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Cancer Research

Levure comme un châssis pour le développement des essais fonctionnels pour étudier l'homme P53

Published: August 4, 2019 doi: 10.3791/59071
Automatic Translation
1, 2, 3, *3, *1, *2
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO, University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto
* These authors contributed equally

Summary

Présenté ici sont quatre protocoles pour construire et exploiter la levure Saccharomyces cerevisiae reporter souches pour étudier le potentiel humain de transactivation P53, les impacts de ses diverses mutations associées au cancer, co-exprimé protéines d'interaction, et les effets de petites molécules spécifiques.

Abstract

La découverte que la protéine bien connue des mammifères P53 peut agir comme facteur de transcription (TF) dans la levure S. cerevisiae a permis le développement de différentes analyses fonctionnelles pour étudier les impacts du site de liaison 1) [c.-à-d., élément de réponse (RE)] variantes de séquence sur la spécificité de transactivation de P53 ou 2) mutations de TP53, co-facteurs exprimés, ou petites molécules sur l'activité de transactivation de P53. Différentes applications de recherche de base et translationnelles ont été développées. Expérimentalement, ces approches exploitent deux avantages majeurs du modèle de levure. D'une part, la facilité d'édition du génome permet la construction rapide de systèmes de reporter qualitatifs ou quantitatifs en exploitant des souches isogéniques qui ne diffèrent qu'au niveau d'un P53-RE spécifique pour étudier la spécificité de la séquence de La transactivation. D'autre part, la disponibilité de systèmes réglementés pour l'expression ectopique P53 permet l'évaluation de la transactivation dans un large éventail d'expression protéique. Les systèmes largement utilisés qui sont basés sur les gènes des journalistes de couleur, la luciferase et la croissance de la levure pour illustrer leurs principales étapes méthodologiques et évaluer de façon critique leur pouvoir prédictif sont examinés dans ce rapport. En outre, l'extrême polyvalence de ces approches peut être facilement exploitée pour étudier différents TFs, y compris P63 et P73, qui sont d'autres membres de la famille des gènes TP53.

Introduction

La transcription est un processus extrêmement complexe impliquant l'organisation dynamique, spatiale et temporelle des facteurs de transcription (TFs) et des cofacteurs pour le recrutement et la modulation des polymérases d'ARN sur des régions de chromatine en réponse aux stimulus spécifiques1 . La plupart des TF, y compris le suppresseur humain de tumeur de P53, reconnaissent les éléments cis-action spécifiques sous la forme des séquences d'ADN appelées éléments de réponse (REs), qui se composent des motifs uniques (ou multiples) uniques de 6-10 nucléotides longs. Dans ces motifs, les positions individuelles peuvent montrer divers degrés de variabilité2, généralement résumépar par matrices de poids de position (PWM) ou logos3,4.

La levure S. cerevisiae est un système modèle approprié pour étudier différents aspects des protéines humaines par des essais de complémentarité, l'expression ectopique, et les essais fonctionnels, même quand un gène de levure orthologue n'est pas présent5, 6 Annonces , 7. En raison de la conservation évolutive des composants basaux du système transcriptionnel8, de nombreux TF humains (lorsqu'ils s'expriment ectopiquement dans les cellules de levure) peuvent moduler l'expression d'un gène journaliste en agissant par l'intermédiaire de promoteurs contiennent des RE appropriés. Le système de modèle de transcription présenté ici pour l'homme P53 est caractérisé par trois variables principales dont les effets peuvent être modulés : 1) la modalité d'expression et le type de P53, 2) la séquence RE contrôlant la transcription P53-dépendante, et 3) le type de gène journaliste (Figure 1A).

En ce qui concerne la modalité de l'expression P53, S. cerevisiae permet le choix des promoteurs inductibles, répressibles ou constitutifs9,10,11. En particulier, le promoteur inductible GAL1 permet l'expression basale (en utilisant le raffinose comme source de carbone) ou variable (en changeant la quantité de galactose dans les médias) d'une TF en levure. En fait, l'expression finement réglable représente un développement critique pour l'étude non seulement P53 lui-même, mais aussi d'autres protéines de la famille P5312,13.

En ce qui concerne le type de R contrôlant l'expression P53-dépendante, S. cerevisiae permet la construction de différentes souches de reporter possédant des différences uniques dans l'ER d'intérêt dans un fond autrement isogénique. Cet objectif est atteint à l'aide d'une adaptation d'une approche d'édition du génome particulièrement polyvalente développée en S. cerevisiae, appelée delitto perfetto12,14,15,16.

En outre, différents gènes de reporter (c.-à-d., URA3, HIS3, et ADE2) peuvent être employés pour évaluer qualitativement et quantitativement des activités transcriptionnelles des TF humains dans S. cerevisiae,chacun avec des dispositifs spécifiques qui peuvent être adapté aux besoins expérimentaux17,18,19,20,21. L'expression de ces gènes de journaliste confère uracil, histidine, et prototrophy d'adénine, respectivement. Le journaliste URA3 ne permet pas la croissance des cellules en présence de 5-FOA ainsi, et donc il peut être contre-sélectionné. Le système de reporter ADE2 a l'avantage qu'en plus de la sélection nutritionnelle, il permet l'identification de cellules de levure qui expriment des cellules sauvages (c.-à-d. fonctionnelles sur l'expression ADE2) ou mutantes (c.-à-d.,non fonctionnelles sur ADE2 ) P53 de la couleur de la colonie.

Par exemple, les cellules de levure exprimant le gène ADE2 génèrent des colonies blanches de taille normale sur des plaques contenant des quantités limitantes d'adénine (2,5-5,0 mg/L), tandis que celles qui le transcrivent mal ou ne le transcrivent pas apparaissent sur la même plaque que les plus petites rouges (ou roses) Colonies. Ceci est dû à l'accumulation d'un intermédiaire dans la voie biosynthétique adénine (c.-à-d., P-ribosylamino-imidazole, qui a été précédemment appelé ribotide amino-imidazole ou AIR), qui est converti pour former un pigment rouge. Le gène de journaliste ADE2 basé sur la couleur qualitative a depuis été remplacé par le quantitatif Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Plus récemment, le journaliste de l'ADE2 a été associé au journaliste de lacZ dans un essai facile à marquer, semi-quantitatif, double reporter qui peut être exploité pour sous-classer les mutants P53 en fonction de leur niveau résiduel de fonctionnalité 23.

Des reporters fluorescents tels que l'EGFP (protéine fluorescente verte améliorée) ou DsRed (protéine fluorescente rouge de Discosoma sp. ont également été employés pour l'évaluation quantitative de l'activité de transactivation liée à toutes les mutations de mauvais sens possibles dans le TP53 séquence de codage24. Enfin, la possibilité de combiner les promoteurs réglables pour l'expression de l'allèle P53 avec des souches de levure isogéniques différentes pour le gène RE et/ou reporter a conduit au développement d'une matrice de données qui génère une classification raffinée des souches de levure sérogènes et germinales associées au cancer. mutant P53 alleles25,26,27.

Les approches décrites ci-dessus sont utilisées pour mesurer l'activité transcriptionnelle de la protéine P53. Cependant, l'expression de type sauvage P53 dans la levure S. cerevisiae28 et Schizosaccharomyces pombe29 peut causer un retard de croissance, qui a été associé à l'arrêt du cycle cellulaire28,30 ou mort cellulaire31. Dans les deux cas, l'inhibition de croissance de levure est déclenchée par l'expression élevée de P53 et a été corrélée avec la modulation transcriptionnelle potentielle des gènes endogènes de levure impliqués dans la croissance cellulaire. À l'appui de cette hypothèse, le mutant P53 R273H, qui a perdu sa fonction, n'a pas interféré avec la croissance des cellules de levure lorsqu'il est exprimé à des niveaux similaires à ceux du P5332. Inversement, l'expression dans la levure du mutant toxique P53 V122A (connu pour une activité transcriptionnelle plus élevée par rapport à la nature sauvage P53) a causé un effet inhibiteur de croissance plus fort que le type sauvage P5332.

En outre, il a été démontré que l'homme MDM2 était capable d'inhiber l'activité transcriptionnelle humaine P53 dans la levure, favorisant son ubiquitination et la dégradation subséquente33. En conséquence, la capacité de MDM2 et de MDMX humains d'inhiber l'inhibition de croissance de levure P53-induite a été démontrée32,34. Dans une étude supplémentaire, une corrélation entre l'activité transcriptionnelle P53 et les niveaux d'expression d'actine a été établie, avec l'identification d'un P53 RE putatif en amont sur le gène ACT1 dans la levure32. Constamment, l'expression d'actine a été renforcée par le type sauvage P53 et encore plus par P53 V122A, mais pas par mutant P53 R273H. Inversement, l'expression d'actine par P53 a diminué dans la co-présence des inhibiteurs de P53 MDM2, MDMX, ou pifithrin-MD (un inhibiteur de petite molécule de l'activité transcriptionnelle de P53), compatible avec des résultats basés sur l'analyse de levure-croissance. Fait important, ces résultats ont établi une corrélation entre l'inhibition de la croissance induite par P53 et le degré de son activité dans la levure, qui a également été exploitée pour identifier et étudier de petites molécules modulant les fonctions P5328,34 , 35.

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Protocol

1. Construction de souches de levure aDE2 ou LUC1 contenant un RE spécifique (yAFM-RE ou yLFM-RE)

  1. Streak a yAFM-ICORE ou yLFM-ICORE souche12,14 (ICORE - I, ISce-I endonuclease sous GAL1 promoteur; CO et contre URA3sélectionnable ; RE - journaliste KanMX4 conférant la résistance de kanamycine ; Tableau 1) à partir d'un stock de glycérol de 15 % stocké à -80 oC sur une plaque d'agar YPDA (tableau 2). Laissez-le pousser pendant 2-3 jours à 30 oC.
  2. Prenez une colonie de levures dans l'assiette fraîche (pas plus de 3 semaines) et placez-la dans un petit flacon contenant 5 ml de YPDA (tableau 2). Incuber à 30 oC pendant la nuit, en secouant à 150-200 tr/min.
  3. Le lendemain, pour enlever toutes les traces de dextrose, pelleter les cellules pendant 2 min à 3000 x g et jeter le supernatant par inversion du tube.
    REMARQUE : Effectuez toutes les centrifugations dans ce protocole à température ambiante (RT).
  4. Resuspendre la pastille cellulaire en 30-50 ml de CM pré-chauffé (média complet) contenant du galactose (tableau 2) et incuber pendant 4 h à 30 oC, en secouant à 150-200 tr/min (nécessaire pour l'induction de l'I-SceI).
  5. Centrifuger les cellules pendant 2 min à 3 000 x g et jeter le supernatant par inversion du tube.
  6. Resuspendre la pastille cellulaire dans 30-50 ml d'eau stérile. Répétez l'étape 1.5.
  7. Resuspendre la pastille cellulaire dans 10 ml d'eau stérile. Répétez l'étape 1.5.
  8. Resuspendre la pastille cellulaire en 5 ml de LiAcTE stérile (tableau 3), une solution ionique qui favorise l'utilisation de l'ADN. Répétez l'étape 1.5.
  9. Resuspendre la pastille cellulaire dans 250 L de LiAcTE stérile et transférer les cellules dans un tube de 1,5 ml. Répétez l'étape 1.5 et suspendez à nouveau la pastille cellulaire en 300-500 l de LiAcTE stérile.
  10. Pendant les lavages, dénaturer une solution de 10 mg/mL de porteur d'ADN de sperme de saumon pendant 10 min à 100 oC et refroidir immédiatement sur la glace pour le maintenir sous forme d'ADN à brin unique.
  11. Dans un tube séparé de 1,5 ml, ajouter 500 picomoles de l'oligonucléotide désiré (tableau 3), 5 l de l'ADN du porteur de sperme de saumon bouilli, 300 l de PEG stérile liAcTE (tableau 3), et 50 l de la suspension des cellules de levure (à partir de l'étape 1.9).
  12. Vortex les tubes pour 10 s à mélanger et incuber pendant 30 min à 30 oC, en secouant à 150-200 tr/min. Placer les tubes de 1,5 ml sur le côté pour favoriser les secousses.
  13. Choc thermique des cellules de levure pendant 15 min à 42 oC dans un bloc chauffant, puis centrifugeuse les cellules pour 20 s à 10 000 x g. Retirer le supernatant et resuspendre les cellules dans 1 ml d'eau stérile.
  14. Étendre 100 lde de la suspension cellulaire sur la plaque d'agar YPDA et incuber (à l'envers) pendant 1 jour à 30 oC. Pour s'assurer que des colonies bien séparées sont obtenues, répartir également 100 L d'une dilution de 1:10.
  15. Le lendemain, réplique de plaque utilisant des velours stériles sur la plaque d'agar CM contenant du dextrose et 5-FOA (tableau 2). Considérez une deuxième plaque de réplique sur une nouvelle plaque si de nombreuses cellules sont transférées (c.-à-d., une certaine croissance des cellules URA3).
  16. Trois jours plus tard, plaque de réplique sur yPDA non sélectif et YPDA contenant G418 (un antibiotique aminoglycoside semblable à la kanamycine) plaques d'agar (tableau 2), marquant chaque plaque pour faciliter leur comparaison ultérieure. Incuber les assiettes toute la nuit à 30 oC.
  17. Le lendemain, identifiez les souches de journalistes candidats provenant de colonies sensibles au G418, mais qui poussent sur des plaques YPDA (p. ex., les colonies yLFM- ou yAFM-RE). Échelle des colonies identifiées (3-6 colonies) sur une nouvelle plaque YPDA pour obtenir des isolats de colonie unique et les laisser pousser pendant 2 jours à 30 oC.
  18. Patchdes colonies de levure sinueux sur une plaque YPDA pour isoler les colonies pour d'autres analyses. Après 24 h à 30 oC, testez-les en reproduisant le placage sur une plaque d'agar DE l'YPGA (tableau 2) qui empêche la croissance des petits mutants (c.-à-d. mutants déficients respiratoires). Dans le même temps, réplique plaque sur une nouvelle plaque d'agar YPDA.
  19. Testez les correctifs corrects (c.-à-d. la croissance sur les plaques d'agar YPDA et YPGA; 1-3 colonies) à partir de l'étape 1.18 pour la présence d'une intégration correcte d'oligonucléotide par la colonie PCR. Assembler un mélange de réaction en ajoutant 5 'L de 10x PCR buffer (1,5 mM MgCl2), 2 'L de 10 picomoles/L amorces (tableau 3), 4 'L de 2,5 mM dNTP, 0,25 'L de 5 U/L Taq polymérase, et de l'eau à un volume final de 50 'L. Multipliez le mélange de réaction pour le nombre de colonies de levures qui doivent être examinées et aliquot 50 L dans chaque tube PCR. À l'aide d'une pipette, ajouter une très petite quantité de cellules de levure de la plaque d'agar YPDA dans un seul mélange de réaction PCR.
  20. Effectuer la réaction PCR avec le programme suivant : 94 oC pendant 8 min suivi de 35 cycles de dénaturation pendant 1 min à 94 oC, des amorces annealing pendant 1 min à 55 oC, et une extension de 2 min à 72 oC.
  21. Une fois la réaction terminée, chargez un aliquot de la réaction PCR (environ un dixième du volume) sur un gel d'agarose pour vérifier la bonne taille (500 pb).
  22. Séquencer le produit PCR après purification avec un kit commercial pour confirmer l'intégration de la séquence RE souhaitée à l'aide des mêmes amorces de l'étape 1.19.
  23. Après la validation de la séquence correcte, faire un stock de glycérol de 15% de la culture de souche yAFM-RE ou yLFM-RE (dans YPDA) et le stocker à -80 oC.

2. Évaluation de la capacité de transactivation des protéines P53 à l'aide de l'analyse qualitative de levure ADE2 à base de couleur

  1. Répéter les étapes 1.1 et 1.2 à l'aide de la souche yAFM-RE (tableau 1).
  2. Le lendemain, diluer la culture cellulaire (1:10) dans 30-50 ml de YPDA pré-chauffé et continuer à incuber à 30 oC en secouant jusqu'à ce que l'OD600nm atteigne 0,8-1.0 (2 h).
  3. Répétez les étapes 1.5-1.10.
  4. Dans un tube séparé de 1,5 mL, ajouter 300 à 500 ng de vecteur d'expression de levure P53 (ou contrôle) (tableau 4), 5 l du porteur d'ADN de sperme de saumon bouilli, 300 'L de PEG stérile de LiAcTE, et 50 'L de suspension de cellules de levure.
  5. Répétez les étapes 1.12 et 1.13 mais resuspendre le granule de cellules dans 300 'L d'eau stérile.
  6. Étendre 100 l l de la suspension cellulaire sur des plaques synthétiques sélectives (pour l'expression ou le vecteur de contrôle P53) contenant du dextrose comme source de carbone et une grande quantité d'adénine (tableau 2), puis incuber (à l'envers) à 30 oC pendant 2 à 3 jours.
  7. Sillonnez les colonies de levureunique unique (2-6 stries par assiette) sur une nouvelle plaque sélective et laissez-les pousser pendant la nuit à 30 oC.
  8. Le lendemain, en utilisant des velours stériles réplique plaque sur de nouvelles plaques sélectives qui permettent l'évaluation du phénotype de couleur (c.-à-d., plaques contenant du dextrose comme source de carbone, mais limitant la quantité d'adénine; Tableau 2). Incuber les assiettes à l'envers à 30 oC pendant 3 jours. Optionnellement, pour évaluer la sensibilité à la température de la protéine P53, incuber à trois températures différentes pendant 3 jours : 24 oC, 30 oC et 37 oC.
    REMARQUE: La même strie peut être réplique plaqué plusieurs fois.
  9. Pour évaluer la capacité de transactivation des protéines P53, vérifiez le phénotype à base de couleur des colonies de levures et comparez le phénotype de protéine P53 par rapport aux phénotypes vecteurs de type sauvage et vide P53.

3. Évaluation de la capacité de transactivation des protéines P53 à l'aide de l'analyse quantitative de levure LUC1 à base de luminescence

  1. Transformez les cellules de levure avec des vecteurs d'expression P53 (ou contrôle) (tableau 4) en utilisant la méthode basée sur LiAc décrite dans le protocole 2. Utilisez la souche yLFM-RE (tableau 1).
  2. Patch unique transformants sur une nouvelle plaque sélective avec la grande quantité d'adénine contenant du glucose comme source de carbone et les laisser croître à 30 oC pendant la nuit. Pour chaque type de transformation, faire 5-7 correctifs différents.
  3. Après la croissance du jour au lendemain, resuspendre une petite quantité de cellules de levure à l'aide d'un cure-dent stérile ou d'une pointe de pipette de la plaque dans un milieu sélectif synthétique contenant du dextrose ou du raffinose comme source de carbone (volume final de 200 L dans une plaque de puits transparente de 96, avec une plaque ronde ou le fond plat). Si l'expérience nécessite une expression Inductible P53, ajouter galactose au milieu du raffinose pour moduler le niveau d'induction (tableau 2).
    REMARQUE: Ces suspensions cellulaires doivent avoir un OD600nm d'environ 0,4 et pas plus élevé que 1.
  4. Mesurer l'absorption de chaque puits à OD600nm après l'expression inductible P53 (4-8 h à 30 oC avec 150-200 tr/min secouant) à l'aide d'un lecteur de plaque multilabel. Assurez-vous que les suspensions cellulaires sont homogènes en mélangeant chaque puits avec une pipette multicanal.
  5. Transférer 10-20 l de suspension cellulaire de la plaque de puits transparente 96 dans une plaque blanche de puits 384 (ou 96) et mélanger avec un volume égal (10-20 l) de tampon de lyse. Incuber de 10 à 15 min à RT sur un shaker (150-200 tr/min) pour obtenir la perméabilisation de la cellule au substrat de luciferase.
  6. Ajouter 10 à 20 l de substrat de luciferase Firefly et mesurer les unités lumineuses (LU) par un lecteur de plaques multi-étiquettes.
  7. Pour déterminer la capacité de transactivation des protéines P53, normalisez les LUs de chaque puits à l'OD600nm correspondant (unité de lumière relative, RLU). Calculer la moyenne RLU et l'écart standard de 3-4 parcelles de colonies de transformateur de levure.
  8. Comparez les données de transactivation des protéines P53 en ce qui concerne le vecteur de type sauvage et vide P53, soit en soustrayant les valeurs obtenues avec le vecteur vide, soit en divisant par les valeurs obtenues avec le vecteur vide (c.-à-d. le pli d'induction de calcul).
    REMARQUE : L'activité de transactivation P53 peut également être évaluée à l'aide de la même configuration expérimentale en présence de protéines à interaction P53 (c.-à-d. MDM2 et MDMX) et/ou y compris le traitement médicamenteux.

4. Évaluation de l'inhibition de la croissance des protéines P53 à l'aide de l'assay phénotypique de levure

  1. Transformez les cellules de levure avec des vecteurs d'expression P53/MDM2/MDMX (ou contrôle) (tableau 4) en utilisant la méthode à base de LiAc décrite à la section 2. Utiliser la souche CG379 (tableau 1) et étendre les transformateurs de levures sur des plaques sélectives minimales (tableau 2).
  2. Cultivez des cellules transformées dans un milieu sélectif minimal (tableau 2) à environ 1 OD600nm.
  3. Diluer les cellules de levure à 0,05 OD600nm dans le milieu d'induction sélective (tableau 2), et en option, ajouter une petite molécule choisie à la concentration appropriée (ou solvant seulement) pour tester son efficacité dans la réactivation mutante P53 ou dans l'inhibition mDM2- /MDMX-P53 interactions.
  4. Incuber les cellules à 30 oC sous secousses orbitales continues (200 tr/min) pendant environ 42 h (temps requis par la levure de contrôle négative pour atteindre la phase médiane du journal, environ 0,45 OD600nm).
  5. Spot 100 Aliquots L de cultures de cellules de levure sur des plaques sélectives minimales (tableau 2).
  6. Incuber pendant 2 jours à 30 oC.
  7. Mesurer la croissance des levures en comptant le nombre de colonies obtenues dans les gouttes de culture de 100 L (unité de formation de colonies, compte CFU). Par exemple, calculer l'effet de réactivation mutant des composés en tenant compte de la croissance de la levure de type sauvage P53 exprimant comme l'effet maximal possible (réglé à 100 %), tandis que la croissance des cellules exprimant le P53 mutant (mais exposée au contrôle des solvants) représente le niveau zéro de réactivation.

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Representative Results

Construction de ADE2 (En) ou LUC1 LUC1 souches de levure journaliste

Ledelitto perfettoapproach12,14,15,16 a été adapté pour permettre la construction de souches de levure squelin P53 reporter ( Figure1B). La méthode utilise des oligonucléotides à brin unique ou double contenant, aux deux extrémités, au moins 30 nucléotides homologues au lieu d'intégration choisi. Plus précisément, l'homologie correspond à des séquences flanquant le site d'intégration de la cassette à double marqueur ICORE, contenant le KlURA3 et le kanMX4 (gène reporter fournissant une résistance à la génétique, G418) précédemment positionné s'il le site cible souhaité15,16. Cette cassette contient également la séquence de codage endonuclease de levure I-SceI, sous le promoteur inductible GAL1 et son site cible cognate. Par conséquent, un commutateur dans le milieu de galactose-contenant juste avant la transformation des cellules de levure avec l'expression désirée de séquence a comme conséquence l'expression i-SceI et la génération conséquente d'une rupture à double brin simple (DSB) sur le site de l'intégration d'ICORE. La présence d'un DSB stimule fortement la fréquence des événements de ciblage, avec plus de 1 000 remplacements obtenus avec une seule transformation.

À la fin du processus de ciblage et de sélection basé sur la résistance acquise à 5-FOA et la sensibilité au G418, les clones candidats sont confirmés par l'amplification basée sur la colonie PCR du locus modifié et le séquençage Sanger pour vérifier l'intégration correcte de la P53 RE(figure 1C). À la fin du protocole de construction de souche, qui peut être complété en environ une semaine, un panneau de souches de levure de reporter isogéniques sont obtenus qui peuvent être utilisés pour évaluer comment les différences dans la séquence des ER influencent la capacité de transactivation de la P53 protéine.

Fonctionnellement hétérogènes mutants P53s

Dans les tumeurs humaines, le gène TP53 est principalement affecté par des mutations de mauvais sens simples qui impliquent généralement six résidus principaux de point chaud (R175, G245, R248, R249, R273, et R282) situés dans le domaine central de liaison d'ADN (DBD) de la protéine De53. Cependant, plus de 2 000 substitutions d'acides aminés P53 simples ont été enregistrées, dont certaines sont rarement observées27. Les P53 mutants peuvent être classés comme contact avec l'ADN ou mutants structurels, selon les effets de la substitution d'acides aminés sur le contact ADN-protéine (p. ex. R273H) ou la structure des protéines (p. ex. R175H)36. Les mutations simples de mauvais sens de TP53 impactaient des fonctions de P53, générant un large éventail de diversité fonctionnelle, qui peut influencer des dispositifs cliniques importants tels que l'agressivité de tumeur, la chimio-résistance, et le potentiel métastatique37, 38 Annonces , 39.

Le concept que les mutants P53 sont fonctionnellement hétérogènes clairement a émergé au cours des 15 dernières années grâce à une grande quantité de données expérimentales disponibles dans les bases de données de mutation TP53 (par exemple, 'lt;p53.free.fr/ / ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Différents essais fonctionnels basés sur des systèmes de testeur de levures et/ou de mammifères ont été développés, mettant en évidence les différentes propriétés des mutants P53 (c.-à-d. transactivation, sensibilité à la température, potentiel dominant-négatif, interférence avec le membres de la famille P53 et interactions avec d'autres TF)13,24,40,41,42,43,44. L'étude fonctionnelle la plus complète a examiné plus de 2 300 mutants dans un test à base de levure en caractérisant leur activité de transactivation vers huit Différents P53 REs24.

Les données ont confirmé que presque tous les P53 mutants impliquant des résidus de points chauds sont une perte de fonction (c.-à-d. qu'ils ont complètement perdu l'activité de transactivation). Inversement, les P53 mutants qui frappent d'autres positions de la protéine P53 et se trouvent généralement à fréquence modérée à faible dans le cancer45 sont des mutants de fonction partielle, qui conservent un certain niveau d'activité de transactivation sur P53 REs13, 17. Un exemple d'utilisation de l'analyse ADE2 pour étudier l'hétérogénéité fonctionnelle des protéines P53 décriteest présente à la figure 2A. En fait, alors que R175H est un mutant de perte de fonction produisant des colonies rouges dans toutes les conditions testées, R282W a montré une sensibilité à la température qui était plus évidente en utilisant l'expression P53 dépendante du galactose (c.-à-d. le secteur rouge à 37 oC dans la souche P21-5' RE dans le plaque contenant galactose inférieur, qui devient rose dans la plaque de galactose supérieure). La figure 2B présente un résumé des résultats d'un panel étendu de mutants P53 et de souches de journalistes.

L'existence de cette hétérogénéité fonctionnelle de P53 a incité l'exploration de si une telle hétérogénéité a parallèle l'hétérogénéité observée au niveau clinique dans les sujets avec des mutations de germline de TP53. Les mutations germinales TP53 sous-tendent la base moléculaire d'un groupe de troubles de prédisposition au cancer, y compris les syndromes les plus graves de Li-Fraumeni (LFS) et de Li-Fraumeni(LFL), et les prédispositions non syndromic les moins graves avec (FH) ou sans (pas de FH) antécédents familiaux46.

Le protocole a mis en évidence les corrélations génotype-phénotype en faisant correspondre les capacités de transactivation basées sur l'analyse de levure de tous les allèles mutants de germline TP53 avec les données cliniques correspondantes de la base de données du CIRC http://www-p53.iarc.fr/Germline.html.gt;. Perte de fonction P53 mutants ont été trouvés dans les syndromes de précité du cancer plus graves, tandis que la fonction partielle P53 mutants a été trouvé dans des conditions de précité du cancer moins graves. Ceci indique que la capacité résiduelle de transactivation de P53 influence le phénotype clinique dans les patients qui ont hérité des mutations de TP53 et ont développé le cancer25,26.

Les variations des séquences de nucléotides au sein des RE régissent P53 potentiel de transactivation

Human P53 est un tétramérique (dimer de dimers) TF. Chaque dimère P53 reconnaît un RE composé de 10 nucléotides (RRRCWWGYYY, R - A ou G; W ou T; Y et T)47,48. Deux de ces demi-sites peuvent être adjacents ou espacés par jusqu'à 13-20 nucléotides, constituant un P53 RE fonctionnel. Néanmoins, Les RE P53 avec un espaceur sont caractérisés par une affinité etune transactivation P53 inférieures à celles de P53 REs sans espace49,50, dans différents essais fonctionnels de différents systèmes.

Il a été récemment démontré que les demi-sites peuvent recruter des tétratiers P53 qui sont liés hemispécifiquement51, avec des essais fonctionnels et des études d'immunoprécipitation chromatine, ces résultats indiquent que P53 peut également agir à des REs non-canoniques, comprenant des demi-sites et des trois quarts des sites48,52. En outre, le fait que le motif P53 RE de consensus complet soit très dégénéré (RRRCWWGYYY)2 préfigure la possibilité que les ER individuels puissent différer considérablement en séquence et en affinité contraignante. Considérant que des centaines de gènes cibles P53 ont été identifiés dans le génome humain41,48, pratiquement tous les P53 REs ont montré une séquence non identique entre eux. En outre, il a été émis l'hypothèse que les RE ayant une affinité distincte de liaison de l'ADN sont sélectionnés dans les promoteurs des gènes cibles P53 impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire ou l'apoptose53.

L'analyse en levure de nombreuses variantes du P53 RE à un emplacement génomique constant a établi l'impact des variantes de nucléotides, de l'espaceur et de l'organisation des demi-sites RE sur la capacité de transactivation49. Il a même conduit à la découverte de Polymorphe P53 REs avec les deux allèles nettement différente dans la réactivité d'un promoteur associé à P5314,54,55. Récemment, l'information provenant des caractéristiques de séquence SP53 RE et du potentiel de transactivation à base de levure a été codée dans p53 Retriever, un algorithme de recherche de motifs qui est capable de localiser et de classer les R canoniques et non canoniques, selon leur potentiel de transactivation prédit dans l'ensemble du génome humain52.

Comme exemple d'utiliser l'assay pour étudier le potentiel de transactivation P53 spécifique à la séquence, présenté ici est une comparaison entre l'homme de type sauvage P53 et la protéine p53 lointaine évolutive de Caenorhabditis elegans (Figure 3). Ces résultats font suite à une étude récente dans laquelle la divergence évolutive de la spécificité de la transactivation parmi les protéines P53 a été explorée56. Des souches de journaliste isogéniques yLFM-RE ont été développées comme décrit dans le protocole. Plus précisément, le Cep-1 P53 RE dérivé du gène ced13 57, et quatre variantes (V1-V4) ont été comparés (Figure 3A). Les variantes RE ont été construites pour examiner l'impact de la variation de la longueur de l'espaceur qui sépare les deux motifs décédriques (qui en ced13, est de 28 nucléotides) et d'examiner les changements dans les nucléotides flanquant le motif de base CWWG (qui en ced13, sont riches En A/ T; tandis que dans la plus haute affinité humaine P53 REs, sont G / C riche)58. Les résultats montrent clairement comment Cep1 et l'homme P53 divergent en termes de spécificité de transactivation. En fait, bien que la transactivation à médiation P53 humaine soit fortement inhibée par la présence d'un astronaute (figure 3B),l'activité Cep-1 est inhibée par l'enlèvement de l'espaceur (figure 3C). En outre, la transactivation à médiation Cep-1 est abolie lorsque le RE est modifié de A/T- en G/C-rich. Ni l'homme P53 ni Cep-1 ne peuvent transactiver à partir d'un seul décestateur dérivé du ced13 RE.

Recherche de petits perturbateurs moléculaires des interactions P53-MDM2/MDMX et réactivateurs de l'activité mutante P53

La corrélation établie entre l'effet inhibiteur de la croissance du P53 humain et le degré de son activité dans la levure a mené à un test de dépistage simplifié basé sur des mesures de la croissance des cellules de levure pour analyser l'impact des facteurs d'interférence sur l'activité P53 (figure4 ). L'efficacité de l'assay phénotypique de levure pour dépister des agents anticancéreux potentiels a été démontrée dans plusieurs travaux. À l'aide de cellules de levure co-exprimant P53 et ses inhibiteurs MDM2 et/ou MDMX, de nouveaux perturbateurs de ces interactions ont été identifiés par leur capacité à inhiber l'effet négatif des MDM sur P53, rétablissant ainsi l'inhibition de la croissance de levure induite par Le P53 de type sauvage ( Figure 4A). En particulier, cet assay a conduit à la découverte de 1) pyranoxanthone 1 comme premier inhibiteur d'interaction P53-MDM2 avec un échafaudage de xanthone34 et 2) inhibiteurs de l'oxazoloisoindolinone de l'interaction P53-MDM259. En outre, avec cet exemple, la mangostin et l'acide gambogique ont été décrits pour la première fois comme inhibiteurs potentiels de l'interaction P53-MDM230.

