Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genomet redigering i däggdjur cellinjer med CRISPR-Cas

Published: April 11, 2019 doi: 10.3791/59086
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2
1Genome Institute of Singapore, Agency for Science Technology and Research, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

CRISPR-Cas är en kraftfull teknik för att konstruera komplexa genomen hos växter och djur. Här, detalj vi ett protokoll för att effektivt redigera det mänskliga genomet som använder olika Cas endonucleases. Vi belysa viktiga överväganden och konstruktionsparametrar att optimera redigering effektivitet.

Abstract

Klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) systemet fungerar naturligt i bakteriell adaptiv immunitet, men har varit framgångsrikt repurposed för genomet engineering i många olika levande organismer. Vanligast, vildtyp CRISPR associerade 9 (Cas9) eller Cas12a Amiiiiin används för att klyva specifika platser i genomet, varefter rasten dubbelsträngat DNA repareras via icke-homolog slutet att gå (NHEJ) väg eller på homologi-regisserad reparation ( HDR) väg beroende på om en givare mall är frånvarande eller presentera respektive. Hittills har har CRISPR system från olika bakteriearter visat sig kunna utföra gen editering i däggdjursceller. Men trots den skenbara enkelheten av teknik måste flera design parametrar övervägas, som ofta lämnar användare villrådig om hur bäst för att utföra sin arvsmassa redigering experiment. Här beskriver vi ett komplett arbetsflöde från experimentell design till identifiering av cell kloner som bär önskat DNA ändringar, med målet att underlätta framgångsrika genomförandet av genomet redigering experiment i däggdjursceller linjer. Vi belysa viktiga överväganden för användare att ta del av, inklusive valet av CRISPR system, spacer längden och utformningen av en mall för givare av enkelsträngat oligodeoxynucleotide (ssODN). Vi föreställer oss att det här arbetsflödet kommer att vara användbart för genen knockout studier, sjukdom modellering ansträngningar, eller generering av reporter cellinjer.

Introduction

Förmågan att ingenjör genomet hos någon levande organism har många biomedicinska och biotekniska tillämpningar, såsom korrigering av sjukdomsframkallande mutationer, byggandet av korrekt cellular-modeller för sjukdom studier eller generation av jordbruks grödor med önskvärda egenskaper. Sedan vänden av århundradet, olika tekniker har utvecklats för genomet engineering i däggdjursceller inklusive meganucleases1,2,3, zink finger nukleotider4,5, eller transkription aktivator-liknande effektor nukleaser (TALENs)6,7,8,9. Dessa tidigare tekniker är dock svår att program och tråkiga att montera, därmed hämmar deras utbredd användning i forskning och industrin.

Under de senaste åren, den klustrade mellanliggande regelbundet kort palindromic repetitioner (CRISPR) - CRISPR-associerade (Cas) system har vuxit fram som en kraftfull ny genome engineering technology10,11. Ursprungligen en adaptiva immunsystemet i bakterier, det har varit framgångsrikt distribuerat för genomet ändring i växter och djur, inklusive människor. En primär anledning varför CRISPR-Cas har fått så mycket popularitet på så kort tid är det elementet som ger den viktiga Cas Amiiiiin, såsom Cas9 eller Cas12a (även känd som Cpf1), på rätt plats i genomet är bara en kort bit av chimära enda guide RN En (sgRNA), som är enkla att design och billigt att syntetisera. Efter rekryteras till målwebbplatsen, Cas enzymet fungerar som ett par molekylära saxar och klyver bundna DNA med dess RuvC, HNH eller Nuc domäner12,13,14. Den resulterande dubbel strandsatta pausen (DSB) repareras därefter av cellerna via antingen icke-homolog slutet att gå (NHEJ) eller homologi-regisserad reparation (HDR) väg. I avsaknad av en reparation mall repareras DSB av felbenägna NHEJ vägen, som kan ge upphov till pseudo-slumpmässiga infogning eller borttagning av nukleotider (indels) på webbplatsen skurna, potentiellt orsaka frameshift mutationer i proteinet-kodande gener. Dock i närvaro av en givare-mall som innehåller DNA ändringarna, repareras DSB av HiFi HDR smittvägen. Vanliga typer av givare mallar inkluderar enkelsträngat oligonukleotider (ssODNs) och plasmider. Förstnämnda används vanligtvis om de avsedda DNA-förändringarna är små (exempelvis ändring av ett enda baspar), medan den senare används vanligtvis om man vill infoga en relativt lång sekvens (exempelvis den kodande sekvensen av ett grönt fluorescerande protein eller GFP) i det mål locus.

Amiiiiin aktiviteten av proteinet Cas kräver närvaro av en protospacer intill motiv (PAM) på mål plats15. Den PAM av Cas9 är slutet 3' av protospacer, medan den PAM av Cas12a (även kallad Cpf1) är på 5' avsluta istället16. Cas-guiden RNA komplex är inte att införa en DSB om PAM är frånvarande17. PAM förlägger därför en begränsning på de genomiska platser där en viss Cas nuclease kunna klyva. Lyckligtvis, Cas nukleaser från olika bakteriearter uppvisar vanligtvis olika PAM krav. Därav, genom att integrera olika CRISPR-Cas system i våra engineering verktygslådan, kan vi öka utbudet av platser som kan riktas i en genomet. Dessutom kan en naturlig Cas-enzym vara konstruerad eller utvecklats för att identifiera alternativa PAM sekvenser, ytterligare utvidgning av genomisk mål nås till manipulation18,19,20.

Även om flera CRISPR-Cas system finns tillgängliga för genomet engineering ändamål, har de flesta användare av tekniken åberopat huvudsakligen den Cas9 nuclease från Streptococcus pyogenes (SpCas9) av flera skäl. Först, det kräver en förhållandevis enkelt NGG PAM, till skillnad från många andra Cas proteiner som kan bara klyva i närvaro av mer komplexa PAMs. Det andra är den första Cas Amiiiiin distribueras framgångsrikt i mänskliga celler21,22,23,24. Tredje är SpCas9 överlägset bäst kännetecknas enzymet hittills. Om en forskare vill använda en annan Cas nuclease, skulle han eller hon ofta vara oklart om hur man bäst att utforma experimentet och hur väl andra enzymer utför i olika biologiska sammanhang jämfört med SpCas9.

För att ge klarhet till relativa prestanda för olika CRISPR-Cas system, har vi nyligen utfört en systematisk jämförelse av fem Cas endonucleases – SpCas9, enzymet Cas9 från Staphylococcus aureus (SaCas9), enzymet Cas9 från Neisseria meningitidis (NmCas9), det Cas12a enzymet från Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) och enzymet Cas12a från Lachnospiraceae bakterien ND2006 (LbCas12a)25. För en rättvis jämförelse utvärderat vi de olika Cas nukleaser använder samma uppsättning mål platser och andra försöksbetingelser. Studien avgränsas också design parametrar för varje CRISPR-Cas-systemet, som skulle tjäna som en användbar referens för användare av tekniken. Här, att bättre möjliggöra forskare att använda CRISPR-Cas system, vi tillhandahåller en stegvisa protokoll för optimal genomet engineering med olika Cas9 och Cas12a-enzymer (se figur 1). Protokollet omfattar inte endast experimentella Detaljer men också viktiga designhänsyn att maximera sannolikheten för en framgångsrik genomet engineering resultatet i däggdjursceller.

