Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע וזמינותו של כרומטין transposase נגיש רצף (האטא ק-seq)-מופעל CD4 + האדם לימפוציטים. הפרוטוקול שונתה כדי למזער מזהמים קריאות דנ א מיטוכונדריאלי מ 50% ל-3% דרך המבוא של מאגר פירוק חדש.
Abstract
האטא ק-seq הפך מתודולוגיה בשימוש נרחב במחקר של אפיגנטיקה בשל גישתה מהירה ופשוטה מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול seq האטא ק משופר אשר מפחית את זיהום קריאות דנ א מיטוכונדריאלי. בעוד פרוטוקולים האטא ק-seq הקודם נאבקו עם קורא ממוצע של 50% מזהמות דנ א מיטוכונדריאלי, המאגר פירוק ממוטבת הציג פרוטוקול זה מפחית את זיהום דנ א מיטוכונדריאלי ממוצע של 3%. פרוטוקול זה seq האטא ק משופר מאפשר ירידה 50% ליד העלות רצף. נדגים כיצד ניתן להכין ספריות האטא ק-seq אלה באיכות גבוהה מופעל CD4 + לימפוציטים, מתן הוראות שלב אחר שלב של CD4 + בידוד לימפוציט של דם דרך ניתוח נתונים. פרוטוקול seq האטא ק משופר זה אומתה במגוון רחב של סוגי תאים ויהיה תועלת מיידית והטייפונים נגישות כרומטין.
Introduction
וזמינותו של כרומטין transposase נגיש רצף (האטא ק-seq) הפך במהירות השיטה המובילה עבור חקירת ארכיטקטורת כרומטין. האטא ק-seq ניתן לזהות אזורים של כרומטין נגיש באמצעות התהליך של tagmentation מזימות, תיוג של ה-DNA על ידי האנזים, כדי לייצר ספריות אשר הרצף ניתן לקבוע כרומטין נגישות מעבר הגנום כולו. תהליך זה tagmentation מתווך על ידי היפראקטיבי Tn5 transposase, אשר רק חותך אזורים פתוחים של כרומטין עקב מכשול הסטריים nucleosomic. בזמן שזה חותך, transposase Tn5 מוסיף גם מתאמים רצף המאפשרים בנייה מהירה ספריה על ידי ה-PCR ורצף הדור הבא של הגנום כולו נגיש כרומטין1,2.
האטא ק-seq הפכה השיטה המועדפת כדי לקבוע אזורים של כרומטין נגישות עקב פרוטוקול יחסית פשוטה ומהירה, איכות ומגוון של מידע יכול להיקבע מן התוצאות שלה, ואת כמות קטנה של החל החומר הנדרש. בהשוואה DNase-seq3 (אשר גם מודד את נגישות כרומטין הגנום כולו), MNase-seq4 (הקובע נוקלאוזום עמדות באזורים פתוחים גנום), בתיווך פורמלדהיד שלהם-seq5, האטא ק-seq הוא מהיר יותר, יותר זול, יותר לשחזור1. זה גם יותר רגיש, עבודה עם החל חומר של מעטים כמו גרעינים 500, לעומת 50 מיליון גרעינים הדרושות DNase-seq3. האטא ק-seq יש גם את היכולת לספק מידע נוסף אודות אדריכלות כרומטין מאשר בשיטות אחרות, כולל אזורים של איגוד פקטור שעתוק, מיצוב נוקלאוזום כרומטין פתוח אזורים1. פרוטוקולים האטא ק-seq יעיל, תא בודד יש מאומת, המספקים מידע על האדריכלות כרומטין החד-תאיים ברמה6,7.