Plus tard, le même résultat a démontré que la prénylation des chalcones a amélioré leur capacité à perturber l'interaction P53-MDM260. Fait intéressant, cet essai de levure a également conduit à la découverte de deux inhibiteurs des interactions P53-MDM2/MDMX: le tryptophanol dérivé oxazolopiperidone lactam OXAZ-161 et tryptophanol dérivé oxazoloidolinone DIMP53-162.

L'impact réduit de la perte de fonction mutant E53 sur la croissance des cellules de levure a également été exploré pour dépister les médicaments mutants P53 réactivant, caractérisés par la capacité de restaurer l'activité inhibitrice de croissance de type sauvage à la mutation P53 (Figure 4B). Avec cet essai de levure, un réactivateur du mutant P53 R280K, l'oxazoloinol enantiopure-dérivé d'oxazoloisoindolinone SLMP53-163, a été identifié. La figure 4C,D montre des résultats représentatifs obtenus dans la levure avec l'expression de P53 ou des traitements avec l'inhibiteur de l'interaction P53-MDM2 Nutlin-3a ou avec le réactivateur du mutant P53 Y220C PhiKan083.

Validation du mécanisme moléculaire d'action de ces composés en tant qu'agents activant P53 ainsi que leur activité antitumorale, à la fois dans les lignées cellulaires tumorales humaines34,60,61,62,63 et les modèles animaux62,63, atteste du grand potentiel de l'épreuve phénotypique de levure dans la découverte de médicaments.

Figure 1
Figure 1 : Caractéristiques des essais de transactivation P53 à base de levure et de flux de travail pour la construction de souches de levure De reporter P53. (A) La facilité de manipulation du génome et l'expression contrôlée des gènes ectopiques rend la levure semblable à un « tube à essai in vivo », dans lequel plusieurs variables pertinentes pour examiner les fonctions de transactivation P53 sont rigoureusement explorées. Ces variables comprennent les niveaux d'expression d'une protéine P53 de type sauvage ou mutant, la séquence de l'ER et le type de gène reporter [qualitatif/semi-quantitatif (p. ex. ADE2 et LACZ)ou quantitatif (p. ex. LUC1)]. La séquence RE consensuelle est fortement dégénérée (RE - RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R et purine; W et A/T; Y et pyrimidine; CWWG - SÉQUENCE CORE, n -0-13 bps espaceur). Le nombre d'inadéquations par rapport au consensus, à la séquence CORE et au nombre d'espaceurs de paires de base influencera l'activité de transactivation. Ce panneau a été modifié à partir d'une publication précédente64. (B) Schéma de l'approche delitto perfetto pour introduire un P53 RE souhaité en amont du promoteur minimal conduisant l'expression du gène journaliste ADE2 ou LUC1. Le protocole a été adapté des publications précédentes12,15,16. (C) Exemple des résultats de l'amplification de la colonie de levurepc de la région entourant le site d'intégration oligo RE. L'image de l'électrophorèse présente le résultat d'amplification de deux colonies positives putatives (URA3 moins et G418 sensibles) avec le contrôle négatif PCR correspondant à côté de l'échelle d'ADN de 1 kb (Promega). La bande de 500 nt attendue à l'aide d'amorces décrites dans le tableau 3 peut être séquencée pour confirmer l'édition correcte du promoteur, comme le montre l'électrophétoygramme. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Les protéines P53 présentent un potentiel de transactivation spécifique à la RE et sensible à la température. Le P53 de type sauvage et les mutations erronées de mauvais sens de TP53 indiquées ont été examinés utilisant l'essai de journaliste couleur-basé de qualitative dans la levure et exploitant des souches de journaliste qui hébergent différents P53 REs contrôlant l'expression de gène d'ADE2. (A) Un exemple du phénotype de couleur de la colonie pour P53 de type sauvage, R175H, et R282W avec le PUMA (BBC3) et le P21-5' REs à 30 'C et 37 'C est montré. Modérée (0,008% galactose) et haute (0,12% galactose) l'expression P53 est comparée. (B) Résultats obtenus avec un ensemble étendu de mutants P53 et de souches de reporter de levure examinées pour le phénotype de couleur de la colonie dépendant de La P53 à trois températures (24 oC, 30 oC et 37 oC). Les résultats illustrent l'hétérogénéité fonctionnelle des alleles Mutants P53 et sont résumés dans un format de table. Par exemple, R175H est un mutant de perte de fonction, tandis que G199H est sauvage-type P53-like. K139E et R282W conservent une fonction partielle et présentent respectivement une sensibilité au froid et à la chaleur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : L'homme P53 et l'ortholog crédité Cep-1 présententune spécificité de transactivation très divergente. (A) Séquences de la séquence de consensus : humain P53 RE, Cep-1 P53 RE dérivé du gène ced13, et quatre variantes (V1-V4) qui ont été testées dans les essais fonctionnels. (B) La transactivation a été mesurée après avoir induit l'expression P53 humaine pendant 8 h en utilisant trois sources de carbone différentes pour atteindre une expression faible, modérée et élevée (0,008%, 0,032%, 0,12% de galactose ajouté au milieu sélectif contenant 2% de raffinose). Les résultats sont exprimés comme des unités lumineuses relatives moyennes (RLU) et une erreur standard de quatre répliques. L'activité de report pour la cellule transformée avec le vecteur vide d'expression a été soustraire. (C) Spécificité de transactivation de Cep1 mesurée en (B). Pour les deux protéines, les niveaux de transactivation étaient proportionnels à la quantité de galactose. Les unités de lumière plus élevées mesurées lorsque l'homme P53 est exprimé peut dépendre de différents niveaux de quantités de protéines produites, en raison de la différence dans la longueur des protéines et potentiellement aussi dans l'utilisation de codon. Les deux protéines sont caractérisées par une spécificité de transactivation différente vers les différents ER testés et cette propriété n'est pas affectée par les différences possibles dans la quantité relative de protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Les activateurs de petites molécules de P53 identifiés à l'aide de l'assay phénotypique de levure. (A) Les cellules de levure co-exprimant les interactions P53 et MDMX de type sauvage humain Ont été utilisées pour rechercher des inhibiteurs des interactions P53-MDM2 et P53-MDMX. Dans ce système, les inhibiteurs d'interaction restaurent l'inhibition de croissance de levure P53-induite dans les cellules de levure co-exprimant P53 et MDM2 ou MDMX. Cette approche a permis d'identifier les inhibiteurs de l'interaction P53-MDM2 et d'identifier les doubles inhibiteurs des interactions P53-MDM2 et P53-MDMX. (B) Les cellules de levure exprimant le Mutant Humain P53 ont été employées pour rechercher les réactivateurs mutants de P53 et sont capables de reconstituer l'inhibition sauvage-type-type-comme de croissance de levure P53-induite dans les cellules mutantes P53-exprimant des levures. (C) Images représentatives de l'évaluation de la tache de plaque montrant l'impact du P53 de type sauvage ou du Y220C mutant sur la croissance des colonies de levures par rapport au vecteur vide (voir l'étape 4.5). (D) Résultats quantitatifs de l'essai de croissance : 10 M Nutlin-3a restaure l'inhibition de la croissance de levure induite par P53 dans les cellules co-exprimant MDM2 ; 50 M PhiKan083 restaure l'inhibition de la croissance de levure induite par le P53 de type sauvage au mutant P53 Y220C. Les deux effets sont tracés par rapport à l'effet inhibiteur de la croissance de la levure de type sauvage P53, qui a été fixé comme un seul. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Nom de la souche et génotype Utilisation spécifique Numéro de protocole
yAFM-ICORE: MATa leu2-3 112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::ADE2 Il est utilisé pour la construction de la souche yAFM-RE (MATaleu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::ADE2) qui est exploité dans le qualitatif, couleur basée sur l'analyse ADE2. Protocoles 1,2
yLFM-ICORE: MATa leu2-3 112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1:LUC1 Il est utilisé pour la construction de la souche yLFM-RE (MATaleu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; RE::pCyc1::LUC1) qui est exploité dans l'analyse quantitative de LUC1 basée sur la luminescence. Protocoles 1,3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [Kil-O] Il est utilisé pour l'assay de croissance phénotypique. Protocole 4

Tableau 1 : Souches de levure.

Nom et recette des médias Utilisation spécifique Numéro de protocole
YPDA (YPDA) (2 % d'extrait de levure, 2 % de peptone, 2 % de dextrose, 200 mg/L d'adénine) 2% d'agar YPDA sans agar est stérilisé de préférence par filtration. L'agar YPDA est stérilisé par l'autoclaclacage; il est possible d'omettre le dextrose de la recette et d'ajouter du dextrose à partir d'une solution stérilisée par filtre de 20 % dans l'eau avant de verser les assiettes. Protocoles 1-4
CM [0,17% Base d'azote de levure sans AA et Sulfate d'ammonium, 0,5 % de sulfate d'ammonium, 5 % (volume/volume, v/v) solution non essentielle d'acide aminé, 20 mg/L d'histidine, 20 mg/L de tryptophane, 20 mg/L uracil, 30 mg/L de lysine, 100 mg/L de leucine, 200 mg/L d'adénine] 2% galactose Les médias sont stérilisés par filtrage. Les solutions de stock stériles suivantes sont préparées dans l'eau (à l'exception de l'uracil, qui est dissous en 0,1 M NaOH) par filtrage : solution aminé-acide non essentielle (0,04 % arginine, 0,04 % méthionine, 0,06 % isoleucine, 0,1 % phénylalanine, 0,2 % glutamic acide, 0,2% d'acide aspartique, 0,3% de valine, 0,4% de thréonine, 0,8% de sérine), 1% d'histidine, 1% de tryptophane, 1% d'uracil, 1% de lysine, 1% de léucine, 0,5% d'adénine, 20% de galactose. La solution de stock d'adénine ne doit pas être stockée dans le réfrigérateur en raison de la formation et de la sédimentation des cristaux. La solution de stock de tryptophane doit être stockée dans l'obscurité. Protocole 1
CM (voir ci-dessus) 2% Dextrose - 1g/L 5-FOA - 2% d'agar Les médias (contenant de la base d'azote de levure sans AA et ammonium Sulfate, Ammonium Sulfate et Agar) sont stérilisés par autoclaclacage. Les autres composants sont ajoutés après l'autoclacage pour conserver les ingrédients de labile de chaleur; la poudre de 5-FOA peut être ajoutée directement dans le support une fois qu'elle a refroidi à environ 55oC. Protocole 1
YPDA 400 g/mL G418 - 2% d'agar Le G418 doit être ajouté après l'autoclacage une fois que les médias sont refroidis à environ 55 oC. Si à partir de poudre, une solution de bouillon G418 de 50 mg/mL peut être préparée dans l'eau et stérilisée par filtration. Protocole 1
L'YPGA [2 % d'extrait de levure, 2 % de peptone, 2 % de glycérol (v/v), 200 mg/L d'adénine] 2% d'agar Les médias sont stérilisés par l'autoclacage. Protocole 1
Plaque sélective synthétique : [0,17 % Base d'azote de levure sans aA et sulfate d'ammonium, 0,5% Ammonium Sulfate, 5% (v/v) solution d'acide aminé non essentiel (0,04% arginine, 0,04% méthionine, 0,06% isoleucine, 0,1% phénylalanine, 0,2% acide glutamique, 0,2% d'acide aspartique, 0,3% de valine, 0,4% de valine, 0,4% threonine, 0,8% serine), 20 mg/L histidine, 20 mg/L uracile, 20 mg/L tryptophane (selon le marqueur de sélection vectorielle), 30 mg/L lysine, 100 mg/mL leucine (selon le marqueur de sélection vectorielle), 5 mg/L ou 200 mg/L adenine] Les médias (contenant de la base d'azote de levure sans AA et ammonium Sulfate, Ammonium Sulfate et Agar) sont stérilisés par autoclaclacage. Les autres composants sont ajoutés après l'autoclacage pour conserver les ingrédients de labile thermique. Lors de l'utilisation de vecteurs à base de pLS et de pLSG, préparez des plaques sans leucine. Lors de l'utilisation de vecteurs à base de pTS et de pTSG, préparez des plaques sans tryptophane. Protocoles 2-3
Médias sélectifs synthétiques : [0,17 % Base d'azote de levure sans aA et sulfate d'ammonium, 0,5% Ammonium Sulfate, 5% (v/v) solution non essentielle d'amino-acide (0,04% arginine, 0,04% méthionine, 0,06% isoleucine, 0,1% phenylalanine, 0,2% acide glutamique, 0,2% d'acide aspartique, 0,3% de valine, 0,4% thréonine, 0,8% de sérine), 20 mg/L histidine, 20 mg/L uracile, 20 mg/L tryptophane (selon le marqueur de sélection vectorielle), 30 mg/L lysine, 100 mg/mL leucine (selon le marqueur de sélection vectorielle), 200 mg/L adénine] - 2% dextrose ou raffinose 0-2 galacse  Le support est stérilisé par filtration. Lors de l'utilisation de vecteurs à base de pLS ou de pTS dans le traitement médicamenteux préparer les médias sans leucine ou tryptophane, respectivement, mais contenant 2% de dextrose. Lors de l'utilisation de pLSG- ou pTSG-basé vecteur dans l'expression inductible P53 avec ou sans traitement médicamenteux préparer les médias sans leucine ou tryptophane, respectivement, mais contenant 2% raffinose et quantité variable de galactose pour moduler l'expression P53. L'étendue de l'induction P53 peut également être modulée en variant le temps d'incubation. Protocole 3
Plaques sélectives minimales : 2 % de glucose, 0,7 % de base d'azote de levure (sans acides aminés et sulfate d'ammonium), 50 mg/L d'adénine, 50 mg/L d'uracil, 50 mg/L d'histidine, 50 mg/L de tryptophane (selon le marqueur de sélection vectorielle), 50 mg/L de leucine (selon marqueur de sélection vectorielle), 2% d'agar Le milieu est stérilisé par autoclacage. Lors de l'utilisation de vecteurs à base de pLS89 préparer milieu sans tryptophane. Utilisez le vecteur vide de pLS89 (ne exprimant aucune protéine) comme contrôle négatif. Lorsque vous utilisez des vecteurs pLS89 et pGADT7-MDM2 (co-expression de P53 et MDM2), préparez le milieu sans leucine et le tryptophane. Utilisez le pLS89 vide et le pGADT7 (tous deux n'exprimant aucune protéine) comme témoins négatifs. Lors de l'utilisation de vecteurs à base de pLS76 préparer milieu sans leucine. Utilisez le vecteur pRS315 (ne exprimant aucune protéine) comme contrôle négatif. Protocole 4
Milieu sélectif minimal : comme plaques sélectives minimales mais sans agar Le milieu est stérilisé par filtration. Protocole 4
Moyen d'induction sélective : comme milieu sélectif minimal mais contenant 2% de galactose au lieu du glucose Le milieu est stérilisé par filtration. Protocole 4

Tableau 2 : Médias de levure.

Nom et recette de la solution ou nom et séquence d'apprêt Caractéristiques et utilisation spécifiques Numéro de protocole
LiAc/TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, avec 1 mM EDTA et 0,1 m d'acétate de lithium Les solutions de stock stériles suivantes dans l'eau sont préparées par autoclacage : 1M Lithium acétate pH 7.5, 1 M Tris-HCl / 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE buffer 10X). Protocoles 1-4
PEG/LiAc/TE: 40% Polyéthylène glycol (PEG) en 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, avec 1 mM EDTA et 0,1 M d'acétate de lithium Les solutions de stock stériles suivantes dans l'eau sont préparées par autoclacage : 1 M Lithium acétate pH 7.5, 1 M Tris-HCl / 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE buffer 10X), 50% PEG (poids moléculaire 3350). Protocoles 1-4
Queues d'homologie pour les oligonucléotides RE :
5'-gcggaattgacttttttttttgaataatacat-RE-gcagatccgccaggcgtgtatatagcgtgg-3'		 A condition de la séquence des queues d'homologie, correspondant aux séquences chromosomiques flanquant la cassette ICORE intégrée; SÉQUENCE RE et RE. Protocole 1
Amorces: Ade2 Fw: 5'-AAGTTGCCTAGTTCATCATGAA-3';
Ade2 Rv: 5'-GGAGCCATTAACGTGGTCAT-3';
Luc1-Rv: 5'-CATAGCTCTGCCAACCGAA-3'		 Pour la souche yAFM-RE (PCR et séquençage) combinez Ade2 Fw avec Ade2 Rv amorce. Pour la souche yLFM-RE (PCR et séquençage), combinez Ade2 Fw et Amorce Luc1-Rv. Protocole 1

Tableau 3 : Solutions et oligonucléotides.