Figure 1
Figur 1 : En översikt av arbetsflödet att generera genomet redigeras mänskliga cellinjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. design av sgRNAs

  1. Välj ett lämpligt CRISPR-Cas system.
    1. Först inspektera målregionen för PAM sekvenser av alla Cas9 och Cas12a nukleaser som har visat sig vara funktionell i däggdjursceller16,21-32. Fem vanliga enzymer ges i tabell 1 tillsammans med deras respektive PAMs.
      Obs: förutom endonucleases som anges i tabell 1, det finns andra mindre vanliga Cas-enzymer som framgångsrikt har distribuerats i däggdjursceller samt, såsom en Cas9 nuclease från Streptococcus thermophilus (St1Cas9) som erkänner den PAM NNAGAAW. Om önskat målwebbplatsen inte innehåller en känd PAM, då skulle man inte kunna använda systemets CRISPR-Cas för genomet engineering.
    2. Andra anser några kända egenskaper målet genomisk locus eller gen. Vissa egenskaper att ta hänsyn till inkluderar gen uttryck nivåer eller kromatin tillgänglighet och om det finns andra nära relaterade sekvenser samt.
      Obs: Vissa enzymer är bättre lämpade för särskilda biologiska sammanhang. Till exempel om du vill redigera en repetitiv genomisk locus eller en gen med flera andra nära paralogs, det rekommenderas att använda antingen AsCas12a (på grund av dess lägre tolerans för avvikelser mellan sgRNA och mål-DNA än SpCas9 och LbCas12a) eller SaCas9 (beror på dess kravet på längre distanser, vilket ger högre inriktning specificitet)25.
CAS Amiiiiin PAM Optimal spacer längd
SpCas9 NGG 17-22 nt inclusive
SaCas9 NNGRRT ≥ 21 nt
NmCas9 NNNNGATT ≥ 19 nt
AsCas12a och LbCas12a TTTV ≥ 19 nt

Tabell 1: några vanliga Cas enzymer med sin cognate PAMs och optimal sgRNA längder. N = varje nukleotid (A, T, G, eller C); R = A- eller G; V = A, C eller G.

  1. Välj en lämplig spacer sekvens. Identifiera som unik en sekvens som möjligt för att minimera risken för off-target klyvning händelser, antingen genom att undersöka målet genomet med BLAST33 eller genom att använda flera fritt tillgängliga online-verktyg, som: (a) Program från Feng Zhangs laboratorium34 (http://crispr.mit.edu/); (b) CHOPCHOP35 (http://chopchop.cbu.uib.no/); (c) E-skarp36 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/); (d) CRISPOR37 (http://crispor.tefor.net/); (e) Cas-OFFinder38 (http://www.rgenome.net/cas-offinder/).
    Obs: Den optimala längden av mellanlägget kan variera från 17 till 25 nukleotider (nt) inkluderande, beroende på vilken Cas enzym som används (se tabell 1). För Cas9, mellanlägget är uppströms PAM, medan det för Cas12a, mellanlägget är nedströms den PAM. Dessutom, HDR effektivitet avtar snabbt med ökande avstånd från webbplatsen skär. Därför, för exakt DNA redigering, placera sgRNA så nära som möjligt till webbplatsen avsedd ändring.
  2. Syntetisera DNA oligonukleotider med lämpliga överhäng för CRISPR plasmiden som används.
    1. Lägga till en G-nukleotid framför mellanlägget om den första positionen av guide inte är en G. bestämma omvänd kompletterande sekvensen av mellanlägget. Lägg i nödvändigt överhäng för kloning ändamål.
      Obs: Ett exempel för de plasmider som används i vår utvärdering studie25, de oligonukleotider ska är synthesizeds visas i tabell 2. Använda exempel ges i figur 2 som en guide, om det behövs. Många CRISPR plasmider finns tillgängliga från kommersiella källor (t.ex. Addgene). Några av de mer populära plasmidsna ges i Tabell för material.
CRISPR Plasmid Sekvens
pSpCas9 och pSaCas9 Känsla: 5' - CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antisense: 3' - (C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'
pNmCas9 Känsla: 5' - CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antisense: 3' - (C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAC - 5'
pAsCas12a och pLbCas12a Känsla: 5' - AGATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'
Antisense: 3' - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA - 5'

Tabell 2: oligonukleotider krävs för kloning sgRNA sekvenser i CRISPR plasmider används i en senare utvärdering studera25. Överhäng är kursiv.

Figure 2
Figur 2 : Ett exempel som illustrerar hur du väljer mål platser och designa oligonukleotider för kloning i CRISPR plasmider. Det mål genomisk locus här är exon 45 av den mänskliga CACNA1D-genen. PAMs för SpCas9 och SaCas9 är NGG respektive NNGRRT och markeras i rött, medan PAM för AsCas12a och LbCas12a är TTTN och är markerade i grönt. Den röda horisontella stapeln visar protospacer för SpCas9 och SaCas9, medan den gröna vågräta fältet visar protospacer för de två Cas12a enzymerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. kloning av oligonukleotider i en ryggrad vektor

  1. Fosforylera och glödga förnuft och antisense oligonukleotider.
    1. Om oligonukleotider är frystorkade, omsuspendera dem till en 100 µM koncentration i tris-etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (TE buffert, se Tabell för material) eller ddH2O.
    2. Förbereda en 10 µL Reaktionsblandning innehållande 1 µL känsla oligonukleotiden, 1 µL antisense oligonukleotiden, 1 µL T4 DNA ligase buffert (10 x), 1 µL T4 polynucleotide kinase (PNK) och 6 µL av ddH2O. Mix väl pipettering och placera reaktionsblandning i en termisk cy Cler med följande parametrar: 37 ° C i 30 min, 95 ° C i 5 min och rampen ner till 25 ° C vid 6 ° C/min.
    3. Späd den reaktion mix 1: 100 i ddH2O (t.ex. 2 µL reaktionsblandning + 198 µL ddH2O).

