Summary

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

Published: April 11, 2019
doi:

Summary

CRISPR-Cas è una potente tecnologia per progettare i complessi genomi delle piante e degli animali. Qui, dettagliamo un protocollo efficiente modificare il genoma umano usando diverse endonucleasi di Cas. Evidenziamo considerazioni importanti e parametri di progettazione per ottimizzare l’efficienza di editing.

Abstract

Il sistema regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) cluster funziona naturalmente nell’immunità adattiva batterica, ma è stato reimpiegato con successo per l’ingegneria del genoma in molti organismi differenti. Più comunemente, il wildtype CRISPR associato 9 (Cas9) o dell’endonucleasi Cas12a sono usato per fendere siti specifici nel genoma, dopo che la rottura del doppio filamento di DNA è riparata tramite l’estremità non-omologo adesione via (NHEJ) o la riparazione di omologia-diretto ( Via di HDR) a seconda che sia un modello di donatore assenti o presenti rispettivamente. Ad oggi, sistemi CRISPR da diverse specie batteriche sono stati indicati per essere in grado di eseguire l’editing genomico in cellule di mammifero. Tuttavia, nonostante l’apparente semplicità della tecnologia, più parametri di progettazione devono essere considerati, che spesso lasciano gli utenti perplessi su come meglio per svolgere il loro genoma esperimenti di editing. Qui, descriviamo un flusso di lavoro completo dal disegno sperimentale identificazione di cloni di cellule che trasportano desiderati modificazioni del DNA, con l’obiettivo di facilitare la corretta esecuzione di esperimenti in linee cellulari di mammifero di editing genomico. Evidenziamo le considerazioni chiave per gli utenti di prendere nota, tra cui la scelta del sistema CRISPR, la lunghezza del distanziale e la progettazione di un modello di donatore singolo filamento oligodeoxynucleotide (ssODN). Immaginiamo che questo flusso di lavoro sarà utile per gli studi di gene knockout, modellazione di sforzi, la malattia o la generazione di reporter linee cellulari.

Introduction

La capacità di progettare il genoma di ogni organismo vivente ha molte applicazioni biomediche e biotecnologiche, come la correzione di malattia-causare mutazioni, costruzione di accurati modelli cellulari per lo studio di malattia, o la generazione di agricolo colture con caratteristiche desiderabili. Poiché la girata del secolo, diverse tecnologie sono state sviluppate per l’ingegneria del genoma in cellule di mammiferi, tra cui meganucleases1,2,3, zinco dito nucleasi4,5, o trascrizione dell’effettore attivatore-come nucleasi (TALENs)6,7,8,9. Tuttavia, queste tecnologie precedenti sono difficili da programma o noioso da montare, quindi che ostacolano l’adozione diffusa nella ricerca e nell’industria.

Negli ultimi anni, il cluster regolarmente intervallate brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) – sistema di CRISPR-collegata (Cas) è emerso come un potente nuovo genoma ingegneria tecnologia10,11. Originariamente un sistema immunitario adattativo nei batteri, è stato correttamente distribuito per la modificazione del genoma in piante e animali, compreso gli esseri umani. Un motivo principale perché CRISPR-Cas ha guadagnato popolarità così tanto in così poco tempo che è l’elemento che porta la chiave dell’endonucleasi di Cas, ad esempio Cas9 o Cas12a (noto anche come Cpf1), nella posizione corretta nel genoma è semplicemente un breve pezzo di guida singola chimerico RN A (sgRNA), che è al design semplice ed economico per sintetizzare. Dopo essere reclutato nel sito di destinazione, l’enzima Cas funziona come un paio di forbici molecolari e si unirà il DNA associato con relativi RuvC, HNH o Nuc domini12,13,14. La risultante doppia interruzione incagliato (DSB) è più riparato dalle cellule via via regia di omologia repair (HDR) o non-omologo fine unirsi (NHEJ). In assenza di un modello di riparazione, il DSB è riparato dalla via NHEJ errori, che possa dar luogo a pseudo-caso inserimento o l’eliminazione di nucleotidi (indels) presso il sito di taglio, causando potenzialmente frameshift mutazioni in geni di proteina-codificazione. Tuttavia, in presenza di un modello di donatore che contiene le modifiche desiderate di DNA, il DSB è riparato dal pathway HDR ad alta fedeltà. Comuni tipi di modelli di donatore includono oligonucleotidi a singolo filamento (ssODNs) e plasmidi. Il primo viene in genere utilizzato se i previsti cambiamenti del DNA sono piccoli (per esempio, alterazione di un singolo paio di base), mentre quest’ultimo viene in genere utilizzato se si vuole inserire una sequenza relativamente lunga (ad esempio, la sequenza di codificazione di una proteina fluorescente verde o GFP) in luogo del bersaglio.

L’attività endonucleasica della proteina Cas richiede la presenza di un motivo di protospacer adiacenti (PAM) presso il sito di destinazione15. Il PAM di Cas9 è all’estremità 3′ del protospacer, mentre il PAM di Cas12a (chiamato anche Cpf1) è invece all’estremità 5′16. La Cas-guida RNA complesso è in grado di introdurre un DSB se il PAM è assente17. Da qui, il PAM luoghi un vincolo sulle posizioni genomiche dove una particolare nucleasi di Cas è in grado di fendere. Fortunatamente, nucleasi Cas da diverse specie batteriche in genere presentano diversi requisiti di PAM. Quindi, integrando i vari sistemi di CRISPR-Cas nel nostro toolbox di ingegneria, possiamo espandere la gamma di siti che possono essere mirati in un genoma. Inoltre, un enzima naturale Cas possa essere progettato o si è evoluto per riconoscere sequenze alternative di PAM, ampliando ulteriormente l’ambito di target genomici accessibile a manipolazione18,19,20.

Anche se più sistemi CRISPR-Cas sono disponibili per scopi di ingegneria del genoma, maggior parte degli utenti della tecnologia si affidano principalmente le nucleasi Cas9 da Streptococcus pyogenes (SpCas9) per molteplici ragioni. Innanzitutto, richiede un PAM relativamente semplicemente NGG, a differenza di molte altre proteine di Cas possono fendere solo in presenza di più complesse PAMs. In secondo luogo, è il primo endonucleasi di Cas per essere impiegati con successo in cellule umane21,22,23,24. In terzo luogo, la SpCas9 è di gran lunga l’enzima meglio caratterizzato fino ad oggi. Se un ricercatore vuole utilizzare un altro nucleasi di Cas, è possibile che lui o lei spesso sarebbe poco chiara sul modo migliore per progettare l’esperimento e come ben altri enzimi si esibiranno in diversi contesti biologici rispetto ai SpCas9.

Per fornire chiarezza per le prestazioni relative dei differenti sistemi di CRISPR-Cas, recentemente abbiamo effettuato un confronto sistematico delle cinque endonucleasi Cas – SpCas9, l’enzima Cas9 da Staphylococcus aureus (SaCas9), l’enzima di Cas9 da Neisseria meningitidis (NmCas9), l’enzima di Cas12a da Thermoanaerobacter SP. BV3L6 (AsCas12a) e l’enzima Cas12a dal batterio Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)25. Per un confronto equo, abbiamo valutato le varie nucleasi Cas utilizzando lo stesso set di siti di destinazione e le altre condizioni sperimentali. I parametri di progettazione di studio anche delineato per ciascun sistema CRISPR-Cas, che dovrebbe servire come un utile riferimento per gli utenti della tecnologia. Qui, per meglio consentire ai ricercatori di fare uso della CRISPR-Cas sistema, forniamo un protocollo dettagliato per l’ingegneria di genoma ottimale con differenti enzimi Cas9 e Cas12a (Vedi Figura 1). Il protocollo comprende non solo i dettagli sperimentali ma anche importanti considerazioni di progettazione per massimizzare la probabilità di un risultato di successo genoma Ingegneria in cellule di mammifero.

Figure 1
Figura 1 : Una panoramica del flusso di lavoro per generare genoma modificato linee cellulari umane. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. design di sgRNAs Selezionare un appropriato sistema di CRISPR-Cas. In primo luogo, esaminare la regione di destinazione per le sequenze di PAM di tutte le nucleasi Cas9 e Cas12a che sono state indicate per essere funzionali in cellule di mammifero16,21-32. Cinque enzimi utilizzati di frequente sono riportati nella tabella 1 , insieme ai loro rispettive PAMs.Nota: oltre l’endonucleasi elencati nella tabella 1, ci sono altri enzimi Cas meno comunemente u…

Representative Results

Per eseguire un esperimento, un plasmide CRISPR esprimendo un sgRNA con destinazione che il locus di interesse deve essere clonato di editing di genoma. In primo luogo, il plasmide si digerisce con un enzima di limitazione (in genere un tipo di enzima di IIs) per linearizzare esso. Si consiglia di risolvere il prodotto digerito su gel di agarosio 1% a fianco di un plasmide non digerito per distinguere tra una digestione completa e parziale. Come non digeriti plasmidi sono supercoiled, tendono a correre più velocemente r…

Discussion

Il sistema CRISPR-Cas è una potente, rivoluzionaria tecnologia per progettare i genomi e trascrittomi delle piante e degli animali. Numerose specie batteriche sono state trovate per contenere sistemi CRISPR-Cas, che potenzialmente possono essere adattati per genoma e del trascrittoma fini44di ingegneria. Anche se l’endonucleasi Cas9 da Streptococcus pyogenes (SpCas9) era il primo enzima per essere distribuito con successo in cellule umane21,<sup class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.T. è supportato da un’agenzia per concessione congiunta Consiglio ufficio di ricerca e di scienza e tecnologia (1431AFG103), un Consiglio nazionale delle ricerche mediche concedere (OFIRG/0017/2016), National Research Foundation concede (NRF2013-THE001-046 e NRF2013-THE001-093), un Concessione del Ministero di educazione Tier 1 (RG50/17 (S)), una startup grant, Nanyang Technological University e fondi per il concorso International Genetically Engineering Machine (iGEM) da Nanyang Technological University.

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK) NEB M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) NEB M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X 1st Base BUF-3000-50X4L Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X 1st Base BUF-3020-10X4L Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA. 
BbsI NEB R0539
BsmBI NEB R0580
T4 DNA Ligase NEB M0202 400,000 units/ml
Quick Ligation Kit NEB M2200 An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit Thermo Scientific K1423 An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit Thermo Scientific 451245 The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli Thermo Scientific C737303
LB Broth (Lennox), powder Sigma Aldrich L3022 Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder Sigma Aldrich L2897 Reconstitute in ddH20, and autoclave before use
SOC media 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade Gold Biotechnology A-301
REDiant 2X PCR Mastermix 1st Base BIO-5185
Agarose 1st Base BIO-1000
T7 Endonuclease I NEB M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit Favorgen FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Hyclone SH30081.01 4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM Gibco 25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL Gibco 15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X Gibco 25200
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160 FBS is heat inactivated before use at 56 oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X Gibco 20012
jetPRIME transfection reagent Polyplus Transfection 114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0 Epicentre LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit Bioline BIO-52067 An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix NEB N0447
6X DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3 Merck 539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm Bio-Rad 1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X Bio-Rad 1610772 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X 1st base BUF-2020 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution Sigma Aldrich P7170
TBS, 20X 1st base BUF-3030 Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20 Sigma Aldrich P9416
Skim Milk for immunoassay Nacalai Tesque 31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP Advansta K12043
Antibody for β-actin (C4) Santa Cruz Biotechnology sc-47778 Lot number: C0916
MiSeq system Illumina SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000
Qubit fluorometer Thermo Scientific Q33226
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Scientific AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Addgene 48138 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA Addgene 61591 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7 Addgene 108379 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 Addgene 42230 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9 Addgene 41815 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1) Addgene 71814 Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1) Addgene 72247 Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

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Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).

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