Types de vecteurs Contrôles positifs et négatifs Numéro de protocole
Vecteurs P53 (ou contrôle).
pLS- ou pLSG-basé : expression de protéine de P53 sous le promoteur constitutif ADH1 ou le promoteur inductible de GAL1 de galactose, respectivement (LEU2 comme marqueur de sélection).
pTS- ou pTSG-basé : expression de protéine de P53 sous le promoteur constitutif ADH1 ou le promoteur gal1 inductible de galactose, respectivement (TRP1 comme marqueur de sélection)		 pLS- et pLSG-basé : utilisation comme commande positive les vecteurs pLS76 et pLSG-P53 (exprimant le type sauvage P53), respectivement ; comme vecteur de contrôle négatif pRS315 (ne exprimant aucune protéine).
pTS- et pTSG-basé : utilisation comme commande positive les vecteurs pTS76 et pTSG-P53 (exprimant le type sauvage P53), respectivement ; comme vecteur de contrôle négatif pRS314 (ne exprimant aucune protéine).		 Protocole 2,3
vecteurs P53 et MDM2 (ou contrôle).
pLS89-basé : expression sauvage de protéine de type P53 sous le promoteur gal1 inductible de galactose (TRP1 comme marqueur de sélection).
pLS76-basé : expression mutante de protéine De P53 sous le promoteur constitutif adh1 (LEU2 comme marqueur de sélection).
pGADT7-based: MDM2 protein expression under constitutive ADH1 promoter (LEU2 as selection marker)		 pLS89- base: utiliser comme contrôle positif le vecteur pLS89-P53 (exprimant le type sauvage P53); utiliser comme contrôle négatif pLS89-vide (ne pas exprimer de protéines).
pLS76- base: utiliser comme contrôle positif le vecteur pLS76-mutant P53 (exprimant mutant P53); comme vecteur de contrôle négatif pRS315 (ne exprimant aucune protéine).
pGADT7- basé: utiliser comme contrôle positif le vecteur pGADT7-MDM2 (exprimant le type sauvage MDM2); comme vecteur de contrôle négatif pGADT7 (ne exprimant aucune protéine).		 Protocole 4

Tableau 4 : Vecteurs d'expression des levures.

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Discussion

Les essais à base de levure se sont avérés utiles pour étudier divers aspects des fonctions protéiques P53. Ces essais sont particulièrement sensibles pour évaluer le potentiel de transactivation P53 vers des variantes de sites cibles RE, y compris l'évaluation des polymorphismes fonctionnels. L'utilisation de journalistes de couleur ainsi que la miniaturisation de l'analyse de la luciférase se traduisent par des essais rentables et relativement évolutifs. En outre, le test d'inhibition de la croissance est potentiellement susceptible d'être utilisé dans le dépistage des bibliothèques chimiques, automatisant la quantification de la viabilité des cellules de levure par la mesure de l'absorption. Tandis que la perméabilité limitée due à la paroi cellulaire et à l'action des transporteurs d'ABC a été considérée une limitation en utilisant la levure pour le criblage de drogue, les modifications génétiques pour améliorer l'utilisation ont été avec succès développées22,65.

Comparé aux essais à base de cellules de mammifères, l'analyse P53 à base de levure peut améliorer l'identification des impacts directs, étant donné que P53 est isolé de la complexité étonnante des cofacteurs et des voies de signalisation en cascade qui modulent ses fonctions chez les eucaryotes plus élevés. Les essais fonctionnels à base de levure ont également été partiellement réussis à surveiller l'interaction de P53 avec les cofacteurs protéiques (à savoir MDM2 et MDMX22,32,33,34) et l'impact des petits (comme Nutlin-3a) sur ces interactions. Cependant, la sensibilité et la puissance prédictive des essais à base de levure pour étudier le traque entre le P53 et les protéines en interaction peuvent être quelque peu limitées, selon la façon dont ces interactions in vivo dépendent des modifications post-traductionnelles et cascades de signalisation spécifiques à chaque espèce.

Les systèmes décrits ici peuvent être facilement adaptés à d'autres TF. En effet, des essais fonctionnels de levure ont été développés pour les protéines P53 et P7342,49 ainsi que des membres de la famille NF-B66,67 [ou même pour une homéobox et helix-boucle-helix de base (bHLH) TFs68,69]. Les récepteurs nucléaires humains ont également été exprimés dans la levure et prouvé à travailler comme ligand-dépendant, séquence spécifique TFs70. Un facteur limitant a été identifié dans la faible capacité de certains mammifères domaine de transactivation (TAD) d'interagir avec la machinerie de transcription basale de levure8, une lacune qui peut être surmontée en utilisant des constructions chimériques, y compris un actif hétérologue TAD68,69.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions l'Union Européenne (Fonds FEDER POCI/01/0145/FEDER/007728 par programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) et les Fonds Nationaux (FCT/MEC, Fundaço para a Ciência e Tecnologia et Ministério da Educaçào e Ciência) sous le Accord de partenariat PT2020 UID/QUI/50006/2019 et les projets (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Bourses FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Ce travail a été soutenu par la Compagnia S. Paolo, Turin, Italie (Projet 2017.0526) et le Ministère de la Santé, (Projet 5x1000, 2015 et 2016; recherche actuelle 2016). Nous remercions profondément la Dre Teresa Làpez-Arias Montenegro (Université de Trente, laboratoires d'enseignement des sciences expérimentales) pour son aide à l'enregistrement vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

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References

  1. Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
  2. Pan, Y., Tsai, C. J., Ma, B., Nussinov, R. Mechanisms of transcription factor selectivity. Trends in Genetics. 26 (2), 75-83 (2010).
  3. Das, M. K., Dai, H. K. A survey of DNA motif finding algorithms. BMC Bioinformatics. 8 Suppl 7, S21 (2007).
  4. Sebastian, A., Contreras-Moreira, B. The twilight zone of cis element alignments. Nucleic Acids Resesarch. 41 (3), 1438-1449 (2013).
  5. Iggo, R., et al. Validation of a yeast functional assay for p53 mutations using clonal sequencing. Journal of Pathology. 231 (4), 441-448 (2013).
  6. Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genetics. 3 (5), e84 (2007).
  7. Scharer, E., Iggo, R. Mammalian p53 can function as a transcription factor in yeast. Nucleic Acids Research. 20 (7), 1539-1545 (1992).
  8. Kennedy, B. K. Mammalian transcription factors in yeast: strangers in a familiar land. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 3 (1), 41-49 (2002).
  9. Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic Acids Research. 26 (4), 942-947 (1998).
  10. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5767-5768 (1994).
  11. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  12. Inga, A., Storici, F., Darden, T. A., Resnick, M. A. Differential transactivation by the p53 transcription factor is highly dependent on p53 level and promoter target sequence. Molelcular and Cellular Biology. 22 (24), 8612-8625 (2002).
  13. Resnick, M. A., Inga, A. Functional mutants of the sequence-specific transcription factor p53 and implications for master genes of diversity. Proceeding of the National Academy of Science USA. 100 (17), 9934-9939 (2003).
  14. Tomso, D. J., et al. Functionally distinct polymorphic sequences in the human genome that are targets for p53 transactivation. Proceeding of the National Academy of Science USA. 102 (18), 6431-6436 (2005).
  15. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nature Biotechnology. 19 (8), 773-776 (2001).
  16. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  17. Campomenosi, P., et al. p53 mutants can often transactivate promoters containing a p21 but not Bax or PIG3 responsive elements. Oncogene. 20 (27), 3573-3579 (2001).
  18. Flaman, J. M., et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 92 (9), 3963-3967 (1995).
  19. Kovvali, G. K., Mehta, B., Epstein, C. B., Lutzker, S. G. Identification of partial loss of function p53 gene mutations utilizing a yeast-based functional assay. Nucleic Acids Research. 29 (5), E28 (2001).
  20. Shimada, A., et al. The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63: similarities and differences. Cancer Research. 59 (12), 2781-2786 (1999).
  21. Sunahara, M., et al. Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast. Oncogene. 18 (25), 3761-3765 (1999).
  22. Andreotti, V., et al. p53 transactivation and the impact of mutations, cofactors and small molecules using a simplified yeast-based screening system. PLoS ONE. 6 (6), e20643 (2011).
  23. Hekmat-Scafe, D. S., et al. Using yeast to determine the functional consequences of mutations in the human p53 tumor suppressor gene: An introductory course-based undergraduate research experience in molecular and cell biology. Biochemistry Molecular Biology Educaction. 45 (2), 161-178 (2017).
  24. Kato, S., et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proceedings of the National Academy of Science USA. 100 (14), 8424-8429 (2003).
  25. Monti, P., et al. Transcriptional functionality of germ line p53 mutants influences cancer phenotype. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3789-3795 (2007).
  26. Monti, P., et al. Dominant-negative features of mutant TP53 in germline carriers have limited impact on cancer outcomes. Molecular Cancer Research. 9 (3), 271-279 (2011).
  27. Leroy, B., et al. The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D962-D969 (2013).
  28. Nigro, J. M., Sikorski, R., Reed, S. I., Vogelstein, B. Human p53 and CDC2Hs genes combine to inhibit the proliferation of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 1357-1365 (1992).
  29. Bureik, M., Jungbluth, A., Drescher, R., Wagner, P. Human p53 restores DNA synthesis control in fission yeast. Biological Chemistry. 378 (11), 1361-1371 (1997).
  30. Leao, M., et al. Alpha-mangostin and gambogic acid as potential inhibitors of the p53-MDM2 interaction revealed by a yeast approach. Journal of Natural Products. 76 (4), 774-778 (2013).
  31. Hadj Amor, I. Y., et al. Human p53 induces cell death and downregulates thioredoxin expression in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 8 (8), 1254-1262 (2008).
  32. Leao, M., et al. Novel simplified yeast-based assays of regulators of p53-MDMX interaction and p53 transcriptional activity. FEBS J. 280 (24), 6498-6507 (2013).
  33. Di Ventura, B., Funaya, C., Antony, C., Knop, M., Serrano, L. Reconstitution of Mdm2-dependent post-translational modifications of p53 in yeast. PLoS ONE. 3 (1), e1507 (2008).
  34. Leao, M., et al. Discovery of a new small-molecule inhibitor of p53-MDM2 interaction using a yeast-based approach. Biochemichal Pharmacology. 85 (9), 1234-1245 (2013).
  35. Billant, O., Blondel, M., Voisset, C. p53, p63 and p73 in the wonderland of S. cerevisiae. Oncotarget. 8 (34), 57855-57869 (2017).
  36. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P. D., Pavletich, N. P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science. 265 (5170), 346-355 (1994).
  37. Muller, P. A., Vousden, K. H., Norman, J. C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion. Journal of Cellular Biology. 192 (2), 209-218 (2011).
  38. Oren, M., Rotter, V. Mutant p53 gain-of-function in cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a001107 (2010).
  39. Walerych, D., Napoli, M., Collavin, L., Del Sal, G. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer. Carcinogenesis. 33 (11), 2007-2017 (2012).
  40. Ciribilli, Y., et al. The coordinated p53 and estrogen receptor cis-regulation at an FLT1 promoter SNP is specific to genotoxic stress and estrogenic compound. PLoS ONE. 5 (4), e10236 (2010).
  41. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. Potentiating the p53 network. Discovery Medicine. 10 (50), 94-100 (2010).
  42. Monti, P., et al. Characterization of the p53 mutants ability to inhibit p73 beta transactivation using a yeast-based functional assay. Oncogene. 22 (34), 5252-5260 (2003).
  43. Monti, P., et al. Tumour p53 mutations exhibit promoter selective dominance over wild-type p53. Oncogene. 21 (11), 1641-1648 (2002).
  44. Shiraishi, K., et al. Isolation of temperature-sensitive p53 mutations from a comprehensive missense mutation library. Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 348-355 (2004).
  45. Soussi, T. TP53 mutations in human cancer: database reassessment and prospects for the next decade. Advances in Cancer Research. 110, 107-139 (2011).
  46. Malkin, D. Li-Fraumeni Syndrome. Genes and Cancer. 2, 474-484 (2001).
  47. el-Deiry, W. S., Kern, S. E., Pietenpol, J. A., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Genetics. 1 (1), 45-49 (1992).
  48. Menendez, D., Inga, A., Resnick, M. A. The expanding universe of p53 targets. Nature Reviews in Cancer. 9, 724-737 (2009).
  49. Ciribilli, Y., et al. Transactivation specificity is conserved among p53 family proteins and depends on a response element sequence code. Nucleic Acids Research. 41 (18), 8637-8653 (2013).
  50. Smeenk, L., et al. Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Research. 36, 3639-3654 (2008).
  51. Vyas, P., et al. Diverse p53/DNA binding modes expand the repertoire of p53 response elements. Proceeding of the National Academy of Science USA. 114 (40), 10624-10629 (2017).
  52. Tebaldi, T., et al. Whole-genome cartography of p53 response elements ranked on transactivation potential. BMC Genomics. 16, 464 (2015).
  53. Wang, T., et al. Species-specific endogenous retroviruses shape the transcriptional network of the human tumor suppressor protein p53. Proceedings of the National Academy of Science USA. 104, 18613-18618 (2007).
  54. Bond, G. L., et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell. 119 (5), 591-602 (2004).
  55. Zeron-Medina, J., et al. A polymorphic p53 response element in KIT ligand influences cancer risk and has undergone natural selection. Cell. 155 (2), 410-422 (2013).
  56. Lion, M., et al. Evolution of p53 transactivation specificity through the lens of a yeast-based functional assay. PLoS ONE. 10 (2), e0116177 (2015).
  57. Schumacher, B., et al. C. elegans ced-13 can promote apoptosis and is induced in response to DNA damage. Cell Death and Differentiation. 12 (2), 153-161 (2005).
  58. Jordan, J. J., et al. Low-level p53 expression changes transactivation rules and reveals superactivating sequences. Proceeding of the National Academy of Science USA. 109 (36), 14387-14392 (2012).
  59. Soares, J., et al. Oxazoloisoindolinones with in vitro antitumor activity selectively activate a p53-pathway through potential inhibition of the p53-MDM2 interaction. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 66, 138-147 (2015).
  60. Leao, M., et al. Enhanced cytotoxicity of prenylated chalcone against tumour cells via disruption of the p53-MDM2 interaction. Life Sciences. 142, 60-65 (2015).
  61. Soares, J., et al. A tryptophanol-derived oxazolopiperidone lactam is cytotoxic against tumors via inhibition of p53 interaction with murine double minute proteins. Pharmacol Research. 95-96, 42-52 (2015).
  62. Soares, J., et al. DIMP53-1: a novel small-molecule dual inhibitor of p53-MDM2/X interactions with multifunctional p53-dependent anticancer properties. Molecular Oncology. 11 (6), 612-627 (2017).
  63. Soares, J., et al. Reactivation of wild-type and mutant p53 by tryptophanolderived oxazoloisoindolinone SLMP53-1, a novel anticancer small-molecule. Oncotarget. 7 (4), 4326-4343 (2016).
  64. Sharma, V., Monti, P., Fronza, G., Inga, A. Human transcription factors in yeast: the fruitful examples of P53 and NF-small ka, CyrillicB. FEMS Yeast Research. 16 (7), (2016).
  65. Stepanov, A., Nitiss, K. C., Neale, G., Nitiss, J. L. Enhancing drug accumulation in Saccharomyces cerevisiae by repression of pleiotropic drug resistance genes with chimeric transcription repressors. Molecular Pharmacology. 74 (2), 423-431 (2008).
  66. Sharma, V., et al. Quantitative Analysis of NF-kappaB Transactivation Specificity Using a Yeast-Based Functional Assay. PLoS ONE. 10 (7), e0130170 (2015).
  67. Epinat, J. C., et al. Reconstitution of the NF-kappa B system in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13 (7), 599-612 (1997).
  68. Inga, A., Reamon-Buettner, S. M., Borlak, J., Resnick, M. A. Functional dissection of sequence-specific NKX2-5 DNA binding domain mutations associated with human heart septation defects using a yeast-based system. Human Molecular Genetics. 14 (14), 1965-1975 (2005).
  69. Reamon-Buettner, S. M., Ciribilli, Y., Inga, A., Borlak, J. A loss-of-function mutation in the binding domain of HAND1 predicts hypoplasia of the human hearts. Human Molecular Genetics. 17 (10), 1397-1405 (2008).
  70. Balmelli-Gallacchi, P., et al. A yeast-based bioassay for the determination of functional and non-functional estrogen receptors. Nucleic Acids Research. 27 (8), 1875-1881 (1999).

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Recherche sur le cancer numéro 150 P53 levure élément de réponse analyse fonctionnelle transcription inhibition de la croissance
Levure comme un châssis pour le développement des essais fonctionnels pour étudier l'homme P53
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Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

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