Summary
이 프로토콜 포함 murine 긴 뼈와 골 절연, 골 수 세포를 생성 하 고 osteoclasts 대 식 세포 콜로 니 계수 (M-CSF) 및 핵 요인 Kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성을 자극을 사용 하 여 생산의 해 부 또는 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 그리고 안티-c-fms 항 체, M-CSF 수용 체에 의해 그들의 체포.
Abstract
뼈는 복잡 한 프로세스 이며 그것은 증 착과 재흡수의 기간을 포함 한다. 뼈 재흡수는 뼈는에 의해 분해 osteoclasts 다른 자극에 응답에서 하는 프로세스입니다. Osteoclast 선구자 多 osteoclasts 대 식 세포 콜로 니 계수 (M-CSF) 및 핵 요인 Kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성 자극에 대 한 응답으로 구분 합니다. Pathologic 조건 cytokine 프로필은 다른 염증 성 cytokines의 혼합물을 포함 한다. 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 염증 osteolysis와 관련 된 분야에서 다량에서 발견 되는 가장 중요 한 cytokines의 하나입니다. 이 프로토콜의 목적은는 murine 골 생성 M-CSF RANKL 및 안티-c-fms 항 체, 수용 체의 복용량을 증가 하 여 이후 저해 될 것입니다 TNF-α와 유도 통해 osteoclasts 하 격리 된 방법을 제공 하 M-CSF에 대 한. 이 실험 염증 뼈 재흡수의 질병 항 체 안티-c-fms의 치료 가치를 강조 한다.
Introduction
Osteoclasts는 고도로 전문화 된 세포, 그리고 그들은 여러 osteoclast 선구자의 융합을 통해 조 혈 줄기 세포에서 분화. 그들은 건강 한 뼈에 필수적인 고 류 마티스 관절염, 치 주 질환1등 염증 성 osteolytic 질병와 관련 된 pathologic 뼈 재흡수에 기여.
Osteoclastogenesis 및 osteoclast 함수는 두 가지 주요 요인;에 의해 중재 (M-CSF) 비율과 핵 요인 kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성을 자극 하는 대 식 세포 식민지. M-CSF와 RANKL osteoclast 차별화2중요 하다. 골 수 세포를 체 외에서 osteoclast 형성을 유도 하기 위해 표시 되었습니다 다른 요인은 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α)3,,45이다. TNF-α 중재 osteoclast 형성 osteolysis6류 마치 스 성 관절염, 치 주 질환7, 폐 경 후 골다공증8등 파괴적인 뼈 질환에 대 한 중요 한 표시 되었습니다.
C-fms M-CSF의 막 수용 체 이며, 그것의 활동을 중재 한다. C-fms의 역할은 잘 문서화는 문학에는 c-fms (안티-c-fms 항 체)에 대 한 항 체의 완전히 체포 관절염 모델에서 osteoclastogenesis로 TNF-α에 유도 하면서 뼈 아픕니다 시연 되었다 osteoclastogenesis 먼 염증이 관절에서 여전히 강력한9했다. 안티-c-fms 항 체의 저해 osteoclast 형성과 뼈 재흡수 lipopolysaccharide (LPS) 마우스 calvariae10 도에서 LPS 유발 염 모델11. 에 의해 유도 된 또한, 안티-c-fms 항 체 억제 교정 치아 운동으로 교정 치아 운동12, 동안 기계적 스트레스 유발 루트 재흡수와 교정 치아 운동13와 관련 된 뼈 재흡수.
M-CSF 호스트 면역 반응에 필수적인 다른 기능을 보고 되었습니다. 세균성 폐 렴으로 op/op 생쥐에서 M-CSF의 부재는 세균성 짐과 간장 괴 사14간 세균성 보급의 증가 이어질. 따라서, M-CSF 감염 으로부터 보호에서 면역 반응에 대 한 중요 하다.
이 연구에서는 M-CSF와 RANKL 또는 TNF-α에 안티-c-fms 항 체의 효과 유도 osteoclast 형성 체 외 osteoclast 선구자의 확산을 유도 하는 M-CSF 보여 줍니다. 이 프로토콜이 보여줍니다 murine 골 수 세포의 긴 뼈, 골 수 세포 (BMM) osteoclast 선구자로 간주 되는 생성 하 고 두 多 osteoclasts에 BMM의 차별화를 유도 단계에서 방법; RANKL 또는 TNF-α입니다. 프로토콜은 또한 안티-c-fms 항 체를 사용 하 여 두 방법에 osteoclastogenesis의 검거를 비교 합니다.
프로세스는 골은 추출 이후 osteoclast 선구자를 생성 하는 데 사용 약물 테스트 등 여러 다운스트림 응용 프로그램에 사용 될 수 있는 순수한 osteoclast 문화의 대량 생산에 안정적입니다. RANKL 또는 TNF-α 유도이 프로토콜에서 osteoclastogenesis의 사용 구분 osteoclastogenesis physiologic 프로세스 (RANKL)로 osteoclastogenesis에서 프로세스로 pathologic (TNF-α), 차례 차례로 두 대체 절차 안내를 제공 하 어떤 결정 하나 다운스트림 응용 프로그램에 사용 될 시 약의 관점에서 우수한입니다. 이 프로토콜은 또한 우리가 뼈 재흡수 및 osteolytic 질병에 관련 된 최신 연구에 대 한 안전 하 게 사용할 수 있는 안티-c-fms 항 체의 적당 한 농도 확인할 수 있는 메서드를 제공 합니다.
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Protocol
모든 동물 절차 및 동물 보호는 도호쿠 대학 규칙 및 규정에 따라 수행 했다.
1. murine Hindlimb 해 부 및 처리
- 절 개, 앞 접시는 컨테이너의 크기에 따라 α-MEM의 약 50 mL와 함께 얼음에 배치. 모든 뼈의 해 부 완료 될 때까지이 컬렉션의 컨테이너 될 것입니다. 이 고 후속 실험, α-MEM 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 IU/mL 페니실린 G, 및 100 μ g/mL 스 사용 합니다.
- 5 %isoflurane 과다 복용의 흡입에 의해 C57Bl/6J 마우스를 안락사.
- 야자수와 발 70% 에탄올으로 깨끗이 스프레이 통해 피어 싱 하는 핀을 사용 하 여 부정사 위치에 마우스를 수정.
- 엉덩이의 수준에서 불 임 수술가 위, 핀셋을 사용 하 여 피부 절 개를 만들고 근육 노출 발까지 연장.
- Quadriceps 근육을 연결 하는 힘 줄과 뼈에 햄 스트링 근육을 연결 하는 힘 줄을 잘라. 껍질 멀리 엉덩이 무릎 관절을 노출 하는 근육. 이 힘 줄을 찾기 부드러운 조직 태그를 떠나지 않고 그들의 첨부 파일에서 두 근육을 자유롭게 하는 것을 쉽게 것입니다. 뼈를 잘라 하지 마십시오.
- 대 퇴 골의 머리와 공동 공간 사이 위 놓고 자유롭게 대 퇴 골 뼈를 그대로 유지 하지만 그것을 잘라. 이 골 노출의 위험 없이 뼈의 분리를 수 있게 된다.
- 마찬가지로 잘라 멀리 경골을 연결 하는 근육. 발목 관절 뼈 오염을 피하기 위하여 그대로 유지에 경골 첨부 파일에서 무료를 잘라.
- 대 퇴 골 및 경골이 위 블레이드와 kimwipe를 사용 하 여 모든 나머지 부드러운 조직을 긁어 그리고 α-MEM 얼음에 배치와 함께 접시에 놓습니다.
2. murine Hindlimb 골 격리
- Α-MEM에 30 G 바늘 주사기를 채우십시오.
- 경골 및 대 퇴 골 무릎 관절에서 뽑습니다.
- 가 위를 사용 하 여 양쪽에서 긴 뼈의 끝을 잘라.
- 핀셋을 사용 하 여 축에서 뼈를 잡고, 뼈의 골 수 공간에 바늘을 삽입 하 고 천천히 6 cm 문화 접시에 골 수의 콘텐츠를 플러시. 뼈는 흰색, 추출의 모든 골 수 콘텐츠를 나타내는 표시 됩니다. 모든 뼈를 반복 합니다.
- 스트레인 골 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브를 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기로 40 μ m 나일론 셀 스 트레이너를 사용 하 여 압축을 풉니다.
- 삭제는 상쾌한, α-MEM의 5 mL로 세척 하 고 2 번의 총에 대 한 반복 세척 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심.
-
Α-MEM의 10 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 세포 수는 hemocytometer를 사용 하 여 다음과 같이 수행 합니다.
- 10 μ 세포 현 탁 액의 0.4% trypan 1.5 mL 튜브에 파란색의 10 μ에 추가 하 여 셀 서 스 펜 션의 1:1 희석을 만들고 한 번에 플라스틱.
- 슬라이드 커버 hemocytometer 챔버를 커버 하 고 염료의 서 스 펜 션은 hemocytometer를 전송. 연극 또는 언더 필 챔버와 모 세관 작용에 의해 챔버를 채우기 위해 현 탁 액을 허용 하지 중요 하다.
- 현미경 단계에 hemocytometer 장소입니다. 10 x 목표를 사용 하 여, 센터 광장에 초점. 3 라인에 의해 구속 하는 모든 셀을 계산 합니다. 셀 두 번 계산 되지 않습니다 있는지 확인 하려면, 각 사각형의 위쪽 및 오른쪽 모서리를 계산 합니다. 죽은 세포는 진한 파란색 표시 됩니다, 그리고이 카운트에서 제외 됩니다.
- 다운스트림 응용 프로그램에 따라 적절 한 문화 혈관으로 셀을 시드하십시오. 이 특정 실험에 대 한 섹션 3을 따릅니다.
3입니다. BMM 세대
- 씨앗 1 x 107 셀/10 mL 10 cm에 요리 문화 고 M-CSF 100 ng/mL를 추가 합니다. M-CSF의 최종 농도가 100 ng/mL의 배양 이다. 37 ° C, 5% CO2 3 일에 문화를 품 어.
- 3 일 후, 문화 매체를 제거 하 고 PBS에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 비 부착 한 세포를 제거, 실내 온도 0.02% 트립 신-EDTA의 5 mL을 추가를 두 번의 10 mL와 함께 적극적으로 셀을 세척 하 고 37 ° C, 5% CO2 5 분 동안에 품 어.
- 철저 한 pipetting 셀을 분리 합니다. 셀 (셀 표시 반올림과 미디어에 부동) 현미경 문화를 관찰 하 여 분리 된는 다는 것을 확인 하십시오. 셀 연결 된 남아, 철저 하 게 분리를 pipetting 반복 합니다. 세포를 분리 하는 경우 비활성화 반응에 α-MEM의 5 mL을 추가 합니다.
- 50 mL 원뿔 튜브와 5 분 삭제, 상쾌한에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기로 세포를 수집 하 고 α-MEM의 5 mL로 씻어.
- 5 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuge 고 α-MEM의 10 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 앞에서 설명한 단계 2.7.1에서에서 세포 수를 수행 합니다.
- 씨앗 1 x 106 세포/10 mL 10 cm에 요리 문화 고 M-CSF 100 ng/mL를 추가 합니다. M-CSF의 최종 농도가 100 ng/mL의 배양 이다. 37 ° C, 5% CO2 3 일에 문화를 품 어.
4. Osteoclast 선구자로 Osteoclasts BMM에서의 세대
- 3 일 후, 다음 단계 3.2-3.7 osteoclast 선구자로 BMM를 대표 하는 연결 된 셀을 수확.
- 5 x 104 셀/200 μ α-MEM 96 잘 접시에서의 씨앗 BMM. RANKL 100 ng/mL의 최종 농도 50 ng/mL 또는 TNF-α의 최종 농도 대 한 추가 합니다. 각 잘을 100 ng/mL의 최종 농도 대 한 M-CSF를 추가 합니다.
- 안티-c-fms 항 체를 추가 (최종 농도 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL)을 각 영역.
- 37 ° C, 5% CO2 4 일에서 품 어. 4 일 동안 매일 미디어를 변경 합니다.
5. 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정) 얼룩
- 4 일 후 부 화, 각의 문화 매체를 발음 부드럽게. 실내 온도 1 x PBS의 200 μ에 각각 한 번 잘 씻는 다.
- 고정을 위한 각 음을 10% 포 르 말린의 200 μ를 추가 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 포 르 말린을 발음 하 고 이온을 제거 된 물으로 잘 각 3 번 씻어.
- 0.2% 트라이 톤 X-100 각 PBS에 permeabilization에 대 한 고 실 온에서 1 h에 대 한 품 어의 200 μ를 추가 합니다. Triton X-100을 발음 하 고 이온을 제거 된 물으로 잘 각 3 번 씻어.
- 각 우물에 트랩 얼룩 솔루션의 200 μ를 추가 합니다. 현미경 얼룩을 시각화. 그것은 제대로 개발을 얼룩에 대 한 10-30 분에서 걸릴 것입니다.
- 얼룩 및 세척 각 이온된 수 3 회, 잘 하 고 건조 한 공기를 발음. 관찰에 사용 하 여 실내 온도에서 보관.
6. 확산 분석 결과
- 5 x 103 셀/200 μ α-MEM 96 잘 접시에서의 osteoclast 선구자로 씨앗 BMM. 각 잘을 100 ng/mL의 최종 농도 대 한 M-CSF를 추가 합니다.
- 안티-c-fms 항 체를 추가 (최종 농도 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL)와 37 ° C, 5% CO2 중간 변화 없이 3 일 동안에 품 어.
- 3 일 후, 1 x PBS로 세포 세척. 각 잘 100 μ α-MEM의 추가.
- 10 μ 키트 솔루션을 계산 하는 셀의 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 2 h에서 품 어 각 450에서의 흡 광도 결정 nm microplate 리더를 사용 하 여.
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Representative Results
이 프로토콜의 목적은 RANKL 또는 TNF-α, 존재 osteoclast 형성에 안티-c-fms 항 체의 효과 평가 하 고 osteoclast 선구자 확산에 M-CSF의 효과 결정 하. 이 프로토콜에서 우리는 순수 osteoclast 문화의 대량 생성 됩니다 신뢰할 수 있는 프로세스 제공. 우리는 또한 다른 문화 조건 osteoclast 형성 억제에 대 한 안티-c-fms 항 체 적당 한 농도 테스트 하는 방법 제공.
M에서 osteoclast 형성-CSF + RANKL 문화 안티-c-fms 항 체를 그림 1에 표시 됩니다. 1, 10 ng/mL 안티-c-fms 항 체, osteoclasts 제어 (0 ng/mL)에 비해 수가 크게 감소 했다. 100에서 1000 ng 안티-c-fms 항 체, osteoclasts 제어에 비해 수가 크게 감소 했다. 안티-c-fms 항 체와 M-CSF + TNF-α 문화에서 osteoclast 형성 그림 2에 표시 됩니다. 1 ng/mL 안티-c-fms 항 체에서 제어 (0 ng/mL)에 비해 osteoclasts 수가 크게 감소가 했다. 동안에 10, 100, 1000 ng/mL 안티-c-fms 항 체, osteoclasts 제어에 비해 수가 크게 감소 했다.
Osteoclast 선구자 문화 M-CSF + 안티-c-fms 항 체를 그림 3에 표시 됩니다. 1, 10, 100 ng/mL, osteoclast 선구자 제어 (0 ng/mL)에 비해 수에서 상당한 감소 했다 1000 ng/mL에서 osteoclast 선구자 제어에 비해 수가 크게 감소 했다. 이 농도가 1000 ng/mL로 높은 크게 osteoclast 선구자의 확산을 억제 하기 위해 필요한 것을 나타냅니다.
이 결과 RANKL의 50 ng/mL의 농도 사용 하는 동안 TNF-α의 100 ng/mL의 농도 osteoclasts의 동일한 수를 얻기 위해 필요 했던 osteoclasts 생산에서 RANKL의 강력한 자연에 대 한 정보를 제공 합니다. 이러한 두 가지이 방법 osteoclast 세대에 적합 하지만이 결정은 우수한 다운스트림 응용 프로그램 컨텍스트에서 시 약의 나중에 사용할 수에 따라 달라 집니다. 결과 표시, RANKL 사용 osteoclasts 생성을 TNF-α를 사용 하 여 해당 되지 않습니다.
이 프로토콜에서 우리 osteoclastogenesis, 억제 하기 위해 안티-c-fms 항 체를 사용 하 고 결과 보면, 우리 안티-c-fms 항 체 100 ng/mL의 농도 osteoclast 수 RANKL 우물에 상당한 감소를 생산 하기 위해 필요 했던 찾을. 안티-c-fms 항 체의 1000 ng/mL의 농도 안티-c-fms 항 체의 10 ng/mL의 농도 osteoclast에 상당한 감소를 생산 하는 데 필요한 했다 하는 동안 MCSF 확산 분석 결과, osteoclast 전조 확산을 억제 하기 위해 필요 했다 TNF-α 우물에 있는 수입니다.
그림 1: RANKL 유도 osteoclast 형성에 안티-c-fms 항 체의 효과. M-CSF, RANKL, 안티-c-fms 항 체의 다양 한 복용량으로 대우 했다 osteoclast 선구자의 현미경 관찰 (0, 1, 10, 100 및 1000 ng/mL) 4 일. 셀 고정 되었고 트랩 얼룩으로 물. M-CSF, RANKL, 안티-c-fms 항 체의 다양 한 농도와 배양 트랩-긍정적인 세포의 수 (0, 1, 10, 100 및 1000 ng/mL) 4 일. 셀 고정 되었고 트랩 얼룩으로 물. 트랩-긍정적인 세포의 수 평가 했다. 결과 평균 ± 사 우 스 다코타 4 개의 문화의 표현 되었다. Scheffe의 테스트를 사용 하 여 검색 통계 차이 (n = 4; * p < 0.01)입니다. 스케일 바 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: TNF-α 유도 osteoclast 형성에 안티-c-fms 항 체의 효과. M-CSF, TNF-α 및 안티-c-fms 항 체의 다양 한 복용량으로 대우 했다 osteoclast 선구자의 현미경 관찰 (0, 1, 10, 100 및 1000 ng/mL) 4 일. 셀 고정 되었고 트랩 얼룩으로 물. 트랩-긍정적인 세포 M-CSF, TNF-α, 안티-c-fms 항 체의 다양 한 농도와 배양의 수 (0, 1, 10, 100 및 1000 ng/mL) 4 일. 셀 고정 되었고 트랩 얼룩으로 물. 트랩-긍정적인 세포의 수 평가 했다. 결과 meanv ± 사 우 스 다코타 4 개의 문화의 표현 되었다. Scheffe의 테스트를 사용 하 여 검색 통계 차이 (n = 4; * p < 0.01)입니다. 스케일 바 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: osteoclast 선구자의 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과. 세포 M-CSF로 치료 했다 osteoclast 선구자의 생존 능력 및 안티-c-fms 항 체의 다양 한 복용량 (0, 1, 10, 100 및 1000 ng/mL) 3 일 동안. 키트-8 계산 셀 생존 능력을 측정 하기 위해 사용 되었다. 데이터는 M-CSF를 포함 하는 우물의 상대 활동을 비교 하는 비율로 표시 되는 + 안티-c-fms M-CSF를 포함 하는 우물 대 혼자 고 표현으로 의미 ± 사 우 스 다코타 4 개의 문화. Scheffe의 테스트를 사용 하 여 검색 통계 차이 (n = 4; * p < 0.01)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 연구에서 우리는 RANKL 유도 osteoclast 형성, TNF-α 유도 osteoclast 형성과 M CSF 유도 osteoclast 전조 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과 조사. 우리는 안티-c-fms RANKL 유도 osteoclast 형성, TNF-α 유도 osteoclast 형성과 osteoclast 선구자의 M CSF 유도 확산 중 osteoclastogenesis의 억제에 대 한 항 체의 효과적인 금액은 다른 것을 발견.
RANKL 중재 osteoclastogenesis M-CSF 생체 외에서, 존재 하 고 순위 null 마우스 경험 심한 osteopetrosis15, 이렇게 RANKL은 osteoclastogenesis에 대 한 의무 cytokine 있으며 개발 osteoclasts의 실패는 뼈 항상 성에 중요 한 규제 역할입니다. 따라서, RANKL 유도 osteoclast 형성을 제어할 수 있습니다 감소 뼈 질량을 제어할 수 있다. 그러나, 과도 한 억제가 발생 하면 뼈 항상성 유지 되지 않습니다. 이 실험에서 우리는 그 안티-c-fms 항 체 감소 osteoclast 형성 RANKL에 의해 유도 된 수 높은 농도 100 ng/mL에서 해야 보여줍니다.
TNF-α 중재 osteoclast 형성 osteolysis 파괴에 대 한 중요 한 표시 되었습니다 뼈 질병 류 마티스 관절염6,7, 치 주 질환 및 폐 경 후 골다공증8 고 여기 우리는 안티-c-fms 항 체는 10 ng/mL의 저 농도에서 TNF-α에 의해 중재 osteoclast 형성을 억제 쉽게 수 있습니다. 결과 안티-c-fms 항 체의 낮은 농도 pathologic 조건에서 osteoclastogenesis의 과정 감소 치료 값의 수 있지만 정상적인 조건에서 osteoclastogenesis에 최소한의 영향을 했을 제안 합니다.
M-CSF op/op 쥐 부족 Csf1 osteoclasts16. 의 완전 한 부족 osteopetrotic 형 M-CSF 표시에 대 한 코딩 하는 유전자로 osteoclast 형성을 위한 중요 한 요소 이다 M-CSF는 또한 osteoclast 선구자2의 생존을 촉진합니다. M-CSF 레벨 느슨한 관절 족18주위 활 액 액체에 심각한 만성 척추 염증17 을 류 마티스 관절염 환자의 혈 청에 증가 된다. TNF-α osteoclast 선구자에서 vivo에서 stromal 세포9M-CSF 유전자 발현을 유도 하는 결과 수를 늘립니다. 이러한 데이터에 비추어 우리 M-CSF TNF-α의 stromal 세포에 이러한 세포에서 M-CSF 생산에서 증가 일으키는 영향 염증의 중요 한 중재자는 가정할 수 있습니다.
그것은 알려졌다 M-CSF 폐 렴14동안 폐와 간 단 식 세포의 항균 기능 등 호스트 면역 반응에 중요 한 역할 놀이. 따라서, M-CSF의 과도 한 억제 발생 하는 경우 면역 반응을 감소 것 이다 가능성이 있다. 이 실험에서 우리는 안티-c-fms 항 체 (1000 ng/mL)의 매우 높은 농도 osteoclast 선구자 생존과 M-CSF에 의해 중재 확산을 억제 하는 데 필요한 했다 다는 것을 보였다. 이 결과 나란히 찍은이 농도 osteoclast 형성에 의해 유도 된 여분의 것 이다 동시에 낮은 농도에서 osteolytic 질병을 유도 하는 치료에서 TNF-α osteoclastogenesis 체포 하는 안티-c-fms 항 체 작동 수 있습니다 제안 RANKL와 M-CSF를 개장 하는 뼈에 대 한 수 있도록.
프로토콜에 중요 한 단계는 실험의 성공을 보장 하기 위해 신중 하 게 수행 해야 합니다. 처음에는 프로토콜의 해 부 하는 동안, 골 수의 오염을 피하기 위하여 뼈로 절단을 피하기 위해 중요 하다. 모든 골 수 추출, 세 정 절차 반복 해야 당 모든 골을 추출 될 때까지 필요한 보장 하기 위해 골 수를 추출 하는 과정을 셀의 높은 수익률을 제공할 것입니다. 시 약 테스트 등 여러 다운스트림 응용 프로그램에서이 프로토콜을 이용 될 수 있다 고는 안티-c-fms 항 체의 농도 시험 될 수 있다 결과의 잘못 된 해석을 방지 하는 방법을 제공 합니다. Osteoclast 형성을 억제 하는 데 필요한 했다는 안티-c-fms 항 체의 농도 같지 않습니다 방법 중 우리가 보여준 어떤 osteoclasts RANKL (TNF-α) 가져온, 따라서 어떤 결과 안티-c-fms의 농도 관해서는 있다 신중 하 게 조사 미래에 실험을 했다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 일부 JSP KAKENHI에 의해 지원 되었다 (No. 16 케이 11776 H. K., No. 17 K 17306 K. S., No. 16 K 20637 K. K., No. 16 K 20636 M. S., No. 18 K 나 m 09862 하 하 하 하.) 과학의 승진에 대 한 일본 사회에서 부여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-c-Fms antibody | AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a) | ||
| TNF-α | Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column. | ||
| RANKL | PEPROTECH | 315-11 | Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli |
| M-CSF | Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish. | ||
| α-MEM | Wako | with L-Glutamine and phenol red | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | s1820-500 | Fetal Bovine Serum French Origin |
| Culture dish | Corning | 100 mm x 20 mm style dish | |
| 96-well plate | Thermofischer Scientific | Nun clon Delta surface | |
| Cell counting kit-8 | Dojindo, Kumamoto, Japan | ||
| Microplate reader | Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan | ||
| Cell strainer | Corning | 40 μm Nylon | |
| Centrifuge tube | Corning | 50 mL CentriStar cap | |
| Triton X-100 | Wako | Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether |
References
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