האטא ק-seq שימש לאפיון אדריכלות כרומטין על פני קשת רחבה של סוגי תאים ומחקר, כולל צמחים8, בני9ו רבים אורגניזמים אחרים. הוא גם היה קריטי בזיהוי epigenetic רגולציה של המחלה הברית7. עם זאת, פרוטוקול האטא ק-seq הנפוצה ביותר כולל את החיסרון העיקרי של זיהום קריאות רצף של דנ א מיטוכונדריאלי. כמה ערכות נתונים, רמת זיהום יכול להיות גבוה ככל 60% של רצף תוצאות1. יש מאמץ בשדה כדי להפחית את קריאות מיטוכונדריאלי מזהמים אלה על מנת לאפשר ליישום יעיל יותר האטא ק-seq7,10,11. כאן אנו מציגים פרוטוקול seq האטא ק משופר אשר מפחית את שיעור הזיהום דנ א מיטוכונדריאלי רק 3%, המאפשר צמצום של-50% תוך רצף עולה10. זה התאפשר על ידי תהליך מיועל של לימפוציטים בידוד CD4 + ואת הפעלת מאגר פירוק משופרת שחיוני במטרה למזער את הזיהום דנ א מיטוכונדריאלי.
פרוטוקול modifiedATAC-seq זה אומתה עם מגוון רחב של ראשי תאים, כולל דם היקפיים ראשי אדם תאי תאים (PBMCs)10, ומונוציטים ראשי האדם העכבר תאים דנדריטים (לא פורסם). הוא גם שימש בהצלחה לחקור מלנומה שורות תאים במסך חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) באשכולות של רכיבים ללא קידוד11. בנוסף, חבילת ניתוח הנתונים המתוארים פרוטוקול זה וסיפק על GitHub מספק חוקרים חדשים ומנוסה עם כלים לניתוח נתונים האטא ק-seq. האטא ק-seq וזמינותו היעיל ביותר כדי למפות כרומטין נגישות מעבר הגנום כולו, שינויים בפרוטוקול הקיים אשר הציג כאן יאפשר החוקרים להפיק נתונים באיכות גבוהה עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי, צמצום עלויות רצף ושיפור תפוקת האטא ק-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול משופרת זה מספק הוראות מפורטות לביצוע האטא ק-seq של CD4 + לימפוציטים, מתוך החומר ההתחלתי של דם מלא באמצעות ניתוח נתונים (איור 1).
1. בידוד תאי CD4 + T של דם מלא
הערה: חומר המוצא עבור פרוטוקול זה הוא 15 מ"ל של דם מלא טריים נאסף באמצעות הליכים סטנדרטיים, לאפשר מקור חומר המוצא שייבחר בהתבסס על דרישות המחקר. קנה המידה הפרוטוקול כנדרש. לחמם buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) + סרום עגל העובר 2% (FCS) לטמפרטורת החדר (RT) ולהתאים לצנטריפוגה כדי RT לפני תחילת ההליך העשרה תאי CD4 + T.
- להוסיף µL 750 האנושי CD4 + תא T העשרה קוקטייל 15 מ"ל של דם מלא צינור חרוטי 50 מ"ל ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך. תקופת דגירה-RT של 20 דקות. בתום דגירה, להוסיף 15 מ"ל של PBS + 2% FCS הצינור ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך.
- הכן צינור חרוטי מ"ל עם 15 מ"ל של צפיפות בינונית. שכבת בקפידה את דגימת הדם מדולל על החלק העליון של המדיום צפיפות, להיות בטוח שלא לשבש את הממשק צפיפות בינונית/דם צורות. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב- 1,200 x g ו- RT עם האצת מוגדר 1 ובלם יורד את.
הערה: זה חיוני כדי להגדיר את ההאצה בלם את 1 וירידה לצנטריפוגה כדי למנוע שיבוש שכבת תאים המדיום צפיפות. - איסוף תאי CD4 + T מועשר מממשק בינוני/פלזמה צפיפות באמצעות פיפטה העברה של גזע צר. העבר את התאים שנאספו צינור חרוטי מ"ל. Centrifuge תאי CD4 + T שנאספו במשך 8 דקות ב- 423- g ו- RT.
הערה: ודא לחזור ההאצה צנטריפוגה בלם 9 ו יורד כ- ON עבור שלב 1.3 ואת כל השלבים הבאים. - למחוק את תגובת שיקוע לשטוף בגדר תא פעמיים עם 50 מ של PBS + 2% FCS, צריך שתוציאו במשך 8 דקות ב 423 x g ו- RT. להשליך את תגובת שיקוע הסופי וקונטה להשעות בגדר תא שטף ב 2 מ"ל של PBS + 2% FCS.
- ספירת תאים באמצעות של hemocytometer. כדי להמשיך עם האטא ק-seq, המשך לשלב 2.3. כדי להקפיא תאים עבור עיבוד מאוחר יותר, להמשיך לצעוד 1.6.
- להוסיף 1 מ"ל של מדיום קפוא טרי (FCS 90% + 10% דימתיל סולפוקסיד) לכל 1 מיליון תאים. Aliquot 1 מ"ל של תאים קפואים בינוני צינורות בטוח ההקפאה. הצב צינורות ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה במיכל קירור איטי. למחרת, העברת צינורות חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
הערה: 1 מיליון תאי CD4 + T יהיה מבודד לכל 2 מיליליטר לאמצעי האחסון המקורי של דם מלא. הקפאת תאים 500,000 aliquots 1 מ"ל של מדיום מקפיא. הופך בינוני קפוא טרי-כל שימוש.
2. להפעיל ולטהר CD4 + T תאים
הערה: פרוטוקול מהיר זה לשם הפעלת וטיהור תאי CD4 + T רק דורש 48 שעות ותוצאות 95% קיימא, מופעלים תאי CD4 + T. מגניב לצנטריפוגה עד 4 ° C לפני תחילת בפרוטוקול.
- להפשיר את מבחנה 1 (500,000) של תאי CD4 + T באמבט מים 37 ° C עד הקרח נמס פשוט. בעדינות להעביר תאים צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 9 מיליליטר מראש ומחוממת מדיה רוזוול פארק אנדרטת המכון-1640 (RPMI-1640) בתוספת 10% FCS, ןלהל RPMI מלאה.
הערה: אל תתנו תאים להפשיר לחלוטין כדי להימנע מחשיפה דימתיל סולפוקסיד. - צנטריפוגה במשך 6 דקות ב-1500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע, בעדינות להשעות את צניפה ב 2 מ של RPMI מלאה. חזור על הספין למטה, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר בעדינות להשעות את התאים ב- 0.5 מ של RPMI מלאה.
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer. להתאים את הצפיפות של התליה תא עם RPMI מלאה על צלחת 50,000 תאים µL 200 לאדם טוב של צלחת תחתית עגולה 96-ובכן.
הערה: מהצינור קפוא אחד של 500K CD4 + T תאים, צלחת 10 בארות של 50,000 CD4 + T תאים ב- µL 200 לכל טוב. -
להכין beads מגנטי מצומדת עם נוגדנים אנטי CD3 ו- anti-CD28 T-מפעיל אנושי.
- µL 12.5 aliquot של חרוזים T-מפעיל CD3/CD28 אנושי לכל האטא ק-seq הדגימה כדי צינור 1.5 מ. לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של 1 x PBS ומניחים את הצינורית על מגנט 1 דקות.
- בזהירות להסיר, למחוק את תגובת שיקוע ברורה להסיר את הצינורית של מגנט, להשעות את החרוזים 13 µL להשלים את RPMI עבור דגימה האטא ק-seq.
הערה: לחשב את כמות החרוזים הדרושים לפי מספר דוגמאות האטא ק-seq המעובדות. פרוטוקול זה דורש µL 12.5 של CD3/CD28 חרוזים לכל התאים 500,000, המהווה דוגמא אחת האטא ק-seq.
- להפעיל את תאי CD4 + T. איסוף תאים 500,000 מ 2.1 ל RPMI מלאה, במדיום צינור חרוטי 15 מ"ל ולהוסיף µL 12.5 של טרום שטף חרוזים T-מפעיל אנושי. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך ברכבת התחתית.
- בעדינות העבר את התאים עם חרוזים סטרילי מאגר וצלחת 200 µL של תאים עם חרוזים לכל טוב של צלחת 96-ובכן התחתון עגול באמצעות פיפטה של רב ערוצית. תקופת דגירה של 48 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים.
- פוסט דגירה, centrifuge את הצלחת 96-ובכן במשך 8 דקות ב- 423- g ו- 100 להסיר RT. µL בינוני לכל טוב מהצלחת 96-ובכן, איסוף זה צינור חרוטי לפני השלכת כדי להבטיח ללא אובדן חרוז. Resuspend בגדר תא ב µL 100 הנותרים ולאסוף כל בשפופרת 1.5 mL.
הערה: בארות 10 תאי T מופעל ייאספו באמצעי אחסון 1 מ"ל. - לבצע CD4 + בידוד. הוסף µL 50 של חרוזים CD4 מצומדת טרום שטף לתאים 500,000 מ 1 ל RPMI מלאה. לשלב חרוזים ותאים באמצעות פיפטה. תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C במקרר. להתסיס ושרשרות תא תערובת כל 6 דקות.
הערה: פרוטוקול זה נועד לשמש דוגמא אחת של תאים 500,000. להתאים ככל הדרוש עבור שניים או יותר דוגמאות 500,000. - עם השלמת הדגירה, מניחים את הצינורית על המגנט עבור 2 דק להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע כאשר ברור. לשטוף את התאים מאוגד-חרוז על ידי הסרת את הצינור המגנט, השעיית התאים חרוז מכורך 1 מ"ל של PBS + 2% FCS, החלפת הצינור על המגנט עבור 1 דקות השמטת את תגובת שיקוע ברורה. חזור על תהליך זה סה"כ 3 מנקי.
הערה: יש להיזהר לא למחוק את כל החרוזים במהלך שוטף. - לאחר השטיפה הסופית במקום הצינור על המגנט עבור 1 מינימלית להסיר, למחוק את תגובת שיקוע ומניחים על בגדר על קרח. המשך סעיף 3 (האטא ק-seq).
3. האטא ק-seq
הערה: בשלב זה, גרעינים מבודדים מתאי CD4 + T מופעל עבור האטא ק-תת סעיף. המאגר פירוק בשימוש פרוטוקול זה שופר להיות עדינה על הגרעינים, וכתוצאה מכך לעיכול יעיל יותר, תוצאות באיכות גבוהה יותר. כל השלבים צנטריפוגה בסעיף 3 מבוצעות באמצעות צנטריפוגה קבוע-זווית ומתוחזק על 4 מעלות צלזיוס. מגניב לצנטריפוגה לפני תחילת פרוטוקול.
- לבצע בידוד רב-קוטבי. Resuspend חרוזים והתאים עם פירוק קר מאגר (10 מ מ טריס-HCl, pH 7.4, 10 מ מ NaCl, 3 מ מ MgCl2, polysorbate 0.03% 20). צנטריפוגה מיד ב x 500 g 10 דקות ב 4 º C. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
- לבצע את התגובה transposase. להשעות בגדר גרעינים מבודד עם 50 µL של Tn5 transposase מיקס (טבלה 1). דגירה ב thermocycler במשך 30 דקות ב 37 ° C עם מכסה 40 ° צלזיוס, מחזיק ב 4 ° C בסיום.
- לאחר thermocycling, מיד לבצע סיבוב צנטריפוגה מהירה benchtop למטה ומניחים את הצינורית על המגנט עבור 1 דקות להסיר את החרוזים של המוצר.
- העבר את תגובת שיקוע ברור מהצינור על המגנט על עמודה טיהור DNA. לשטוף את העמודה פעם 250 µL של המאגר PB, פעמיים עם 750 µL של המאגר PE. Elute הדגימה ב µL 10 • תנאי המאגר. המשך ישירות לשלב 3.5.
הערה: שלב זה מגביר את שברי DNA עם מתאמים מחוברים, המכונים כאן הספרייה האטא ק-seq. כדי מגה-פלקס מספר ספריות האטא ק-seq להתנהל אחד המיתרים ליין, להשתמש מדד פריימר 1 עבור כל דוגמאות ו- 2 פריימר אינדקס שונים לקבלת דוגמאות בודדות (טבלה 2). תחל משמשים עובד ריכוזים של 1.25 מיקרומטר. - להגדיר את התגובה הראשונית של הגברה PCR בשפופרת נטולת נוקלאז PCR, שילוב הרכיבים השונים ההזמנה ואת אמצעי האחסון שצוין ב- טבלה 3- למקם את צינור ה-PCR thermocycler ולהפעיל את התוכנית הגברה PCR עם תנאי הרכיבה כמפורט בטבלה4.
-
נטר את התגובה על ידי qPCR. להגדיר את התגובה qPCR בשפופרת נטולת נוקלאז PCR, שילוב הרכיבים השונים ההזמנה ואת הסכום הנקוב בטבלה 5. המקום המכונה qPCR, מחזור כמו שצוין ב טבלה 6.
- כדי לקבוע את שהמספר האופטימלי של הגברה נוספת מחזורים עבור התגובה 45 µL הנותרים, ליצור מגרש עם מחזור מספר על ציר ה-x ואת יחסי קרינה פלואורסצנטית (RFU) בציר ה-y. המספר האופטימלי של מחזורים נוספים הגברה הוא שליש מספר מחזורים שלוקח את התגובה qPCR להגיע אל הרמה.
הערה: ניטור התגובה על ידי qPCR מאפשרת קביעה של מספר מחזורים PCR הרצוי כדי לקבל הגברה פרגמנט ספריית אופטימלית תוך מזעור GC תוכן ודעות קדומות גודל אופטימלי.
- כדי לקבוע את שהמספר האופטימלי של הגברה נוספת מחזורים עבור התגובה 45 µL הנותרים, ליצור מגרש עם מחזור מספר על ציר ה-x ואת יחסי קרינה פלואורסצנטית (RFU) בציר ה-y. המספר האופטימלי של מחזורים נוספים הגברה הוא שליש מספר מחזורים שלוקח את התגובה qPCR להגיע אל הרמה.
- להשלים הגברה PCR הסופי של µL 45 הנותרים של תגובת ה-PCR. מקום ברכבת התחתית PCR עם התגובה הגברה מהשלב 3.5 חזרה thermocycler ולהפעיל את התוכנית כפי שמתואר בטבלה 7.
הערה: לקבלת דוגמאות מעובד כפי שמתואר פרוטוקול זה, המספר הכולל אופטימלית של PCR הגברה מחזורים היה נחוש בדעתו להיות 12. - בתום ההגברה, לטהר את ספריות באמצעות ערכת ניקוי PCR הפרוטוקול של היצרן, eluting ב- 25 µL של המאגר • תנאי.
הערה: ספריות מוגבר יכול להיות מאוחסן ב 4 ° C עבור עד 48 שעות או קפוא ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
4. האטא ק-seq ספריית ותמרוקים
הערה: חשוב לאמת את האיכות והכמות של ספריות האטא ק-seq לפני הדור הבא רצפי. וצריך להעריך את האיכות והכמות של הספריות באמצעות ערכות זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).
- להעריך את האיכות והכמות של ספריות האטא ק-seq באמצעות פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה אחיזה לשינוי גודל, כימות של בקרת איכות של ה-DNA. ראה איור 2 תוצאות הערכת איכות נציג.
הערה: בטח הריכוז ATAC-seq ספריות > 1 ng/µL כדי להשיג תוצאות איכותיות רצף. בממוצע, 30 nM, 25 µL הושג.
5. רצף וניתוח נתונים
הערה: צינור ניתוח זה מאפשר למשתמשים לשלוט באיכות של קריאות מיפוי הליך, להתאים את קואורדינטות עבור תכנון ניסויים, אקרא פסגות לניתוח במורד הזרם. להלן פקודות קווים והסבר על ביצוע. חבילת ניתוח הנתונים זמין (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
- רצף של ספריות מוכן על ברצף הדור הבא עומק קריאה ממוצע של 42 מיליון קריאות עבור דגימה.
