Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/59055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Georgetown University

Summary

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Abstract

Bakteriyel virülans genler kez transkripsiyon düzeyinde farklı çevresel sinyallere yanıt multipl faktörler tarafından düzenlenmektedir. Bazı faktörler doğrudan virülans genler üzerinde hareket; diğerleri Patogenez aşağı akım düzenleyiciler ifade veya regülatör etkinlik etkileyen sinyalleri birikimi ayarlayarak kontrol. Yönetmelik kapsamlı vitro büyüme sırasında okudu iken, nispeten az nasıl gen ekspresyonu enfeksiyon sırasında ayarlanır bilinir. Belirli gen ürünü terapötik müdahale için bir aday olduğunda böyle önemli bir bilgidir. Transkripsiyon yaklaşımlar gibi nicel, gerçek zamanlı RT-PCR ve RNA-Seq gen ekspresyonu küresel düzeyde incelemek ama bakteriyel RNA ana bilgisayar RNA ve örnek ile karşılaştırıldığında düşük bolluk dahil olmak üzere birçok teknik sorunlar muzdarip için güçlü yolu vardır RNases tarafından bozulması. Floresan gazetecilere kullanarak düzenleme değerlendirmek nispeten kolaydır ve benzersiz spektral özellikleri ile floresan proteinler ile multiplexed. Yöntemi gen ekspresyonu bakteriyel düzenleyici ağları etkileyen karmaşık üç boyutlu mimari ve physiochemical degradeler sergi dokularda tek hücreli, kronolojik zamanmekansal analizine olanak sağlar. Veri toplu Nüfus ortalaması bu tür bilgileri kaybolur. Burada, bakteriyel patojenler içinde in situgen ifadesinde miktarının bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem basit doku işleme ve floresan muhabir proteinler üzerinden doğrudan gözlem dayanır. Biz bu sistem yardımcı programı olan gen ürünü bağışıklık kaçırma ve ex vivo ve içinde vivo tam virülans için gereklidir Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), ifade inceleyerek göstermek. Biz o nük-gfp şiddetle renal apse ifade edilir ve türdeş olmayan gen ekspresyonu nedeniyle kısmen tamamen meşgul bağışıklık yanıtıyla apse nuc organizatörü faaliyete belirgin mekansal düzenleme için ortaya çıkarmak göstermek. Yöntem manipulatable bir genetik sistemi ile herhangi bir bakteri ve preklinik çalışmalar ve ilaç geliştirme için değerli bilgi veren herhangi bir enfeksiyon modeli uygulanır.

Introduction

Bakteri differentially adaptasyon ve hayatta kalmak için gerekli genler ifade ederek değişiklik çevreleri beslenme durumu ve fizyolojik şartlarda değişen cevap. Örneğin, fırsatçı patojenler yüzeyler, nispeten düşük yoğunlukları ve çoğu kez zararsız vücut kolonize. Bir kez bakteri fiziksel ve kimyasal bariyerler nüfuz, ancak, bu ana bilgisayar bağışıklık hücre karşı savunma ve sınırlı besin kullanılabilirlik1ile uğraşmak zorundadır. Örnek olarak, Staphylococcus aureus nüfusun yaklaşık üçte biri asymptomatically colonizes ama aynı zamanda yıkıcı deri ve yumuşak doku enfeksiyonları, osteomiyelit, endokardit ve bakteriyemi2nedeni. S. aureus bir patojen olarak başarısı kez metabolik olarak esneklik yanı sıra kan dolaşımına kaçmak ve periferik dokularda çoğaltmak bakteri etkinleştirmek yüzey ilişkili ve salgılanan virülans faktörleri bir cephanelik atfedilir 3,4,5. Stafilokokal hastalığı nedeniyle ana ölüm bir evrimsel çıkmaz ve yeni ev sahibi6sınırları iletim olduğundan, virülans faktörü üretime bağlılık dikkatle denetlenmelidir.

Karmaşık bir düzenleyici ağı kodlamayan RNA'ların yanıt için a değişiklik-in çevre uyaranlara ve proteinler de dahil olmak üzere hücre yoğunluğu, büyüme aşaması, nötrofil ilişkili faktörler ve besin durumu virülans genler, ifade edilir emin olmak için kesin zaman ve yer içinde ana bilgisayar doku7,8,9,10,11,12,13. Örneğin, SaeR/S iki bileşen sistemi (TCS) sensör kinaz (SaeS) ve yanıt regülatörü (SaeR)14üzerinden birkaç virülans faktörleri ifade düzenlemektedir. SaeS autophosphorylated ana bilgisayar sinyalleri (örneğin, insan nötrofil peptidler [HNPs], calprotectin)8,15,16yanıt olarak korunmuş histidin kalıntısı üzerinde olduğunu. Phosphoryl grubu sonra SaeR, harekete geçirmek o DNA'ya bağlanıcı protein üzerinde bir aspartat kalıntı aktarılır (SaeR ~ P)17. SaeR/S TCS fibronektin proteinler (FnBPs), leukocidins ve koagülaz14,18,19,20gibi patogenezinde katkıda 20'den fazla gen düzenlemektedir. Hedefleri SaeR düzeyi olarak indüklenen olasılığı yüksek benzeşme ve düşük-benzeşme gen hedefleri içine gizli ~ P onun ipuçlarını21' e maruz kaldığında yükselir. SaeR/S etkinlik gen ekspresyonu Agr çekirdek algılama sistemi gibi diğer düzenleyiciler, önleyici toksinler protein (Rot) ve alternatif sigma faktörü B (SigB)22,23,24tarafından kontrol edilir.

nuc Staphylococcus aureus bir Sae-bağımlı virülans gen ve thermonuclease (Nuc), neutrophilic extracellular trap (ağlar) kaçan ve dağıtımı sırasında için gerekli olan kodlar Tabii ki enfeksiyon25,26. Nuc ifade tarafından CodY dallı zincirli amino asitler ve GTP27varlığında da şiddetle dolaylı olarak bastırılmış ve doğrudan Stafilokokal aksesuar regülatör protein SarA28,29 tarafından bastırılmış , olan faaliyet oksijen (redoks devlet) ve pH30tarafından etkiledi. SAE ve nuc mutantlar enfeksiyon fare modellerinde zayıflatılmış verilen bu, onların ilgili etkinlikleri26,31inhibe kimyasal müdahaleler gelişmekte olan ilgi olduğunu. Buna rağmen onların düzenleme sırasında enfeksiyon ile ilgili hiçbir bilgi yoktur.

Floresan gazetecilere Gen ifadesinin tek hücre düzeyinde ölçmek ve izlemek için kullanılmaktadır. Burada, biz Smiktarının bir yöntem mevcut. aureus gen ekspresyonu enfeksiyon sırasında ne zaman çifte ile tüp bebek transcriptome Analizi ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve manyetik rezonans spektroskopi (MRS), gibi güçlü görüntüleme teknikleri ortaya nasıl bakteriyel Fizyoloji vivo ve belirli niş içinde besin göreli zenginliği düzenlenmiştir. Yöntem bakteriyel herhangi bir patojen uysal bir genetik sistemi ile uygulanabilir.

Genom bütünleştirici vektör genel bakış.

Genom bütünleştirici vektör pRB4 500 baz çifti her S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene Homolog rekombinasyon kolaylaştırmak için akış yukarı ve aşağı akım bölgelerinden içerir. pRB4 eritromisin direnç kaset (ermC) ve opsonins beta galaktozidaz gen bgaB mavi/beyaz tarama rekombinasyonlar32içeren sıcaklığa duyarlı pMAD vektör omurga türetilir. Mühendislik muhabir yapı da seçimden sonra genom entegrasyon ve plazmid eleme yanı sıra ilgi superfolder yeşil düzenleyici bölgesi sigorta için EcoRI ve SmaI siteleri için kloramfenikol direnç işaretçisi (kedi) içeren Floresan protein (sGFP) (Şekil 1). Seçtiğiniz ribozom bağlama Makinası (KÇY) bir muhabir aktivitesini etkiler ve ampirik optimizasyonu33kez gerektirir bilinir. Böylece, bir KÇY sağlanan. Burada, yerel ribozom bağlama sitesi gen ekspresyonu daha doğal bir desen için sağlamak için kullanılır, ancak diğer sitelerde kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Georgetown Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. nesil floresan muhabir zorlanma

  1. Sırayla EcoRI ve SmaI enzimleri ile genom bütünleştirici pRB4 vektör sindirmek. Üreticinin protokolüne pRB4 1 µg 25 ° C'de kullanarak SmaI ile bir gecede sindirim ayarlayın ve sonra ikinci sindirim 37 ° C'de 1 h için EcoRI reaksiyon karışıma ekleyerek devam. Enzimler için 20 dk 65 ° C'de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
  2. PCR yükseltmek (içinde thermonuclease [nük] organizatörü bölge içeren bu durumda, bir ~ 350 baz çifti DNA parçası), genomik DNA dan ilgi Düzenleyici bölge 5' EcoRI kısıtlama sitesi ve 3' SmaI kısıtlama sitesi ekleme. Çerçeve SmaI tanıma sıra olmalıdır translasyonel başlama kodonu ile. Bu çalışmada, bir yüksek-sadakat DNA polimeraz üreticinin önerilerini göre ileri astar oRB015 ile kullanarak PCR gerçekleştirildi (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') ve ters astar oRB016 () 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). Tavlama sıcaklığı 53 ° C. yapıldı. Üreticinin yönergelerini izleyerek bir PCR temizlik kiti kullanılarak elde edilen parça arındırmak.
  3. Elde edilen PCR ürün EcoRI ve 1.1 adımda gerçekleştirilen gibi SmaI sindirmek ve sindirilmiş DNA parçası sitelere T4 DNA ligaz üretici tarafından önerilen gibi bütünleştirici yapı oluşturmak için aynı pRB4, ligate. E. coli tüp ligasyonu karışımı tanıtmak ve yapı sırasını doğrulayın.
  4. Electroporate yapı S. aureus zorlanma RN4220 içine daha önce34açıklandığı gibi. Kısacası, plazmid 1 µg elektro-yetkili hücreleri 70 µL ile kullanın (100 Ω, 25 µF ve 2.3 kV) B2 suyu (%1 [w/v] kazein hidrolizat, %2.5 [w/v] maya ekstresi, %2.5 [w/v] NaCl, %0,1 [w/v] K2PO4, %0,5 [w/v] glikoz) içinde. Eritromisin direnç (Emr), eritromisin (5 µg mL-1) ve 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 80 µg mL-1) ile tryptic soya agar (TSA) üzerinde keyfi sıcaklığında (30 ° C) seçin. Plazmid kodlanmış β-galaktozidaz etkinliği nedeniyle ortaya çıkan transformants mavidir.
    Not: DNA'ın transfer klinik yalıtır içine nedeniyle bir güçlü kısıtlama-değişiklik bariyer35son derece zordur. Böylece, çünkü bu kısıtlama eksik ve son derece transformable S. aureus RN4220 füzyon yapı ara bir alıcı olarak kullanıldı.
  5. Plazmid S. aureus USA300 zorlanma Elektroporasyon ya da iletim faj-aracılı36 keyfi sıcaklığında kullanarak ilgi aktarın. Kısacası, parçacıklar üzerinde 5 mM CaCl2 içeren TSA plakaları kullanarak donör zorlanma 30 ° C'de bir gecede ve bir 0,45 µM selüloz asetat şırınga filtreden filtrasyon tarafından sterilize Φ11 bakteriyofaj yaymak. S. aureus zorlanma LAC Emriçin transduce için Lysates kullanın.
    Not: LAC daha önce Em tarafından seri Emr 37,38confers yerli plazmid pUSA03 suşu tedavi için tekerlekli sandalye basketbolu orta pasajda hassas yapıldı yaygın olarak kullanılan bir klinik izole olduğunu.
  6. Yapı iki, art arda gelen Homolog rekombinasyon olaya32daha önce açıklandığı gibi kromozom entegre. Rekombinasyonlar kloramfenikol, eritromisin duyarlı (Erms) ve hiçbir uzun mavi kloramfenikol dayanıklı (Cmr) 5 μg mL-1 içeren TSA plakaları vardır.
    Not: mümkün olduğunda, tüp bebek zorlanma geçit39 ve sıcaklık vardiya ile ilişkili mutasyonların birikimi önlemek için iletim faj-aracılı ile USA300 içine füzyon işaretli yeniden tanıtmak.

2. hayvan enfeksiyon: Hazırlık Inoculum, sistemik enfeksiyon ve doku işleme

  1. Bakteriyel inoculum hazırlanması
    1. S. aureus suşları yalıtım için ilgi kan agar tabaklarda donmuş gliserol stoktan çizgi. 16-24 h 37 ° C'de hemolitik fenotipleri kırmızı kan hücreleri (RBCs) koşullar onların becerisi ilgili ve formu temizlemek şeffaf bölgeleri onaylamak için kuluçkaya.
    2. Gecede kültürler her baskı 4 ml steril cam tüpler tryptic soya suyu (TSB) tek kolonileri aşı başlatın. 16-24 h yaklaşık 70 ° açı ve [d/d] dakikada 70 dönüşler ayarlamak bir tüp rulo olarak 37 ° C'de tüpler döndürün.
    3. 600 optik yoğunluk ölçmek için bir spektrofotometre kullanın nm (OD600) adım 2.1.2 kültürlerin. Steril Orta (boş) bir optik başvuru olarak kullanın. Bu hücreler olarak 0,05 25 mL ayrı Tryptic soya suyu (TSB) Steril, OD600 sulandırmak, 125 mL şişe (5:1 şişe hacim oranı için) DeLong ve bir su banyosu (için kültürlere uygun ısı transferi), kültürde kuluçkaya 280 RPM'de sallayarak ve 37 ° C'ye ayarla
      Not: İnoculum büyüme çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir; hücreleri üssel faz için büyüyen bir yöntem sunulur. Ne olursa olsun, sürekli olarak hücreleri aşılama için hazırlamak için aynı yöntemi kullanmak önemlidir.
    4. Bir OD600 ~ 1, hücreleri içine taze bir başlangıç OD600 hücreleri üssel faz ulaşmak ve gecede kuluçka sırasında birikir faktörler üssel faz seviyelere düşürülmüştür var emin olmak için 0,05 ortamına yeniden sulandırmak.
    5. Hücreleri üssel faz (OD600 ~0.6–0.8) sırasında 3000 x g oda sıcaklığında 10 dakika için de centrifuging tarafından hasat.
    6. Granül iki kez steril 1 fosfat tamponlu tuz (PBS; pH 7,4) x eşdeğer hacmi yıkayın.
    7. 1 x 1 x 108 koloni birimleri (CFUs) mL-1 oluşturan bir konsantrasyon (pH 7,4) PBS'ye hücrelerde askıya alma veya istenen uygun olarak deneme.
      Not: hücre boyutu ve şekli zorlanma bağlı değişikliklere ışık saçılma özellikleri etkileyebilir çünkü OD600 ve CFU mL-1 faiz her tür için arasındaki ilişkiyi belirlemek önemlidir ve sonuçta, enfeksiyon doz.
  2. Hayvanlar ve bakteriyel enfeksiyon hazırlanması
    1. Saf diyet AIN-93 7 gün için fareler alışmana. Diyet doku auto-floresan standart fare chow40içinde kullanılan bitkisel kökenli malzemeler tüketimi ile ilişkili azaltırken yeterli beslenme sağlamak için formüle edilmiştir.
      Not: Kadın C57/BL6 fareler (6-8 haftalık) burada kullanılır, ancak fare zorlanma ve seks üzerine çalışma bağlı olacaktır.
    2. Enfeksiyon önce ılık su ile fare kuyruğu damarlar dilate.
    3. Hayvanlar bakteriyel inoculum sistemik enfeksiyon üretmek için kuyruk-damarlar yoluyla enjekte ederek 100 µL tarafından bulaştırmak. Akış Sitometresi gerçekleştirme ilk inoculum bir aliquot kaydedin (bkz. Bölüm 4).
    4. Hayvanlar her gün izlemek ve gözden geçirilmiş ve bir kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış bir izleme sistemi kullanarak onların sağlık durumunu değerlendirmek.
    5. İlerleme için enfeksiyon istenen süresi için izin vermek. Burada, deneyler sona erdirilen 3 gün sonrası enfeksiyon vardır.
      Not: Bu koşullar altında fibrin mevduat tarafından alınmış ve bağışıklık hücreleri5,41eşmerkezli katman tarafından çevrili bakteri, Stafilokokal apse topluluğu apseler oluşur.
  3. Organ ve doku işleme hasat
    1. CO2 inhalasyon ve servikal çıkık bir ikincil Yöntem olarak hayvanlara ötenazi ve Nekropsi gerçekleştirin.
    2. Hasat böbrek (sağda) ve diğer hayati organlara (kalp, karaciğer, akciğer, dalak) ve % 10 [v/v] arabelleğe alınmış formalin içeren 15 mL polipropilen tüpler içine aktarın. Bu organların 2.3.4 aşağıdaki adım ile devam edin.
    3. Sol böbrek ~ 500 µL 2 mm silis boncuk ve 1 mL steril 1 x PBS (pH 7,4) içeren steril 2 mL darbeye dayanıklı boru için transfer. Bu organ ile 4.2 adıma geçin.
    4. Organ adım 2.3.2 nazik sallayarak veya dönüş için en az 24 saat ama 48 saatten fazla oda sıcaklığında karanlıkta düzeltmek için izin verir.
    5. Organları orta buz gibi açık dokusunda katıştırmak ve dokulara-80 ° C'de depolayın
    6. Bir cryostat, Bölüm doku 10 µm kalınlığında dilimler halinde kullanarak.
    7. 20 dk için önceden temizlenmiş, şarj edilmiş cam slayt üzerindeki bölümler karanlıkta kuru, sabit montaj orta ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) leke, uygulamak ve coverslip uygulayın. Oda sıcaklığında bağlı slaytlar gecede tedavi ve uzun süreli depolama için 4 ° c aktarın.

3. lazer Confocal mikroskobu tarama ve görüntü işleme

  1. Lezyonlar lazerler kullanılmakta floresan muhabir için uygun kullanarak bulmak için takılı slaytları inceleyin. Bu durumda, yeşil (GFP), kırmızı (tdTomato) ve mavi (DAPI) Floresan içinde sinyalleri kullanılır.
  2. Tek tek hücreleri görüntülenmesi için uygun amaç kullanarak görüntüyü elde etmek (örneğin, genellikle 20 x veya 40 x hedefleri kullanılır).
  3. Floresans yoğunluklarını confocal görüntüleri ölçmek.
    1. Confocal görüntü içinde görüntü J açın ve düzgün görselleştirmek lezyon floresans sinyalinin için Parlaklık/kontrast ayarlamak.
    2. İlgi ve eşik seçeneğini kullanarak bölgesi tanımlamak, floresans alt ve üst sınırları gerektiği gibi ayarlayın.
    3. Centroid seçerek belirleyin alan → ortalama gri değeri → Centroid → sınırlamak için eşik görüntü J. çözümlemek etiket altında
    4. Centroid floresans yoğunluk değeri ayıklamak için veya GFP ve tdTomato için verilen bir lezyon birim alan (ortalama floresans yoğunluğu, MFI) başına ortalama floresans şiddeti ölçmek. Burada, bir µm2 alanlarında kullanıldı.
      Not: Örnek kimliğini bilindiğinde önyargı kör bir ikinci analiz en aza indirir.
    5. Verileri çizmek ve uygun istatistiksel analizler için her karşılaştırma gerçekleştirir.

4. Akış Sitometresi Analizi

  1. (İsteğe bağlı) Enfeksiyon (2.2.3 bölümünden) günü inoculum füzyon etkinliğini belirlemek
    1. 1 x 899 µL için steril PBS (pH 7,4) her inoculum 100 µL ekleyin ve 1 µL membran permeant nükleik asit leke ( Tablo malzemelerigörmek). Bir denetim olarak, nükleik asit leke eksik bir örnek eklediğinizden emin olun.
    2. Akış Sitometresi tüm örnekleri üzerinde gerçekleştirin.
      Not: İlk deneme için bir vektör tek denetimini kullanmak için uygun voltaj belirlemek için faiz füzyon için eklemek yararlıdır. Pozitif ve negatif örnekleri arasında net bir ayrım veri analizi için esastır muhabir gösteren de arka plan sinyaldir.
    3. Bakteriyel nüfusu tanımlamak için nükleik asit leke (y ekseni) kullanarak olayları arsa ve dağılım (x ekseni) iletmek.
    4. Bir içerme kapı her iki nükleik asit leke olumlu olaylar ve bakteri ( S. aureusiçin 0.5-2.0 µm arasında) ileri dağılım göre doğru boyutunu çizin.
      Not: Bu nüfus olayları açıkça bu parametreleri içerecek şekilde kritik olarak tanımlarken titiz olmak. Bu kapının diğer koşullar altında negatif denetimler için tüm olayları hariç emin olun. Bu çalışmada, yaklaşık % 70 hücre nüfus araya geldi bu gereksinimleri analiz.
  2. Kurban sonra doku örnekleri analiz:
    1. Hayvanlara ötenazi, (bkz: adım 2.3) sol böbrek hasat ve transfer boncuk atan içine tüpler içeren 1 mL steril PBS (pH 7,4) x 1 ve 2 mm borosilikat boncuk 250 µL.
    2. Bakteri hücreleri serbest bırakmak için doku bozabilir. Böbrek için hücreleri bozmaya bir homogenizer kullanın. Burada, üç 30 s patlamaları 1dk dönemlere ilişkin döngüleri arasında ıslak buz soğutma ile 6800 rpm Isıtma örnekleri en aza indirmek için kullanılmıştır.
    3. 250 x g masa üstü microcentrifuge 3 dk için de centrifuging tarafından büyük doku enkaz 4 ° C'ye soğutmalı Pelet
      Not: Genellikle, bir hücre Pelet tüp ve yüzen enkaz üst tabakası altındaki olur. Orta sulu tabaka bakteri hücreleri içerir.
    4. PBS 989 µL nükleik asit leke 1 µL içeren bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine sulu katmandan 10 µL transfer (Toplam birim 1 mL).
    5. Aynı veri toplama parametrelerini kullanarak ve ilk inocula gelince çoğunluğuna akış sitometresi gerçekleştirin.
      Not: Örnek esas olarak doku enkaz içerdiğinden bakteriyel hücre sayısı çok düşük olacaktır. Uygulamaya veri yüklendiğinde nükleik asit leke olumlu ve boyutu geçitli hücreler varsa "Canlı kapısı" seçeneği de kullanılabilir. Bu da hedef olayların daha fazla analiz ve dosya boyutunu azaltmak için yardımcı olacaktır. Yaklaşık bir milyon olayları örnek başına sayılır, ama daha fazla olay sayar enfeksiyonun şiddeti ve analiz doku boyutunu bağlı olarak gerekli olabilir.
    6. Veri Analizi: Belirlemek için her fluorophore verilen örnek 4.1.4 bölümünde belirlenen dahil kapıları kullanarak bir floresan yoğunluğu (MFI) demek. Akış Analizi yazılım gerek olay örneklerinde normalleştirmek. 10.000 adet Analize genellikle yeterlidir.
      Not: Bu olay sayısı daha az bu apse oluşumu ve enfeksiyon şiddetine bağlıdır beri içeren örnekler bulmak için nadir değildir. Bu yaklaşım, 500-40,000 kullanarak olayları genellikle enfekte dokusunda bulunur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Herhangi bir muhabir sunabilirsiniz pMAD32 türetilmiş bir plazmid geliştirdiğimiz füzyon yapı tarafından çift crossover Homolog rekombinasyon (Şekil 1) kromozom içine. Kantitatif analiz GFP protein ve arka plan üzerinde floresan sinyal üretimini destekleyen herhangi bir düzenleyici bölgesi için bu yapıyı sağlar. Plazmid ampisilin direnç (Apr) bakım ve E. coli yayılmasında confers ve eritromisin direnç (Emr) in confers S. aureus. Yapı aynı zamanda entegre muhabir füzyon kolay Aktarım Gelişmiş Genetik Analizi çeşitli mutant suşları arasında izin veren kloramfenikol direnç (Cmr), confers S. aureus.

İlke kanıtı olarak biz nuc erimiş gfp. nük düzenleyici bölgeye onun gen ürünü tam virülans için gereklidir ve S. aureus -makrofajlar kısıtlama apse42, indüklenen için gereklidir çünkü seçildi 43. Yapı Protokolü'nün 1.4-1.6 adımlarda açıklandığı gibi kromozom içine entegre edildi. Entegre füzyon sonra bir PsarAP1- tdTomato füzyon içeren AH3926 nakledildi. SarA P1 organizatörü daha önce yapısal etkin44 olmak gösterilmiştir ve bu nedenle, tüm hücreler etiketleri.

Muhabir füzyon vitro sırasında etkin sallamak balonun büyüme Tryptic soya suyu (TSB; bir zengin, karmaşık orta) ve floresan düzeyleri hücresel Otomatik Floresan (Şekil 2) arka plan olduğunu olduğunu önce doğruladı. Nasıl flüoresan gazetecilere içinde vivo davranmak belirlemek için kullanılan5değiştirilmiş renal apse model idi. Kadın C57BL/6 farelerin grupları intravenöz 1 x 107 ile her muhabir füzyon eksik S. aureus LAC hücreleri veya nük-sGFP ve sarAp1-tdTomato füzyon taşıyan LAC hücreler CFU meydan. Hayvanlar kurban üç gün sonrası enfeksiyon vardı. Sonra hasat organları % 10 [v/v] arabelleğe alınmış formalin içinde tespit edildi, soguk kesitli ve görüntülü tarafından açıklandığı gibi DAPI boyama sonra confocal mikroskobu 2 ve 3 (Şekil 3A, B) adımları. Görüntüleri görüntü J kullanarak analiz edildi ve floresan böbrek lezyon alanında birim başına ölçüldü. Şekil 3' teCgösterildiği gibi daha füzyon değil muhabiri füzyon taşıyan hücrelere taşıyan hücrelere neredeyse 9-fold daha yüksek ortalama nük-gfp füzyon floresans vardı; İkinci sinyal algılama (auto-floresan) (karşılaştırma nük-sGFP LAC için) sınırını oluşturmaktadır. Benzer şekilde, PsarAP1- tdtomato füzyon floresans oldu ~ 6-fold (Şekil 3E, karşılaştırmak sarAP1- tdT vs LAC) hiçbir gazeteci kontrolü daha yüksek. Akış Sitometresi kullanarak, muhabir faaliyetlerinin desen böbrek homogenates kullanarak doğrulandı akış sitometresi adım 4'te açıklandığı gibi kat floresans içinde farklılıklar olsa (resim 3D, F) daha düşük idi.

İlginçtir, floresan muhabir füzyon taşıyan hücreleri tarafından kurulan lezyonlar floresans verilerden daha yüksek değişkenlik bu gazeteciler eksik daha göstermek için ortaya çıktı. Varyasyon gözlenen floresans ölçümlerde gazeteciler türdeş olmayan ifade nedeniyle olup olmadığını merak ettik (diğer bir deyişle, biyolojik kökenli). Nitekim, ~ 100 µm mesafe içinde bazı lezyonlar bir veya her iki gazeteci (Şekil 4) ifade bulundu. Önemlisi, tek hücre çözünürlük (SACs) Stafilokokal apse toplumlarda aktivitesiyle muhabir inceleyerek mekansal düzenleme güçlü DAPI, büyük olasılıkla ile ilgili boyama ile sınırlı apse nuc ifade, ortaya oluşumu ve serbest bırakmak-in nötrofil hücre dışı yakalar (Şekil 5A-C)45. Örneğin, önemli ölçüde daha yüksek nük-sGFP füzyon floresan ile (Şekil 5B, E) çevre üzerinde kıyasla SAC iç çekirdek ölçülen. Aynı apse sarAp1-tdTomato füzyon floresan için desen olduğu ortaya çıktı (Şekil 5D) ters. Ancak, desen aynı hayvanlar (Şekil 5F) kullandığı istatistiksel olarak anlamlı değildi.

Figure 1
Resim 1 : Genom bütünleştirici muhabir plazmid pRB4 şematik gösterimi. Plazmid pRB4 S. aureus (Ori pE194ts) çoğaltmasında sıcaklık duyarlı kökeni ile pMAD bir türevidir. Üç ilaç direnci işaretleri vardır: (i) blaampisilin Escherichia coliiçinde; direnç veriyor, S. aureuseritromisin direnci veriyor (II) ermC, ve (iii) kedi S. aureuskloramfenikol direnci veriyor. Muhabir yapı ~ 500 tarafından çevrili olduğunu her pseudogene SAUSA300_0087 akış yukarı ve aşağı akım dizilerinden bp (genom başvuru: FPR3757) çift crossover Homolog rekombinasyon ve genom entegrasyon için. sGFP, yeşil flüoresan protein gen; CS, klonlama sitesi; TT, güçlü çift yönlü transkripsiyon Sonlandırıcı. Şekil değil ölçek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Ben ntegrated nük-sGFP ve sarAp1-tdTomato gazetecilere tüp bebek büyüme sırasında ifade edilir . S. aureus LAC hücreleri (vahşi-türü [WT]) ve(a) nük -sGFP veya (B) sarAp1-tdTomato gazetecilere olmadan) üssel faz tekerlekli sandalye basketbolu büyüdü ve aynı ortamın yeniden seyreltilmiş. Optik yoğunluk (OD) ve floresan belirtilen optik yoğunluk değerlerinde ölçüldü. Arka plan düşülen floresans yoğunluk değerleri (uyarma/emisyon: sGFP, 485/535 nm; tdTomato [tdT], 535/590 nm) göreli floresans birimleri oluşturmak için optik yoğunluk değerleri tarafından ayrıldı. SEM +/-anlamına gelir iki bağımsız deney verilerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Floresan gazetecilere böbrek dokusunda görünür. 13 C57BL/6 farelerin grupları intravenöz LAC hücreleri veya nük-sGFP ve sarAp1-tdTomato (tdT)taşıyan LAC hücreleri ile meydan ve enfeksiyon üç gün boyunca devam etmek için izin verildi. Fareler euthanized ve organları 2 ve 3 iletişim kuralının adımlarda açıklandığı gibi işlendi. Çoklu lezyonlar ve ilişkili floresan(a)için gösterilen temsilcisi böbrek bölüm nük-sGFP ve (B) sarAp1 tdTomato. Ölçek çubukları 250 µm (10 x amaç) =. Böbrek lezyonlar ile ilişkili birim alana (RFU [μm kalınlığında2]-1) başına göreli floresans birim 3,3 adımda anlatıldığı gibi görüntü analizi kullanılarak ölçüldü ve için çizildi (C) nük-sGFP ve (E) sarAp1-tdTomato; Her nokta bir lezyon temsil eder ve ortanca Çubuklarõn; 3-5 lezyonlar fare analiz. Akış Sitometresi Analizi nük-sGFP (D) ve (F) sarAp1-tdTomato füzyon floresans bakteriyel nüfus virüslü böbrek homogenates üç gün sonrası enfeksiyondan izole. Demek floresan yoğunluğu (MFI) katı çubukla belirtilir ve her nokta bir böbrek değil. LAC, reporterless yaban tipi zorlanma. İstatistikler: Mann-Whitney Test; p < 0.05. İki bağımsız deney temsilcisi verilerdir. Uyarma dalga boylarında floresans kanallar için aşağıdaki gibidir: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Dalgaboyu aralığında toplanan verilmiş floresans veri: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Apse değişken ifade gazetecilere böbrek dokularda sergi. 13 C57BL/6 farelerin grupları 1 x 107 S. aureus hücre kuyruk-damar yoluyla CFU ile meydan. Hayvanların üç gün ötenazi sonrası enfeksiyon olduğunu. Böbrekler, sabit ve kesitli floresans mikroskobu (40 x amaç) için Protokolü'nün 2 adımda anlatıldığı gibi hasat edildi. Üç lezyonlar yakın nük-sGFP (a)ve (B) sarAp1-tdTomato floresan çeşitli düzeyleri ile gösterilmiştir. (C) nükleik asit stafilokoklar ve ana bilgisayar hücreleri belirtilir DAPI boyama tarafından. Yeşil ve kırmızı kanalları (D) birleştirilir. Benzer sonuçlar diğer bölümlerde görüldü. Görüntüleri bir 40 x hedefi kullanarak elde; Ölçek çubuğu 25 µm =. Uyarma dalga boylarında floresans kanallar için aşağıdaki gibidir: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Dalgaboyu aralığında toplanan verilmiş floresans veri: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : nük-sGFP Stafilokokal apse mikro ortamında dağınık şekilde düzenlenir. Confocal lazer S. aureus zorlanma LAC taşıma nük-sGFP ve sarAp1-tdTomato muhabir füzyon tarafından üretilen Stafilokokal apse topluluk (SAC) lezyon görüntülerini mikroskobu (CLSM) tarama. (A) gösterilmiştir birleştirilmiş nük-sGFP ve sarAp1-tdtomato, (B) nük-sGFP Floresan (yeşil), kanalı nükleik asitler (mavi) ve (D) (C) DAPI boyama sarAp1-tdTomato Floresan (kırmızı). Yıldız hücreler çekirdek (centroid) gösterir ve oklar, periferal hücreleri gösterir. (E) nük -sGFP ve (F) Floresan yoğunluklarını sarAp1 tdTomato çekirdek ve SAC çevre hücrelerde destekleyen yapýlandýrmalar gösterilir. Uyarma dalga boylarında floresans kanallar için aşağıdaki gibidir: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Dalgaboyu aralığında toplanan verilmiş floresans veri: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Verileri 8 böbrekler (fare başına bir adet) türetilir ve 1-2 lezyon her böbrek görüntüsü. Çubuklar medyan gösterir. Kesikli çizgi sınırı algılama. İstatistikler: Normal dağılım veri, öğrenci t-(unpaired), test ***p < 0,05. (Ölçek çubuğu 20 µm =; tüm görüntüler için geçerlidir.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bakteriyel enfeksiyon hastalıkları antibiyotik direnci belirleyicileri46edinimi nedeniyle Dünya çapında bir artan sağlık sorunu vardır. Ana bilgisayar ortamları uyum gelişim ve hayatta kalma sırasında enfeksiyon için gerekli olduğundan, patojen fitness artırmak gen ifade programları hedefleme stratejileri tedavi amaçlı işe yarayabilir. Böyle bir programı bağışıklık kaçırma47yılında önemli bir rol oynamak için daha önce gösterilen SaeR/S iki bileşen sistemi (TCS), tarafından kontrol genler kümesidir. SaeR/S faktörler, en önemlisi bu nötrofil8,20ile ilgili çeşitli tarafından indüklenen. Enfeksiyon sırasında S. aureus içinde enfeksiyon2siteye nötrofil ve diğer fagositler işe güçlü bir enflamatuar yanıt aydınlığa çıkartıyor. الرسالة nekroz ve fibrin birikimi izleyin, daha fazla doku hasar48önlemek için bir apse oluşturan. Bu bağışıklık ayrıcalıklı siteler içinde S. aureus hücreleri bakteriyel çarpma5,48kolaylaştırmak için apse yeniden programlamak için Sae-bağımlı gen ürününü kullanın. Bir Sae-bağımlı gen, nuc, nükleaz için kodları ve 2'-makrofajlar43öldürmeye deoxyadenosine üretmek için ağlar metabolize. Böylece, Nuc tam virülans42 için önemlidir ve ifade vivo içinde (Şekil 3, Şekil 4ve Şekil 5) önemli salgılanan enzimdir.

S. aureus virülans faktörleri kapsamlı bir şekilde inceledik rağmen nasıl büyür bakteri konak çöküşünde, onun fizyolojisi enfeksiyon sırasında nasıl düzenlenir anlama gibi yerleşim yeridir. Burada bakteri gen ekspresyonu ve davranış endişe plazmid kaybı yokluğunda, seçim için bir azaltıcı etkendir değiştirilmiş bir bütünleştirici vektör kullanarak tek hücre düzeyinde problama için bir yöntem açıklanmaktadır. Metodolojimiz apse Gen ifadesinin doğrudan görüntüleme için antikorlar ve etiketleme için gerek kalmadan ve hücre duvarları permeabilize zorunda kalmadan sağlar. Güçlü ifade nük-sGFP füzyon hem de sarAp1-tdTomato füzyon renal apse SACs üç gün vahşi tipi hücreleri tarafından kurulan bir Akut sistemik enfeksiyon modelinde enfeksiyon sonrası içinde tespit ettik. Ancak, deneysel tasarım diğer sitelerdeki gen ekspresyonu ile ilgili soruları cevaplamak için değiştirilebilir. S. aureus onların dokulardan temizlemek C57BL/6 fareler başlatamadığından, gerçekten de, her biri farklı fizyolojisi iskelet sistemi (kemikler ve eklemler) ve beyin, kalp, dalak ve karaciğer de dahil olmak üzere çeşitli anatomik siteleri bakteri istila ve besleyici özellikleri5,49. Böylece, çok şey doğa ana bilgisayar dokuların soruşturma için S. aureus kullanarak öğrenilebilir. Bu belirli ana bilgisayar nişler doğada hipoksik veya başka bir güçlü oksijen degrade50sergi bilinmektedir unutmamak gerekir. Floresan proteinler etkinlik için moleküler oksijen gerektirir, ve bazı diğerlerinden daha oksijen kısmi basınç duyarlı51. Floresans gördüğümüz iken sinyal apse içinde derin, büyüklükleri bir hafife olabilir. Floresan proteinler kodon optimize Clostridium difficile kullanılmak üzere geliştirilen kullanarak bu endişe52azaltmak için kullanılabilir. Unutulmaması gereken ikinci bir nokta bu çalışmada kullanılan muhabir suşları tarafından üretilen floresan proteinler (sGFP ve tdTomato) kararlı olmasıdır. Bu nedenle, floresan veri birikimi son bir yanıt yerine deneme boyunca yansıtır. Bir kararsız sGFP veya tdTomato gen içeren bir yapı oluşturma dinamik deneyler için sistem yardımcı programı büyük ölçüde artar.

Burada açıklanan muhabir sistemi kantitatif gen düzenleme vitro ve içinde vivoçalışmada için güçlü bir araç sağlar. Muhabir kromozom üzerinde tek kopya tutulduğundan, sistem (yüksek organizatörü faaliyet sahip) kuvvetle ifade genler için çok uygundur. Floresans ifade düzey algılama veya arka planda otomatik floresans sınırın altına düşebilir çünkü biyosentetik genleri veya diğer basit ifade genler görünmeyebilir. Ribozom bağlama Makinası (KÇY) muhabir füzyon33aktivitesini etkiler bilinmektedir. Bir potansiyel bu soruna çeviri başlatma bölge (tır)53 gibi daha güçlü bir KÇY veya Organizatör ilgi kopyalarını tandem kromozom entegre bir çözümdür. Alternatif olarak, istikrarlı çoklu kopya plazmid kullanılan54olabilir.

Dokulardan çıkarılan RNA üzerinden cDNA hazırlık genler nispeten az sayıda aynı anda sorguya, açıklanan yöntemi kısıtlamasıdır (floresan kanallar spektral çakışma olmadan sınırlı). Ancak, potansiyel olarak daha bilgilendirici olabilir ne elde edilir. qRT-PCR ve toplu nüfus ortalama diğer dökümanları nüfus heterojenite enfeksiyon yerinde yakalamak mümkün değildir. Nitekim, Biz heterojenite nük-sGFP düzeyde gözlenen ve apse lezyonlarının arasında sarAp1-tdTomato ifade yakın (Şekil 4). Bu ne son zamanlarda Cassat ve ark. tarafından rapor edildi için benzer 55 Şu anda, bu heterojenlik kökeni bilinmemektedir. Ancak, besin kullanılabilirlik, değişken indüksiyon besin satın alma sistemleri veya diğer ana faktörler muhtemelen fenomen açıklayabilir. Ayrıca, ana bilgisayar-patojen etkileşim içinde organ veya karmaşık üç boyutlu yapısı ve çeşitli hücre tiplerinin apse microenvironments oluşur. Bu yapılar içinde dokular pH, Osmolarite, oksijen ve besin kullanılabilirlik, metabolik zonation56,57bilinen bir olay ile ilgili olarak önemli ölçüde değişebilir. Keşfettiğimiz serendipitously bir desen mekansal düzenleme apse (Şekil 5) ikamet eden vahşi-tip hücrelerde ortaya çıkar. Bu bizim için gram-pozitif bir patojen kendi türünde ilk gözlem sırasında enfeksiyon bilgidir. İşte bu Davis ve ark. tarafından elde edilen benzer mekansal düzenleme bildirdi dalak dokusunda gram-negatif patojenin Yersinia pseudotuberculosis58microcolonies içeren. Bu durumda ana bilgisayar nitrik oksit (NO *) nitrik oksit dioxygenase (Hmp) hücrelerinde microcolony akışkanın NO iç tutumlu * için yakın çevre üretim hücreleri ifade ikna etmek gerek uyarılmış üretilen hmp. Stafilokokal apse içinde nuc SAC ve çevre boyunca zayıf özünde güçlü ifadesidir. Apse nötrofil eline kelepçe tarafından çevrili çünkü o nötrofil elde edilen ipuçları hücreleri iki phenotypically ayrı nüfus, morphogenic hatırlatan polarize stafilokok davranışını rehberlik spekülasyon için cazip olduğunu düzenleme, daha yüksek yaşam59geliştirme sırasında farklılaşma. Bu desen mekanik destek bilinmeyen ve bizim laboratuvar yoğun çalışmanın bir konudur.

Biz tek tek hücreler gen ifadesinde enfeksiyon sırasında ince detay çalışmak için etkin bir araç bizim yöntem sağlar inanıyoruz. Yöntem gözlemlemek ve sonunda heterojenite fizyolojik kökenleri ve dokularda Gen ifadesinin kayma desenlendirme anlamak için eşsiz bir fırsat sağlar. Sadece bir subpopulation (yani, bu genlerin ifade) hücre tarafından tedavi hedefleyebilir gibi türdeş olmayan bu davranış yeni tedavi yöntemleri, geliştirirken dikkate alınmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Alexander Horswill PsarAP1- tdTomato füzyon ve Karen Creswell hediye Akış Sitometresi Analizi ile ilgili yardım için teşekkür ediyoruz. Biz Ayrıca Alyssa King istatistiksel analiz tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen bir NIH Exploratory/gelişim Araştırma Ödülü (grant AI123708) ve SRB fakülte başlangıç fonlar tarafından finanse edildi. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve yorumu veya iş yayını için göndermek için karar herhangi bir rolü yoktu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

Tags

Genetik sayı: 144 gen ekspresyonu virülans floresan confocal mikroskobu histopatoloji bakteri patojen mekansal düzenleme Sae iki bileşen sistemi nükleaz böbrek apse
Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz,… More

Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz, M. S., Brinsmade, S. R. A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (144), e59055, doi:10.3791/59055 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter