5. Урожай клетки экспоненциальной фазе (OD600 ~0.6–0.8) центрифугированием в 3000 x g 10 мин при комнатной температуре.
    6. Вымойте гранулы дважды в эквивалентный объем стерильных 1 x фосфат амортизированное saline (PBS; рН 7,4).
    7. Приостановить клетки в однократном ПБС (рН 7,4) к концентрации 1 x 108 колонии, образуя единиц (CFUs) мл-1 или в зависимости от желаемого эксперимент.
      Примечание: важно определить отношения между ОД600 и кое мл-1 для каждого штамма интерес, потому что штамм зависимые изменения формы и размера ячейки может повлиять на светорассеивающих свойств и в конечном счете, доза инфекции.
  2. Подготовка животных и бактериальной инфекции
    1. Акклиматизироваться мышей за 7 дней на диете очищенный АЙН-93. Рацион разработан для обеспечения адекватного питания при одновременном снижении ткани auto флуоресценции связанные с потреблением растительные ингредиенты, используемые в стандартной мыши Чоу40.
      Примечание: Здесь используются самок мышей C57/BL6 (6-8 недель), но штамм мыши и секс будет зависеть от исследования.
    2. Перед инфекцией расширяются вены хвост мыши с теплой водой.
    3. Заразить животных путем инъекций 100 мкл бактериальной посевные через хвост вен производить системной инфекции. Сохранить Алиготе первоначального посевным материалом, если выполнение проточной цитометрии (см. раздел 4).
    4. Ежедневно контролировать животных и оценивать состояние их здоровья, с помощью системы мониторинга рассмотрели и утвердили в институциональный уход животных и использования Комитетом.
    5. Разрешить инфекции прогресса для требуемой продолжительности. Эксперименты здесь прекращено 3 дней после инфицирования.
      Примечание: В этих условиях абсцессы состоят из стафилококковых абсцессов сообщества бактерий, окруженная отложения фибрина и окружен концентрических слоев иммунные клетки5,41.
  3. Органы и ткани обработки
    1. Усыпить животных CO2 ингаляции и шейки матки дислокации как дополнительный метод и выполнять вскрытие.
    2. Урожай почек (справа) и других жизненно важных органов (сердца, печени, легких, селезенки) и передачи в 15 мл полипропиленовые пробирки, содержащие формалина 10% [v/v] буфер. Продолжите с этими органами для шаг 2.3.4 ниже.
    3. Левая почка передать стерильные 2 мл-ударопрочный трубка, содержащая ~ 500 мкл 2 мм Бусины кремнезема и 1 мл стерильного ПБС (рН 7,4). Перейдите к шагу 4.2. с этим органом.
    4. Разрешить органов из шага 2.3.2 исправить в темноте при комнатной температуре с нежным встряхивания или вращение по крайней мере 24 часов, но не более 48 часов.
    5. Внедрить органов ясно ткани замораживание среднего и хранить тканей в-80 ° C.
    6. С помощью криостат, раздел ткани на ломтики толщиной 10 мкм.
    7. Сухие разделы на предварительно очищенный, порученное стеклянное скольжение для 20 мин в темноте, применять средний жесткий монтаж с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) пятно и применить coverslip. Вылечить навесные слайды при комнатной температуре на ночь и передачи до 4 ° C для длительного хранения.

3. Лазерная конфокальная микроскопия сканирования и обработки изображений

  1. Изучите навесные слайды для обнаружения поражений с использованием лазеров для флуоресцентных репортер используется. В этом случае, зеленый (КГВ), красный (tdTomato) и синий (DAPI) флюоресценции используются сигналы.
  2. Получить изображение, используя соответствующие цели для визуализации отдельных клеток (например, обычно 20 x 40 x целей используется или).
  3. Измерения интенсивности флуоресценции в конфокальных изображения.
    1. Открыть в изображение J конфокальное изображение и отрегулировать яркость/контрастность правильно визуализировать флуоресценции сигнал поражения.
    2. Определение региона интерес и с помощью параметра порог , установите пределы нижней и верхней флуоресценции при необходимости.
    3. Определения центра тяжести, выбрав район → среднее значение серого → центроид → ограничить порог на вкладке анализировать изображения Дж.
    4. Извлечь значение интенсивности флуоресценции центроида или измерить интенсивность средняя флуоресценции в данной поражения на единицу площади (средняя флуоресценции интенсивности, MFI) для GFP и tdTomato. Здесь были использованы районах одной мкм2 .
      Примечание: Ослепленный второй анализ минимизирует предвзятости, когда известна личность образца.
    5. Печать данных и выполнять соответствующие статистические анализы для каждого сравнения.

4. поток Cytometry анализ

  1. (Необязательно) Определить активность синтеза посевным материалом в день инфекции (из раздела 2.2.3)
    1. 899 мкл 1 x стерильные PBS (рН 7,4) добавить 100 мкл каждого посевным материалом и 1 мкл мембраны permeant нуклеиновых кислот пятна (см. Таблицу материалы). Как элемент управления не забудьте включить образец хватает пятен нуклеиновой кислоты.
    2. Выполните все образцы проточной цитометрии.
      Примечание: Для самого первого эксперимента полезно включить только переносчиками для сплавливания интерес для определения правильного напряжения для использования. Четкое разделение между положительным и отрицательным образцы имеет существенно важное значение для анализа данных, указывающее репортер находится значительно выше фонового сигнала.
    3. Для идентификации бактерий населения, участок событий с помощью пятен нуклеиновой кислоты (ось y) и вперед точечной (ось x).
    4. Нарисуйте включение ворота вокруг событий, которые оба нуклеиновых кислот пятна позитивные и правильный размер бактерии на основании прямого рассеяния (от 0,5 до 2,0 мкм для S. aureus).
      Примечание: При определении этой группы населения, как важно, чтобы включить события, которые явно в рамках этих параметров, будьте строгим. Убедитесь, что эти ворота исключает все события для отрицательных элементов управления в других условиях. В этом исследовании, примерно 70% популяции клеток встретились эти требования в анализе.
  2. Анализ образцов тканей после жертвоприношения:
    1. Усыпить животных, урожай левой почки (см. шаг 2.3) и передачи в шарик избиение трубки с 1 мл 1 x стерильные PBS (рН 7,4) и 250 мкл бусины боросиликатное 2 мм.
    2. Нарушить тканей освободить бактериальной клетки. Для почек используйте гомогенизатор для срыва клетки. Здесь для сведения к минимуму Отопление образцы были использованы три 30 s очередей при 6800 об/мин с 1 мин, охлаждения периодов на мокрый лед между циклами.
    3. Пелле, больше мусора ткани центрифугированием на 250 x g 3 мин в настольная microcentrifuge охлаждается до 4 ° C.
      Примечание: Как правило есть клетки Пелле в нижней части трубки и слой плавающего мусора на вершине. Средний водный слой содержит бактериальные клетки.
    4. Передача 10 мкл от водный слой в чистой 1,5 мл microcentrifuge трубка, содержащая 1 мкл пятен нуклеиновой кислоты в 989 мкл PBS (общий объем 1 мл).
    5. Выполняйте проточной цитометрии с использованием тех же параметров сбора данных и стробирования что касается первоначального инокуляты.
      Примечание: Бактериальных клеток будет очень низкие, потому что образец содержит главным образом ткани мусора. Параметр «Живой ворота» также может использоваться, если клетки пятен нуклеиновой кислоты позитивные и Размер закрытого, когда данные загружаются в приложение. Это также поможет проанализировать несколько целевых событий и уменьшить размер файла. Почти один миллион события на сэмпл учитываются, но больше событий счетчиков может быть необходимым в зависимости от тяжести инфекции и размер проанализированы ткани.
    6. Анализ данных: Определять означают интенсивности флуоресценции (МФО) для каждого Флюорофор в данной выборке с помощью включения ворот, определяется в разделе 4.1.4. Нормализовать образцов в программное обеспечение для анализа потока событий пунктам. 10 000 пунктам обычно достаточно в анализе.
      Примечание: Это не редкость, чтобы найти примеры, которые содержат меньше, чем это число событий, так как это зависит от формирования и инфекции тяжести абсцесса. Используя этот подход, 500-40000 события обычно находятся в инфицированных тканях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы разработали плазмида, производный от pMAD32 , который может доставить любой репортер сплавливания построить в хромосоме, двойной кроссовер гомологичная рекомбинация (рис. 1). Эта конструкция позволяет для количественного анализа любого регулирования региона, которая поддерживает производство белка GFP и флуоресцентного сигнала выше фона. Плазмида наделяет ампициллин сопротивления (rAp) для обслуживания и распространения в E. coli и наделяет эритромицин сопротивления (rEm) в S. aureus. Конструкция также наделяет хлорамфеникол сопротивления (rсм), который позволяет для переноса комплексной репортер сплавливание между различными мутантных штаммов для сложных генетического анализа в S. aureus.

Как подтверждение принципа, мы сплавили КНУ регулирования региона gfp. КНУ была выбрана потому, что его продукт гена не требуется для полного вирулентности и требуется для ограничения макрофагов с S. aureus -индуцированной абсцессы42, 43. Конструкция была интегрирована в хромосоме, как описано в шагах 1.4-1.6 протокола. Интегрированный фьюжн, затем был переведен в AH3926, содержащий фьюжн - tdTomatosarAP1P. Сара P1 промоутер было показано ранее конститутивно активных44 и таким образом, этикетки все ячейки.

Мы сначала проверяется, что репортер сплавливания были активным во время в vitro shake колбу роста в Tryptic соевый бульон (БСЭ, богатый, сложный средний) и что уровни флюоресценции были выше сотовой авто люминесцентные фона (рис. 2). Чтобы определить, как флуоресцентные журналисты ведут себя в естественных условиях, изменение почек абсцесс модель была используется5. Группы женщин мышей C57BL/6 были оспорены внутривенно с 1 x 107 кое Стафилококк золотистый лак клеток не хватает репортер сплавливания или лак клетки, несущие как nuc-sGFP и sarAp1-tdTomato сплавливания. Животные были пожертвовал три дня пост инфекции. Затем собранный органов были зафиксированы в формалина 10% [v/v] буфер, крио секционного и фотосъемка, confocal микроскопии после DAPI окрашивание, как описано в шагах 2 и 3 (рис. 3A, B). Изображения были проанализированы с использованием изображений J и была измерена флуоресцирования на единицу площади в поражении почек. Как показано на рис. 3C, КНУ gfp фьюжн флуоресценции был в среднем почти в 9 раз выше в клетках, перевозящих фьюжн чем в клетках, не перевозящих репортер фьюжн; Последний сигнал представляет собой предел обнаружения (auto флуоресцентным) (Сравните nuc-sGFP для лак). Аналогичным образом, PsarAP1- tdtomato фьюжн флуоресценции был ~ шестикратно выше, чем не репортер элемента (рис. 3E, сравнить sarAP1- tdT против лак). С помощью проточной цитометрии, шаблон репортер мероприятий было подтверждено с помощью гомогенатах почек и проточная цитометрия, как описано в шаге 4, хотя раза различия в флуоресцировании были ниже (Рисунок 3D, F).

Интересно, что флуоресценции данных от поражения, образованный ношение флуоресцентные репортер сплавливаниями клетки, как представляется, показать выше изменчивость, чем те, которые отсутствуют на встрече с журналистами. Мы интересуется, является ли вариации в измерениях флуоресценции наблюдается из-за разнородных выражение журналистов (то есть, биологического происхождения). Действительно на расстоянии ~ 100 мкм было обнаружено, что некоторые поражения выразил одного или обоих журналистов (рис. 4). Важно отметить, что изучение деятельности репортер с резолюцией одну ячейку в общинах стафилококковых абсцессов (мешки) показали пространственных регуляцию экспрессии КНУ в гнойнички, ограничена с сильным DAPI окрашивание, вероятно, связанные с образование и выброс нейтрофилов внеклеточного ловушки (рис. 5A-C)45. К примеру мы измерили значительно выше nuc-sGFP фьюжн флуоресценции в ядре интерьера SAC, по сравнению с этим на периферии (рис. 5B, E). В том же абсцесса, шаблон для sarAp1-tdTomato фьюжн флуоресценции, как представляется, быть инвертированы (рис. 5D). Однако картина не была статистически значимой, используя одинаковое количество животных (рис. 5F).

Figure 1
Рисунок 1 : Схематическое представление генома интегративной репортер плазмида pRB4. Плазмида pRB4 является производным от pMAD с температуры чувствительных происхождения репликации в S. aureus (Ori pE194ts). Существует три наркотиков сопротивления маркеры: (i) бла, присвоении сопротивление ампициллин в кишечной палочки; (ii) ermC, присвоении устойчивость эритромицина в S. aureus; и (iii) кошка, присвоении сопротивление хлорамфеникол в S. aureus. Репортер конструкции в окружении ~ 500 bp от вышестоящих и нижестоящих последовательностей Псевдогены SAUSA300_0087 (ссылка генома: FPR3757) для двойной кроссовер гомологичная рекомбинация и генома интеграции. sGFP, зеленого флуоресцентного белка гена; CS, клонирование сайт; TT, сильные двунаправленные transcriptional Терминатор. Рисунок не в масштабе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Я многообразие NUC-sGFP и sarAp1-tdTomato Репортеры выражаются во время роста в пробирке . Стафилококк золотистый лак клеток (дикого типа [Вт]), с и без sGFP nuc-(A) или (B) sarAp1-tdTomato Репортеры) были выросла до экспоненциальной фазе в БСЭ и повторно разбавляют в той же среде. Оптическая плотность (ОД) и флуоресценции измерялись на значения указанных оптической плотности. Значения интенсивности флуоресценции фон вычитается (возбуждения/выбросов: sGFP, 485/535 Нм; tdTomato [tdT], 535/590 нм) были разделены по оптической плотности значений для создания относительных единицах флуоресценции. Данные являются средства + / SEM от двух независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Флуоресцентные Репортеры видны в почечной ткани. Группы 13 мышей C57BL/6 были оспорены внутривенно с ячейки лак или лак nuc-sGFP и sarAp1-tdTomato (tdT), и инфекции было разрешено продолжать следовать за три дня. Мышей были умерщвлены, и органы были обработаны как описано в шагах 2 и 3 протокола. Представитель почек секции показаны несколько поражений и связанные флуоресценции для (A) nuc-sGFP и (B) sarAp1-tdTomato. Масштаб баров = 250 мкм (10 x цель). Относительных единицах флуоресцирования на единицу площади (RFU [2мкм]-1), связанные с поражением почек были измерены с помощью анализа изображений, как описано в шаге 3.3 и были построены для (C) nuc-sGFP и (E) sarAp1-tdTomato; Каждая точка представляет один поражения и бары указывают медианы; 3-5 поражений, проанализированы на мышь. Cytometry анализ потока nuc-sGFP (D) и (F) sarAp1-tdTomato фьюжн флуоресценции в бактериальных популяций изолированных от инфекции пост трех дней гомогенатах инфицированных почек. Означают интенсивности флуоресценции (MFI) обозначается твердых бар, и каждая точка является одной почки. Лак, reporterless дикого штамма. Статистика: Тест Манна Уитни; p < 0,05. Данные представляют два независимых экспериментов. Волны возбуждения флуоресценции каналов для заключаются в следующем: DAPI, 405 нм; GFP, 488 нм; tdTomato, 561 Нм. Излучаемый флуоресценции данные были собраны в диапазоне длин волн: DAPI, 419-481 Нм; sGFP, 505-551 Нм; tdTomato, 575-630 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Абсцессы экспонат выражение переменной репортеров в почечной ткани. Группы 13 мышей C57BL/6 были оспорены с 1 x 107 кое S. aureus клеток через хвост вен. Животные были Усыпленных три дня пост инфекции. Почки были собраны, фиксированные и секционного для микроскопии флуоресцирования (40 x цель), как описано в шаге 2 протокола. В непосредственной близости с переменным уровнем nuc-sGFP (A) и (B) sarAp1-tdTomato флуоресценции изображены три поражения. (C) нуклеиновых кислот от стафилококки и узла указывается клетки путем пятнать DAPI. Красный и зеленый каналы объединены в (D). Аналогичные результаты были замечены в других разделах. Изображения были приобретены с использованием 40 x цели; Шкалы бар = 25 мкм. Волны возбуждения флуоресценции каналов для заключаются в следующем: DAPI, 405 нм; GFP, 488 нм; tdTomato, 561 Нм. Излучаемый флуоресценции данные были собраны в диапазоне длин волн: DAPI, 419-481 Нм; sGFP, 505-551 Нм; tdTomato, 575-630 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : NUC-sGFP пространственно регулируется в микро среды стафилококковых абсцессов. Конфокальный лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) изображения сообщества (SAC) поражения стафилококковых абсцессов, производимые S. aureus штамм лак нося nuc-sGFP и sarAp1-tdTomato репортер сплавливания. Изображены (A) объединить каналы для nuc-sGFP и sarAp1-tdtomato, (B) nuc-sGFP флуоресцирования (зеленый), (C) DAPI пятнать нуклеиновых кислот (синий) и (D) sarAp1-tdTomato флуоресцирования (красный). Звездочки показывают ячейки в ядре (центр тяжести) и стрелки показывают ячейки на периферии. Интенсивности флуоресценции для (F) и (E) nuc -sGFP sarAp1-tdTomato указаны для ячеек в ядро и периферии SAC. Волны возбуждения флуоресценции каналов для заключаются в следующем: DAPI, 405 нм; GFP, 488 нм; tdTomato, 561 Нм. Излучаемый флуоресценции данные были собраны в диапазоне длин волн: DAPI, 419-481 Нм; sGFP, 505-551 Нм; tdTomato, 575-630 Нм. Данные являются производными от 8 почек (по одному на мыши), и поражения 1-2 были образы от каждой почки. Бары указывают медиана. Пунктирная линия, предел обнаружения. Статистика: нормальное распределение данных, t критерия Стьюдента (непарные), ***p < 0,05. (Шкала бар = 20 мкм; применяется ко всем образам.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Бактериальных инфекционных заболеваний являются растущей проблемой здравоохранения во всем мире за счет приобретения антибиотикорезистентности детерминанты46. Потому, что адаптация к принимающей среде имеет важное значение для роста и выживания во время инфекции, стратегии, ориентированные программы выражение гена повышающие возбудителя фитнес может оказаться полезным терапевтически. Одна из таких программ является набор генов, контролируемых SaeR/S два компонента системы (TCS), играть важную роль в иммунной уклонение47было показано ранее. SaeR/S под воздействием целого ряда факторов, прежде всего те, которые связаны с нейтрофилов8,20. Во время инфекции S. aureus вызывает сильное воспалительной реакции, в котором нейтрофилов и другие фагоциты набираются на сайт инфекции2. Сжижение некроза и фибрин осаждения следовать, образуя абсцесс, чтобы предотвратить дальнейшее повреждение ткани48. В рамках этих иммунной привилегированных сайтов S. aureus клетки используют ряд продуктов Sae зависимых генов для перепрограммирования абсцесса для содействия бактериальных умножение5,48. Один ген Sae зависимых, КНУ, коды для нуклеиназы и усваивает сеток производить 2'-деоксиаденозин убить макрофаги43. Таким образом КНУ является важным выделяется фермент, который имеет важное значение для полной вирулентности42 и выраженной в vivo (рис. 3, рис. 4и рис. 5).

Хотя широко изучены факторы вирулентности S. aureus , как бактерии растет в узле представляет собой малоисследованный область, как это понимание, как его физиологии регулируется во время инфекции. Здесь мы описываем метод для проверки выражения гена бактериальной и поведения на уровне одной ячейки с помощью модифицированных интегративной вектор, уменьшает беспокойство для плазмида потери в отсутствие выбора. Наша методология позволяет прямой визуализации экспрессии генов в гнойнички без разрушения клеточной стенки и без необходимости для антител и маркировки. Мы обнаружили сильное выражение nuc-sGFP fusion, а также фьюжн sarAp1-tdTomato в почки абсцесс, должность SACs, образованный одичал тип клеток три дня инфекции в острой системной инфекции модели. Однако экспериментальный дизайн могут быть изменены для ответа на вопросы, касающиеся экспрессии генов в других сайтах. Действительно потому что мышей C57BL/6 способны очистить S. aureus от их тканей, бактерии вторгнуться различных анатомических сайтов, включая костной системы (костей и суставов) и мозг, сердце, селезенка и печень, все из которых имеют разные физиологии и питательные свойства5,49. Таким образом многое можно почерпнуть с помощью S. aureus зонда характер пребывания тканей. Важно отметить, что известно, что определенные ниши хост гипоксических характер или иным образом демонстрируют сильный кислорода градиента50. Флуоресцентные белки требуют молекулярного кислорода для деятельности, и некоторые более чувствительны к парциальному давлению кислорода чем другие51. Хотя мы видим флуоресценции сигнал глубоко внутри абсцесса, величины может быть занижен. С помощью кодон оптимизированный флуоресцентных белков, разработан для использования в Clostridium difficile могут использоваться для смягчения этой озабоченности52. Второй следует отметить, что флуоресцентные белки (sGFP и tdTomato), производимые репортер штаммов, используемых в настоящем исследовании являются стабильными. Таким образом флуоресцентный данные отражают накопления в течение эксперимента, вместо того, чтобы последние ответ. Генерации конструкцию, содержащий нестабильной sGFP или tdTomato гена будет значительно повысить полезность системы для динамических экспериментов.

Репортер система, описанная здесь предоставляет мощный инструмент учиться количественно гена регулирование в пробирке и в естественных условиях. Потому что репортер поддерживается в единственном экземпляре на хромосоме, система хорошо подходит для сильно выраженной генов (которые имея высокие промоутер активности). Биосинтетических генов или других смирен выраженной генов могут быть видны не потому, что уровень флюоресценции выражение может упасть ниже предела обнаружения или фон auto флуоресценции. Известно, что рибосома привязки сайта (RBS) влияет на активность Репортер сплавливания33. Потенциальным решением этой проблемы является использование сильнее RBS, таких как перевод инициации региона (МДП)53 или интегрировать тандем копии промоутеров интерес в хромосомы. Кроме того стабильные мульти копирования плазмид может быть используется54.

Метод, описанный ограничены, что в отличие от подготовки cDNA от РНК, извлеченные из тканей, сравнительно небольшое количество генов может быть допрошен одновременно (ограничено флуоресцентные каналов без спектральных перекрытия). Однако что достигается может быть потенциально более информативным. qRT-PCR и другие надписи, которые средняя массовая населения не в состоянии захватить неоднородности населения в месте инфекции. Действительно мы наблюдали гетерогенность в уровне КНУ sGFP и sarAp1-tdTomato выражение между абсцесс поражений в непосредственной близости (рис. 4). Это похоже на то, что недавно сообщили Кассат et al. 55 в настоящее время не известно происхождение этой неоднородности. Однако наличия питательных веществ, переменная всасывание питательных веществ приобретения систем или других факторов хост может возможно объяснить это явление. Кроме того в рамках микросреды органов или абсцессы, которые имеют сложную трехмерную структуру и различные типы клеток происходит взаимодействие хост патогена. В рамках этих структур тканей может существенно различаться в отношении pH, осмолярность, оксигенации и наличия питательных веществ, явление, известное как метаболические зональности56,57. Интуитивно мы обнаружили, что шаблон пространственного положения возникает в одичал тип клеток, проживающих в абсцесс (рис. 5). Это наши знания первое наблюдение в своем роде в грамотрицательных патогенов во время инфекции. Пространственное положение сообщили здесь похожа на что получено Davis et al. в селезеночной ткани содержащие microcolonies грамотрицательных патогенов Yersinia pseudotuberculosis58. В этом случае, принимающей производства оксида азота (NO *) стимулировал производство оксида азота dioxygenase (ГМЗ) в клетках на периферии ближе к диффундирующих NO *, щадящие интерьер microcolony клетки необходимость побудить выражение hmp. В стафилококковых абсцессов КНУ выражение является сильнейшим в центре мешка и слабым вдоль периферии. Потому что абсцессы окружены манжеты нейтрофилов, это соблазн предположить, что нейтрофилов, полученных сигналов руководите поведение стафилококки, поляризационный клетки в двух фенотипически отдельных популяций, напоминает морфообразующих регулирование дифференциация во время разработки в выше жизни59. Механистический основу этой модели неизвестна и является предметом интенсивного исследования в нашей лаборатории.

Мы считаем, что наш метод обеспечивает эффективный инструмент для изучения детализации экспрессии генов в отдельных клетках во время инфекции. Этот метод предоставляет уникальную возможность наблюдать и в конечном итоге понять физиологические истоки неоднородность и пространственного структурирования экспрессии генов в тканях. Это разнородных поведение должны учитываться при разработке новых методов лечения, как только субпопуляцию клеток (то есть, тех, кто выразил гены) может быть мишенью терапевтический.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Александра Horswill за дар PsarAP1- tdTomato fusion и Карен Кресвелл за помощь с cytometry анализ потока. Мы также благодарим Alyssa короля за консультацией по статистического анализа. Эта работа частично финансируется NIH награду разведочных/развития исследований (Грант AI123708) и факультет запуска средства SRB. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и толкование или решение представить работу для публикации.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

Tags

Генетика выпуск 144 экспрессии генов вирулентности флуоресценции конфокальная микроскопия гистопатология бактерии возбудитель территориального регулирования Sae два компонента системы Нуклеаза почек абсцесс
Для изучения бактериальный ген регулирование в инфицированных тканях метод, основанный на флуоресцирования
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz,… More

Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz, M. S., Brinsmade, S. R. A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (144), e59055, doi:10.3791/59055 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter