Summary
このプロトコルにはマウス長管骨および骨髄分離、骨髄のマクロファージを生成し、破骨細胞マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体活性化剤を使用するが含まれていますか腫瘍壊死因子 α (TNF-α) と M-CSF 受容体抗体抗 c fms によって彼らの逮捕。
Abstract
骨リモデリングは複雑なプロセスで、沈着と吸収の期間が含まれます。骨は、骨はさまざまな刺激への応答で破骨細胞によって分解プロセスです。破骨細胞前駆体は、マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体活性化に応えて核破骨細胞に分化します。病理学的条件下でサイトカイン プロファイルが異なっており、炎症性サイトカインの混合物が含まれます。腫瘍壊死因子 α (TNF-α) は、炎症性融解に関与する領域に大量にある最も重要なサイトカインの一つです。このプロトコルの目的は、M-CSF と RANKL や TNF α 受容体抗体抗 c fms の線量の増加によってその後抑制が誘導を介して破骨細胞を生成する、骨髄に分離された方法を提供するにはM-CSF。この実験では、炎症性骨吸収の疾患における抗 c fms 抗体の治療上の価値を強調表示されます。
Introduction
破骨細胞は専門性の高いセルであり、彼らは複数の破骨細胞前駆体の融合による造血幹細胞から区別します。彼らは健康な骨の改造のために不可欠であり、リウマチ性関節炎など歯周疾患1炎症性骨疾患に関連付けられている病的骨吸収に貢献。
破骨細胞形成と破骨細胞の機能は、2 つの重要要因によって仲介されます。マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体の活性化。M-CSF と RANKL は破骨細胞分化2にとって重要です。骨髄マクロファージからの破骨細胞形成を誘導するために示されているもう一つの要因は、腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α)3,4,5です。TNF α を介した破骨細胞形成関節リウマチ6、歯周疾患7、閉経後骨粗鬆症8などの破壊的な骨の病気で骨溶解のために重要であることが示されています。
C fms M CSF の膜受容体で、その作用を仲介します。C fms の役割が、ことを示したこと、c-fms (抗 c-fms 抗体) 抗体の完全に関節炎モデルにおける破骨細胞形成を逮捕し同様管理 TNF-α 誘導しながら骨びらんと文献に記載されています破骨細胞形成遠い炎症関節からまだ堅牢な9歳だった。抗 c-fms 抗体の投与マウス研究10同様 LPS 誘導性歯周炎モデル11.のようにリポ多糖 (LPS) による破骨細胞形成と骨吸収を抑制また、抗 c-fms 抗体抑制中矯正歯の移動だけでなく、矯正学的歯の移動12、機械的応力誘起歯根と骨の矯正学的歯の移動13に関連付けられています。
M-CSF は、宿主の免疫応答に不可欠な他の機能が報告されています。Op/op 細菌性肺炎でマウスの M-CSF の不在14肝細胞壊死と肝臓に細菌の散布や細菌の負担の増加に します。したがって、M CSF は感染症からの保護に免疫応答のために重要です。
本研究は、TNF α や RANKL M CSF に及ぼす抗 c-fms 抗体による破骨細胞形成の in vitro および M CSF による破骨細胞前駆細胞の増殖を示します。このプロトコルは、長い骨と破骨細胞前駆細胞とみなされる骨髄マクロファージ (BMM) を生成し、2 BMM の多核破骨細胞への分化を誘導する手順からマウス骨髄細胞の分離を示しますメソッド;RANKL または TNF α。プロトコルはまた、抗 c-fms 抗体を使用して両方の方法で破骨細胞形成の逮捕を比較します。
骨髄を抽出し、その後破骨細胞前駆体を生成するために使用するプロセスは、薬物検査など複数のダウン ストリーム アプリケーションで使用することができます純粋な破骨細胞文化の大量に生産で信頼性の高いです。このプロトコルでは破骨細胞形成を誘導する RANKL または TNF α の使用を区別する破骨細胞形成 (RANKL) の生理学的なプロセスとして破骨細胞形成から病理学的プロセス (TNF α)、順番をガイドする 2 つの代替手段を提供します。決定は 1 つが下流のアプリケーションで使用する試薬の面で優れています。このプロトコルはまた、我々 が適切な骨吸収と骨疾患に関連するその後の研究の安全に使用することができます反 c fms 抗体濃度を判断できますメソッドを提供します。
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Protocol
すべての動物の手続きや動物の世話は、東北大学の諸規則に従って行われました。
1. マウスの後肢の郭清と処理
- 解剖前にコンテナーのサイズによって α MEM の約 50 mL のプレートを埋める、氷の上に置きます。これはすべてのボーンの郭清が完了するまでコレクションのコンテナーとなります。これおよびそれに続く実験は 100 μ g/mL ストレプトマイシン、100 IU/mL ペニシリン G、α MEM 含む 10% 牛胎児血清 (FBS) を使用します。
- 5% イソフルランの過量の吸入による c57bl/6 j マウスを安楽死させます。
- 手のひらと足と 70% のエタノールで十分にスプレーを貫通ピンを使用して仰臥位でマウスを修正します。
- 滅菌外科はさみとピンセットを使用してヒップのレベルで皮膚切開を行い、筋肉を公開するフィートに拡張します。
- アタッチする大腿四頭筋腱とハムスト リング筋を骨に接続する腱をカットします。股関節と膝の両方を公開する筋肉をはがします。これらの腱の検索タグ軟部組織を離れることがなく、添付ファイルから両方の筋肉を解放を緩和します。骨にはカットしません。
- 大腿骨頭と関節腔のはさみの位置し、大腿骨の解放が、骨を維持するそれに切る。これは骨髄を公開することのリスクのない骨の剥離を有効になります。
- 同様に脛骨にアタッチする筋肉を切り取る。汚染を避けるためにそのまま骨を保つ足関節で脛骨の添付ファイルから自由をカットします。
- 大腿骨と脛骨のはさみの刃とキムワイプを使用してから任意の残りの軟部組織をこすり、氷上に置いた α MEM とプレートに。
2. マウスの後肢骨髄分離
- Α MEM で 30 G の針の注射器を満たしなさい。
- 脛骨と大腿骨、膝関節から外します。
- はさみを使って両側から長い骨の両端をカットします。
- ピンセットを使用してシャフトから骨を押し、骨の骨髄空間に針を挿入ゆっくりと 6 cm 培養皿に骨髄のコンテンツをフラッシュします。骨は、骨髄のすべてのコンテンツの抽出を示す白に表示されます。すべてのボーンを繰り返します。
- ひずみ、骨髄は、50 mL の円錐形遠心管に 300 x gで 5 分間遠心 40 μ m ナイロンストレーナ セルを使用して抽出します。
- 上澄みを廃棄、α-MEM の 5 mL で洗浄し、遠心 300 x gで 5 分間で合計 2 回の繰り返し洗浄。
-
Α MEM の 10 mL にペレットを再懸濁します、次のように診断を使用してセル数を実行します。
- 0.4% トリパン 1.5 mL チューブに青の 10 μ L に細胞懸濁液の 10 μ L の追加によって細胞懸濁液の 1:1 希釈を行うし、一度ピペットします。
- スライド カバー付き検定室をカバーし、染料懸濁液を検定に転送します。いっぱいになる、商工会議所をアンダーフィルや毛管作用によってチャンバーには、サスペンションを許可することが重要です。
- 顕微鏡のステージに、検定を配置します。対物レンズ 10 倍を使用すると、中央の四角形に焦点を当てます。3 行でバインドされているすべてのセルをカウントします。セルが 2 回カウントされますしないことを確認するために、それぞれの正方形の上部と右コーナーをカウントします。死んだ細胞は、濃い青色が表示されます、これらのカウントから除外されます。
- 下流のアプリケーションに応じて適切な培養容器に細胞を播きます。この実験では、セクション 3 を参照してください。
3. BMM の世代
- 種子 1 x 107セル/10 mL 10 cm の皿を文化し、M-CSF 100 ng/mL を追加します。M 脳脊髄液の最終濃度が 100 ng/mL の培養液です。37 ° c、5% CO2 3 日間の文化を孵化させなさい。
- 3 日後培養培地を取り除き、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 非付着性のセルを削除したり、部屋の温度 0.02% トリプシン-EDTA の 5 mL を追加する 2 回の 10 mL で精力的に PBS で洗浄、37 ° c、5% CO2 5 分の間孵化させなさい。
- 徹底的なピペッティングにより細胞をデタッチします。(セルは丸みを帯びたとメディアで浮動表示する) 顕微鏡の下で文化を観察することによって、セルが切り離されていることを確認します。セル接続されたまま、徹底的にそれらをデタッチするピペッティングを繰り返します。セルが切り離されている場合は、反応を不活化する α MEM の 5 mL を追加します。
- 50 mL の円錐管と 300 × gで遠心する 5 分破棄、上清にセルを収集し、α MEM の 5 mL で洗います。
- 5 分 300 × gで遠心し、α MEM の 10 mL にペレットを再懸濁します。
- 2.7.1 の手順で前述したように細胞数を実行します。
- 種子 1 x 106セル/10 mL 10 cm の皿を文化し、M-CSF 100 ng/mL を追加します。M 脳脊髄液の最終濃度が 100 ng/mL の培養液です。37 ° c、5% CO2 3 日間の文化を孵化させなさい。
4. BMM から破骨細胞の破骨細胞前駆体として生成
- 3 日後次の手順 3.2 3.7、破骨細胞の前駆体として BMM を表す接続されたセルを収穫します。
- 96 ウェル プレートで α MEM の 5 × 104セル/200 μ L でシード BMM は。100 ng/mL の最終濃度 50 ng/mL または TNF α の最終的な集中の RANKL を追加します。各ウェルに 100 ng/mL の最終的な集中の M-CSF を追加します。
- 抗 c-fms 抗体を追加 (最終濃度 0、1、10、100、1000 ng/mL) 各ウェルに。
- 37 ° C、5% CO2の 4 日間で孵化させなさい。4 日間毎日メディアを変更します。
5. 酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) 染色
- 培養 4 日後優しく各ウェルの培養液を吸い出しなさい。それぞれ室温 1 × PBS の 200 μ L にも一度洗います。
- 固定のため各ウェルに 10% ホルマリンの 200 μ L を追加し、室温で 1 時間インキュベートします。吸引、ホルマリンとも各 3 回を脱イオン水で洗います。
- それぞれに PBS でトリトン X-100 が透過性よく、室温で 1 時間インキュベート 0.2% の 200 μ L を追加します。トリトン X-100 を吸引、脱イオン水で 3 回もそれぞれを洗ってください。
- 各ウェルにトラップ染色溶液 200 μ L を追加します。顕微鏡下で汚れを視覚化します。適切に開発に汚れの 10-30 分からかかるでしょう。
- 汚れと洗浄 3 回、脱イオン水でよく、空気が乾燥を吸い出しなさい。詳細な観測で使用する室温で維持します。
6. 拡散の試金
- 96 ウェル プレートで α MEM の 5 x 103セル/200 μ L で破骨細胞前駆体として種子 BMM は。各ウェルに 100 ng/mL の最終的な集中の M-CSF を追加します。
- 抗 c-fms 抗体を追加 (最終濃度 0、1、10、100、1,000 ng/mL) と 37 ° C、5% CO2中変更することがなく 3 日間で孵化させなさい。
- 3 日後 1 × PBS のセルを洗浄します。各ウェルに 100 μ L α MEM を追加します。
- キット ソリューションを数えるセルの 10 μ L を追加し、37 ° C、5% CO2 2 時間インキュベート、450 各ウェルの吸光度を決定する nm マイクロ プレート リーダーを使用しています。
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Representative Results
このプロトコルの目的は、RANKL や TNF α 存在下での破骨細胞形成に及ぼす抗 c-fms 抗体を評価し、M-CSF の破骨細胞前駆細胞の増殖に及ぼす影響を決定するためです。このプロトコルでは、純粋な破骨細胞文化の大量生成する信頼性の高いプロセスを実施しています。異なる培養条件下での破骨細胞の形成を阻害する抗 c-fms 抗体適切な濃度をテストする方法を行っています。
M の破骨細胞形成-CSF + RANKL 抗体抗 c fms 文化は図 1に示します。1、10 ng/mL 抗 c fms 抗体、コントロール (0 ng/mL) と比較して破骨細胞数の有意な減少はありませんでした。一方で 100、1,000 ng 対策 c fms 抗体、コントロールと比較して破骨細胞数の大幅な減少があった。抗 c-fms 抗体を持つ M CSF + TNF-α 文化における破骨細胞形成は図 2に示します。1 ng/mL 抗 c fms 抗体でコントロール (0 ng/mL) と比較して破骨細胞数の有意な減少はありませんでした。滞在中は、10、100、1,000 ng/mL 抗 c fms 抗体、コントロールと比較して破骨細胞数の大幅な減少があった。
M-CSF + 抗 c fms 抗体と破骨細胞の前駆物質文化は図 3に示します。1、10、100 ng/mL、コントロール (0 ng/mL) と比較して破骨細胞前駆細胞数の大幅な減少があった一方で 1,000 ng/mL、コントロールと比較して破骨細胞前駆細胞数の大幅な減少があった。これは破骨細胞前駆細胞の増殖を著しく抑制する 1,000 ng/mL の高濃度が必要であることを示します。
これらの結果は、RANKL の 50 ng/mL の濃度を用いて、TNF-α の 100 ng/mL の濃度が破骨細胞の同じ番号を取得する必要が、破骨細胞の生産に RANKL の堅牢な性質に関する情報を提供します。両方これらのメソッドの破骨細胞の生成に適していますが、どちらが優れた試薬の後で使用するコンテキストで下流のアプリケーションによって異なります。結果が示すよう、使用 RANKL は破骨細胞を生成する TNF α の使用と同等ではありません。
このプロトコルでは、破骨細胞形成を阻害する抗 c-fms 抗体を用いて、結果を見て、我々 は見つける RANKL 井戸における破骨細胞数の有意な減少を生成する抗 c-fms 抗体の 100 ng/mL の濃度が必要であります。一方、破骨細胞の有意な減少を作り出すためであった反 c fms 抗体のみ 10 ng/mL の濃度 MCSF 拡散の試金の破骨細胞前駆体の増殖を抑制する抗 c fms 抗体 1,000 ng/mL の濃度が必要でした。TNF α の井戸の数です。
図 1: RANKL による破骨細胞形成に及ぼす抗 c fms 抗体です。M CSF、RANKL および抗 c-fms 抗体の様々 な用量で治療された破骨細胞前駆細胞の顕微鏡観察 (0、1、10、100、1,000 ng/mL) の 4 日間。セルは固定され、トラップの染色で染色します。M-CSF、RANKL 抗 c-fms 抗体の濃度と TRAP 陽性細胞数 (0、1、10、100、1,000 ng/mL) 4 日間。セルは固定され、トラップの染色で染色します。TRAP 陽性細胞数を評価しました。結果は、4 つの文化の平均 ± 標準偏差で表現されました。シェッフェのテストを使用して統計的な差異が検出された (n = 4;*p < 0.01)。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: TNF α による破骨細胞形成に及ぼす抗 c fms 抗体です。M CSF、TNF α および抗 c-fms 抗体の様々 な用量で治療された破骨細胞前駆細胞の顕微鏡観察 (0、1、10、100、1,000 ng/mL) 4 日間。セルは固定され、トラップの染色で染色します。M CSF、TNF α および抗 c-fms 抗体の濃度で培養された TRAP 陽性細胞数 (0、1、10、100、1,000 ng/mL) の 4 日間。セルは固定され、トラップの染色で染色します。TRAP 陽性細胞数を評価しました。結果は、meanv ± s. d. の 4 つの文化として表現されました。シェッフェのテストを使用して統計的な差異が検出された (n = 4;*p < 0.01)。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 破骨細胞前駆体の増殖に及ぼす抗 c fms 抗体です。細胞 M 脳脊髄液で扱われた破骨細胞前駆細胞の生存率および抗 c-fms 抗体の様々 な線量 (0、1、10、100、1,000 ng/mL) 3 日間。キット 8 を数えるセル実行可能性を測定する使用されました。M CSF を含む井戸の相対的な活動を比較する割合としてデータを提示 + アンチ-c-fms M CSF を含む井戸対だけで、表現として意味 ± s. d. の 4 つの文化。シェッフェのテストを使用して統計的な差異が検出された (n = 4;*p < 0.01)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では RANKL による破骨細胞形成、TNF α による破骨細胞形成と M CSF による破骨細胞前駆体の増殖に及ぼす抗 c-fms 抗体を調べた。破骨細胞形成 RANKL による破骨細胞形成・ TNF α による破骨細胞形成・ M CSF による破骨細胞前駆細胞の増殖を阻害する抗 c fms 抗体の有効量は異なることがわかった。
RANKL は、M-CSF の in vitro での存在下での破骨細胞形成を仲介してランク null マウス経験15,このように RANKL は破骨細胞形成に必須のサイトカインでありを開発する破骨細胞の障害により重篤な大理石骨、骨代謝に重要な規定する役割。したがって、RANKL による破骨細胞形成を制御することができます、もし減少骨の質量を制御することができます。ただし、過度の抑圧が発生すると、骨の恒常性は維持されません。この実験では、高濃度 100 ng/ml RANKL による破骨細胞形成を減少できるようにする必要がありますその対策 c fms 抗体を示します。
TNF-α を介した破骨細胞形成が破壊的な融解のため重要であること示されている骨関節リウマチ6、歯周疾患7、閉経後骨粗鬆症8などの疾患とその対策 c fms の紹介抗体は簡単に 10 ng/mL の低濃度の TNF-α を介した破骨細胞形成を抑えることができます。抗 c fms 抗体濃度が低いは病的な状態で破骨細胞形成のプロセスを減らすための治療的価値の可能性がありますが、通常の条件で破骨細胞形成に及ぼす影響最小限のだろうが示唆されました。
M CSF はCsf1符号化 M CSF ショーのため破骨細胞16.の完全な不足のため osteopetrotic 表現型遺伝子が無い op/op マウスとして破骨細胞形成の重要な要素M-CSF は、破骨細胞前駆体2の生存を促進します。M-CSF のレベルを増加する深刻な強直性脊椎炎17を持っている関節リウマチ患者の血清中緩やかな人工関節18周りの滑液中。TNF α は、破骨細胞前駆体の生体内で間質細胞9M CSF 遺伝子発現を誘導する結果の数を増やします。これらのデータに照らして M CSF は TNF-α の間質細胞にこれらの細胞から M csf の産生の増加が発生する影響により炎症の重要なメディエーターであることが言えます。
それは、M-CSF は肺炎14時に肺と肝臓の両方の単核食細胞の抗菌機能などの宿主の免疫応答に重要な役割を果たしていることが報告されています。したがって、M-CSF の過度の抑圧が発生した場合、免疫反応が減少する可能性があります。この実験では、破骨細胞前駆細胞の生存と M-CSF を介した増殖を阻害する抗 c-fms 抗体 (1000 ng/mL) の非常に高濃度が必要であるとしました。並べて撮影示唆された TNF α の破骨細胞形成を阻止する治療による骨疾患この集中による破骨細胞形成に倹約する同時に、低濃度で動作可能性があります抗 c fms 抗体RANKL と M-CSF 骨発生する改造を可能にします。
プロトコルの重要なステップは、実験の成功を確保するため慎重に行います。解剖しながらプロトコルの初めに、骨髄の汚染を避けるために骨に切断を避けるために重要です。洗浄手順ごと繰り返す必要がありますすべての骨髄が抽出されるまでに必要なすべての骨髄が抽出されていることを確認する、骨髄を解凍の過程で細胞の高収率を提供します。試薬テストなどの複数のダウン ストリーム アプリケーションでこのプロトコルが利用できるそれはまた、抗 c-fms 抗体の濃度は結果の誤った解釈を避けることテストすることができることを提供しています。破骨細胞形成抑制のために必要だった反 c fms 抗体の濃度が方法の中で等しくない私達を示した、従って抗 c fms の濃度に関して得られた結果を持って (RANKL または TNF-α) を破骨細胞が得られたで慎重に将来的に実験を検討しました。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、日本学術振興会科研費の一部によって支えられた (第 16 K 11776 H. k.、第 17 K ・ k ・ s、第 16 K ・ k ・ K、第 16 K m ・ s、第 18 K I. m 09862 20636 に 20637 17306。) 学術振興会から付与。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-c-Fms antibody | AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a) | ||
| TNF-α | Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column. | ||
| RANKL | PEPROTECH | 315-11 | Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli |
| M-CSF | Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish. | ||
| α-MEM | Wako | with L-Glutamine and phenol red | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | s1820-500 | Fetal Bovine Serum French Origin |
| Culture dish | Corning | 100 mm x 20 mm style dish | |
| 96-well plate | Thermofischer Scientific | Nun clon Delta surface | |
| Cell counting kit-8 | Dojindo, Kumamoto, Japan | ||
| Microplate reader | Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan | ||
| Cell strainer | Corning | 40 μm Nylon | |
| Centrifuge tube | Corning | 50 mL CentriStar cap | |
| Triton X-100 | Wako | Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether |
References
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