Summary
Se describe aquí es un método para el análisis de expresión génica bacteriana en los tejidos animales a nivel celular. Este método proporciona un recurso para el estudio de la diversidad fenotípica que ocurre dentro de una población bacteriana en respuesta al ambiente de tejido durante una infección.
Abstract
Genes de virulencia bacteriana a menudo están regulados a nivel transcripcional por múltiples factores que responden a señales ambientales diferentes. Algunos factores que actúan directamente sobre los genes de virulencia; otros controlan patogenesia ajustando la expresión de los reguladores de aguas abajo o la acumulación de señales que afectan la actividad de regulador. Mientras que el Reglamento ha sido estudiado ampliamente durante el crecimiento en vitro , relativamente poco se sabe sobre cómo se ajusta la expresión génica durante la infección. Dicha información es importante cuando el producto de un gen particular es un candidato para la intervención terapéutica. Enfoques transcripcionales como RT-PCR cuantitativa en tiempo real, y RNA-Seq son poderosas formas de examinar la expresión génica a nivel global pero sufren muchos problemas técnicos incluyendo la baja abundancia de RNA bacteriana en comparación con el RNA del anfitrión y muestra degradación por RNasas. Evaluación de regulación utilizando reporteros fluorescentes es relativamente fácil y puede ser multiplexado con proteínas fluorescentes con propiedades espectrales únicas. El método permite el análisis unicelular, espacio-temporal de la expresión génica en los tejidos que presentan complejas tridimensionales gradientes arquitectura y fisicoquímicos que afectan redes de regulación bacterianas. Dicha información se pierde cuando se calcula el promedio de los datos sobre la población a granel. Adjunto, describimos un método para cuantificar la expresión génica en bacterias patógenas in situ. El método se basa en el procesamiento de tejido simple y directa observación de la fluorescencia de proteínas de reportero. Demostramos la utilidad de este sistema mediante el examen de la expresión de la thermonuclease de Staphylococcus aureus (nuc), cuyo producto del gene es necesario para la evasión inmune y la virulencia completo ex vivo e in vivo. Mostramos que nuc-gfp se expresa fuertemente en abscesos renales y revelar expresión génica heterogénea debido en parte a la aparente regulación espacial de la actividad de promotor de nuc en abscesos comprometidos plenamente con la respuesta inmune. El método puede aplicarse a cualquier bacteria con un sistema de genético manipulable y cualquier modelo de la infección, proporcionando información valiosa para los estudios preclínicos y desarrollo de fármacos.
Introduction
Las bacterias responden a cambiar condiciones fisiológicas y las alteraciones en el estado nutricional de su entorno expresando diferencialmente genes necesarios para la adaptación y supervivencia. Por ejemplo, patógenos oportunistas colonizan cuerpo superficies en relativamente bajas densidades y suelen ser inofensivos. Sin embargo, una vez que la bacteria ha penetrado las barreras físicas y químicas, deben lidiar con el anfitrión célula inmune contra defensas y restringida la disponibilidad de nutrientes1. Por ejemplo, Staphylococcus aureus coloniza aproximadamente un tercio de la población de forma asintomática pero también es la causa de la piel devastador e infecciones de tejidos blandos, osteomielitis, endocarditis y bacteremia2. El éxito de S. aureus como patógeno a menudo se atribuye a su flexibilidad metabólica, así como un arsenal de factores de virulencia asociados a superficie y secretada que permiten a la bacteria escapar el torrente sanguíneo y replicar en tejidos periféricos 3,4,5. Porque la muerte del anfitrión debido a la enfermedad estafilocócica es un callejón sin salida evolutivo y límites de transmisión a nuevos anfitriones6, debe controlarse cuidadosamente el compromiso con la producción del factor de virulencia.
Una compleja red de regulación de proteínas y no-codificación RNAs responde a una variedad de estímulos ambientales, incluyendo la célula densidad, fase de crecimiento, factores asociados del neutrófilo y la disponibilidad de nutrientes, para asegurar que los genes de virulencia se expresan en la hora exacta y la ubicación en host tejidos7,8,9,10,11,12,13. Por ejemplo, el sistema de dos componentes de SaeR/S (TCS) regula la expresión de varios factores de virulencia a través de la cinasa del sensor (SaeS) y la respuesta de regulador (SaeR)14. SaeS es autophosphorylated en un residuo conservado de histidina en respuesta a señales (e.g., humano neutrófilos péptidos [HNPs], calprotectina) de host8,15,16. El grupo fosforilo es entonces transferido a un residuo de aspartato en SaeR, activarlo como una proteína de unión al ADN (SaeR ~ P)17. El TCS SaeR/S regula más de 20 genes que contribuyen a la patogénesis, incluyendo proteínas de unión de fibronectina (FnBPs), leukocidins y coagulasa14,18,19,20. Objetivos se pueden clasificar en objetivos gene de alta afinidad y baja afinidad, que son probablemente inducida como el nivel de SaeR ~ P se levanta cuando se exponen a sus señales21. La actividad de SaeR/S es controlada por otros reguladores de expresión génica como el sistema de detección de quórum de Agr, represor de las toxinas proteínas (putrefacción) y el factor sigma alternativo B (SigB)22,23,24.
NUC es un gen de virulencia dependientes de la Sae en Staphylococcus aureus y codifica thermonuclease (Nuc), que es esencial para escapar de neutrophilic extracellular traps (redes) y para su difusión durante la curso de la infección25,26. La expresión de nuc es también fuertemente indirectamente reprimida por CodY en presencia de los aminoácidos de cadena ramificada y GTP27y directamente reprimida por la proteína estafilocócica regulador accesorio SarA28,29 , cuya actividad está influenciada por el oxígeno (estado redox) y pH30. Dado que sae y nuc mutantes se atenúan en modelos de ratón de la infección, hay interés en el desarrollo de intervenciones químicas que inhiben sus correspondientes actividades26,31. A pesar de esto, no hay información con respecto a su regulación durante la infección.
Reporteros fluorescentes se han utilizado para controlar y cuantificar la expresión génica a nivel unicelular. Adjunto, presentamos un método para cuantificar el S. aureus expresión génica durante la infección, cuando se combina con análisis de transcriptoma en vitro y potentes técnicas de imagen como resonancia magnética (MRI) y espectroscopia de resonancia magnética (MRS), puede revelar cómo bacteriana Fisiología está regulada in vivo y la relativa abundancia de nutrientes en ciertos nichos. El método puede aplicarse a cualquier patógeno bacteriano con un manejable sistema de genético.
Resumen del vector integrador de genoma.
El pRB4 vector integrador de genoma contiene 500 pares de bases cada uno de las regiones de aguas arriba y aguas abajo del pseudogene S. aureus USA300 SAUSA300_0087 para facilitar la recombinación homóloga. pRB4 se deriva de la columna vertebral de vector pMAD sensibles a la temperatura que contiene el cassette de resistencia a eritromicina (ermC) y beta-galactosidasa termoestable gene bgaB para azul/blanco cribado de recombinantes32. La construcción de ingeniería reportero también contiene un marcador de resistencia a cloranfenicol (cat) para la selección después de la integración del genoma y eliminación de plásmido, así como sitios de EcoRI y SmaI fusionar la región reguladora de interés verde superfolder proteína fluorescente (sGFP) (figura 1). Se sabe que la elección del sitio de unión a ribosoma (RBS) influye en la actividad del reportero y a menudo requiere optimización empírica33. Por lo tanto, no se suministra un RBS. Aquí, el sitio de unión del ribosoma nativa se utiliza para proporcionar un patrón natural de la expresión génica, pero pueden utilizarse otros sitios.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Georgetown.
1. generación de la cepa de reportero fluorescente
- Digerir el vector de pRB4 integradora de genoma secuencialmente con enzimas de restricción EcoRI y SmaI. Siguiendo el protocolo del fabricante, configurar una digestión durante la noche con SmaI con 1 μg de pRB4 a 25 ° C y luego proceder con la segunda digestión por 1h a 37 ° C mediante la adición de EcoRI de la mezcla de reacción. Inactivar las enzimas por incubación a 65 ° C por 20 min.
- PCR amplifica la región reguladora de interés de la DNA genomic (en este caso, un par de base ~ 350 fragmento de ADN que contiene la región del promotor thermonuclease [nuc]), la incorporación de un sitio de restricción de EcoRI de 5' y un sitio de restricción SmaI 3'. La secuencia de reconocimiento de SmaI debe ser en el marco con el codón de inicio traslacional. En este estudio, la PCR fue realizada usando una ADN polimerasa de alta fidelidad según las recomendaciones del fabricante con primer avance oRB015 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') y atrás (oRB016) primer 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). La temperatura de recocido es 53 ° C. Purificar el fragmento resultante usando un kit de limpieza PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Digerir el producto resultante de la polimerización en cadena con EcoRI y SmaI ya que se realiza en el paso 1.1 y ligar el fragmento de ADN digerido a los mismos sitios de pRB4 con T4 ADN ligasa como recomendado por el fabricante para generar la construcción integradora. Introducir la mezcla de ligadura en e. coli y confirmar la secuencia de construcción.
- Electroporate la construcción en la cepa de S. aureus RN4220 como describió anteriormente34. En Resumen, utilizar 1 μg de plásmido con 70 μl de células competentes de electro (Ω 100, 25 μF y 2,3 kV) en caldo de B2 (hidrolizado de caseína 1% [p/v], extracto de levadura 2.5% [p/v], 2,5% [p/v] NaCl, 0,1% [p/v] K2PO4, 0.5% [p/v] de glucosa). Seleccionar para la resistencia a la eritromicina (Emr) a la temperatura permisiva (30 ° C) en agar peptona de soja (TSA) suplementado con eritromicina (5 μg mL-1) y 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 80 μg mL-1). Los transformantes resultantes son azules debido a la actividad de β-galactosidasa codificada por el plásmido.
Nota: Transferencia de ADN en cepas clínicas es muy difícil debido a una fuerte restricción-modificación barrera35. Por lo tanto, S. aureus RN4220 fue utilizado como un destinatario intermedio de la construcción de la fusión porque es restricción deficiente y altamente transformable. - Transferencia de plásmido a S. aureus cepa USA300 interés con electroporación o transducción mediada por fagos36 a la temperatura permisiva. En Resumen, propagar bacteriófagos de11 Φ las partículas de la cepa donante usando las placas de TSA que contiene 5 mM CaCl2 noche a 30 ° C y luego esterilización por filtración a través de un filtro de jeringa 0.45 μm acetato de celulosa. Utilizar lisados para transducir S. aureus cepa LAC Emr.
Nota: LAC es un aislante clínico ampliamente utilizado que previamente hizo Em sensible paso serial en medio TSB para curar la tensión de la pUSA03 nativa de plásmido que confiere Emr 37,38. - Integrar la construcción por dos eventos de recombinación homóloga sucesivas en el cromosoma como se describió anteriormente32. Los recombinantes son resistentes al cloranfenicol (Cmr) en placas de TSA que contiene 5 μg mL-1 de cloranfenicol, eritromicina susceptibles (Erms) y no más azul.
Nota: Cuando sea posible, volver a introducir la fusión marcada en USA300 vía transducción mediada por fagos para evitar la acumulación de mutaciones asociadas con tensión in vitro paso39 y temperatura cambios.
2. animal infección: Preparación del inóculo, infección sistémica y procesamiento de tejido
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Preparación del inóculo bacteriano
- Raya las cepas de S. aureus de interés para el aislamiento en placas de agar sangre de un stock de glicerol congelados. Incubar a 37 ° C durante 16-24 h confirmar los fenotipos hemolíticos basados en su capacidad para lisar los glóbulos rojos (gr) y forma claras zonas transparentes.
- Inocular las colonias individuales de cada cepa a 4 mL de caldo de soja tríptica (TSB) en tubos de vidrio estériles para iniciar cultivos durante la noche. Gire los tubos a 37 ° C durante 16-24 h en un rodillo de tubo de aproximadamente un ángulo de 70° y 70 revoluciones por minuto [RPM].
- Use un espectrofotómetro para medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) de las culturas en el paso 2.1.2. Medio estéril de uso como una referencia óptica (en blanco). Diluir estas células a un OD600 de 0.05 en 25 mL de estéril peptona soya caldo (TSB) en separado, 125 mL DeLong frascos (5:1 frasco al cociente del volumen) e incubar de culturas en un baño de agua (para la transferencia de calor adecuado a las culturas), sacudiendo a 280 RPM y en 37 ° C.
Nota: Crecimiento del inóculo puede realizarse de varias maneras; se presenta un método para el cultivo de células en fase exponencial. Cueste lo que cueste, es importante que siempre utilice el mismo método para preparar las células para la inoculación. - A un OD600 de ~ 1, volver a diluir las células en medio fresco a un partida de OD600 de 0.05 para las células alcanzar fase exponencial y que factores que se acumulan durante la incubación durante la noche se han reducido a niveles de fase exponencial.
- Recoger las células durante la fase exponencial (OD600 ~0.6–0.8) por centrifugación a 3.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
- Lavar el pellet dos veces en volumen equivalente de estéril 1 x solución salina con tampón fosfato (PBS, pH 7,4).
- Suspender las células en PBS 1 x (pH 7,4) a una concentración de 1 x 108 colonias formando unidades (UFC) mL-1 o según corresponda para el deseado experimentar.
Nota: es importante determinar la relación entre el OD600 y UFC mL-1 para cada cepa de interés debido a alteraciones dependientes de la tensión de forma y tamaño celular pueden afectar propiedades de dispersión de la luz y en última instancia, la dosis de infección.
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Preparación de los animales y la infección bacteriana
- Aclimatar ratones durante 7 días en purificada dieta AIN-93. La dieta está formulada para proporcionar una nutrición adecuada reduciendo el tejido auto-fluorescencia asociada con el consumo de alimentos basados en plantas utilizadas en la ratón estándar chow40.
Nota: Mujer ratones C57/BL6 (6-8 semanas) se utilizan aquí, pero dependerán de la cepa de ratón y el sexo en el estudio. - Antes de la infección, se dilatan las venas de cola de ratón con agua tibia.
- Infectar a animales por inyección 100 μl del inóculo bacteriano mediante cola las venas para producir una infección sistémica. Guardar una alícuota del inóculo inicial en caso de citometría de flujo (ver sección 4).
- Vigilar animales diariamente y evaluar su estado de salud mediante un sistema de monitoreo revisado y aprobado por la institucional Animal cuidado y uso.
- Permiten la infección al progreso para la duración deseada. Aquí, los experimentos son terminados 3 días post-infección.
Nota: En estas condiciones, abscesos consisten en una comunidad de absceso estafilococio de bacterias, rodeado de depósitos de fibrina y rodeado por capas concéntricas de células inmunes5,41.
- Aclimatar ratones durante 7 días en purificada dieta AIN-93. La dieta está formulada para proporcionar una nutrición adecuada reduciendo el tejido auto-fluorescencia asociada con el consumo de alimentos basados en plantas utilizadas en la ratón estándar chow40.
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Recolección de los órganos y el proceso de tejido
- Eutanasia a los animales por inhalación de CO2 y dislocación cervical como método secundario y realizar la necropsia.
- Cosecha de riñón (derecha) y otros órganos vitales (pulmones corazón, hígado, bazo) y transferir a tubos de polipropileno de 15 mL que contenga formol al 10% [v/v] intermedia. Proceder con estos órganos a 2.3.4 abajo.
- Transferir el riñón izquierdo a un tubo resistente a los choques estériles de 2 mL que contiene ~ 500 μl de perlas de silicona de 2 mm y 1 mL estéril de 1 x PBS (pH 7.4). Proceder con este órgano al paso 4.2.
- Permita que los órganos de paso 2.3.2 para fijar en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave o rotación de al menos 24 horas pero no más de 48 horas.
- Integrar órganos de tejido claro medio de congelación y almacenar los tejidos a-80 ° C.
- Usando un criostato, sección tejido en rebanadas de 10 μm de grosor.
- Secar las secciones en un portaobjetos de vidrio previamente limpia y cargada durante 20 min en la oscuridad, aplicar medio de montaje disco duro con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Mancha y aplicar el cubreobjetos. Curar las diapositivas montadas a temperatura ambiente durante la noche y traslado a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.
3. Microscopía Confocal y proceso de imagen del laser
- Examinar diapositivas montadas para localizar lesiones con láseres apropiados para el reportero fluorescente se utiliza. Las señales se utilizan en este caso, el verde (GFP), rojo (tdTomato) y fluorescencia (DAPI) azul.
- Adquirir la imagen mediante el objetivo adecuado para la visualización de células individuales (por ejemplo, típicamente 20 x o 40 x objetivos se utilizan).
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Medir las intensidades de fluorescencia en las imágenes confocales.
- Abra la imagen confocal en Image J y ajustar brillo y contraste para visualizar correctamente la señal de fluorescencia de la lesión.
- Definir la región de interés y mediante la opción de umbralización , establecer los límites inferior y superior de la fluorescencia según sea necesario.
- Definen el centroide seleccionando área → valor de gris medio → centroide → límite umbral en la pestaña de análisis de imagen J.
- Extraer valor de intensidad de fluorescencia de centroide o medir la intensidad de fluorescencia media en una lesión determinada por unidad de área (intensidad de fluorescencia media, IMF) para GFP y tdTomato. Aquí, se utilizaron áreas de2 μm.
Nota: Un segundo análisis ciego minimiza el sesgo cuando se conoce la identidad de la muestra. - Parcela los datos y realizar los análisis estadísticos apropiados para cada comparación.
4. Análisis de citometría de flujo de
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(Opcional) Determinar la actividad de la fusión del inóculo en el día de la infección (de la sección 2.2.3)
- A 899 μl de 1 x PBS estéril (pH 7.4) Añadir 100 μl de cada inóculo y 1 μl de ácido nucleico florescente de membrana mancha (véase Tabla de materiales). Como control, asegúrese de incluir una muestra de falta de tinción del ácido nucleico.
- Realizar citometría de flujo en todas las muestras.
Nota: Para el primer experimento, es útil incluir un control único vector para la fusión de interés para determinar el voltaje adecuado a utilizar. Una clara separación entre muestras positivas y negativas es esencial para el análisis de los datos, indicando que el reportero está muy por encima de la señal de fondo. - Para identificar la población bacteriana, parcela eventos mediante tinción de ácido nucleico (eje y) y adelante scatter (eje x).
- Dibujar una puerta de inserción alrededor de eventos que son ambos ácidos nucleicos tiñen positivamente y el tamaño correcto de la bacteria basado en la dispersión hacia delante (entre 0.5 a 2.0 μm para S. aureus).
Nota: Ser riguroso al identificar esta población ya que es fundamental para incluir eventos que están claramente dentro de estos parámetros. Asegúrese de que esta puerta no incluye todos los eventos para los controles negativos en otras condiciones. En este estudio, aproximadamente el 70% la población de células se reunió estos requisitos en el análisis.
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Análisis de muestras de tejido después del sacrificio:
- Eutanasia a los animales, cosechar los riñones izquierdos (ver paso 2.3), y transferencia en grano-paliza tubos conteniendo 1 mL de 1 x PBS estéril (pH 7.4) y 250 μl de granos de borosilicato de 2 mm.
- Alteran los tejidos para liberar las células bacterianas. Para riñones, utilizar un homogeneizador para alterar las células. Aquí, tres 30 s ráfagas a 6800 rpm con 1 min períodos en hielo húmedo entre los ciclos de enfriamiento fueron utilizados para minimizar las muestras de la calefacción.
- Pellets de los más grandes restos de tejido por centrifugación a 250 x g durante 3 minutos en una microcentrífuga de mesa enfriado a 4 ° C.
Nota: Por lo general, es un precipitado de células en la parte inferior del tubo y una capa de escombros flotantes en la parte superior. La capa acuosa media contiene las células bacterianas. - Transferir 10 μl de la capa acuosa a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL que contiene 1 μl de colorante de ácidos nucleicos en 989 μl de PBS (volumen total de 1 mL).
- Realizar citometría de flujo utilizando los mismos parámetros de adquisición de datos y bloquear como el inóculo inicial.
Nota: Recuento bacteriano será muy bajo porque la muestra contiene principalmente desechos de tejido. La opción "Live gate" también puede utilizarse si las células son ácido nucleico tinción positiva y cerrada de tamaño cuando los datos se cargan en la aplicación. Esto también ayudará a analizar más de los eventos de destino y reducir el tamaño del archivo. Casi 1 millón de eventos por muestra se cuentan, pero más cuentas de evento pueden ser necesarias dependiendo de la severidad de la infección y el tamaño del tejido analizado. - Análisis de los datos: Determinar significa intensidad fluorescente (IMF) para cada fluoróforo en una muestra determinada usando las puertas de la inclusión en la sección 4.1.4. Normalizar las muestras en el software de análisis de flujo a evento cuentas. 10.000 cuentas son generalmente suficientes en el análisis.
Nota: No es raro encontrar muestras que contienen menos de este número de eventos ya que es dependiente en la severidad de infección y formación de absceso. Usando este acercamiento, 500-40.000 eventos suelen encontrarse en tejido infectado.
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Representative Results
Hemos desarrollado un plásmido derivado pMAD32 que puede ofrecer cualquier reportero construcción de fusión en el cromosoma por recombinación homóloga doble cruce (figura 1). Esta construcción permite el análisis cuantitativo de cualquier región reguladora que apoya la producción de la proteína GFP y la señal fluorescente sobre fondo. El plásmido confiere resistencia a la ampicilina (Apr) para el mantenimiento y propagación de e. coli y confiere resistencia a la eritromicina (Emr) en S. aureus. La construcción también confiere resistencia a cloranfenicol (Cmr), que permite la transferencia fácil de la fusión de reportero integrado entre varias cepas mutantes para sofisticados análisis genético en S. aureus.
Como prueba de principio, nos fundió el nuc región reguladora a gfp. nuc fue elegida porque su producto del gene es necesaria para plena virulencia y es requerida para la restricción de los macrófagos de S. aureus-inducida por abscesos42, 43. La construcción fue integrada en el cromosoma como se describe en pasos 1.4-1.6 del protocolo. La fusión integrada fue transferida a AH3926 que contiene una fusión de PsarAP1- tdTomato. SarA promotor P1 se ha demostrado previamente ser constitutivamente activa44 y etiquetas por lo tanto, todas las células.
Primero verificamos que las fusiones de reportero eran activo durante en vitro agitar crecimiento frasco en caldo de soja (TSB; un medio rico y complejo) y que los niveles de fluorescencia sobre fondo fluorescente auto celular (figura 2). Para determinar el comportan in vivo de los reporteros fluorescentes, un modelo modificado de absceso renal fue usada5. Grupos de ratones femeninos C57BL/6 fueron desafiados por vía intravenosa con 1 x 107 UFC de S. aureus LAC células falta fusiones de reportero o LAC llevando fusiones la sGFP nuc y sarAp1-tdTomato . Los animales fueron sacrificados tres días post infección. Luego, órganos cosechados se fijaron en formalina al 10% [v/v] tamponada, cryo-seccionado e imagen por microscopía confocal después de tinción DAPI como se describe en los pasos 2 y 3 (figura 3A, B). Las imágenes se analizaron la imagen J y se midió la fluorescencia por unidad de área en las lesiones renales. Como se muestra en la figura 3C, fluorescencia de fusión nuc-gfp fue en promedio casi 9-fold mayor en las células llevando la fusión que en células no lleva la fusión de reportero; la señal de este último constituye el límite de detección (auto-fluorescencia) (compare sGFP nuc a LAC). Del mismo modo, la fluorescencia de fusión PsarAP1- tdtomato fue ~ doblez 6 más alto que el no control de reportero (figura 3E, comparar sarAP1- tdT vs LAC). Mediante citometría de flujo, el patrón de actividades de reportero fue confirmado usando homogenados de riñón y como se describe en el paso 4 de citometría de flujo, aunque el pliegue diferencias en fluorescencia fueron inferiores (figura 3D, F).
Curiosamente, los datos de fluorescencia de las lesiones formadas por células con fusiones de reportero fluorescente parecen mostrar mayor variabilidad que las que carecen los reporteros. Nos pregunta si la variación en las mediciones de fluorescencia observada debido a la heterogénea expresión de los periodistas (es decir, de origen biológico). De hecho, a ~ 100 μm distancia se encontró que algunas lesiones expresaran uno o los dos reporteros (figura 4). Lo importante es examinar la actividad de reportero con la resolución de la célula en comunidades de absceso estafilocócico (SACs) reveló regulación espacial de expresión nuc en abscesos circunscritos con fuerte tinción DAPI, probablemente asociados a la formación y liberación de neutrófilos extracelular trampas (figura 5A-C)45. Por ejemplo, medimos fluorescencia de fusión nuc sGFP significativamente más alta en la base interior del saco con respecto a la periferia (figura 5B, E). En el absceso de la misma, el patrón de fluorescencia de fusión sarAp1 tdTomato parece ser invertido(figura 5). Sin embargo, el patrón no fue estadísticamente significativo utilizando el mismo número de animales (figura 5F).
Figura 1 : Representación esquemática de la genoma integrante reportero plásmido pRB4. Plásmido pRB4 es un derivado del pMAD con un origen sensible de la temperatura de la replicación en S. aureus (Ori pE194ts). Hay tres marcadores de resistencia a drogas: (i) bla, que confiere resistencia a ampicilina en Escherichia coli; (ii) ermC, confiriendo resistencia a eritromicina en Staphylococcus aureus; y (iii) gato, que confiere resistencia al cloranfenicol en S. aureus. La construcción del reportero está flanqueada por ~ 500 bp de las secuencias ascendentes y descendentes del pseudogene SAUSA300_0087 (genoma de referencia: FPR3757) doble crossover homólogo recombinación y genoma integración. gen de la proteína fluorescente del sGFP, verde; CS, sitio de clonación; TT, terminador transcripcional fuerte bidireccional. Figura no está a escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Yo ntegrated NUC-sGFP y tdTomato sarAp1 reporteros se expresan durante el crecimiento in vitro . S. aureus LAC células (wild-type [WT]), con y sin la sGFP nuc -(A) o (B) tdTomato sarAp1 reporteros) eran convertidas en fase exponencial en TSB y volver a diluir en el mismo medio. Densidad óptica (OD) y la fluorescencia se midieron los valores de densidad óptica indicada. Valores de intensidad de fluorescencia de fondo resta (excitación/emisión: sGFP, 485/535 nm; tdTomato [tdT], 535/590 nm) fueron divididos por los valores de densidad óptica para generar unidades de fluorescencia relativa. Los datos son el medio +/-SEM de dos experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Reporteros fluorescentes son visibles en el tejido renal. Grupos de 13 ratones C57BL/6 fueron desafiados por vía intravenosa con células LAC o LAC llevando nuc sGFP y sarAp1-tdTomato (tdT), y la infección fue permitida para continuar por tres días. Ratones fueron sacrificados, y los órganos se procesaron como se describe en los pasos 2 y 3 del protocolo. Sección representativa del riñón que muestra lesiones múltiples y la fluorescencia asociada para (A) nuc sGFP y (B) tdTomato sarAp1. Barras de escala = 250 μm (objetivo de 10 x). Las unidades de fluorescencia relativa por unidad de área (RFU [μm2]-1) asociado con lesiones renales fueron medidas usando análisis de imagen como se describe en el paso 3.3 y se trazaron para (C) nuc sGFP y (E) sarAp1-tdTomato; cada punto representa una lesión y las barras indican la mediana; 3-5 las lesiones analizadas por ratón. Análisis de citometría de flujo de (D) nuc sGFP y (F) tdTomato sarAp1 fusión fluorescencia en las poblaciones bacterianas aisladas de homogenados de riñón infectado tres días post infección. La intensidad de fluorescencia media (MFI) es indicado por la barra, y cada punto es un riñón. LAC, reporterless cepa de tipo salvaje. Estadística: Test de Mann-Whitney; p < 0.05. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. Las longitudes de onda de excitación de los canales de fluorescencia son las siguientes: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Se recogieron datos de fluorescencia emitida en un rango de longitudes de onda: DAPI, 481 419 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Abscesos presentan expresión variable de reporteros en los tejidos renales. Grupos de 13 ratones C57BL/6 fueron desafiados con 1 x 107 UFC de S. aureus las células vía la vena de la cola. Los animales fueron sacrificaron tres días post infección. Los riñones se cosecharon, fijado y seccionado para microscopía de fluorescencia (objetivo x 40) como se describe en el paso 2 del protocolo. Se muestran tres lesiones en proximidad cercana con niveles variables de (A) nuc sGFP y (B) tdTomato sarAp1 fluorescencia. (C) de ácido nucleico de estafilococos y host se indica células por tinción DAPI. Los canales rojo y verdes se combinan en (D). Se observaron resultados similares en otras secciones. Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de 40 x; Barra de escala = 25 μm. Las longitudes de onda de excitación de los canales de fluorescencia son las siguientes: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Se recogieron datos de fluorescencia emitida en un rango de longitudes de onda: DAPI, 481 419 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : NUC-sGFP espacial está regulada en el absceso estafilococio micro-ambiente. Láser confocal de barrido de imágenes de microscopía (CLSM) de una lesión de la comunidad (SAC) de absceso estafilococio producida por S. aureus cepa LAC transporte nuc sGFP y sarAp1 tdTomato reportero fusiones. Se muestran la (A) fusionado canales de nuc-sGFP y sarAp1-tdtomato, (B) nuc sGFP fluorescencia (verde), (C) DAPI coloración de ácidos nucleicos (azul) y (D) sarAp1 tdTomato fluorescencia (rojo). Los asteriscos indican las células en el núcleo (centro) y las flechas indican las células en la periferia. Las intensidades de fluorescencia para sGFP nuc -(E) y (F) tdTomato sarAp1 se muestran para las células en el núcleo y la periferia del saco. Las longitudes de onda de excitación de los canales de fluorescencia son las siguientes: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Se recogieron datos de fluorescencia emitida en un rango de longitudes de onda: DAPI, 481 419 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Los datos se derivan de los 8 riñones (uno por ratón), y 1-2 lesiones fueron reflejadas de cada riñón. Las barras indican la mediana. Línea discontinua, límite de detección. Estadística: distribución Normal de datos, prueba t de Student (desapareado), ***p < 0.05. (Barra de escala = 20 μm; se aplica a todas las imágenes.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Enfermedades infecciosas bacterianas son un problema de salud creciente en todo el mundo debido a la adquisición de los determinantes de resistencia antibiótica46. Porque la adaptación a entornos de host es esencial para el crecimiento y supervivencia durante la infección, estrategias dirigidas a programas de expresión génica que aumentan la aptitud del patógeno pueden resultar útiles terapéuticamente. Un tal programa es el conjunto de genes controlados por el sistema de dos componentes de SaeR/S (TCS), previamente demostrado que juegan un papel esencial en la evasión inmune47. SaeR/S es inducida por una variedad de factores, en particular aquellos asociados con neutrófilos8,20. Durante la infección, el S. aureus provoca una fuerte respuesta inflamatoria en la que los neutrófilos y otros fagocitos son reclutados en el sitio de infección2. Deposición de licuefacción necrosis y fibrina seguir, formando un absceso para evitar más daño de tejido48. Dentro de estos sitios privilegiados inmunes, las células de S. aureus utilizan un número de productos Sae dependiente del gen reprogramar el absceso para facilitar la multiplicación bacteriana5,48. Un gen de Sae-dependiente, nuc, códigos para nucleasa y metaboliza redes para producir 2'-desoxiadenosina para matar de los macrófagos43. Así, Nuc es una importante enzima secretada que es esencial para la virulencia completo42 y es expresada en vivo (figura 3, figura 4y figura 5).
Aunque los factores de virulencia de S. aureus han sido estudiados ampliamente, como la bacteria crece en el host es un área escasamente, como es la comprensión de cómo se regula su fisiología durante la infección. Aquí se describe un método para sondear la expresión génica bacteriana y comportamiento en el nivel unicelular usando un vector integral modificado que mitiga la preocupación por la pérdida del plásmido en la ausencia de la selección. Nuestra metodología permite la visualización directa de la expresión génica en abscesos sin necesidad de permeabilizar la pared celular y sin necesidad de anticuerpos y de etiquetado. Se detectó expresión fuerte de la fusión nuc sGFP así como la fusión de tdTomato sarAp1 absceso renal sacos formados por células de tipo salvaje tres días post infección en un modelo de infección sistémica aguda. Sin embargo, el diseño experimental puede ser modificado para responder a preguntas sobre la expresión génica en otros sitios. De hecho, ya que ratones C57BL/6 son incapaces de eliminar S. aureus de sus tejidos, las bacterias invaden sitios anatómicos diversos incluyendo el sistema esquelético (huesos y articulaciones) y el cerebro, corazón, bazo y hígado, todas ellas con diferente fisiología y propiedades nutritivas5,49. Por lo tanto, mucho se puede aprender mediante el uso de S. aureus para sondear la naturaleza de los tejidos del huésped. Es importante tener en cuenta que se sabe que ciertos nichos de host son hipóxicos en la naturaleza o de lo contrario presentan un gradiente de oxígeno fuerte50. Proteínas fluorescentes requieren oxígeno molecular para la actividad, y algunos son más sensibles a presiones parciales de oxígeno que otros51. Mientras vemos la fluorescencia señal profunda dentro del absceso, las magnitudes pueden ser una subestimación. Uso de proteínas fluorescentes codón-optimizado para uso en Clostridium difficile podría utilizarse para atenuar esta preocupación52. Un segundo punto a destacar es que las proteínas fluorescentes (sGFP y tdTomato) producidas por el reportero las cepas utilizadas en este estudio son estables. Por lo tanto, los datos fluorescentes reflejan la acumulación a lo largo del experimento, en lugar de una respuesta reciente. Generando un constructo que contiene un inestable sGFP o tdTomato gene aumentaría enormemente la utilidad del sistema para experimentos de dinámicos.
El sistema reportero descrito aquí proporciona una poderosa herramienta para estudiar cuantitativamente la regulación génica en vitro y en vivo. Porque el reportero se mantiene en sola copia en el cromosoma, el sistema es adecuado para genes fuertemente expresados (que es, tener actividad de promotor alta). Genes biosintéticos u otros genes mal expresados pueden no ser visibles porque el nivel de expresión de fluorescencia podría caer por debajo del límite de detección o fondo auto-fluorescencia. Se sabe que el sitio de unión del ribosoma (RBS) influye en la actividad del reportero fusiones33. Una posible solución a este problema es utilizar un RBS más fuerte como el de región (TIR) de iniciación de traducción53 o integrar copias de tándem de promotores de interés en el cromosoma. Por otra parte, plásmidos de copia múltiple estables podrían ser usado54.
Una limitación del método descrito es que, a diferencia de una preparación de cDNA del ARN extraído de los tejidos, un número relativamente pequeño de genes puede ser interrogado simultáneamente (limitado por canales sin solapamiento espectral fluorescentes). Sin embargo, lo que se gana puede ser potencialmente más informativa. qRT-PCR y otras lecturas que promedio de la población a granel son incapaces de capturar la heterogeneidad de la población en el sitio de la infección. De hecho, se observa heterogeneidad en el nivel de nuc-sGFP y expresión sarAp1 tdTomato entre lesiones de absceso en la proximidad (figura 4). Esto es similar a lo reportado recientemente por Cassat et al. 55 en este momento, no se sabe el origen de esta heterogeneidad. Sin embargo, la disponibilidad de nutrientes, inducción variable de sistemas de adquisición de nutrientes u otros factores de anfitrión podrían posiblemente explicar el fenómeno. Por otra parte, la interacción huésped-patógeno ocurre dentro de microambientes de abscesos que tienen estructura tridimensional compleja y varios tipos de células u órganos. Dentro de estas estructuras, los tejidos pueden variar considerablemente con respecto a pH, osmolaridad, oxigenación y la disponibilidad de nutrientes, un fenómeno conocido como zonación metabólica56,57. Hemos descubierto casualmente que un patrón de regulación espacial se presenta en las células de tipo salvaje que residen en el absceso (figura 5). Esto es a nuestro conocimiento la primera observación de este tipo en un patógeno gram-positivo durante la infección. La regulación espacial registrados aquí es similar a la obtenida por Davis et al. en tejido esplénico que contienen microcolonias del patógeno gramnegativo Yersinia pseudotuberculosis58. En esa instancia, host produce óxido nítrico (n *) estimula la producción de óxido nítrico dioxigenasa (Hmp) en las células en la periferia de la microcolony más cercana a la NO difusión *, escasamente interior células inducen la expresión de la necesidad hmp. En abscesos estafilococios, nuc expresión es más fuerte en la base del saco y más débiles a lo largo de la periferia. Debido a que los abscesos están rodeados por un manguito de neutrófilos, es tentador especular que señales derivadas del neutrófilo están guiando el comportamiento de los estafilococos, polarización de las células en dos poblaciones fenotípicamente distintas de morfogénica regulación de la diferenciación durante el desarrollo en mayor vida59. La base mecanicista de este patrón es desconocida y es objeto de intenso estudio en nuestro laboratorio.
Creemos que nuestro método proporciona una herramienta eficaz para estudiar el detalle fino de la expresión génica en células individuales durante la infección. El método proporciona una oportunidad única para observar y eventualmente entender los orígenes fisiológicos de la heterogeneidad y el patrón espacial de la expresión génica en los tejidos. Este comportamiento heterogéneo debe tenerse en cuenta en el desarrollo de nuevas modalidades de tratamiento, como sólo una subpoblación de células (es decir, los que expresan los genes) puede ser objetivo de la terapéutica.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos a Alexander Horswill para el regalo de la fusión de PsarAP1- tdTomato y Karen Creswell para ayuda con análisis de citometría de flujo. También agradecemos a Alyssa King para asesoramiento en análisis estadístico. Este trabajo fue financiado en parte por fondos de inicio de Facultad a SRB y un premio de investigación exploratorios/desarrollo de NIH (grant AI123708). Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos e interpretación o la decisión de enviar el trabajo para su publicación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
| confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
| cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
| Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
| D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
| DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
| Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
| glass beads | Sigma | Z273627 | |
| Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
| orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
| PCR purification | QIagen | 28106 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
| Plate reader | Tecan | NA | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
| pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
| Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
| Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
| Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
| Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
| Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
| Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
| UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
| Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
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