Summary
Bu iletişim kuralı fare uzun kemik ve kemik iliği makrofajlar oluşturup Osteoklastlar makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör Kappa B ligand (RANKL) kullanarak üretmek için kemik iliği yalıtım, diseksiyon içerir veya tümör nekroz faktör alfa (TNF-α) ve anti-c-fms antikor, M-CSF reseptör tarafından onların tutuklama.
Abstract
Kemik remodeling karmaşık bir süreçtir ve ifade ve rezorpsiyonu dönemleri içerir. Kemik rezorpsiyonu tarafından kemik Osteoklastlar farklı uyaranlara yanıt olarak tarafından bozuldu bir süreçtir. Osteoklast öncüleri makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör Kappa B ligand (RANKL) yanıt olarak multinuclear Osteoklastlar içine ayırt etmek. Patolojik koşullarda sitokin profili farklıdır ve inflamatuar sitokinlerin karışımı içerir. Bu bölgelerde inflamatuvar mekanizmaları ile ilgili büyük miktarlarda bulunur gibi tümör nekrozis faktör alfa (TNF-α) en önemli sitokinler biridir. Hangi fare kemik iliği Osteoklastlar M-CSF ve RANKL veya daha sonra anti-c-fms antikor, reseptör doz artırarak inhibe TNF-α ile indüksiyon yoluyla oluşturmak için izole bir yöntem sağlamak amacıyla bu iletişim kuralının amacı olduğunu M-CSF. Bu deney anti-c-fms antikor inflamatuar kemik rezorpsiyonu hastalıklarında tedavi edici değerini vurgular.
Introduction
Osteoklastlar uzmanlaşmış hücrelerdir ve hematopoetik kök hücre birden çok Osteoklast öncüleri füzyonu sayesinde ayırt. Onlar romatoid artrit ve periodontal hastalık1gibi inflamatuar osteolitik hastalıklarla ilişkili patolojik kemik rezorpsiyonu katkıda ve sağlıklı kemik tadilat nedeniyle gereklidir.
Osteoclastogenesis ve Osteoklast işlevi iki anahtar faktör tarafından aracılı; makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör kappa B ligand (RANKL). M-CSF ve RANKL Osteoklast farklılaşma2için önemlidir. Kemik iliği makrofajlar tüp bebek üzerinden Osteoklast oluşumu ikna etmek için gösterilen başka bir tümör nekrozis faktör alfa (TNF-α)3,4,5faktördür. TNF-α Osteoliz romatoid artrit6, periodontal hastalık7ve Postmenopozal Osteoporoz8gibi yıkıcı kemik hastalıklarında için kritik olmak aracılı Osteoklast oluşumu gösterilmiştir.
C-fms M-CSF membran reseptör ve eylem aracılık eder. C-fms (anti-c-fms antikor) karşı bir antikor yönetimini tamamen osteoclastogenesis artrit modelinde tutuklandı yanı sıra TNF-α içinde kemik erozyonlar süre indüklenen gösterilmiştir gibi c-fms rolü de literatürde belgelenen iltihaplı eklem üzerinden uzak osteoclastogenesis hala sağlam9yaşındaydım. Anti-c-fms antikor İdaresi Osteoklast oluşumu ve kemik rezorpsiyonu fare calvariae10 de olduğu gibi LPS kaynaklı periodontitis modeli11. lipopolysaccharide (LPS) tarafından indüklenen inhibe Ayrıca, anti-c-fms antikor mekanik stres kaynaklı kök rezorpsiyonu ortodontik diş hareketi12, aynı zamanda Ortodonti diş hareketi sırasında ve ortodontik diş hareketi13ile ilişkili kemik rezorpsiyonu inhibe.
M-CSF konak immün yanıt için gerekli olan diğer işlevler için rapor edildi. M-CSF bakteriyel pnömoni ile op/op farelerde yokluğu bakteri yükü ve karaciğere hepatik nekroz14ile bakteri yayılmasını artış yol açar. Bu nedenle, M-CSF enfeksiyon korunmasında immünolojik yanıt için önemlidir.
Bu çalışmada anti-c-fms antikor etkisi M-CSF ve RANKL veya TNF-α Osteoklast oluşumu tüp bebek indüklenen ve M-CSF Osteoklast öncüleri yayılması indüklenen gösterir. Bu iletişim kuralı yalıtım fare kemik iliği hücrelerinin uzun kemiklerde ve Osteoklast öncüleri kabul edilmektedir kemik iliği makrofajlar (BMM) oluşturmak ve BMM farklılaşma multinuclear Osteoklastlar içine iki tarafından ikna etmek için adımları gösterir yöntemleri; RANKL veya TNF-α. Protokol Ayrıca anti-c-fms antikor kullanarak her iki yöntem de osteoclastogenesis tutuklanması karşılaştırır.
Hangi kemik iliği çıkarılan ve daha sonra Osteoklast öncüleri oluşturmak için kullanılan büyük miktarlarda uyuşturucu testi gibi birden çok downstream uygulamalarında kullanılan saf Osteoklast kültürlerin üretiminde güvenilir işlemidir. RANKL ya da TNF-α osteoclastogenesis bu protokolündeki ikna etmek için osteoclastogenesis fizyolojik bir süreç (RANKL) olarak osteoclastogenesis hangi sırayla rehberlik için iki alternatif yordam sağlar bir patolojik süreç olarak (TNF-α) ayıran bir aşağı akım uygulamalarda kullanılmak üzere reaktifleri açısından üstün olduğu karar. Bu iletişim kuralı Ayrıca hangi tarafından biz güvenli bir şekilde daha sonraki çalışmalar kemik rezorpsiyonu ve osteolitik hastalıklar için kullanılan anti-c-fms antikor uygun bir konsantrasyon belirleyebilirsiniz bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan yordamlar ve hayvan bakımı Tohoku Üniversitesi kurallara ve düzenlemelere göre yapıldı.
1. fare Hindlimb diseksiyon ve işleme
- Diseksiyon önce bir tabak α-MEM konteyner boyutuna bağlı olarak yaklaşık 50 mL ile doldurun ve Buza koyun. Tüm kemikler diseksiyon tamamlanana kadar bu bir koleksiyon kapsayıcı olarak görev yapacak. Bu ve sonraki deneyler, α-MEM içeren % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 IU/mL penisilin G ve 100 μg/mL streptomisin kullanın.
- C57Bl/6J fare %5 isoflurane aşırı dozda inhalasyon tarafından ötenazi.
- Avuç içi ve ayak ve % 70 etanol ile iyice sprey ile deldi iğne kullanarak bir sırtüstü pozisyonda fare düzeltmek.
- Steril Cerrahi makas ve cımbız kullanarak kalça düzeyinde bir cilt kesi yapmak ve kasları açığa feet aşağı genişletir.
- Kuadriseps kas ekleme tendon ve hamstring kas kemik ekleme tendon kesti. Kalça ve diz eklem açığa kasları peel Away. Bu tendonlar bulma yumuşak doku Etiketler terk etmeden her iki kas onların eklerinden boşaltma kolay olmayacaktır. Kemiğin içine kesme.
- Makas uyluk kemiği başı ve ortak alanı arasında konumlandırın ve femur azat ama kemik olduğu gibi tutmak kesti. Bu dekolmanı kemik kemik iliği görünmesi riski olmadan sağlar.
- Benzer şekilde tibia bağlama kasları Kes gitsin. Onun ekten ücretsiz tibia kemik kirlenmesini önlemek için olduğu gibi tutmak ayak bileği eklemi kes.
- Femur ve tibia makas bıçakları ve kimwipe kullanarak herhangi bir kalan yumuşak dokudan raspa ve α-MEM buza yerleştirilir ile bir tabak içinde yerleştirin.
2. fare Hindlimb kemik iliği yalıtım
- 30 G iğne şırınga α-MEM ile doldurun.
- Diz eklemi uzak femur ve tibia kesmek.
- Makas kullanarak her iki taraftan uzun kemik ucu kesilmiş.
- Cımbız kullanarak şaft kemiğinden tutun, kemik iliği uzaya iğne yerleştirin ve yavaş yavaş bir 6 cm kültür tabak içine kemik iliği içeriğini floş. Kemik kemik iliği içeriğin tümü ayıklama gösteren beyaz görünür. Tüm kemikler için yineleyin.
- Zorlanma kemik iliği ayıklamak bir 50 mL konik santrifüj tüpü ve 5 min için 300 x g , santrifüj içine bir 40 mikron naylon hücre süzgeç kullanarak.
- Süpernatant atmak, α-MEM 5 mL ile yıkayın ve 300 x g 5 dakika süreyle de tekrar yıkama 2 kez olmak üzere toplam santrifüj kapasitesi.
-
Pelet α-MEM 10 mL resuspend ve bir hemasitometre aşağıdaki gibi kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirin:
- 1:1 seyreltme hücre süspansiyon hücre süspansiyon 10 μL %0,4 trypan bir 1,5 mL tüp içinde mavi 10 μL ekleyerek yapmak ve bir kez pipet.
- Hemasitometre odası ile bir slayt kapak kapak ve boya süspansiyon hemasitometre için transfer. Değil bantlayın veya odası underfill ve süspansiyon odası kılcal eylem tarafından doldurmak izin vermek önemlidir.
- Hemasitometre mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin. 10 x amacı istimal, Merkez meydan odaklanmak. 3 çizgilerle bağlı tüm hücreleri saymak. Hücreleri iki kez sayılmaz emin olmak için her bir kare ve sağ üst köşelerine saymak. Ölü hücreleri koyu mavi görünür, bunlar sayımdan hariç tutulur.
- Aşağı akım uygulamaya bağlı olarak, hücre bir uygun kültür gemi tohum. Bu özel deneme için Bölüm 3 izleyin.
3. nesil BMM
- Tohum 1 x 107 hücreler/10 mL 10 cm çanak kültür ve M-CSF 100 ng/mL ekleyin. Son M-CSF 100 ng/mL kültür ortamının bölgedir. Kültür 37 ° c, % 5 CO2 3 gün kuluçkaya.
- 3 gün sonra kültür orta kaldırmak, fosfat tamponlu tuz (PBS) iki kez yapışık olmayan hücreleri kaldırmak, oda sıcaklığında %0.02 tripsin-EDTA 5 mL eklemek için 10 mL şiddetle hücrelerle PBS içinde yıkayın ve 37 ° c, % 5 CO2 5 min için kuluçkaya.
- Hücreleri ayrıntılı pipetting tarafından bağlantısını kesin. Kültür (hücreleri yuvarlak ve medya kayan görünmesi gereken) bir mikroskop altında gözlemleyerek hücreleri ayırdıktan olduğunu emin olun. Hücreleri bağlı kalır, iyice onları ayırmak için pipetting işlemini yineleyin. Hücreleri müstakil, 5 mL tepki devre dışı bırakabilirsiniz için α-MEM de ekleyin.
- 50 mL konik tüp ve 5 dk. atma süpernatant 300 x g , santrifüj içine hücreleri toplamak ve α-MEM 5 mL ile yıkayın.
- 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve Pelet α-MEM 10 mL resuspend.
- Daha önce 2.7.1. adımda açıklandığı gibi bir hücre sayısı gerçekleştirin.
- Tohum 1 x 106 hücreler/10 mL 10 cm çanak kültür ve M-CSF 100 ng/mL ekleyin. Son M-CSF 100 ng/mL kültür ortamının bölgedir. Kültür 37 ° c, % 5 CO2 3 gün kuluçkaya.
4. nesil Osteoklastlar BMM üzerinden Osteoklast öncüleri olarak
- 3 gün sonra BMM adımları 3.2-3.7 takip Osteoklast öncüleri temsil bağlı hücre hasat.
- Tohum BMM, 5 x 104 hücreleri/200 μL α-MEM 96 iyi plaka. RANKL 50 ng/mL veya TNF-α son bir konsantrasyon 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. M-CSF 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için her şey için ekleyin.
- Anti-c-fms antikor Ekle (0, 1, 10, 100, son konsantrasyonları 1000 ng/mL) her şey için.
- 37 ° c, % 5 CO2 4 gün kuluçkaya. Medya 4 gün boyunca her gün değiştirin.
5. tartarat dayanıklı asit fosfataz (tuzak) leke
- Kuluçka 4 gün sonra yavaşça her şey kültür orta Aspire edin. Her oda sıcaklığında 1 x PBS 200 μL ile de bir kez yıkayın.
- Her şey fiksasyon için % 10 formalin 200 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Formalin Aspire edin ve her şey 3 kez deiyonize su ile yıkayın.
- 0,2 her PBS Triton X-100 permeabilization için iyi ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya % 200 μL ekleyin. Triton X-100 Aspire edin ve her şey 3 kez deiyonize su ile yıkayın.
- TUZAK leke çözüm 200 μL her şey için ekleyin. Mikroskop altında leke görselleştirin. Üzerinden düzgün geliştirmek leke için 10-30 dakika sürer.
- Leke ve her deiyonize su ile 3 kez iyi ve kuru hava yıkama Aspire edin. Daha fazla gözlem kullanmak için oda sıcaklığında tutmak.
6. nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil
- Tohum BMM Osteoklast öncüleri, 5 x 103 hücreleri/200 μL, α-MEM 96 iyi plaka olarak. M-CSF 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için her şey için ekleyin.
- Anti-c-fms antikor Ekle (0, 1, 10, 100, son konsantrasyonları 1000 ng/mL) ve 37 ° c, % 5 CO2 orta değiştirmek olmadan 3 gün kuluçkaya.
- 3 gün sonra 1 x PBS hücrelerle yıkayın. α-MEM 100 μL her şey için ekleyin.
- 10 μL seti çözüm sayma Hücre Ekle ve 37 ° c, % 5 CO2 2 h için kuluçkaya ve 450 her kuyuda Absorbans belirlemek Mikroplaka okuyucu kullanarak nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı Osteoklast oluşumu RANKL veya TNF-α huzurunda anti-c-fms antikor etkisini değerlendirmek ve M-CSF Osteoklast öncüleri yayılması üzerindeki etkisini belirlemek için amaçtır. Bu protokol için biz güvenilir bir süreç büyük miktarlarda saf Osteoklast kültürler tarafından oluşturulduğu sağladı. Biz de farklı kültür koşullar altında Osteoklast oluşumu inhibe için uygun toplama anti-c-fms antikor test etmek için bir yol sağladı.
M Osteoklast oluşumunda-CSF + RANKL kültür anti-c-fms antikor ile şekil 1' de gösterildiği. 1, 10 ng/mL anti-c-fms antikor, kontrol (0 ng/mL) karşılaştırıldığında Osteoklastlar sayısı önemli hiçbir azalma oldu. 100 iken, 1000 ng anti-c-fms antikor, Osteoklastlar denetimine göre sayısı önemli bir azalma oldu. M-CSF + TNF-α kültürü ile anti-c-fms antikor Osteoklast oluşumunda Şekil 2' de gösterilmiştir. 1 ng/mL anti-c-fms antikor kontrol (0 ng/mL) karşılaştırıldığında Osteoklastlar sayısı önemli hiçbir azalma vardı. Süre 10, 100, 1000 ng/mL anti-c-fms antikor, Osteoklastlar denetimine göre sayısı önemli bir azalma oldu.
Osteoklast öncüleri kültür M-CSF + anti-c-fms antikor ile şekil 3' te gösterilmiştir. 1, 10, 100 ng/mL, kontrol (0 ng/mL), karşılaştırıldığında Osteoklast öncüleri sayısı önemli hiçbir azalma oldu, 1000 ng/mL iken, denetimine göre Osteoklast öncüleri sayısı önemli bir azalma oldu. Bu 1000 ng/mL yüksek bir konsantrasyon önemli ölçüde Osteoklast öncüleri proliferasyonunu inhibe gerektiğini gösterir.
Bu sonuçlar bir konsantrasyon 50 ng/mL RANKL kullanıldı ve TNF-α 100 ng/mL bir konsantrasyon Osteoklastlar aynı sayıda almak için gerekli süre Osteoklastlar üretiminde RANKL sağlam yapısı hakkında bilgi sağlar. Bu yöntemlerin her ikisi de Osteoklast üretimi için uygundur ama hangi kararın üstün daha sonra kullanılmak üzere aşağı akım uygulanması reaktifleri içinde belgili tanımlık bağlam bağlıdır. Sonuçlar gösterir gibi RANKL kullanarak TNF-α Osteoklastlar oluşturmak için kullanılmasıyla aynı işlevi değil.
Bu iletişim kuralı, anti-c-fms antikor osteoclastogenesis inhibe yapardık ve sonuçlarına bakarak tarafından 100 ng/mL anti-c-fms antikor bir konsantrasyon Osteoklast numarası RANKL Wells önemli azalma üretmek için gerekli bulabilirsiniz. Bir konsantrasyon 1000 ng/mL anti-c-fms antikor sadece 10 ng/mL anti-c-fms antikor bir konsantrasyon Osteoklast önemli azalma üretmek için gerekli süre Osteoklast habercisi yayılması MCSF nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil, etkisizleştirmek için ihtiyaç vardı TNF-α Wells numarası.
Şekil 1: anti-c-fms antikor RANKL kaynaklı Osteoklast oluşumu üzerine etkisi. M-CSF, RANKL ve çeşitli anti-c-fms antikor doz ile tedavi edildi Osteoklast öncüleri mikroskobik gözlem (0, 1, 10, 100 ve 1000 ng/mL) 4 gün için. Hücreleri sabit ve tuzak boyama ile lekeli. M-CSF, RANKL ve çeşitli anti-c-fms antikor konsantrasyonları ile kültürlü tuzak-pozitif hücre sayısı (0, 1, 10, 100 ve 1000 ng/mL) 4 gün için. Hücreleri sabit ve tuzak boyama ile lekeli. TUZAK-pozitif hücre sayısı değerlendirildi. Sonuçları ortalama ± SD dört kültürler ifade edildi. İstatistiksel farklar Scheffe'nın testleri kullanılarak algılandı (n = 4; * p < 0,01). Ölçek çubukları 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: anti-c-fms antikor TNF-α-indüklenen Osteoklast oluşumu üzerine etkisi. M-CSF, TNF-α ve çeşitli anti-c-fms antikor doz ile tedavi edildi Osteoklast öncüleri mikroskobik gözlem (0, 1, 10, 100 ve 1000 ng/mL) 4 gün için. Hücreleri sabit ve tuzak boyama ile lekeli. M-CSF, TNF-α ve çeşitli anti-c-fms antikor konsantrasyonları ile kültürlü tuzak-pozitif hücre sayısı (0, 1, 10, 100 ve 1000 ng/mL) 4 gün için. Hücreleri sabit ve tuzak boyama ile lekeli. TUZAK-pozitif hücre sayısı değerlendirildi. Sonuçları meanv ± dört kültürlerin S.D. ifade edildi. İstatistiksel farklar Scheffe'nın testleri kullanılarak algılandı (n = 4; * p < 0,01). Ölçek çubukları 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: anti-c-fms antikor Osteoklast habercisi yayılması üzerine etkisi. Hücre M-CSF ile tedavi edildi Osteoklast öncüleri canlılığı ve çeşitli anti-c-fms antikor doz (0, 1, 10, 100 ve 1000 ng/mL) 3 gündür. Kit-8'i sayma hücre canlılığı ölçmek için kullanıldı. M-CSF içeren Wells göreli etkinliğini karşılaştırmak için yüzde olarak sunulan verilerin + anti-c-fms M-CSF içeren wells karşı yalnız ve ifade olarak ortalama ± SD dört kültürlerin. İstatistiksel farklar Scheffe'nın testleri kullanılarak algılandı (n = 4; * p < 0,01). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, biz anti-c-fms antikor RANKL kaynaklı Osteoklast oluşumu, TNF-α-indüklenen Osteoklast oluşumu ve M-CSF-indüklenen Osteoklast habercisi yayılması üzerindeki etkisini araştırdık. Biz anti-c-fms antikor osteoclastogenesis RANKL kaynaklı Osteoklast oluşumu, TNF-α indüklenen Osteoklast oluşumu ve M-CSF-indüklenen yaygın Osteoklast öncüleri arasında inhibisyonu için etkili miktarı farklı olduğunu fark ettik.
RANKL aracılık eder osteoclastogenesis M-CSF tüp bebek huzurunda ve sırası boş fareler deneyim şiddetli osteopetrosis Osteoklastlar başarısız bu nedenle RANKL osteoclastogenesis için zorunlu bir sitokin ve sahip15, geliştirmek için bir kemik homeostazı önemli düzenleyici rol. Bu nedenle, eğer RANKL kaynaklı Osteoklast oluşumu kontrol edilebilir, azalma kemik kitle kontrol edilebilir. Ancak, aşırı bastırma ortaya çıkarsa, kemik homeostazı korunmaz. Bu deneyde, gösterdiğimiz o anti-c-fms antikor yüksek konsantrasyon 100 ng/mL RANKL tarafından indüklenen Osteoklast oluşumunu azaltmak muktedir olmak gerekiyor.
TNF-α aracılı Osteoklast oluşum mekanizmaları yıkıcı içinde için kritik olmak gösterilen kemik romatoid artrit6, periodontal hastalık7ve8 Postmenopozal Osteoporoz gibi hastalıkların ve işte o anti-c-fms göstermektedir antikor kolayca düşük konsantrasyon 10 ng/mL TNF-α tarafından aracılı Osteoklast oluşumu inhibe olabilir. Sonuç anti-c-fms antikor düşük konsantrasyon osteoclastogenesis patolojik koşullarda işlemini azaltmak için tedavi değeri olabilir ama osteoclastogenesis en az düzeyde etkisi normal koşullarda gerekir öneriyor.
M-CSF Osteoklast oluşum olarak Csf1 M-CSF göstermelik bir osteopetrotic fenotip Osteoklastlar16. tam eksikliği nedeniyle kodlama gen eksikliği op/op fareler için önemli bir faktördür M-CSF Ayrıca Osteoklast öncüleri2yaşama teşvik etmektedir. M-CSF düzeyleri şiddetli Ankilozan Spondilit17 Romatoid Artritli hastaların serum ve gevşek eklem protezi18etrafında synovial sıvı artmıştır. TNF-α Osteoklast öncüleri vivo içinde M-CSF gen ekspresyonu stromal hücreler9inducing sonucu sayısını artırır. Bu veriler ışığında biz M-CSF inflamasyon TNF-bu hücreler M-CSF üretiminde artışa neden olan α stromal hücreler üzerinde etkisi nedeniyle önemli bir arabulucu olduğunu sonucuna varabiliriz.
Bu M-CSF önemli bir rol konak immün yanıt akciğer ve karaciğer Mononükleer fagositler antimikrobiyal fonksiyonları gibi zatürree14sırasında çalış bildirilmiştir. Bu nedenle, aşırı M-CSF bastırılması ortaya çıkarsa, bağışıklık yanıtı azalacak bir olasılık yoktur. Bu deneyde, biz anti-c-fms antikor (1000 ng/mL) çok yüksek yoğunlukta Osteoklast öncüleri hayatta kalma ve M-CSF tarafından aracılı yayılması etkisizleştirmek için gerekli olduğunu gösterdi. Yan yana alınan bu sonuç aynı zamanda bu konsantrasyon tarafından indüklenen Osteoklast oluşumu bağışlayacağımı düşük konsantrasyon osteolitik hastalıklar tedavi TNF-α osteoclastogenesis tutuklamaya indüklenen gibi o anti-c-fms antikor çalışabilir öneririz RANKL ve M-CSF gerçekleşmesi için remodeling kemik için izin verir.
Protokolündeki kritik adımları dikkatlice deneme başarılı olmasını sağlamak için yapılması gerekiyor. Diseksiyon sırasında başlangıçta iletişim kuralı, kemik iliği kirlenmesini önlemek için kemik içine kesme önlemek önemlidir. Kemik iliği tüm kemik iliği çıkarılan, reçeteye göre sarf yordamı başına kadar tüm kemik iliği çıkarılan, gerekli yinelenmelidir emin olmak için çıkarma sürecinde hangi hücrelerin yüksek verim sağlar. Bu iletişim kuralı-ebilmek var olmak kullanmak gibi reaktif test, birden çok uygulamada aşağı akım, ve ayrıca hangi anti-c-fms antikor konsantrasyonu sonuçlarının yanlış yorumun kaçınarak test edilebilir bir yol sağlar. Osteoklast oluşumu engellemek için gerekli anti-c-fms antikor konsantrasyonu gösterdik gibi yöntemler arasında eşit değildir hangi Osteoklastlar (RANKL veya TNF-α) elde edildi tarafından böylece anti-c-fms konsantrasyonu ile ilgili olarak elde edilen herhangi bir sonuç var dikkatli olmak için gelecekte deneyler incelenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser kısmen JSP'ler KAKENHI tarafından desteklenen bilim promosyon (No. 16 K 11776 H. K., No 17 bin 17306 K. S., No. 16 K 20637 K. K., No. 16 K 20636 M. S., No 18 K 09862 ı. M için için için için için.) Japonya toplumdan verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-c-Fms antibody | AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a) | ||
| TNF-α | Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column. | ||
| RANKL | PEPROTECH | 315-11 | Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli |
| M-CSF | Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish. | ||
| α-MEM | Wako | with L-Glutamine and phenol red | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | s1820-500 | Fetal Bovine Serum French Origin |
| Culture dish | Corning | 100 mm x 20 mm style dish | |
| 96-well plate | Thermofischer Scientific | Nun clon Delta surface | |
| Cell counting kit-8 | Dojindo, Kumamoto, Japan | ||
| Microplate reader | Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan | ||
| Cell strainer | Corning | 40 μm Nylon | |
| Centrifuge tube | Corning | 50 mL CentriStar cap | |
| Triton X-100 | Wako | Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether |
References
- Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).
- Teitelbaum, S. L.
- Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).
- Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).
- Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).
- Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).
- Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).
- Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
- Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).
- Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).
- Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).
- Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).
- Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).
- Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).
- Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).
- Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).
- Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).
- Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).
