Summary
Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.
Abstract
Die posttranslationale Modifikation von Proteinen durch das kleine Protein Ubiquitin ist an vielen zellulären Ereignissen beteiligt. Nach der tryptischen Verdauung von ubiquitinierten Proteinen können Peptide mit einem Diglycin-Rest, die zur Epsilon-Aminogruppe von Lysin ('K-'-Diglycin' oder einfach 'diGly') konjugiert sind, verwendet werden, um die ursprüngliche Modifikationsstelle zurückzuverfolgen. Effiziente Immunreinigung von diGly-Peptiden in Kombination mit sensiblem Nachweis durch Massenspektrometrie hat zu einem enormen Anstieg der Anzahl der bis heute identifizierten Ubiquitinationsstellen geführt. Wir haben einige Verbesserungen an diesem Workflow vorgenommen, einschließlich der Offline-Hoch-pH-Reverse-Phase-Fraktionierung von Peptiden vor dem Anreicherungsverfahren und der Einbeziehung erweiterter Peptidfragmentierungseinstellungen in den Ionen-Routing-Multipol. Außerdem führt eine effizientere Bereinigung der Probe mit einem filterbasierten Stecker, um die Antikörperperlen zu erhalten, zu einer größeren Spezifität für diGly-Peptide. Diese Verbesserungen führen zum routinemäßigen Nachweis von mehr als 23.000 diGly Peptiden aus menschlichen Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa) Zelllysate bei Proteasomenhemmung in der Zelle. Wir zeigen die Wirksamkeit dieser Strategie für die eingehende Analyse der Ubiquitinom-Profile verschiedener Zelltypen und von In-vivo-Proben, wie z. B. Hirngewebe. Diese Studie präsentiert eine originelle Ergänzung der Toolbox für die Protein-Ubiquitinationsanalyse, um das tiefe zelluläre Ubiquitinom aufzudecken.
Introduction
Die Konjugation von Ubiquitin zu Proteinen kennzeichnet sie für den Abbau durch das Proteasom und ist ein entscheidender Prozess bei der Proteostase. Die C-Terminal-Carboxylgruppe von Ubiquitin bildet eine Isopeptidbindung mit der Lysin-Amino-Gruppe des Zielproteins1,2. Darüber hinaus kann Ubiquitin an andere Ubiquitin-Module angeschlossen werden, was zur Bildung homogener (d.h. K48 oder K11) oder verzweigter (d.h. heterogener oder gemischter) Polyubiquitinstrukturen1,3führt. Die bekannteste Funktion von Ubiquitin ist seine Rolle bei der proteasomalen Degradation, vermittelt durch K48-verknüpftes Polyubiquitin. Es ist jedoch klar geworden, dass sowohl Mono- als auch Polyubiquitination in vielen Prozessen eine Rolle spielen, die unabhängig von der Degradierung durch das Proteasom sind. Zum Beispiel haben K63-verknüpfte Ketten nicht abbauende Rollen im intrazellulären Handel, lysosomale Degradation, Kinase-Signalisierung und die Reaktion auf DNA-Schäden4,5. Die anderen sechs Verknüpfungstypen sind weniger häufig und ihre Rollen sind immer noch weitgehend rätselhaft, obwohl erste Hinweise auf ihre Funktionen in der Zelle entstehen, vor allem aufgrund der Entwicklung neuer Werkzeuge, um eine linkagespezifische Erkennung zu ermöglichen6,7.
Die Massenspektrometrie ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug für Proteomanalysen geworden und heutzutage können Tausende verschiedener Proteine aus praktisch jeder biologischen Quelle in einem einzigen Experiment identifiziert werden. Eine zusätzliche Komplexitätsschicht wird durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Proteinen (z. B. Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung und Ubiquitination) dargestellt, die die Proteinaktivität modulieren können. Die großflächige Identifizierung von PTM-haltigen Proteinen wurde auch durch Entwicklungen im Bereich der Massenspektrometrie ermöglicht. Die im Vergleich zu ihren unveränderten Gegenstücken relativ geringe Stoichiometrie von Peptiden mit PTMs stellt eine technische Herausforderung dar, und biochemische Anreicherungsschritte sind im Allgemeinen vor der Massenspektrometrieanalyse notwendig. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden verschiedene spezifische Anreicherungsmethoden für die Analyse von PTM entwickelt.