Figure 3
Figur 3 : Ett exempel på en CRISPR plasmid. (en) A karta som anger olika viktiga funktioner i Plasmiden. Här driver EF-1a arrangören uttrycket av Cas9, medan U6 arrangören driver ett uttryck för sgRNA. Amp(R) indikerar en genen för ampicillin-resistens i Plasmiden. (b) sekvensen av ”BbsI-BplI kloning webbplatsen” i Plasmiden. Sekvensen erkännande av BbsI är GAAGAC och indikeras i rött, medan BplI erkännande är GAG-N5- CTC och indikeras i grönt. (c) Primers som kan användas för kolonin PCR för att kontrollera huruvida den sgRNA sekvensen har varit framgångsrikt klonade in Plasmiden. HU6_forward primer indikeras med en lila pil på plasmid kartan, medan den universella M13R(-20) primern indikeras med en rosa pil på plasmid kartan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Smälta CRISPR plasmiden med en lämplig restriktionsenzym.
    Obs: Kloning av sgRNAs vanligtvis lita på Golden Gate montering med typ IIs restriktionsenzym. Olika enzymer kan användas för olika CRISPR plasmider. För pSpCas9, använda BbsI eller BplI (se figur 3). För pSaCas9, pNmCas9, pAsCas12a och pLbCas12a, Använd BsmBI.
    1. Förbered en 20 µL Reaktionsblandning innehållande 1 µg av cirkulärt plasmid vektor, 2 µL buffert (10 x), 1 µL restriktionsenzym (t.ex. BbsI, BplI eller BsmBI) och ddH2O till en slutlig volym av 20 µL. Inkubera reaktionen vid 37 ° C för 2,5 h.
    2. Tillsätt 1 µL räkor alkaliskt fosfatas (SAP) i reaktionen, och inkubera vid 37 ° C för en annan 30 min.
    3. Släcka reaktionen genom att lägga till 5 µL 6 x DNA lastning dye (se Tabell för material), blanda väl, och lösa reaktionen på en 0,8% agarosgel med 1 x tris-acetat-EDTA (TAE) buffert. Sedan accis rätta bandet och vidare till gel rena linearized vektorn.
  2. Ligera av glödgad oligonukleotider till smält CRISPR Plasmiden.
    1. Förbereda en 10 µL reaktionsblandning: 50 ng av linearized vektor, 1 µL utspädda glödgad oligonukleotider, 1 µL T4 DNA-ligase buffert (10 x), 1 µL av T4 DNA-ligase och ddH2O till en slutlig volym av 10 µL (se Tabell för material). Inkubera reaktionen vid 16 ° C över natten eller i rumstemperatur i 2 h.
      Obs: För att påskynda processen ligatur, använda koncentrerad T4 DNA-ligase och inkubera reaktion mixen i rumstemperatur i 15 min (se Tabell för material).
  3. Omvandla sammanskrivna produkter till kemiskt behöriga E. coli celler (se kompletterande fil 1). Spridda omformade bakteriecellerna på en LB agarplatta med 100 µg/mL ampicillin.
  4. Utföra kolonin polymeraskedjereaktion (PCR) för att identifiera bakterier med infoga.
    1. Förbered två uppsättningar av sterila PCR-strip rören. I Set 1, tillsätt 4,7 µL ddH2O, medan i Set 2, tillsätt 50 µL av LB buljong med lämpligt antibiotikum (t.ex. 100 µg/mL ampicillin).
    2. Med en steril pipettspetsen, plocka en koloni av plattan, dra det kortfattat i en uppsättning 1 tub och lämna tipset i ett Set 2 rör. Upprepa för några kolonier, se till att använda olika PCR-rör varje gång.
      Obs: Screening fyra kolonier är vanligtvis tillräcklig. Detta kan dock variera beroende på kloningens effektivitet.
    3. Tillsätt följande reagenser i varje Set 1 rör (för en 10 µL PCR): 5 µL av 2 x PCR master mix (med lastning färgämne, se Tabell för material), 0,15 µL av förnuft eller antisense oligonukleotiden (100 µM), 0,15 µL av primer (100 µM) inriktning CRISPR plasmiden nedströms eller upp ström av sgRNA kassett respektive (se figur 3).
      Obs: PCR-produkten ska helst ge en Produktstorlek på ca 150 bp eller större, så att eventuella positiva band är inte misstas som primer dimerer.
    4. Kör i primärvården i en termocykel med följande parametrar: 95 ° C i 3 min, 95 ° C i 30 s (steg 2), 60 ° C under 30 s (steg 3), 72 ° C under 30 s (steg 4), upprepa steg 2\u20124 för en annan 34 cykler, 72 ° C under 5 min , och håll vid 4 ° C.
      Obs: Glödgning temperaturen 60 ° c kan behöva optimeras för primers utformad. Töjning tiden 30 s kan också variera beroende på den förväntade PCR-amplikon storleken och den DNA-polymeras används.
    5. Lösa reaktionerna på en 1% agarosgel med 1 x TAE buffert.
    6. Inokulera en koloni som ger en positiv band i PCR genom att överföra 50 µL av dess kultur från motsvarande Set 2 röret i ett större koniska rör innehållande 5 mL LB med lämplig antibiotika. Låt kulturen växa över natten i en 37 ° C inkubator-shaker.
    7. Isolera plasmider från övernattning kultur med en miniprep kit (se Tabell av material) och sekvens provet med kolonin PCR primer som inte är den känsla eller antisense oligonukleotiden (hU6_forward eller M13R(-20) i figur 3).
      Obs: Om nödvändigt, utföra en maxiprep av sekvens-verifierade CRISPR plasmiden att erhålla ett större belopp för nedströms experiment.

3. design och syntes av reparation mallar

Obs: För genomet finmekanik, en mall som anger de önskade DNA ändringarna behöver tillhandahållas tillsammans med CRISPR reagenserna. För små DNA redigeringar som förändring av en enda nukleotid är ssODN givare mallar mest lämplig (se avsnitt 3.1). För större DNA redigeringar såsom införandet av en god Jordbrukarsed tagga 5' eller 3' av en särskild gen för protein-kodning, plasmid givare mallar är mest lämplig (se avsnitt 3.2).

  1. Designa och syntetisera en ssODN givare mall (se figur 4).
    1. Bestämma rätt strand vars sekvens mallen bör följa.
      Obs: Cas12a uppvisar en förkärlek för ssODNs av icke-målarter strand sekvensen, medan Cas9 uppvisar en preferens för ssODNs inom målet del sekvens istället25 (se figur 4en).
    2. Se till att den reparerade sekvensen inte targetable av den valda Cas nuclease igen. Till exempel mutera PAM på ett sådant sätt att det inte finns någon aminosyra förändring eller eliminera PAM från mallen givaren om den har ingen funktionell betydelse. Använda exempel ges i figur 4b som en guide, om det behövs.
    3. Besluta om en symmetrisk eller asymmetrisk givare mall önskas. För symmetriska givare, se till att varje homologi arm flankerande webbplatsen DNA modifiering är minst 17 nt lång25. För asymmetrisk givare mallar, använda längre armar 5′ av DNA ändringarna (se figur 4en). Viktigast, se till att den kortare arm omkring 37 nt i längd, medan den andra homologi-armen är cirka 77 nt i längd25,39.
    4. Syntetisera mallen utformad som en bit av enkelsträngat DNA.
      Obs: Asymmetrisk ssODNs kan, men inte alltid, uppvisar högre HDR effektivitet än symmetrisk ssODNs. I allmänhet utför en asymmetrisk donator normalt minst samt en symmetrisk givare, när utformats korrekt. Men kostar mallen asymmetrisk mycket mer eftersom den är längre och därmed kräver Polyakrylamidgelen elektrofores (sidan) rening eller speciella syntes förfarande. Rutinmässiga gen knockouts oftast lita på NHEJ reparera vägen och kräver inte en reparation mall. Om knockout effektivitet är låg, utforma en ssODN givare mall som innehåller en frameshift mutation och är minst 120 nt i längd25,40.

Figure 4
Figur 4 : Design av ssODN givare mallar. (en) Schematisk bild som illustrerar olika möjliga mönster. De röda vågräta rektanglarna visar det målarter (NT) strand, medan de blå rektanglarna ange mål (T) strand. Dessutom visar små gröna rektanglarna de önskade DNA-ändringarna (till exempel enda nukleotid ändringar). När en symmetrisk ssODN används, minsta längd varje homologi arm bör vara minst 17 nt (men kan vara längre). För asymmetrisk ssODNs verkar den 37/77 T ssODN vara optimalt för SpCas9-inducerad HDR, medan de 77/37 NT ssODN verkar vara optimal för Cas12a-inducerad HDR. L = vänster homologi arm; R = rätt homologi arm. (b) ett konkret exempel för att visa hur att utforma ssODN mallar. Här är det mål genomisk locus exon 45 i den mänskliga CACNA1D-genen. PAM för Cas9 är rosa och understrukna, medan PAM för Cas12a är brun och understruken. Målet är att skapa en missense mutation (markerade i grönt) genom att konvertera AGU (kodning serin) att AGG (kodning arginin). För att förhindra Omriktning av Cas12a, är TTTC PAM muterad till CTTC. Observera att det finns ingen förändring i aminosyra (för UAU- och UAC-både kod för tyrosin). För att ytterligare förhindra Omriktning av Cas9, en AGU kodon ersätts med en UCC codon (bold), både som kod för serine. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Design och klona en lämplig plasmid givare mall. Det kan till exempel, innehålla en god Jordbrukarsed sekvens flankerad av långa armar som är homolog till det mål genomisk locus (se figur 5).
    1. Se till att den modifierade sekvensen inte targetable av den valda Cas nuclease igen. Protospacer kan exempelvis delas med taggen infogade (GFP). Alternativt, PAM kan vara muterade eller tagits bort från mallen givare på ett sådant sätt som inte påverkar geners funktion.
    2. Förstärka homologi armarna från genomiskt DNA med PCR. Längden på varje homologi arm är vanligtvis 1000 till 1500 bp.
      Obs: För att underlätta kloning, säkerställa att framåt primern för vänster homologi armen och reverse primer för den rätt homologi arm varje har minst 20 nt överlappande sekvens med en valda vektor ryggrad. Dessutom säkerställa att reverse primer i vänster homologi-armen och framåt primer för rätt homologi armen har vissa överlappande sekvenser med epitop etiketten samt.
    3. Klona två homologi armarna och taggen (GFP) in vektor ryggraden med Gibson montering41 (se Tabell för material). Verifierar plasmiden av Sanger sekvensering med framåt och bakåt primers som är uppströms och nedströms av mallen givare respektive.
      Obs: Sanger sekvensering finns allmänt och billigt som en kommersiell tjänst. Skicka en alikvot av Plasmiden tillsammans med sekvensering primers till en tjänsteleverantör.
    4. Linjär mallen givare med ett restriktionsenzym som skär plasmiden endast en gång antingen uppströms den vänstra homologi arm eller nedströms den rätt homologi arm.
      Obs: Nyligen, en dubbel-cut givare, som flankeras av de sgRNA-PAM sekvenserna och frisätts från plasmiden efter klyvning av den motsvarande Cas nuclease, har visat sig öka HDR effektivitet42. När sgRNA-PAM sekvenser infogas uppströms och nedströms i vänster och höger homologi armar respektive (till exempel genom Gibson församlingen), homologi armlängd kan sänkas till 300 bp och det finns ingen anledning att linjär Plasmiden.

Figure 5
Figur 5 : Design och kloning av en plasmid givare mall. (en) målet i detta exempel är att säkring P2A-GFP till C-terminus av proteinet CLTA. Den blå horisontella rektangeln visar den vänstra homologi arm, medan den röda horisontella rektangeln visar rätt homologi armen. Stora bokstäver indikerar protein-kodande sekvenser, medan små bokstäver indikerar icke-kodande sekvenser. PAMs för SpCas9 och Cas12a är kursiv och understruken. (b), plasmid givare mall som kan användas för att tagga endogenously P2A-GFP på C-terminus av CLTA. Den medföljande primer sekvenser kan användas att klona plasmiden av Gibson församling. PCR-villkoren är följande: 98 ° C för 3 min, 98 ° C i 30 s (steg 2), 63 ° C för 30 s (steg 3), 72 ° C i 1 min (steg 4), upprepa steg 2\u20124 för en annan 34 cykler, 72 ° C under 3 min, och håll vid 4 ° C. Svart bokstäverna motsvarar vektorn sekvenser, blå bokstäverna motsvarar vänster homologi armen, gröna bokstäverna motsvarar P2A-GFP och röda bokstäverna motsvarar rätt homologi armen. Observera att när sekvensen kodning P2A-GFP är framgångsrikt integrerat i det mål locus, Omriktning av SpCas9 inte blir möjligt, eftersom endast 9 nt av dess protospacer (GTGCACCAG) kommer att lämnas intakt. Dessutom för att förhindra Omriktning av Cas12a, tre basepairs omedelbart nedströms STOPPET codon (i fetstil) tas bort från plasmiden sekvensen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. cell transfection

Obs: De resterande delarna av protokollet skrivs med HEK293T celler i åtanke. De odlingssubstrat som används består av Dulbecco modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 4,5 g/L glukos, 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin och 0,1% penicillin/streptomycin. Olika stegen i protokollet kan behöva modifieras enligt den faktiska cell linje används. Alla cell kulturarbete sker i ett klass II biosäkerhet skåp att säkerställa en steril miljö.

  1. Utsäde 1,8 x 105 celler i en 24-väl vävnadsodling platta en dag före transfection.
    1. Separera celler genom aspirera media och sedan lägga 150 µL 0,25% Trypsin-EDTA per brunn. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 2 min.
    2. Neutralisera trypsin genom att lägga till 150 µL (eller 1 x volym) av cellen kultur media. Överföra cellsuspensionen till ett koniskt rör. Snurra ner cellerna i en bänk topp Centrifugera vid 1000 x g under 5 minuter.
    3. Aspirera supernatanten och återsuspendera med 5 mL cell kultur media. I ett separat centrifugrör, alikvotens 10 µL 0,4% trypan blå lösning. Lägg i 10 µL resuspended celler från steg 4.1.2 sedan och blanda väl.
    4. Pipettera 10 µL blandningen (celler + trypan blå) i en hemocytometer. Fortsätt att räkna cellerna manuellt eller med hjälp av en automatiserad cell räknare.
    5. Utsäde 1,8 x 105 celler i en brunn 24-väl vävnadsodling platta.
  2. Förbereda en transfection blandning innehållande antingen 500 ng av CRISPR plasmid (för NHEJ-medierad redigering) eller 300 ng av CRISPR plasmid och 300 ng för givare mall (för HDR-medierad redigering), enligt instruktionerna som medföljer transfection reagens (se En tabell av). Odla i rumstemperatur under Rekommenderad tid (vanligtvis runt 10\u201220 min).
  3. Lägg transfection mixen till celler i en droppvis mode och snurra försiktigt plattan efter.
  4. Inkubera vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 luft inkubator för 24 h (för NHEJ-baserade experiment) eller 72 h (för HDR-baserade experiment).

5. fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) transfekterade celler

  1. Separera celler genom aspirera media och sedan lägga 150 µL av 0,25% trypsin-EDTA per brunn. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 2 min.
  2. Neutralisera trypsin genom att lägga till 150 µL (eller 1 x volym) av cellen kultur media. Överföra cellsuspensionen till ett centrifugrör. Snurra ner cellerna i en mikrocentrifug vid 235 x g i 5 min.
  3. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna med 2% fetalt bovint serum (FBS) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Filtrera cellerna genom en 30 µm mesh eller cell sil i en 5 mL FACS tub.
  4. Förbereda en annan centrifugrör med cirka 100 µL kulturmassmedia eller 2% FBS i PBS för samling celler.
  5. På flödescytometer, utfärda utegångsförbud för cellerna med icke-transfekterade celler som en negativ kontroll. Sortera och samla de transfekterade cellerna, enligt vilken fluorescens markör finns på CRISPR plasmiden används. Till exempel om plasmiden bär en mCherry gen, sortera för RFP-positiva celler.
    Obs: Olika CRISPR plasmider har olika valbara markörer. Uppsättningen plasmider (pSpCas9, pSaCas9, pNmCas9, pAsCpf1 och pLbCpf1) som används i denna utvärderingsstudie bär antingen orange fluorescerande proteinet (OFP) eller den mCherry genen.

6. expansion av enskilda kloner

  1. Centrifugera sorterade cellerna i en bänk topp centrifug med maximal hastighet (18.000 x g) för 5 min. aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten med 300 µL kultur media. Utsäde 200 µL celler i en 24-väl vävnadsodling plattan och låta dem återhämta sig ett par dagar i en 37 ° C inkubator. Hålla de resterande 100 µL cellerna för avsnitt 7.
  2. När cellerna börjar bli konfluenta, passage dem enligt steg 4.1.1\u20124.1.3. Utsäde cellerna glest i en 100 mm vävnadsodling maträtt att ha tillräckligt utrymme för enskilda kolonier att växa. Inkubera vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 luft inkubator.
    Obs: Prova olika spädningar. Enstaka celler behöver tillräckligt med utrymme att växa som enskilda kolonier. Men de kan inte heller alltför glesa, som vissa cellinjer inte växer bra när antalet celler är alltför få.
  3. När kolonierna börjar bilda, plocka dem under mikroskopet (med en 4 x förstoring) och placera varje klon i en enskild brunn 24-well platta som innehåller cell kulturmassmedia. Inkubera vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 luft inkubator tills cellerna blir konfluenta.
    Obs: Ett alternativ till seriespädningar och kolonin plockning är att använda flödescytometri för att sortera för enstaka celler i en plattan med 96 brunnar. Detta fungerar dock inte för vissa cellinjer som inte växer väl när endast en cell är närvarande.

7. utvärdering av redigering effektivitet

  1. Extrahera genomiskt DNA genom centrifugering återstående 100 µL sorterade cellerna (från steg 6.1) i en bänk topp centrifug med maximal hastighet (18.000 x g) för 5 min. aspirera supernatanten och fortsätta att isolera genomiskt DNA med en utvinning kit (se tabellen Material).
  2. Utföra den T7 Amiiiiin jag (T7EI) klyvning assay (se figur 6).
    1. Ställa in en 50 μL PCR som innehåller 10 µL av PCR-reaktionen buffert (5 x), 1 µL dNTP mix (10 mM), 2,5 µL av användardefinierade framåt primer (10 µM), 2,5 µL av användardefinierade reverse primer (10 µM), 0,5 µL av DNA-polymeras, 2\u20125 µL av genomisk DNA mall (beroende på hur många celler har varit sorterade), sedan topp upp till 50 µL med ddH2O (se Tabell för material).
      Obs: Primers är utformade för att flank i målet genomisk locus och avkastning en PCR produkt av runt 400\u2012700 bp. vanligtvis en primer är placerad närmare till webbplatsen skära av enzymet Cas än den andra primern, så att resultatet av T7EI analysen är två distinkta band på en ag uppstod gel (se figur 6).
    2. Köra PCR i en termocykel med följande parametrar: 98 ° C för 3 min, 98 ° C i 30 s (steg 2), 63 ° C för 30 s (steg 3), 72 ° C under 30 s (steg 4), upprepa steg 2\u20124 för en annan 34 cykler, 72 ° C under 2 min , och håll vid 4 ° C.
    3. Lösa reaktionen på en 2% agarosgel med 1 x TAE buffert.
    4. Punktskatt PCR-produkten från gelen med en ren, skarp skalpell och rena DNA använder en gel utvinning kit, enligt tillverkarens instruktioner. Mätning av koncentrationen av PCR-produkten med en spektrofotometer vid en våglängd på 260 nm absorbans (se Tabell för material).
    5. Förbereda en assay blandning innehållande 200 ng DNA, 2 µL av T7EI reaktion buffert (10 x), och toppade upp till 19 µL med ddH2O (se Tabell för material).
    6. Re glödga PCR-produkten i en termocykel med följande parametrar: 95 ° C i 5 min, ramp ner till 25 ° C på 6 ° C/min, håll sedan vid 4 ° C.
    7. Lägg 5 U T7EI till nytt glödgad PCR-produkten, blanda väl genom pipettering och inkubera vid 37 ° C i 50 min.
    8. Lösa T7EI-rötas DNA på en 2,5% agarosgel med 1 x TAE buffert.
    9. Bild gelen, kvantifiera de band stödnivåer använder ImageJ och beräkna ditsatta bildning hjälp av följande formel:
      Equation 1
      där en representerar intensiteten av intakt PCR-produkten och b och c motsvarar den klyvning produkter43stödnivåerna.
      1. För att kvantifiera intensiteten i ett band i ImageJ, först Rita en rektangulär ruta runt bandet som nära dess gränslinje som möjligt. För det andra, klicka på analysera och sedan Ange mätningar. Säkerställa att alternativen , grå medelvärdeoch integrerad täthet kontrolleras. Avsluta inställningsfönstret genom att klicka på ok. Tredje, klicka på analysera och sedan mäta. Det menar eller RawIntDen värde används som bandet intensiteten.

Figure 6
Figur 6 : Kontrollera celler för framgångsrika genomet redigering utfall. (en) A Schematisk illustrerar två vanligen används analyser, nämligen mismatch klyvning assay med den T7 Amiiiiin jag (T7EI) enzym och nästa generations sekvensering (NGS) eller riktade amplikon sekvensering. De blå vågräta rektanglarna visar DNA och gula cirklar indikerar ändringar inducerad av CRISPR-Cas systemet. Primers för T7E1 analysen betecknas i grönt, medan primers för att generera amplikoner för NGS markeras i rött. (b), Design av primer sekvenser för T7EI klyvning analysen och för NGS. Här är det mål genomisk locus exon 45 i den mänskliga CACNA1D-genen. Webbplatsen för avsedd ändring är anges av en asterisk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Utföra riktade amplikon sekvensering (se figur 6).
    1. Design PCR primers att förstärka det mål genomisk locus. Placera en av primers vara mindre än 100 bp men mer än 20 bp från protospacer.
      Obs: Vanligtvis den totala storleken för PCR-produkt är konstruerad att vara runt 150\u2012300 bp (se figur 6).
    2. Lägg till ytterligare sekvenser till primers enligt följande: (a) 5' \u2012GCGTTATCGAGGTC - NNNN-[framåt Primer] – 3'; (b) 5' - GTGCTCTTCCGATCT-[Reverse Primer] – 3 '.
    3. Ställa in en 50 µL PCR-reaktionsblandning innehållande 10 µL av PCR-reaktionen buffert (5 x), 1 µL dNTP (10 mM), 5 µL primer en (10 µM), 5 µL primer b (10 µM), 0,5 µL DNA-polymeras, 2\u20125 µL genomisk DNA-mall (beroende på hur många celler har sorterats) , sedan början upp till 50 µL med ddH20.
    4. Köra PCR i en termocykel med följande parametrar: 98 ° C för 3 min, 98 ° C i 30 s (steg 2), 63 ° C för 30 s (steg 3), 72 ° C under 15 s (steg 4), upprepa steg 2\u20124 för en annan 34 cykler, 72 ° C under 2 min , och håll vid 4 ° C.
    5. Lösa reaktionen på 2% agarosgel och rena PCR-produkten med en gel utvinning kit enligt tillverkarens anvisningar. Kvantifiera DNA med en spektrofotometer vid en våglängd på 260 nm absorbans (se Tabell för material).
    6. Syntetisera följande runda 2 PCR primers: (c) 5' \u2012 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC – 3'; (d) 5' \u2012CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[streckkod] - GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
    7. Ställ in en 20 µL PCR-reaktion blanda innehållande 4 µL av PCR-reaktionen buffert (5 x), 0,4 µL av dNTP (10 mM), 2 µL av primer c (10 µM), 2 µL av primer d (10 µM), 0,2 µL av DNA-polymeras, 2 µL av DNA mall (från steg 7.3.5 efter utspädning 1: 100), och 9,4 µL av ddH2O.
      Obs: Utspädningsfaktorn för mallen DNA kan variera beroende på dess ursprungliga koncentration. Om koncentrationen är runt 20\u201240 ng/µL, Använd en utspädningsfaktor 1: 100. Dessutom plocka en annan streckkod för varje experimental prov, om samma primer en och primer b används i steg 7.3.3.
    8. Köra PCR i en termocykel med följande parametrar: 98 ° C för 3 min, 98 ° C i 30 s (steg 2), 65 ° C i 30 s (steg 3), 72 ° C under 30 s (steg 4), upprepa steg 2\u20124 för en annan 14 cykler, 72 ° C under 2 min , och 4 ° C håller.
    9. Lösa 5 µL av varje reaktion på en 2% agarosgel att avgöra framgången för primärvården. kombinera alla prover tillsammans (förutsatt att en annan streckkod har använts för varje prov) och städa upp den poolade DNA med hjälp av en PCR-rening kit enligt tillverkarens instruktioner. Om några av primärvården uppvisar mer än ett band (indikerar förekomsten av icke-specifika produkter), utföra en ytterligare gel utvinning steg.
    10. Sekvensera biblioteket på en hög genomströmning sekvensering instrumentet (se Tabell för material) enligt tillverkarens instruktioner för att producera Parade 151 bp läsningar. Läs 1 sekvensering primer är specialdesignade och måste tillhandahållas separat. Dess sekvens är följande: Read1_seq: 5' – CCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC – 3'. Den Läs 2 sekvensering primer och index sekvensering primer är standard och finns i reagens patronen.
      Obs: Den T7EI analysen och riktade amplikon sekvensering används ofta kontrollera effektiviteten av gen editering. Andra experiment kan dock utföras för att utvärdera redigering effektivitet, beroende på vilken typ av DNA-ändringar som införts. Exempelvis om en begränsning-webbplats skapas på målwebbplatsen, kan en begränsning fragment längd polymorfism (RFLP) analysen utföras. Det är liknande till T7EI analysen förutom att en begränsning Amiiiiin används för att smälta PCR-produkten istället.

8. screening av enskilda kloner

  1. Från steg 6.3, dela celler när de börjar komma konfluenta. För varje enskild klon, samla återstående cellerna och extrahera genomiskt DNA enligt steg 7,1.
  2. Utföra T7EI analysen för alla enskilda kloner enligt avsnitt 7.2, med undantag för en ändring. Förstärk det mål genomisk locus från vildtyp celler och i steg 7.2.5, istället för att använda 200 ng test DNA endast, mix 100 ng DNA test med 100 ng av vildtyp DNA.
    Obs: Orsaken till det ändrade steget är att vissa kloner kan ha genomgått lyckad biallelic konvertering och är homozygot mutanter. I sådana fall finns ingen klyvning band i T7EI analysen om vildtyp DNA inte blandas i.
  3. Sekvens målplatsen i klonerna som uppvisar klyvning band i T7EI analys.
    1. Förstärka den modifierade genomisk locus enligt steg 7.2.1–7.2.4.
    2. Ställ in följande kloning reaktion: 4 µL av PCR-produkten, 1 µL av saltlösning, 1 µL TOPO vektor (se Tabell för material).
    3. Blanda försiktigt genom pipettering och odla i rumstemperatur minst 5 minuter.
    4. Omvandla 3 µL av reaktionsblandning till kemiskt behöriga E. coli celler (såsom TOP10 eller Stbl3) (se kompletterande fil 1). Spridda omformade bakteriecellerna på en LB agarplatta med 50 μg/mL kanamycin.
    5. Nästa dag, Inokulera minst 10 kolonier i LB flytande media som innehåller 50 μg/mL kanamycin.
    6. När bakteriekulturerna är grumligt, isolera de plasmider som använder en miniprep kit (se Tabell av material) och sekvens dem med hjälp av standard M13 framåt eller M13 reverse primer.
  4. Utföra en western blot (kallas också immunoblot) för att bestämma frånvaron eller närvaron av proteinet riktade (om genomet redigering experiment innebär knackar ut en protein-kodning gen via frameshift mutationer). Se kompletterande fil 1.
    Obs: Andra experiment kan utföras för att identifiera den klon som transporterar de önska genomisk ändringarna. Exempelvis kan en fenotypisk analysen utföras om knackar ut en särskild gen är känt för att orsaka vissa förändringar i cellulära beteende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Att utföra en genomet redigering experiment, en CRISPR plasmid uttrycker en sgRNA inriktning i locus-of-intresse behöver klonas. Först rötas plasmiden med ett restriktionsenzym (vanligtvis en typ IIs enzym) till linjär det. Det rekommenderas att lösa den smälta produkten på en 1% agarosgel tillsammans med en osmält plasmiden att skilja mellan en fullständig och partiell matsmältning. Osmält plasmider är supercoiled, tenderar de att köra snabbare än motsvarigheterna linearized (se figur 7en). Andra, två oligonukleotider för sgRNA måste glödgas och sammanskrivna i skurna Plasmiden. För att avgöra om oligonukleotider har varit framgångsrikt klonade in CRISPR plasmid ryggraden, koloni PCR utförs (se figur 7b). Positiva kloner inokuleras sedan innan plasmidsna extraheras och skickas för Sanger sekvensering.

Figure 7
Figur 7 : Kloning av sgRNA-uttryckande CRISPR plasmider. (en) bilden visar rötas och osmält plasmider efter gelelektrofores. Lanes 1\u20123 Visa plasmider som har varit linearized helt av BbsI. Lane 4 visar den ursprungliga osmält plasmid, som är supercoiled och därmed migrerar snabbare på en agarosgel. (b), representativa gel bild av kolonin PCR-produkter. Positiva kloner är markerade med en grön bock (indikerar att oligonukleotider har varit framgångsrikt sammanskrivna i vektor ryggraden), medan negativa kloner markeras med ett rött kors. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

När konstruktioner har varit sekvens-verifierade, kan de vara sensorik till en önskad cell linje (t.ex. HEK293T). CRISPR plasmider bär ofta en valbar markör (t.ex. en mCherry-gen), vilket innebär att framgångsrikt sensorik celler ska väljas. Fluorescens kan lätt visualiseras i Mikroskop vid framgångsrik leverans av plasmidsna (se figur 8en). Cellerna är sorterade efter flödescytometri runt 24\u201272 h efter transfection. Den gating är ställa baserat på en icke-transfekterade kontroll (se figur 8b). En del av sorterade cellerna är seedade på en vävnadskultur tallrik för återhämtning.

Figure 8
Figur 8 : Införandet av CRISPR reagenser i mänskliga celler. (en) representant mikroskopi bild av HEK293T celler framgångsrikt transfekterade med en CRISPR plasmiden bär en mCherry markör (se Tabell för material). Transfection effektivitet kan uppskattas av andelen celler visar röd fluorescens. 10 x förstoring, skalstapeln representerar 200 µm. (b) representativa FACS tomter. Transfekterade celler (höger panel) är gated mot en icke-transfekterade kontroll (till vänster). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Medan sorterade cellerna återställer, utvärderas redigering effektivitet för att avgöra om experimentet bör fortsättas. Genomiskt DNA (gDNA) är isolerat från de återstående un cellerna. En T7EI analys utförs för att kontrollera klyvning effektivitet, som beräknas från stödnivåerna som de band som observerats på en agaros gel (se figur 9en). Dessutom, om ett HDR-baserade experiment är utformad för att inkorporera en begränsning webbplats på det mål locus, en RFLP-analysen kan utföras med enzymet motsvarande begränsning (se figur 9b).

Figure 9
Figur 9 : Utvärdera omfattningen av gen editering. (en) representativa gel bild visar resultaten av en T7E1 analys. Lanes 1\u20128 representerar olika experimentella prover. För varje prov anger det övre bandet uncut DNA, medan de nedre två banden indikerar sönderdelningsprodukterna. Varierande NHEJ effektivitetsvinster kan observeras bland proverna. Rötning av PCR-amplikoner från icke-transfekterade celler används som en negativ kontroll och är markerad med ett ”-”. (b), representativa gel bild visar resultaten av en RFLP-analysen. Lanes 1\u20126 representerar olika experimentella prover. För varje prov anger det övre bandet uncut DNA, medan de nedre två banden indikerar sönderdelningsprodukterna efter begränsning digest. Varierande HDR effektivitetsvinster kan observeras bland proverna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Om redigering effektivitet är acceptabel (t.ex. minst 5% av T7EI assay), vi fortsätter att identifiera enskilda kloner som bär de önskade DNA-ändringarna. Guldpläterade celler, som har kvar att återhämta sig, är seedade glest för att möjliggöra för enskilda kolonier att växa. Därefter plockas enskilda kolonier och expanderade, innan gDNA är isolerad från dessa enskilda kloner. Ytterligare en runda av T7EI assay utförs för att identifiera kloner med modifierad DNA på målwebbplatsen. TOPO kloning och Sanger sekvensering utförs sedan för att fastställa den exakta sekvenser av alla alleler. Idealiskt, för genen knockouts, indels bör inte i multiplar av tre, som inte orsakar frameshift mutationer (se figur 10en). Ytterligare validera att en protein-kodning gen har varit framgångsrikt inaktiverade, en western blot kan utföras för att säkerställa att inga riktade protein är närvarande (se figur 10b).

Figure 10
Figur 10 : Screening för genen knockouts. (en) representant Sanger sekvensering data. Den ursprungliga omodifierade DNA-sekvensen (översta raden) kan justeras med sekvensering resultatet fick (nedersta raden) att kontrollera om några ändringar har skett. Här finns en 1 bp infogning och en 7 bp borttagning på målwebbplatsen (som skildras av rutorna Röd, som representerar luckor i justeringen). (b) representant western blot bild. Här, screenas flera kloner (utökad från enstaka celler) för förekomst eller frånvaro av proteinet GLUL. De röda pilarna visar klonerna där den GLUL genen har varit framgångsrikt utslagen. ”WT” står för vildtyp celler, där GLUL uttrycks mycket. ACTB (β-aktin) fungerar som en lastning kontroll (se Tabell för material). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CRISPR-Cas systemet är en kraftfull, revolutionerande teknik till ingenjör i arvsmassan och transcriptomes av växter och djur. Många bakteriearter har befunnits innehålla CRISPR-Cas system, som kan potentiellt anpassas för genomet och transkriptom engineering ändamål44. Även om den Cas9 Amiiiiin från Streptococcus pyogenes (SpCas9) var det första enzymet distribueras framgångsrikt i mänskliga celler21,22,23,24, enzymer från andra bakteriella arter, inklusive de som visas i tabell 1, har också visat sig fungera väl som tekniska verktyg i mänskliga16,26,27,28. Följaktligen, forskare angelägen om att använda tekniken är ofta osäker på vilket system man väljer för sitt arbete och hur man utformar sina experiment för optimalt resultat.

Här försöker vi hjälpa CRISPR-användare att maximera sin användning av tekniken. Grundläggande för alla genomet redigering experiment är valet och kloning av en lämplig sgRNA för inriktning. Arbete som utförs av oss och andra avslöja att olika CRISPR-Cas system är optimalt aktiva på olika spacer längder (se tabell 1)25. Forskaren bör dessutom välja vilket system att använda baserat på kunskap om målwebbplatsen. Generellt, bland de enzymer som testas i vår utvärdering undersökning, SpCas9 och LbCas12a uppvisar högsta klyvning effektivitet, särskilt i mer högt uttryckt gener förmodligen till följd av mer öppna och tillgängliga kromatin. Därför rekommenderar vi att dessa två enzymer för rutinmässig genomet redigering experiment. Vi har dock funnit att båda nukleaser uppvisar högre tolerans för avvikelser mellan sgRNA och riktade DNA än AsCas12a. Om forskaren riktar en gen med flera närbesläktade homologs eller en upprepande region av genomet, rekommenderar vi därför med AsCas12a för att minimera off-target effekter. Alternativt kan SaCas9 också användas eftersom det kräver längre spacer längder för robust aktivitet, därmed kan erbjuda högre inneboende specificitet än SpCas9 och LbCas12a.

Exakt redigering av en genomisk locus kräver införandet av en reparation mall tillsammans med CRISPR reagenserna. Mallen fungerar som en bruksanvisning att berätta cellerna reparera dubbelsträngat avbrottet via den HDR-vägen. Två vanliga former av mall är en ssODN och en plasmid. Utformningen av denna reparation mall är ett kritiskt steg för optimal HDR effektivitet25,39,42,45,46,47. SsODNs är av DNA-strängen som sekvensen av ssODN härleds viktigt. AsCas12a och LbCas12a uppvisar en förkärlek för ssODNs av icke-målarter strand sekvensen, medan SpCas9 uppvisar en förkärlek för ssODNs av målet strand sekvensen istället. Dessutom HDR effektivitetsvinster potentiellt kan förbättras ytterligare genom att utnyttja asymmetrisk givare. Forskaren har dock vara försiktig med vilka homologi arm är utsträckt (se figur 2). Öka längden på fel arm kommer hamna förnedrande HDR effektiviteten i stället. Givare av Plasmiden är mallen ofta linearized av begränsning digest innan cellen transduktion. Dessutom har en ”dubbel-cut” plasmid givare, där spacer-PAM sekvenser placeras före och efter vänster och höger homologi armarna respektive, visat sig ge en högre HDR effektivitet än en plasmid givare utan ytterligare spacer-PAM sekvenser 42.

Förutom utarbetandet av de nödvändiga CRISPR reagenserna med eller utan en reparation mall innebär generation av modifierade cellinjer (t.ex. innehållande specifik gen knockouts) också cell transduktion, enda cell expansion och screening av enskilda kloner. Protokollet beskrivs alla efterföljande steg om du vill aktivera användare att utföra en fullständig arvsmassa redigering experiment. Vissa detaljer är cell linjespecifika. Till exempel kan vissa cellinjer vara lätt att transfect, medan andra kan kräva omfattande optimering med olika transduktion metoder, inklusive nucleofection och elektroporation. Allt från våra erfarenheter är ett avgörande steg i protokollet encelliga kloning. Vissa celltyper kan inte föröka sig när de är seedade som en enskild cell i en brunn, kanske på grund av utsöndrade tillväxtfaktorer. Till exempel mänskliga embryonala stamceller och många patientderiverade primära cellinjer vanligtvis växer mycket dåligt som isolerade enstaka celler. Efter transduktion rekommenderar vi därför plätering celler glest och sedan plocka enskilda kolonier på en tallrik med hjälp av flödescytometri för att sortera enstaka celler i olika brunnar i en plattan med 96 brunnar. Det kan också finnas ett behov av att lägga till Pro överlevnad faktorer till cell kultur media, till exempel på ROCK hämmare48, för att förbättra återvinningen av dissocierade celler. Dessutom under processen för encelliga kloning, kan det finnas tillfällen där två separata celler växa mycket nära varandra och till slut sammanslagning, vilket ger en koloni bara falskt utseende. I sådana situationer kan i skede av fastställandet genomisk mutationerna infördes, en sluta identifiera tre eller fler olika alleler. Det är dock fortfarande möjligt att återställa enskilda kloner av glest plätering dessa celler igen och sedan plocka ytterligare enskilda kolonier.

Avslutningsvis revolutionerar den CRISPR-Cas-tekniken biomedicinsk och bioteknisk forskning. Det lider dock för närvarande flera begränsningar (till exempel begränsad inriktning utbud och stor protein storlek) som hämmar dess utbrett införande i vissa applikationer, inklusive genterapi. Men allteftersom tiden går, mer naturligt förekommande enzymer som Cas kommer att upptäckas i ett brett utbud av mikrobiell art och några av dessa nya enzymer kan ha fördelaktiga egenskaper över befintliga nukleaser. Detaljerade studier kommer då behöva utföras för att ordentligt förstå parametrarna design av dessa roman CRISPR-Cas system när de distribueras som genomet och transkriptom tekniska verktyg. Medan våra protokoll fungerar som en bra referens för nuvarande genomet redigering ansträngningar, måste det därför uppdateras kontinuerligt med senaste informationen om de nya systemen som de dyker upp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inte konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

M.H.T. stöds av en byrå för vetenskap, teknologi och forsknings gemensamma rådet Office grant (1431AFG103), en National Medical Research Council bevilja (OFIRG-0017-2016), National Research Foundation bidrag (NRF2013-THE001-046 och NRF2013-THE001-093), en Ministeriet för utbildning Tier 1 grant (RG50/17 (S)), en start bevilja från Nanyang Technological University, och medel för internationella genetiskt Engineering maskin (iGEM) konkurrensen från Nanyang Technological University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 Polynucleotide Kinase (PNK) NEB M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) NEB M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X 1st Base BUF-3000-50X4L Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X 1st Base BUF-3020-10X4L Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA. 
BbsI NEB R0539
BsmBI NEB R0580
T4 DNA Ligase NEB M0202 400,000 units/ml
Quick Ligation Kit NEB M2200 An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit Thermo Scientific K1423 An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit Thermo Scientific 451245 The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli Thermo Scientific C737303
LB Broth (Lennox), powder Sigma Aldrich L3022 Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder Sigma Aldrich L2897 Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
SOC media - - 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Biotechnology A-301
REDiant 2X PCR Mastermix 1st Base BIO-5185
Agarose 1st Base BIO-1000
T7 Endonuclease I NEB M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit Favorgen FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Hyclone SH30081.01 4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM Gibco 25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL Gibco 15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X Gibco 25200
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160 FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X Gibco 20012
jetPRIME transfection reagent Polyplus Transfection 114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0 Epicentre LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit Bioline BIO-52067 An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix NEB N0447
6X DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3 Merck 539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm Bio-Rad 1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X Bio-Rad 1610772 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X 1st base BUF-2020 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution Sigma Aldrich P7170
TBS, 20X 1st base BUF-3030 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
Skim Milk for immunoassay Nacalai Tesque 31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP Advansta K12043
Antibody for β-actin (C4) Santa Cruz Biotechnology sc-47778 Lot number: C0916
MiSeq system Illumina SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000
Qubit fluorometer Thermo Scientific Q33226
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Scientific AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA Addgene 61591 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7 Addgene 108379 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 Addgene 42230 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9 Addgene 41815 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1) Addgene 71814 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1) Addgene 72247 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
  2. Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
  3. Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
  4. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  5. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  6. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
  7. Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
  8. Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
  9. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
  10. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
  14. Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
  15. Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888 (2012).
  16. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  17. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  18. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  19. Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
  20. Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
  21. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  22. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  23. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
  24. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
  25. Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62 (2018).
  26. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  27. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  28. Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500 (2017).
  29. Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
  30. Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
  31. Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
  32. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
  33. Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
  34. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  35. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  36. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  37. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  38. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  39. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  40. Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463 (2016).
  41. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  42. Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35 (2017).
  43. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  44. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  45. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024 (2017).
  46. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
  47. Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
  48. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Tags

Genetik fråga 146 CRISPR Cas9 Cas12a editering icke-homolog slutet att gå homologi-regisserad reparation
Genomet redigering i däggdjur cellinjer med CRISPR-Cas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, K. I., Sutrisnoh, N. A. B.,… More

Liu, K. I., Sutrisnoh, N. A. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter