ATAC-seq Assay med låg Mitokondrie-DNA kontaminering från primära humana CD4 + T-lymfocyter

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra ett test för transposase-tillgänglig kromatin sekvensering (ATAC-seq) på aktiverade CD4 + mänskligt lymfocyter. Protokollet har modifierats för att minimera kontaminering Mitokondrie DNA läsningar från 50% till 3% genom införandet av en ny lyseringsbuffert.

Abstract

ATAC-seq har blivit en allmänt använd metod i studiet av epigenetik på grund av dess snabba och enkla strategi att mappning av genome-wide tillgängliga kromatin. I denna uppsats presenterar vi ett förbättrat ATAC-seq-protokoll som minskar kontaminerande Mitokondrie DNA läsningar. Medan tidigare ATAC-seq protokoll har kämpat med läser i genomsnitt 50% kontaminerande Mitokondrie-DNA, optimerad lyseringsbuffert infört i protokollet minskar Mitokondrie DNA-kontaminering till i genomsnitt på 3%. Detta förbättrade ATAC-seq-protokollet möjliggör en nära 50% minskning av sekvensering kostnaden. Vi visar hur dessa högkvalitativa ATAC-seq bibliotek kan framställas från aktiverade CD4 + lymfocyter, som tillhandahåller stegvisa instruktioner från CD4 + lymfocyter isolering från helblod genom analys av data. Detta förbättrade ATAC-seq-protokollet har validerats i en rad olika celltyper och kommer att vara till omedelbar nytta för forskare som studerar kromatin tillgänglighet.

Introduction

Analysen för transposase-tillgänglig kromatin sekvensering (ATAC-seq) har snabbt blivit den ledande metoden för förhör kromatin arkitekturen. ATAC-seq kan identifiera regioner av tillgängliga kromatin genom processen för tagmentation, fragmentera och taggning av DNA av samma enzym, att producera bibliotek som sekvensering kan bestämma kromatin tillgänglighet över en hela arvsmassa. Denna tagmentation process medieras av den hyperaktiva Tn5 transposase, som endast skär öppna regioner av kromatin på grund av nucleosomic Sterisk hinder. Eftersom det skär, skär den Tn5 transposase också sekvensering adaptrar som möjliggör snabb bibliotek konstruktion med PCR och nästa generations sekvensering av genome-wide tillgängliga kromatin^1,2.

ATAC-seq har blivit rekommenderad metod för att bestämma regioner av kromatin tillgänglighet på grund av relativt enkel och snabb protokoll, kvalitet och utbud av information som kan vara beslutsam från dess resultat, och liten mängd utgångsmaterial krävs. Jämfört med DNAS-seq³ (som också mäter genome-wide kromatin tillgänglighet), MNase-seq⁴ (som bestämmer nukleosomens positioner i öppen genomet regioner) och formaldehyd-medierad FAIRE-seq⁵, ATAC-seq är snabbare, billigare och mer reproducerbar¹. Det är också mer känsliga, arbeta med utgångsmaterial för så få som 500 kärnor, jämfört med 50 miljoner atomkärnor krävs för DNAS-seq³. ATAC-seq har också möjlighet att ge mer information om kromatin arkitekturen än andra metoder, inklusive regioner av transkription faktorn bindande, nukleosomens placering och öppna kromatin regionerna¹. Effektiva, encelliga ATAC-seq protokoll har validerats, tillhandahålla information om kromatin arkitektur vid enskild cell nivå^6,7.

ATAC-seq har använts för att karakterisera kromatin arkitektur över ett brett spektrum av typer av forskning och celler, inklusive växter⁸, människor⁹och många andra organismer. Det har också varit kritiska att identifiera epigenetisk reglering av sjukdom staterna⁷. Protokollet används mest ATAC-seq innehåller dock den stora nackdelen med kontaminering sekvensering läsningar av Mitokondrie-DNA. I vissa datauppsättningar, kan denna förorening vara så hög som 60% av sekvensering resultat¹. Det finns en samlad insats i fältet för att minska dessa kontaminerande mitokondriell läsningar för att möjliggöra en effektivare tillämpning av ATAC-seq^7,10,11. Här presenterar vi ett förbättrat ATAC-seq-protokoll som minskar andelen kontaminering av Mitokondrie DNA till bara 3%, vilket gör att minskning på cirka 50% sekvensering kostnader¹⁰. Detta möjliggörs genom en strömlinjeformad process av CD4 + lymfocyter isolering och aktivering och en förbättrad lyseringsbuffert som är avgörande för att minimera Mitokondrie DNA-kontaminering.

Denna modifiedATAC-seq-protokollet har validerats med ett brett utbud av primära celler, inklusive människans primära perifera mononukleära blodceller (PBMC)¹⁰, människans primära monocyter och mus dendritiska celler (opublicerade). Det har även använts framgångsrikt att förhöra melanom cell linjer i en klustrad regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) skärm av icke-kodande elements¹¹. Dessutom förser Filpaketet data analys beskrivs i detta protokoll och som anges på GitHub nya och erfarna forskare med verktyg för att analysera ATAC-seq data. ATAC-seq är den mest effektiva analysen att mappa kromatin tillgänglighet över en hela arvsmassa, och ändringar av befintliga protokoll som införs här gör att forskare att producera högkvalitativa data med låg Mitokondrie DNA kontaminering, att minska sekvensering kostnader och förbättra ATAC-seq genomströmning.

Protocol

Detta förbättrade protokoll innehåller stegvisa instruktioner för att utföra ATAC-seq av CD4 + lymfocyter, från utgångsmaterialet helblod genom dataanalys (figur 1).

1. isolering av CD4 + T-celler från helblod

Obs: Utgångsmaterialet för detta protokoll är 15 mL av färskt helblod samlas in med hjälp av standardiserade förfaranden, så att källan av utgångsmaterialet väljas baserat på forskningsbehov. Skala protokollet som behövs. Pre varm fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 2% fetalt kalvserum (FCS) till rumstemperatur (RT) och justera centrifugen RT innan du startar CD4 + T cell anrikning proceduren.

1. Lägga till 750 µL av humana CD4 + T cell anrikning cocktail i 15 mL helblod i en 50 mL konisk tub och blanda försiktigt genom inversion. Inkubera vid RT i 20 min. När ruvningen är klar, tillsätt 15 mL PBS + 2% FCS till röret och blanda försiktigt genom inversion.
2. Förbereda en färsk 50 mL koniska tub med 15 mL densitet medium. Noggrant lager utspätt blodprovet på toppen av densitet medium, att vara säker på att inte störa gränssnittet densitet medium/blod som bildar. Centrifugera i 20 min på 1,200 x g och RT med acceleration anges till 1 och fallande bromsen OFF.
   Obs: Det är viktigt att ställa accelerationen 1 och fallande broms OFF på centrifugen att undvika störningar av lagrets cell densiteten medium.
3. Samla de berikade CD4 + T-cellerna från gränssnittet densitet medium platt med smala stammen överföring pipett. Överföra de insamlade cellerna till en färsk 50 mL koniska tub. Centrifugera de insamlade CD4 + T-cellerna i 8 min på 423 x g och RT.
   Obs: Kontrollera att återvända centrifug accelerationen till 9 och fallande broms på ON för steg 1.3 och alla följande steg.
4. Avlägsna supernatanten och tvätta cellpelleten två gånger med 50 mL PBS + 2% FCS, centrifugering i 8 min på 423 x g och RT. Kassera slutliga supernatanten tvätta och centrifugerade tvättade cell i 2 mL PBS + 2% FCS.
5. Räkna celler som använder en hemocytometer. För att fortsätta med ATAC-seq, Fortsätt till steg 2,3. Om du vill låsa celler för senare bearbetning, Fortsätt till steg 1,6.
6. Tillsätt 1 mL färsk frysning medium (90% FCS + 10% dimetyl sulfoxid) per 1 miljon celler. Alikvotens 1 mL av celler i frysning medium i kryogena säkra rör. Placera rören vid-80 ° C över natten i en långsam frysning behållare. Nästa dag, överföra rören till flytande kväve för långsiktig lagring.
   Obs: 1 miljon CD4 + T-celler kommer att isoleras per 2 mL av ursprungliga volym helblod. Frysa 500.000 celler i 1 mL alikvoter av frysning medium. Se färska frysning medium vid varje användning.

2. Aktivera och rena CD4 + T-celler

Obs: Denna snabba protokoll för aktivering och renande CD4 + T-celler endast kräver 48 h och resultat i 95% livskraftiga, aktiverade CD4 + T celler. Cool centrifugen till 4 ° C före början av protokollet.

1. Tina 1 injektionsflaska (500 000) av CD4 + T-celler i 37 ° C vattenbad tills isen just har smält. Försiktigt överför celler till en 15 mL koniska rör innehållande 9 mL före värmde Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) media kompletteras med 10% FCS, hädanefter kallad komplett RPMI.
   Obs: Låt inte celler Tina helt för att undvika exponering för DMSO.
2. Centrifugera i 6 min vid 1500 x g och 4 ° C. Avlägsna supernatanten och försiktigt centrifugerade i 2 mL komplett RPMI. Upprepa spinn ner, avlägsna supernatanten och försiktigt avbryta celler i 0,5 mL av komplett RPMI.
3. Räkna de celler som använder en hemocytometer. Justera tätheten på cellsuspension med komplett RPMI till tallrik 50.000 celler i 200 µL per brunn 96 brunnar rund botten platta.
   Obs: Från en fryst tub 500K CD4 + T-celler, plattan 10 brunnar av 50.000 CD4 + T-celler i 200 µL per brunn.
4. Förbereda magnetiska pärlor konjugerat med humana T-aktivator anti-CD3 och anti-CD28 antikroppar.
   1. Alikvotens 12,5 µL humant T-aktivator CD3/CD28 pärlor per ATAC-seq prov till ett 1,5 mL rör. Tvätta pärlorna med 1 mL 1 x PBS och placera röret på en magnet för 1 min.
   2. Försiktigt bort och kassera klara supernatanten, ta bort röret från magnet och avbryta pärlorna i 13 µL slutföra RPMI per ATAC-seq prov.
      Obs: Beräkna mängden pärlor nödvändig baserat på antalet ATAC-seq prover bearbetas. Detta protokoll kräver 12,5 µL av CD3/CD28 pärlor per 500 000 celler, som utgör ett ATAC-seq prov.
5. Aktivera CD4 + T-cellerna. Samla in 500 000 celler i 2,1 mL för komplett RPMI medium i en 15 mL konisk slang och lägga till 12,5 µL av Förtvättat human T-aktivator pärlor. Blanda försiktigt genom att vända tuben.
6. Försiktigt överför cellerna med pärlor till en steril behållare och plattan 200 µL celler med pärlor per brunn av rund bottenplattan med 96 brunnar med flerkanalig pipett. Inkubera i 48 h i en 37 ° C, 5% CO₂ inkubator.
7. Efter inkubation, Centrifugera plattan med 96 brunnar i 8 min på 423 x g och RT. bort 100 µL av medium per brunn från den plattan med 96 brunnar, att samla in det till ett koniskt rör innan kasta för att säkerställa bibehållen pärla. Återsuspendera cellpelleten i de resterande 100 µL och samla allt i en 1,5 mL tub.
   Obs: 10 brunnar av aktiverade T-celler kommer att samlas i en 1 mL volym.
8. Utföra CD4 + isolering. Tillsätt 50 µL av Förtvättat CD4 konjugerat pärlor till 500.000 celler i 1 mL av komplett RPMI. Kombinera pärlor och celler med pipett. Inkubera i 20 minuter vid 4 ° C i kylskåpet. Agitera pärlor och cell blandning varje 6 min.
   Obs: Detta protokoll är att användas för ett prov av 500.000 celler. Justera vid behov för två eller flera prover av 500.000.
9. När ruvningen är klar placera röret på magneten för 2 min. avlägsna och Kassera supernatanten när klart. Tvätta pärla-bundna cellerna genom att ta bort röret från magneten, avbryta pärla-bundna cellerna i 1 mL PBS + 2% FCS, ersätta röret på magneten för 1 min och kasta klara supernatanten. Upprepa denna process för sammanlagt 3 tvättar.
   Obs: Var noga med att inte kasta någon pärlor under tvättar.
10. Efter den sista tvättningen, placera röret på magneten för 1 min. ta bort och Kassera supernatanten och placera pelleten på isen. Fortsätt till avsnitt 3 (ATAC-seq).

3. ATAC-seq

Obs: I det här steget är kärnor isolerade från aktiverade CD4 + T-celler för ATAC-följande punkter Den lyseringsbuffert som används i detta protokoll har förbättrats för att vara skonsammare atomkärnor, vilket resulterar i effektivare matsmältning och högre kvalitetsresultat. Alla centrifugering steg i avsnitt 3 utförs med en fast vinkel centrifug hålls vid 4 ° C. Cool centrifugen innan du börjar protokoll.

1. Utföra atomkärnor isolering. Återsuspendera pärlor och celler med kall lyseringsbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,03% polysorbat 20). Centrifugera omedelbart 500 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Avlägsna och Kassera supernatanten.
2. Utföra transposase reaktionen. Centrifugerade isolerade atomkärnor med 50 µL av Tn5 transposase mix (tabell 1). Inkubera i en termocykler under 30 minuter vid 37 ° C med 40 ° C lock, holding vid 4 ° C när du är klar.
3. Efter termocykling, omedelbart utföra en snabb bänkmonterade centrifug spinn ner och placera röret på magneten för 1 min att ta bort pärlorna från produkten.
4. Överföra klara supernatanten från röret på magneten till en kolumn för rening av DNA. Tvätta kolonnen en gång med 250 µL buffert PB och två gånger med 750 µL buffert PE. Eluera provet i 10 µL eluering buffert. Vidare direkt till steg 3.5.
   Obs: Detta steg förstärker de DNA-fragment med ligated adaptrar, här kallade ATAC-seq biblioteket. För att sammankoppla flera ATAC-seq-bibliotek för att köras på en NGS lane, Använd icke indexerade Primer 1 alla prover och en annan indexerade Primer 2 för enskilda prover (tabell 2). Primers används på arbetar koncentrationer av 1,25 µM.
5. Ställ in inledande PCR-amplifiering reaktionen i en nuclease-fri PCR-röret, kombinera komponenterna i ordning och volym anges i tabell 3. Placera PCR-röret i termocyklern och kör programmet PCR-amplifiering med cykling villkor som anges i tabell 4.
6. Övervaka reaktionen av qPCR. Ställa in qPCR reaktionen i en nuclease-fri PCR-röret, kombinera komponenterna i ordning och belopp som anges i tabell 5. Plats i qPCR maskin och cykel som anges i tabell 6.
   1. För att fastställa det optimala antalet ytterligare förstärkning cykler för de återstående 45 µL reaktionen, skapa en handling med cykel nummer på x-axeln och relativa fluorescens (RFU) på y-axeln. Det optimala antalet ytterligare förstärkning cykler är en tredjedel antalet cykler som krävs för qPCR reaktionen att nå platå.
      Obs: Övervakning reaktionen av qPCR möjliggör bestämning av det optimala antalet PCR cykler önskas att erhålla optimala bibliotek fragment förstärkning samtidigt minimera GC innehåll och storlek bias.
7. Slutföra den sista PCR-amplifieringen av de återstående 45 µL av PCR-reaktionen. Placera PCR-röret med förstärkning reaktionen från steg 3.5 tillbaka i termocyklern och kör programmet som beskrivs i tabell 7.
   Obs: För prover bearbetas som beskrivs i detta protokoll, fastställdes det optimala totala antalet PCR-amplifiering cykler vara 12.
8. Efter förstärkning är komplett, rena biblioteken med hjälp av en PCR-rengöring kit efter tillverkarens protokollet, eluering i 25 µL eluering bufferten.
   Obs: Förstärkt bibliotek kan lagras vid 4 ° C i upp till 48 h eller fryst vid-20 ° C för långsiktig lagring.

4. ATAC-seq bibliotek kvalitetsanalys

Obs: Det är viktigt att validera kvaliteten och kvantiteten av ATAC-seq bibliotek innan nästa generations sekvensering. Kvalitet och kvantitet av biblioteken bör bedömas med hjälp av kommersiellt tillgängliga Kit (se Tabell för material).

1. Bedöma kvalitet och kvantitet av ATAC-seq bibliotek med en mikrofluidik-baserad plattform för dimensionering, kvantifiering och kvalitetskontroll av DNA. Se figur 2 för representativa kvalitet bedömning resultat.
   Obs: Koncentrationen av ATAC-seq biblioteken måste vara > 1 ng/µL att få kvalitet sekvensering resultat. Den genomsnittliga, 30 nM i 25 µL erhölls.

5. sekvensering och dataanalys

Obs: Denna analys rörledning tillåter användare att kontrollera kvaliteten på läsningar mappning förfarande, justera koordinater för experimentell design och ring toppar för efterföljande analys. Följande är de kommandon linjer och förklaring av utförandet. Data analys-paketet finns på (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).

1. Sekvensera beredda biblioteken på en nästa generation sequencer till ett Läs medeldjup på 42 miljoner läsningar per prov.
2. Uppskatta kvaliteten av sekvensering läser genom att kontrollera filer som genereras av FastQC¹² programpaket med kommandot:
   fastqc -o < output_directory >< fastq_file >
3. Trimma baserna av läsningar av Trimmomatic¹³ programvara, om det behövs, som bestäms av den FastQC kvalitetskontrollen, kommandot (för par-ended):
   java-jar < sökväg till trimmomatic jar-filen > PE < input1 >< input2 >< Parade RESULTAT1 >< oparade RESULTAT1 >< Parade output2 >< oparade output2 > HEADCROP: < beskära baser >
4. Justera läsningar mänsklig referens genomet (hg38) av Bowtie2¹⁴ software:
   bowtie2 - x < referera genomet > -1 < input par 1 >< ingående par 2 > -S < output SAM-fil >
   Obs: Argumentet - x är för basename indexet för referens genomet och -S är för SAM format utdata.
5. Kontrollera dendokumentation av mappade läser med Samtools¹⁵ flagstat-paketet:
   samtools flagstat < BAM fil >
6. Sortera den mappade läser filen och ta bort dubbletter med hjälp av Picard¹⁶ verktyg:
   java-jar picard.jar SortSam INPUT = < input SAM filnamn > OUTPUT = < sorterade BAM utfilnamet > SORT_ORDER = koordinat ”och” java-jar picard.jar MarkDuplicates INPUT = < sorterad BAM fil > OUTPUT = < output BAM fil utan dubbletter > REMOVE_DUPLICATES = SANT
7. Index BAM fil, trimma den oanvända kromosom läser och skifta koordinaterna för experimentell grund av ATAC-seq¹⁷:
   java-jar picard.jar BuildBamIndex INPUT = < BAM filen >
   samtools idxstats < Input BAM fil > | skär -f 1 | grep - v Krysanteus | grep - v chrM | grep - v chrUn | xargs samtools Visa -b < Input BAM fil >>< utdata trimmade BAM fil >
   bedtools bamtobed -i < Input trimmade BAM fil >>< utdata trimmade BED fil >
   awk ' börja {OFS = ”\t”}; {om ($6 == ”+”) skriva ut $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; annars skriva ut $1, $2-5, 3-5 $, $4, $5, $6}' < Input trimmade BED fil >< trimmad skiftade BED fil >
8. Ta bort den läser som skiftas till negativ samordning:
   awk '{om ($2 > 0) skriva ut $1 ”\t” $2 ”\t” $3 ”\t” $4 ”\t” $5 ”\t” $6}' < Input BED fil >< utdatafilen negativt samordning säng >.
9. Konvertera filen säng till BAM fil för följande DiffBind¹⁸ analys:
   bedtools bedtobam -i < Input BED fil > -g < referens genomet >< utdata BAM fil >
10. Utföra peak ringer DiffBind¹⁸ programpaket för:
    macs2 callpeak -t < Input BAM fil > -f BAM -g hs - nomodel--nolambda--keep-dup alla--samtal-toppmöten--outdir < Output sökväg > - n < Output namn > -B - q 0,01--bdg--SKIFT -100--extsize 200
    Obs: Efter filtrering, räkna med en median på 37 miljoner läsningar per prov. Mitokondriellt DNA förorening kommer att variera från 0,30 – 5.39% (1,96% i genomsnitt). Det blir en låg hastighet av multiplicera mappade läsningar (6,7% – 56%, 19% i genomsnitt) och en relativt hög andel av användbara nukleära läser (60% – 92%, 79% i genomsnitt).

Representative Results

Från 15 mL av färskt helblod genererar detta protokoll ett genomsnitt på 1 miljon CD4 + T-celler. Dessa kan frysas för senare behandling eller användas omedelbart. Lönsamhet av CD4 + T celler, färska eller tinade, var konsekvent > 95%. Denna metod av CD4 + T cell isolering ger flexibilitet i källa material och samling tid. Detta förbättrade ATAC-seq protokoll producerar ett sista bibliotek med större än 1 ng/µL för sekvensering. Kvalitetskontroll utförs med hjälp av kommersiellt tillgängliga system bör Visa DNA-fragment mellan 200 och 1 000 bp (figur 2). Sekvensering bör endast utföras med hög kvalitet bibliotek.

Alla bibliotek var sekvenserade till ett genomsnittligt djup på mer än 40 miljoner Läs per prov. Medan vanliga ATAC-seq protokoll har ifrågasatts av kontaminerande sekvensering läsningar av Mitokondrie-DNA som kan variera från 50-60% av den totala sekvensering läser¹ eliminerar detta förbättrat protokoll problemet. Bibliotek som utarbetats efter detta protokoll innehåller i genomsnitt bara 3% mitokondriell läsningar (figur 3A). Den höga andelen användbara läsningar är tillräckligt konstant över biologiska replikat (figur 3B). Protokollet var kunna tillhandahålla mycket reproducerbara resultat över tekniska replikat (figur 4A, B) samt biologiska replikat (figur 4 c, D). Dessutom protokollet för CD4 + T cellaktivering presenteras tar 48 h snarare än en vecka eller mer och ger konsekvent och effektiv aktivering, vilket framgår av reproducerbara sekvensering resultat (figur 4A, B). Förutspådda ATAC-seq toppar kallas korrekt av rörledningen analys (figur 4E). Analys av sekvensering resultat identifierade tydliga förändringar i kromatin tillstånd under mänsklig T cellaktivering. Differentially tillgängliga regioner i öppen kromatin identifierades mellan sex prover före och efter 48 h för aktivering (figur 5).

Figur 1: experimentell översikt av protokollet modifierade ATAC-seq. (A) prova förvärv och bearbetning, från 15 mL patientens helblod genom CD4 + T cell isolering, plätering och aktivering av T-celler och atomkärnor isolering med den förbättrade lyseringsbuffert. (B), transposase reaktionen och PCR-amplifiering av sekvensering biblioteket. (C) kvalitet analys, sekvensering och dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: representativa högkvalitativa ATAC-seq bibliotek från en mikrofluidik-baserad plattform för dimensionering, kvantifiering och kvalitetskontroll av DNA. (A) elektroniska gel bild av prover B1 och D1 med ränder mellan 200 och 1 000 baspar. (B och C) Elektroferogram spårningsresultat prover B1 (B) och D1 (C), med toppar mellan 200 och 1 000 baspar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: minskade Mitokondrie DNA kontaminering med förbättrad ATAC-seq protokoll resulterar i en ökning av användbara DNA sekvensering läsningar. (A) jämförelse av användbara läser (lila), duplicera läser (grön) och mitokondrie läsningar (röd) av CD4 + T cell ATAC-seq profilering i litteraturen. (B) jämförelse av användbara läser (lila), duplicera läser (grön), mitokondriell läser (röd) och omappade läsningar (blå) av CD4 + T cell ATAC-seq profilering från flera friska individer (n = 22). Denna siffra har ändrats från Cheng et al.¹⁰. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: förbättrad ATAC-seq protokoll reproducerbarhet och noggrannhet. Scatter tomter av kromatin tillgänglighet (ATAC-seq signal, x och y) för två replikera experiment av ostimulerade (A; 36,486 Th toppar) eller aktiveras (B; 52,154 Thstim toppar) T-celler visar tekniska reproducerbarhet. Kromatin tillgänglighet för aktiverade T-celler från enskilda IGTB1191 (y-axeln) och IGTB1190 (x-axeln) (C) och histogram av korrelationer mellan varje par av individer för 52,154 Thstim topparna (D) visar reproducerbarhet mellan individer. (E) ATAC-seq toppar kallas med vårt förbättrade ATAC-seq protokoll på kromosom 19 Q13.12. Denna siffra har ändrats från Cheng et al.¹⁰. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: representant ATAC-seq resultat av ändringar i kromatin tillstånd efter CD4 + T-cells aktivering. (A) experimentell översikt (vänster) och nomenklaturen (höger). (B) Differentially tillgängliga regioner i öppen kromatin (kolumner) i sex prover (rader) före (överst, Th) och efter (botten, Th_stim) 48 h aktiveringen av primär CD4 + T-celler. Denna siffra har ändrats från Cheng et al.¹⁰. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2 x TD buffert	25 ΜL
TN5 enzym	5 ΜL
Nuclease gratis vatten	20 ΜL
Totala volymen	50 ΜL

Tabell 1: Steg 3,2 transposase reaktion komponenter.

Ad1_noMX: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG

Ad2.1_TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.2_CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.3_AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.4_TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.5_GGACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.6_TAGGCATG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.7_CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.8_CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.9_GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.10_CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.11_AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.12_GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.13_GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.14_ACCACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGTGGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.15_TGGATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.16_CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.17_TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.18_GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.19_AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.20_GTGTGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.21_TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.22_TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.23_TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Ad2.24_CCACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT

Tabell 2: ATAC-seq oligos utformningar som används för PCR.

Nuclease gratis vatten	11.9 ΜL
100 µM anpassade Nextera Primer 1 (tabell 2)	0.6 ΜL
NEBNext HiFi-2 x PCR Master Mix	25 ΜL
ATAC-Seq bibliotek	10 ΜL
25 µM anpassade Nextera Primer 2 (tabell 2)	2,5 ΜL
Totala volymen	50 ΜL

Tabell 3: Steg 3.5 inledande PCR-reaktionsblandning.

CYKEL STEG	TEMPERATUR	TID	CYKLER
Förlängning	72 ° C	5 min	1
Inledande denaturering	98 ° C	30 s	1
Denaturering	98 ° C	10 s	10
Glödgning	63 ° C	30 s
Förlängning	72 ° C	1 min
Håll	4 ° C	Infinity	1

Tabell 4: Steg 3.5 inledande PCR-amplifiering cykling program.

PCR-reaktionen alikvot	5 ΜL
PCR-Cocktail från tabell 3 med 0,6 x Syber grön	10 ΜL

Tabell 5: Steg 3.6 qPCR reaktionsblandning.

CYKEL STEG	TEMPERATUR	TID	CYKLER
Inledande denaturering	98 ° C	30 s	1
Denaturering	98 ° C	10 s	20
Glödgning	63 ° C	30 s
Förlängning	72 ° C	1 min
Håll	4 ° C	Infinity	1

Tabell 6: Steg 3.6 qPCR cykling programmet.

CYKEL STEG	TEMPERATUR	TID	CYKLER
Inledande denaturering	98 ° C	30 s	1
Denaturering	98 ° C	10 s	Som bestämts
Glödgning	63 ° C	30 s
Förlängning	72 ° C	1 min
Håll	4 ° C	Infinity	1

Tabell 7: Steg 3,7 PCR cykling program för sista PCR-amplifiering.

Discussion

Protokollet för modifierade ATAC-seq som presenteras i denna artikel ger reproducerbara resultat med minimal Mitokondrie DNA-kontaminering. Protokollet har framgångsrikt används för att karakterisera kromatin arkitekturen av människans primära PBMC¹⁰, humana monocyter, mus dendritiska celler (opublicerade) och odlade melanom cell linjer¹¹. Vi räknar denna förbättrade lysis skick har potential att fungera för andra celltyper samt. Det förväntas också att detta atomkärnor isolering protokoll kommer att vara kompatibel med enda nuclei ATAC-seq protokoll, minimera Mitokondrie DNA förorening för att förbättra sekvensering resultat.

En ytterligare fördel av detta modifierade protokoll är förmågan att frysa partier av isolerade CD4 + T-celler från PBMC vid olika tidpunkter beroende på tillgången av patientprover. ATAC-seq kan sedan utföras samtidigt på alla prover, är potentiella batch effekt bias i transposase reaktion och sekvensering minimerade¹⁰. Det är viktigt att frysning medium göras färsk med varje användning, för att upprätthålla hög bärkraft som uppnås med detta frysning-tining protokoll. Lönsamhet av isolerade CD4 + T-celler bör förbli över 90% för att undvika icke-specifik matsmältningen i transposase reaktion¹.

Observera att ytterligare optimering kan krävas för att använda det här protokollet med varierande celltyper och kvantiteter. Eftersom förhållandet Tn5 transposase-till-kärnor har optimerats för 500.000 kärnor i detta protokoll, om utför ATAC-seq med olika antal kärnor, bör mängden Tn5 transposase justeras. Överdriven Lys av kärnor på grund av ett överskott av Tn5 kan leda till hög bakgrund från stängda kromatin och låg komplexitet sekvensering bibliotek, medan under Lys inte kan tillhandahålla en komplett PCR amplifieras bibliotek¹. För att undvika dessa komplikationer, är det klokt att utföra noggrann kärnor räkna och optimera förhållandet Tn5 som behövs. För att ytterligare förbättra datakvaliteten, rekommenderas det att optimera PCR-amplifiering cykler av qPCR övervakning. Om det slutliga biblioteket genomgår alltför många förstärkning cykler, det kan finnas bias infördes i sekvensering data². Det rekommenderas att utföra korrekt kvalitetskontroll av ATAC-seq biblioteken före nästa generations sekvensering för att spara tid och pengar.

Som vi har visat, en modifierad lyseringsbuffert är nyckeln till en minskning av Mitokondrie DNA-kontaminering och är effektivt på en rad olika celltyper. Andra protokoll har behandlat frågan om mitokondriell kontaminering med alternativa lysis buffertar^7,19 eller genom intensiva processen av en CRISPR-medierad Mitokondrie DNA utarmning²⁰. Våra alternativa ATAC-seq-protokollet bidrar till ansträngningarna att minska Mitokondrie DNA kontaminering av sekvensering läser med en förbättrad lyseringsbuffert och bevarande av enkelheten i ATAC-seq som gör det en sådan tillgänglig teknik. Tillsammans med RNA-seq och encelliga sekvensering är ATAC-seq ett kraftfullt verktyg för att utforska epigenetisk reglering. Denna förbättrade ATAC-seq protokoll och data analys-paketet hjälper minska sekvensering kostnaderna och ge högre kvalitetsresultat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS, Sterile	Gibco	10010023	Can use other comparable products.
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets	Eppendorf	22625501	Can use other comparable products.
96 Well Round Bottom Plate	Thermo Scientific	163320	Can use other comparable products.
Agilent 4200 Tape Station System	Agilent	G2991AA	Suggested for quality assessment.
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	Can use other comparable products.
DMSO	Sigma	D8418	Can use other comparable products.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	Invitrogen Life Technologies	11346D	Critical Component
Dynamagnet	Invitrogen Life Technologies	12321D	Critical Component
FCS	Gemini Bio Products	100-500	Can use other comparable products.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	50674626	Suggested for quality assessment.
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade	Sigma	M2393	Can use other comparable products.
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)	Qiagen	28004	Critical Component
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Can use other comparable products.
NaCl, Molecular Biology Grade	Sigma	S3014	Can use other comparable products.
NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20	Gibco	10977015	Can use other comparable products.
Polysorbate 20 (Tween20)	Sigma	P9416	Can use other comparable products.
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	Critical Component
Precision Water Bath	Thermo Scientific	TSGP02	Can use other comparable products.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	Q32851	Suggested for quality assessment.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	Suggested for quality assessment.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium	Stem Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	Can use other comparable products.
Sterile Resevoir	Thermo Scientific	8096-11	Can use other comparable products.
T100 Thermocycler with Heated Lid	BioRad	1861096	Can use other comparable products.
Tris-HCL	Sigma	T5941	Can use other comparable products.