Aufgrund der vielfältigen Rolle der Protein-Ubiquitination in der Zelle besteht eine große Nachfrage nach der Entwicklung von Analysemethoden für den Nachweis von Ubiquitinationsstellen auf Proteinen8. Die Anwendung von massenspektrometrischen Methoden hat zu einer Explosion der Anzahl der identifizierten Ubiquitinationsstellen in Fruchtfliegen-, Maus-, Human- und Hefeproteinen9,10,11,12,13,14geführt. Ein wichtiger Schritt wurde durch die Entwicklung von immunititizipationsbasierten Anreicherungsstrategien auf Peptidebene unter Verwendung von Antikörpern gegen das Restmotiv K-A-GG (auch als "Diglycin" oder "diGly" bezeichnet) dargestellt. Diese diGly Peptide werden bei der Verdauung von ubiquitinierten Proteinen mit Trypsin als Protease15,16produziert.
Hier präsentieren wir einen optimierten Workflow zur Anreicherung von diGly-Peptiden mittels Immunreinigung und anschließender Detektion durch Orbitrap-Massenspektrometrie. Mit einer Kombination mehrerer Modifikationen bestehender Arbeitsabläufe, insbesondere in den Phasen der Probenvorbereitung und Massenspektrometrie, können wir nun routinemäßig mehr als 23.000 diGly-Peptide aus einer einzigen Probe von HeLa-Zellen identifizieren, die mit einem Proteasom behandelt wurden. Inhibitor und 10.000 US-Us-Us-Euro aus unbehandelten HeLa-Zellen. Wir haben dieses Protokoll auf Lysate sowohl aus unbeschrifteten als auch aus stabilen Isotopenkennzeichnungen mit Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) mit HeLa-Kennzeichnung sowie auf endogene Proben wie Hirngewebe angewendet.
Dieser Workflow stellt eine wertvolle Ergänzung zum Repertoire an Werkzeugen für die Analyse von Ubiquitinationsseiten dar, um das tiefe Ubiquitinom aufzudecken. Das folgende Protokoll beschreibt alle Schritte des Workflows im Detail.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (EDC) von Erasmus MC genehmigt.
1. Probenvorbereitung
- Kultivierte Zellen
- Wählen Sie eine Zelllinie von Interesse (z. B. HeLa oder Osteosarkom [U2OS] Zellen) und wachsen die Zellen in Dulbeccos Minimal Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10% Hitze inaktivierten fetalen Rinderserum (FBS) und 100 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin.
- Für quantitative Proteomik-Experimente, Kulturzellen in DMEM fehlt Arginin und Lysin. Das Medium muss mit 10% dialysiertem fetalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin und Alanin-Glutamin ergänzt werden. Herstellung von zwei Arten von Medien, indem Sie entweder konventionelles Lysin und Arginin ('Light' Medium) oder Lysin-8 (13C6; 15N2) und Arginin-10 (13C6; 15N4) (im"Schweren Mittel".
- Kulturchargen von Zellen in Light Medium (d.h. unbeschriftet) und Heavy Medium (d. h. mit der Bezeichnung SILAC) für mindestens sechs Verdoppelungen vor der Expansion und Behandlung, um sicherzustellen, dass alle Proteine in der Heavy Medium-Kultur mit schwerem, stabilem Isotop gekennzeichnet sind, das Aminosäuren.
- Behandeln Sie die Zellen für 8 h mit 10 'M des Proteasomeninhibitors Bortezomib oder einem entsprechenden Volumen von DMSO als Scheinbehandlung. Waschen Sie die Zellen mit PBS, dissoziieren Sie sie mit 1% Trypsin/EDTA und pellet die Zellen.
- Lyse das Zellpellet von einer 150 cm2 Kulturplatte pro Zustand getestet in 2 ml eiskalte mM Tris-HCl (pH = 8,2) mit 0,5% Natriumdesoxycholat (DOC). Das Lysat bei 95 °C für 5 min kochen und 10 min beschallen (Einstellung "H" für den in der Materialtabelleaufgeführten Beschallungsgerät) bei 4 °C. Wir empfehlen nicht die Verwendung von Deubiquitinase-Inhibitoren wie N-Ethylmaleimid (NEM), da dies unerwünschte Proteinmodifikationen mit sich bringen kann, die die Peptididentifikation erschweren können.
- In vivo Maus Hirngewebe
- Bei Verwendung von In-vivo-Gewebe das Gewebe in einem eiskalten Puffer mit 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 12 mM Natrium-DOC und 12 mM Natrium N-Lauroylsarcosinat17. Beschallen Sie das Lysat für 10 min (Einstellung "H" für den in der Materialtabelleaufgeführten Beschallungsmittel) bei 4 °C und kochen Sie das Lysat 5 min bei 95 °C.
- Quantitieren Sie die gesamte Proteinmenge mit einem farbmetrischen Absorbanz BCA Protein Assay Kit. Die Gesamtmenge des Proteins sollte mindestens mehrere Milligramm für eine erfolgreiche diGly Peptid-Immunpräzipitation (IP) betragen. Für SILAC-Experimente mischen Sie die leichten und schwer beschrifteten Proteine in einem Verhältnis von 1:1, basierend auf der Gesamtproteinmenge.
- Reduzieren Sie alle Proteine mit 5 mM 1,4-Dithiothreitol 30 min bei 50 °C und alkylieren Sie sie anschließend mit 10 mM Iodoacetamid 15 min im Dunkeln. Durchführung der Proteinverdauung mit Lys-C (1:200 Enzym-Substrat-Verhältnis) für 4 h, gefolgt von einer nächtlichen Verdauung mit Trypsin (1:50 Enzym-Substrat-Verhältnis) bei 30 °C oder bei Raumtemperatur (RT).
- Trifluoressigsäure (TFA) der verdauten Probe auf eine Endkonzentration von 0,5 % und Zentrifugieren Sie die Probe 10 min bei 10.000 x g, um alle Reinigungsmittel auszufällen und zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand, der die Peptide für die nachfolgende Fraktionierung enthält.
2. Offline-Peptidfraktionierung
- Verwenden Sie die Hoch-pH-Reverse-Phase (RP) C18-Chromatographie mit polymerem stationärem Phasenmaterial (300 , 50 M; siehe Materialtabelle),die in eine leere Säulenpatrone geladen werden, um die tryptischen Peptide zu fraktionieren. Die stationäre Phasenbettgröße muss an die Menge des zu fraktionierenden Proteinverdaus angepasst werden. Bereiten Sie eine leere 6 ml-Säulenpatrone (siehe Materialtabelle) vor, die mit 0,5 g stationärem Phasenmaterial für 10 mg Protein-Digest gefüllt ist. Das Protein-Digest-zu-stationärePhase-Verhältnis sollte ca. 1:50 (w/w) betragen.
- Laden Sie die Peptide auf die vorbereitete Säule und waschen Sie die Säule mit ca. 10 Spaltenvolumen von 0,1% TFA, gefolgt von ca. 10 Spaltenvolumen von H2O.
- Elute die Peptide in drei Fraktionen mit 10 Spaltenvolumen von 10 mM Ammoniumformatlösung (pH = 10) mit 7%, 13,5% bzw. 50% Acetonitril (AcN). Lyophilisieren Sie alle Fraktionen bis zur Vollständigkeit.
- Verwenden Sie Ubiquitin-Restmotiv (K---GG) Antikörper, die mit Protein A Agarose-Perlen konjugiert sind, um diGly Peptide immunanreichert zu werden. Da die genaue Menge an Antikörpern pro Charge von Perlen proprietäre Informationen ist und nicht vom Hersteller offengelegt wird, wird empfohlen, die gleiche Definition für eine Charge von Perlen wie der Hersteller zu verwenden, um Verwechslungen zu vermeiden. Waschen Sie eine Charge dieser Perlen 2x mit PBS und teilen Sie die Perlenschlämme in sechs gleiche Fraktionen. Siehe Abbildung 1 für ein detailliertes Versuchsschema.
- Lösen Sie die drei Peptidfraktionen, die in Schritt 2,3 in 1,4 ml eines Puffers aus 50 mM MOPS, 10 mM Natriumphosphat und 50 mM NaCl (pH = 7,2) gesammelt wurden, auf und drehen Sie die Trümmer herunter.
- Die Überräube der Fraktionen zu den diGly-Antikörperperlen geben und 2 h bei 4 °C auf einer Rotatoreinheit brüten. Die Perlen abdrehen und den Überstand auf eine frische Charge von Antikörperperlen übertragen und bei 4 °C wieder für 2 h brüten.
- Speichern Sie die Überstande für die nachfolgende globale Proteom-Analyse (GP).
- Übertragen Sie die Perlen aus jeder Fraktion in eine 200-L-Pipettespitze, die mit einem GF/F-Filterstecker ausgestattet ist, um die Perlen zu halten. Legen Sie die Pipettenspitze mit den Perlen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit zentrifugenspitzen Adapter. Waschen Sie die Perlen 3x mit 200 l eiskalten IAP-Puffer und anschließend 3x mit 200 l eiskaltem MilliQ H2O. Drehen Sie die Säule vor jedem Waschschritt 2 min bei 200 x g nach unten, aber achten Sie darauf, die Säule nicht trocken laufen zu lassen. Elute die Peptide mit 2 Zyklen von 50 l von 0,15% TFA.
- Die Peptide mit einer C18-Stufenspitze (im Wesentlichen eine 200-L-Pipettespitze mit zwei C18-Scheiben) zu trocknen und mit Vakuumzentrifugation auf Vollständigkeit zu trocknen.
3. Nanoflow LC-MS/MS
- Führen Sie LC-MS/MS-Experimente an einem empfindlichen Massenspektrometer durch, das an ein Nanoflow-LC-System gekoppelt ist.
- Verwenden Sie eine hauseigene, verpackte 50 cm-Umkehrphasensäule mit einem 75 m Innendurchmesser, verpackt mit CSH130-Harz (3,5 m, 130 , ) und verwenden Sie die Peptide mit einem Gradienten von 2 bis 28 % (AcN, 0,1% FA) über 120 min bei 300 nL/min. Alternativ können Sie handelsübliche LC-Säulen mit ähnlichen Eigenschaften verwenden. Halten Sie die Säule z. B. mit einem Säulenofen bei 50 °C (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie die Massenspektrometrieanalyse durch.
- Das Massenspektrometer muss im datenabhängigen Erfassungsmodus (DDA) betrieben werden. MS1-Massenspektren sollten mit hoher Auflösung (z. B. 120.000) mit einer automatisierten Gain Control (AGC) Zieleinstellung von 4E5 und einer maximalen Injektionszeit von 50 ms bei einem Orbitrap-Massenspektrometer gesammelt werden.
- Führen Sie zuerst die Massenspektrometrieanalyse im Modus "Höchste Intensität zuerst" durch. Auf diese Weise wird das intensivste Ion zuerst für die Fragmentierung ausgewählt, dann das zweithöchste usw., mit der Höchstgeschwindigkeitsmethode mit einer Gesamtzykluszeit von 3 s. Führen Sie anschließend eine zweite Runde der DDA MS-Analyse im Modus "Niedrigste Intensität zuerst" durch, sodass zuerst das am wenigsten intensive Ionen ausgewählt wird, dann die zweitniedrigste usw. Diese Strategie gewährleistet eine optimale Erkennung von Peptiden mit sehr geringem Abstrich.
- Filtern Sie die Vorläuferionen nach ihren Ladungszuständen (2-7 Ladungen) und monoisotopischer Spitzenzuweisung. Ausschließen sie zuvor verhörte Vorläufer dynamisch für 60 s. Isolieren Sie Peptid-Vorläufer mit einem Quadrupol-Massenfilter, der auf eine Breite von 1,6 Th eingestellt ist.
- Sammeln Sie MS2-Spektren in der Ionenfalle bei einem AGC von 7E3 mit einer maximalen Einspritzzeit von 50 ms und einer HCD-Kollisionsenergie von 30 %.
4. Datenanalyse
- Analysieren Sie die Massenspektrometrie-Rohdateien mit einer geeigneten Suchmaschine wie der frei verfügbaren MaxQuant Software-Suite basierend auf der Andromeda Suchmaschine18,19. Wählen Sie in MaxQuant die Standardeinstellungen mit einigen Anpassungen aus, die unten angezeigt werden. Stellen Sie die Enzymspezifität auf Trypsin fest, wobei die maximale Anzahl der verpassten Spaltungen auf drei erhöht wird. Lysin mit einem diGly-Überrest (+114.04 Da), Oxidation von Methionin und N-terminaler Acetylierung als variable Modifikationen einstellen und Carbamidomethylierung von Cystein als feste Modifikation einstellen.
- Führen Sie Datenbanksuchen anhand einer FASTA-Datei durch, die Proteinsequenzen enthält, die beispielsweise aus dem Uniprot-Repository (https://www.uniprot.org/downloads)in Kombination mit einem Lockvogel und einer gemeinsamen Standarddatenbank für Verunreinigungen heruntergeladen wurden, die automatisch von MaxQuant bereitgestellt wird. Legen Sie die false discovery rate (FDR) auf 1% und die Mindestpunktzahl für modifizierte (diGly) Peptide auf 40 (Standardwert) fest. Peptide, die mit einem C-Terminal diGly modifizierten Lysinrückstand identifiziert wurden, von der weiteren Analyse ausausschließen.
- Für die quantitative Analyse von SILAC-Experimentdateien legen Sie die Multiplizität auf "2" und Schritt 4.2 zu wiederholen.
- Führen Sie alle nachgelagerten Analysen (z.B. Statistiken, Genontologieanalysen) mit dem Perseus Modul20 der MaxQuant Software-Suite durch.
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Representative Results
Ubiquitinierte Proteine hinterlassen einen 114,04 Da-Diglycin-Rest auf dem Ziellysin-Rückstand, wenn die Proteine mit Trypsin verdaut werden. Der durch dieses Motiv verursachte Massenunterschied wurde verwendet, um den Ort der Ubiquitination in einem Massenspektrometrieexperiment eindeutig zu erkennen. Die Strategie, die wir hier beschreiben, ist eine hochmoderne Methode zur Anreicherung und anschließenden Identifizierung von diGly Peptiden durch Nanoflow LC-MS/MS (Abbildung 1A). In dieser Studie wurden sowohl kultivierte Zellen als auch In-vivo-Material als biologische Quelle von Proteinen verwendet, aber dieses Protokoll ist mit jeder Quelle von Proteinen kompatibel. Nach den Schritten im Protokoll sollte es einfach sein, 10.000-25.000 diGly Peptide aus 2-20 mg Protein-Input zu identifizieren. Um das Ausmaß der Protein-Ubiquitination in Zellen zu erhöhen, kann ein Proteasomen-Inhibitor wie Bortezomib oder MG132 ein paar Stunden vor der Ernte der Zellen hinzugefügt werden. Wenn kein Proteasomen-Inhibitor verwendet wurde, war die Anzahl der identifizierten diGly-Peptide tendenziell signifikant niedriger (30-40%).
Wir haben einige Verbesserungen an bestehenden Protokollen vorgenommen. Zunächst wird eine grobe Fraktionierung in drei Fraktionen auf der Grundlage der umgekehrten Phasenchromatographie und der anschließenden Elution bei hohem pH-Wert durchgeführt, um die Komplexität der Peptidmischung zu reduzieren. Diese Fraktionen zeigen eine sehr geringe Überlappung bei peptididentifikationen, und vergleichbare Zahlen von diGly Peptiden sollten pro Fraktion identifiziert werden (Abbildung 2). Dies führt zu einer hohen Anzahl von einzigartigen diGly Peptide in jeder dieser Fraktionen identifiziert. Wichtig ist, dass eine der Fraktionen (in der Regel die zweite) das eigene K48 modifizierte tryptische Peptid LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39) enthalten sollte. Dies ist bei weitem das am häufigsten vorkommende Peptid in der immunpräzipierten Fraktion und zeichnet sich durch den intensiven und breiten Peak im LC-Chromatogramm aus (Abbildung 1B). Dies ist ein chromatographischer Benchmark-Peak, und wenn er im Chromatogramm fehlt, war die IP höchstwahrscheinlich erfolglos.
Eine weitere Verbesserung ist die Anpassung des DDA-Analyseverfahrens ist der Ionen-Routing-Multipol im Massenspektrometer. Bei der konventionellen Top-N-Datenabhängigen Erfassung (DDA) werden N-Peaks aus dem MS1-Spektrum für die Fragmentierung ausgewählt. Dieses Fragmentierungsschema beginnt zuerst mit der höchsten Intensitätsspitze, gefolgt von der Spitze der zweithöchsten Intensität usw. In einem alternativen Fragmentierungsschema wird zuerst der am wenigsten intensive Peak ausgewählt, gefolgt von der zweitwenigsten intensiven Spitze usw. Der Grund für diese Reihenfolge der Auswahl ist, dass es genügend Zeit gibt, um sehr geringe reichliche Peptide zu fragmentieren. Tatsächlich stellten wir fest, dass die Anzahl der Peptid-Identifikationen zunimmt, wenn die DDA-Läufe "höchste erste" und "niedrigste erste" kombiniert werden, verglichen mit einer doppelten LC-MS-Analyse mit Standard-DDA-Einstellungen (d. h. dem höchsten ersten). Für eine umfassendere Ubiquitinom-Profilerstellung wird daher empfohlen, die LC-MS-Läufe mit "höchsten ersten" und "niedrigsten ersten" Fragmentierungsregimen im Datenanalyseverfahren zu kombinieren. Diese "niedrigste erste" Strategie kann mehr als 4.000 einzigartige DIGly-Peptide erzeugen, die nicht entdeckt wurden, als nur das herkömmliche DDA-Regime verwendet wurde (Abbildung 2).
Schließlich können zusätzliche IP-Informationen des Durchflusses nach der ersten IP-Adresse weitere 2.500 eindeutige DIGly-Peptide erzeugen (Abbildung 2).
Artikel in der Literatur über Ubiquitinationsprofiling berichten in der Regel von etwa 10.000 identifizierten diGly Peptiden12,21. Hier waren von allen diGly-Peptiden, die über drei biologische Replizien-Screens identifiziert wurden, >9.000 in allen drei enden, während >17.000 in mindestens zwei von drei Replikationen vorhanden waren (Abbildung 3). In der Regel sollte man nach dem hier beschriebenen Protokoll >21.000 einzigartige diGly Peptide aus einer 15-20 mg-Proteinprobe mit einer Standardcharge Von CST-Antikörperperlen identifizieren. In Bezug auf Reinheit und Selektivität sollte das Verhältnis zwischen identifizierten diGly-Peptiden und unveränderten Peptiden immer >0,5 betragen. Die Anzahl der diGly Peptid-Identifikationen war in hohem Maße abhängig von der Menge des Protein-Eingangsmaterials. Eine IP mit nur 1 mg Eingangsmaterial produzierte etwa 2.500 diGly Peptid-Identifikationen, während mit 10 mg Protein-Eingangsmaterial >15.000 diGly Peptid-Identifikationen produziert wurden. Tabelle 1 listet die erwartete Anzahl der identifizierten diGly-Peptide für jede Bedingung auf. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Zahlen nur Schätzungen sind und von der Art des verwendeten Massenspektrometers abhängen. Abbildung 4 zeigt die Überlappung zwischen diGly Peptid-Identifikationen mit niedrigen, mittleren und hohen Mengen an Eingangsmaterial.
Um den Mehrwert der oben beschriebenen Verbesserungen für die Analyse der Ubiquitination-Site zu veranschaulichen, führten wir auch eine quantitative ubiquitinomische Analyse von SILAC-markierten HeLa-Zellen durch, die mit dem Proteasomen-Inhibitor Bortezomib im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen in einem doppelten Etiketten-Swap-Test behandelt wurden. Mehr als die Hälfte (>55%) von allen identifizierten Peptiden im Eluat nach IP waren diGly Peptide. Es wurden über 19.000 einzigartige DIGly-Peptide identifiziert, was nur geringfügig geringer ist als in einer nicht-SILAC-beschrifteten Probe. Der Grund dafür könnte die höhere Komplexität von MS1-Spektren in einem SILAC-Assay sein, da Peptid-Spitzenpaare vorliegen. In der SILAC-Analyse wurden relativ große Unterschiede zwischen der Anzahl der diGly-Peptide beobachtet, die ausschließlich in der Vorwärtsbedingung identifiziert wurden (d. h. bortezomib behandelte Zellen im schweren Kanal, Kontrollzellen im Lichtkanal) und solchen, die ausschließlich im umgekehrten Zustand identifiziert wurden (d. h. bortezomib behandelte Zellen im Lichtkanal, Kontrollzellen im schweren Kanal), in diesem Fall 1.752 versus 6.356 (Zusatztabelle 1). Beim Betrieb der MaxQuant-Software im Modus "multiplicity = 2" (d.h. zweikanaliger SILAC) wurden 7.555 diGly-Peptide mit Nullintensität im schweren Kanal (praktisch alle im Reverse-Experiment) und einem Intensitätswert ungleich Null im Lichtkanal identifiziert. Im Gegensatz dazu wurden keine einzelnen diGly-Peptide mit einem Intensitätswert ungleich Null im schweren Kanal identifiziert, begleitet von einem Null-Intensitätswert im Lichtkanal. Wenn eine MaxQuant-Analyse desselben Datensatzes im Modus "multiplicity = 1" mit dem diGly moiety und der beschrifteten Aminosäure zu einer einzigen variablen Modifikation kombiniert wurde, wurden viele schwere diGly Peptidvarianten identifiziert, auch wenn kein leichtes Gegenstück zu diesem Peptid nachgewiesen werden konnte. Die wahrscheinlichste Erklärung dafür ist die Unfähigkeit der Software, mit der Identifizierung von diGly Peptiden fertig zu werden, die ausschließlich im schweren Kanal vorhanden sind. Dieses Phänomen wird wahrscheinlich ausgiebig auftreten, da die Hemmung des Proteasom die Bildung neuartiger Allgegenwärtigkeitsorte auslösen wird. Das Kontrollkästchen "Requantify" in MaxQuant, das entwickelt wurde, um diese Probleme zu behandeln und dafür korrigieren sollte, scheint nicht ausreichend zu sein, um dieses Problem vollständig zu vermeiden. Offensichtlich wird die überwiegende Mehrheit der diGly-Peptide auf Proteasome-Hemmung hochreguliert oder de novo gebildet, da mehr als zwei Drittel des Peptidpools H:L-Verhältnisse von mindestens 1,5 aufweisen(Abbildung 5B).
Schließlich haben wir diese Ubiquitinations-Site-Analysemethode auf eine In-vivo-Gewebeprobe angewendet. Um die Wirksamkeit zu bewerten, extrahierten wir ca. 32 mg Protein aus dem frischen Maushirn (10 % des Nassgewebegewichts ist Protein). Das Gehirnmaterial wurde nicht mit Proteasomenhemmern oder anderen Reagenzen behandelt, die die allgemeine Protein-Ubiquitination steigern könnten. Aus dieser Stichprobe wurden 10.871 eindeutige DIGly-Peptide identifiziert (Zusatztabelle 2). Alle in diesem Gewebe identifizierten diGly-Peptide stammten von endogenen Stellen der Ubiquitination in einer stationären Situation. Es wurde keine Behandlung zur Förderung der globalen Ubiquitination (z. B. Proteasome-Hemmung) eingeführt. Wir gehen daher davon aus, dass diese Ubiquitinationsseiten zumindest teilweise aus (Poly-)Ubiquitination herkommen, die an nicht-proteasome vermittelten zellulären Signalereignissen beteiligt ist, was mit den in der LiteraturvorgeschlagenenIdeen 5,16,22stimmt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene Methode eine reproduzierbare Erforschung des Ubiquitinoms ermöglicht. Eine Übersicht über die mit diesem Verfahren erzielten typischen Ergebnisse finden Sie unter Van Der Wal et al.23.
Abbildung 1: Experimentelle Übersicht. (A) Überblick über den experimentellen Ansatz. Die Proben wurden mithilfe der Reverse-Phasen-Chromatographie mit hoher pH-Elution vorbereitet, trypsinisiert und in drei Fraktionen fraktioniert. Eine Charge kommerzieller Peptid-Antikörperperlen wurde in sechs gleiche Fraktionen aufgeteilt und die drei Peptidfraktionen wurden dann auf drei der Perlenfraktionen geladen. Die diGly Peptide wurden immungereinigt, eluiert und gesammelt, und der Durchfluss wurde anschließend auf die drei verbleibenden frischperlen Fraktionen übertragen. Die gesammelten diGly Peptide wurden durch Massenspektrometrie auf einem Lumos Orbitrap Massenspektrometer nach einem zweistufigen Schema analysiert, das einen Zyklus kombiniert, in dem die intensivsten Peaks zuerst für die Peptidfragmentierung ausgewählt wurden, und den nächsten Zyklus, in dem die am wenigsten intensiven Spitzen zuerst ausgewählt wurden. Der komplette Satz von nLC-MS/MS-Ausführungen wurde dann mit MaxQuant analysiert. (B) Eine der Fraktionen sollte Ubiquitins eigenes K48 modifiziertes tryptisches Peptid LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39) enthalten. Dies ist bei weitem das am häufigsten vorkommende Peptid in der immunpräzipierten Fraktion und zeichnete sich durch den intensiven und breiten Peak im LC-Chromatogramm zwischen 50-55 min bei einem 120 min Gradienten aus. Wenn dieser Benchmark-Peak im Chromatogramm fehlt, war die IP höchstwahrscheinlich erfolglos. Diese Zahl wurde von Van Der Wal et al.23geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Anzahl der diGly-Peptide, die für jeden der drei Verbesserungsschritte erkannt wurden. (A) Wirkung der rohen Fraktionierung vor der Immunpräzipitation. Die Überlappung zwischen den in den drei getrennten Fraktionen identifizierten DiGly-Peptidpopulationen wird gezeigt. (B) Wirkung des ersten und zweiten Inkubationsschritts. (C) Ergebnisse des angepassten Peptidfragmentierungsregimes. Diese Zahl wurde von Van Der Wal et al.23geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: DiGly-Peptide, die in drei biologischen Replikationen von bortezomib behandelten Zellen nachgewiesen wurden und die Menge der Überlappung zwischen den Durchläufen zeigen. Diese Zahl wurde von Van Der Wal et al.23geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Überlappung der identifizierten DIGly-Peptide aus Analysen mit niedrigen (4 mg), mittleren (10 mg) und hohen (40 mg) Gesamtprotein-Inputmengen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Nachweis von diGly-Peptiden in SILAC-markierten Zellen. (A) Anzahl der Peptide, die in den Vorwärts- und Rückwärtsbedingungen der SILAC-gekennzeichneten HeLa-Zellen für die Multiplizitätseinstellungen 1 und 2 erkannt wurden. (B) Streudiagramm von diGly Peptid SILAC Verhältnisse in Bortezomib (Btz) behandelt HeLa Zellen. Es werden nur Peptide gezeigt, die sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsexperimenten identifiziert und quantifiziert wurden. Diese Zahl wurde von Van Der Wal et al.23geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Zustand | Menge des Ausgangsmaterials (mg) | Erwartete Anzahl der identifizierten diGly Peptide |
| Unbehandelte HeLa-Zellen | 10 | 7,500 |
| Proteasome-Hemmer behandelt E-La-Zellen | 1 | 2,500 |
| 2 | 5,000 | |
| 10 | 15,000 | |
| 20 | 20,000 | |
| 40 | >25.000 | |
| Gewebe (Maushirn) | 30 | >10.000 |
Tabelle 1: Erwartete Anzahl von diGly Peptid-Identifikationen für verschiedene Bedingungen. Diese Zahlen sind nur Schätzungen und hängen von den verwendeten experimentellen Einstellungen ab.
Ergänzende Tabelle 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
Ergänzende Tabelle 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde auf Proben aus verschiedenen biologischen Quellen angewendet, wie z. B. kultivierte Zellen und In-vivo-Gewebe. In allen Fällen identifizierten wir Tausende von DIGly-Peptiden, vorausgesetzt, dass die Gesamteinmenge des Proteineinsatzes mindestens 1 mg betrug. Die Anreicherung mit spezifischen Antikörpern ist hocheffizient, da höchstens 100-150 sehr geringe diGly-Peptide aus ganzen Zelllysaten identifiziert wurden, wenn keine Anreicherungsverfahren für ubiquitinierte Proteine oder diGly Peptide angewendet wurden. Offensichtlich ist eine empfindliche Massenspektrometrie eine Voraussetzung für die Erlangung einer hohen Anzahl von DIGly-Identifikationen. Obwohl wir erfolgreich mehrere verschiedene Massenspektrometer eingesetzt haben, fanden wir den Orbitrap Tribrid Lumos als den empfindlichsten, der die höchsten Erträge lieferte.
Die Offline-RP-Chromatographie mit hoher pH-Elution sollte vor der Durchführung der IP-Daten getestet werden. Die Überlappung zwischen den Fraktionen in Bezug auf Peptid-Identifikationen sollte für ein optimales Experiment so gering wie möglich sein. Nach der IP sollte eine der Fraktionen das eigene K48 modifizierte Tryptic-DiGly-Peptid LIFAGK(GG)QLEDGR (m/z 730.39) enthalten. Dies ist bei weitem das am häufigsten vorkommende Peptid in der immunpräzipierten Fraktion und zeichnet sich durch den intensiven und breiten Peak im LC-Chromatogramm zwischen 50-55 min bei einem 120 min Gradienten aus (Abbildung 1B). Wenn dieser Benchmark-Peak im Chromatogramm fehlt, war die IP höchstwahrscheinlich erfolglos.
Es ist wichtig, die immunpräzipitierten diGly tryptic Peptide unmittelbar nach dem IP-Verfahren zu analysieren, so dass die Zeit zwischen dem IP und der Analyse auf ein Minimum beschränkt werden sollte. Während dieser Zeit sollten Peptide vorzugsweise in einer Glasflasche statt in Kunststoffrohren gelagert werden. Peptide in Kunststoffrohren zu lange zu lassen, entweder bei RT oder bei -20 °C, kann zu Ausfällungen von Peptiden und/oder zum Kleben an der Kunststoffrohrwand führen. Dies wird sich letztlich auf die Empfindlichkeit der Analyse auswirken.
Obwohl es in der Literatur Berichte über die mögliche Fehlinterpretation von Iodoacetamid-Addukten als Ubiquitinationsstellen wegen ihrer identischen 114.04 Da-Massenverschiebungen24gegeben hat, haben wir mit unseren Präparaten immunpräzipitierter Tryptische Peptide keinen Hinweis darauf gefunden. Erstens sind die Nebenwirkungen der Verwendung von Iodoacetamid (IAM) in unseren Händen mit dem oben beschriebenen Alkylierungsreduktionsprotokoll minimal. Zweitens ist der Antikörper spezifisch für Peptide mit einem Diglycinrest. Peptide mit zwei Iodoacetamiden-Moieties, die Lysinrückständen kovalent zugesetzt werden, sollten in diesem Protokoll nicht angereichert werden. Drittens sind die meisten Peptide in der immunpräzipierten Fraktion auf proteasome-Hemmung hochreguliert, wie am oben beschriebenen SILAC-Experiment(Abbildung 5)veranschaulicht. Da die Population von ubiquitinierten Proteinen als Folge dieser Behandlung betroffen ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass diese betroffenen Peptide tatsächlich diGly Peptide sind, die aus ubiquitinierten Proteinen resultieren.
Schließlich könnte dieses Protokoll in Kombination mit einer kürzlich veröffentlichten multiplexed quantitativen Strategie mit TMT19verwendet werden. Offensichtlich, obwohl die veröffentlichten diGly Peptid Zahlen sind etwas niedriger als die mit dem vorliegenden Protokoll erhalten, die Fähigkeit, relativ quantifizieren bis zu 16 Proben gleichzeitig ist ein großer Vorteil. Die Kombination dieser Methoden wird es den Forschern ermöglichen, groß angelegte quantitative Ubiquitinom-Studien in großer Tiefe durchzuführen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit ist Teil des Projekts "Proteins at Work", einem Programm des Niederländischen Proteomics Centre, das von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) im Rahmen der Nationalen Roadmap-Großforschungseinrichtungen (Projektnummer 184.032.201) finanziert wird. ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
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