- להעריך את האיכות של רצף פעולות הקריאה על-ידי בדיקת קבצים שנוצרו על ידי FastQC12 חבילת תוכנה באמצעות הפקודה:
fastqc -o < output_directory >< fastq_file > - לקצץ הבסיסים של קריאות על ידי תוכנה13 Trimmomatic, אם יש צורך, כפי שנקבע על ידי בדיקת איכות FastQC, בעזרת הפקודה ' ' (עבור זוג הסתיימה):
java-צנצנת < נתיב לקובץ jar trimmomatic > PE < input1 >< input2 >< output1 לזווג >< אינטראקצית output1 >< לזווג output2 >< output2 אינטראקצית > HEADCROP: < לחתוך בסיסים > - ליישר שאוחזרו כדי הגנום האנושי הפניה (hg38) על-ידי תוכנת14 Bowtie2:
bowtie2 - x < הפניה הגנום >-1 < קלט זוג 1 >< קלט זוג 2 > -S < קובץ הפלט סאם >
הערה: ארגומנט ה - x עבור basename של האינדקס עבור הגנום הפניה, -S לפלט בתבנית סם. - בדוק ופיתחתיאיכות הקריאות ממופים באמצעות Samtools15 flagstat החבילה:
samtools flagstat < באם הקובץ > - למיין את קובץ ממופה קריאות, להסרת כפילויות בכלי16 פיקרד:
java-ג'אר picard.jar SortSam קלט = < שם קובץ סאם קלט > פלט = < שם קובץ באם פלט ממוין > SORT_ORDER = קואורדינטות "ו" java-ג'אר picard.jar MarkDuplicates קלט = < ממוינים באם קובץ > פלט = < באם פלט קובץ ללא כפילויות > REMOVE_DUPLICATES = TRUE - קובץ אינדקס בם, לקצץ את קריאות כרומוזום שאינם בשימוש ולהזיז את הקואורדינטות מהסיבה ניסיוני האטא ק-seq17:
java-ג'אר picard.jar BuildBamIndex קלט = < באם הקובץ >
samtools idxstats < Input באם קובץ > | לחתוך -f 1 | grep - v chrY | grep - v chrM | grep - v chrUn | xargs samtools להציג -b < קובץ הקלט BAM >>< פלט גזוז באם הקובץ >
bedtools bamtobed -i < Input גזוז באם הקובץ >>< פלט גזוז מיטה קובץ >
אתה תקבל את המגיע ' להתחיל {שבטוב = "\t"}; {אם (6 דולר = = "+") הדפס $1, 2 + 4 דולר, 3 + 4 דולר, 4 דולר, 5, 6; הדפסה אחר $1, 2-5, 3-5, 4 דולר, 5 דולר, 6 דולר}' < Input גזוז מיטה קובץ >< Trimmed העביר את המיטה קובץ > - מחק את הקורא את יוזזו כדי תיאום שלילי:
אתה תקבל את המגיע '{אם (2 דולר > 0) הדפסה $1 "\t" 2 "\t" 3 דולר "\t" 4 דולר "\t" 5 "\t" 6 דולר}' < Input מיטה קובץ >< קובץ הפלט לא שלילי תיאום מיטה >. - להמיר את הקובץ מיטה לקובץ באם לניתוח18 DiffBind הבאים:
bedtools bedtobam -i < קובץ הקלט מיטה > -g < הפניה הגנום >< באם פלט קובץ > - לבצע שיא הביקור על-ידי חבילת תוכנה18 DiffBind:
macs2 callpeak -t < Input באם קובץ > -f בום -g hs - nomodel - nolambda - שמור-dup כל - קריאה-פסגות - outdir < נתיב הספריה פלט > - n < שם פלט > -B - q 0.01..--bdg - shift-100 - extsize 200
הערה: לאחר סינון, מצפה החציוני של 37 מליון קריאות עבור דגימה. זיהום דנ א מיטוכונדריאלי ינוע מ 0.30% – 5.39% (1.96% בממוצע). יהיו קצב נמוך של קריאות להכפיל ממופה (6.7% – 56%, 19% בממוצע) וקורא אחוז גבוה יחסית של שמיש גרעינית (60% – 92%, 79% בממוצע).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מ- 15 מ"ל של דם טרי, פרוטוקול זה יוצר ממוצע של 1 מיליון תאי CD4 + T. אלה יכולים להיות קפוא לעיבוד מאוחר יותר או שימוש באופן מיידי. הכדאיות של תאי CD4 + T, טריים או המופשרים, היה עקבי > 95%. שיטה זו של בידוד תאי CD4 + T מאפשר גמישות בזמן חומר ואוסף מקור. פרוטוקול seq האטא ק משופר זה מייצר ספרייה הסופי של יותר מ 1 ng/µL עבור רצף. בקרת איכות המבוצעת באמצעות מערכות זמינים מסחרית צריך להפגין שברי DNA בין 200 ל 1,000 bp (איור 2). רצף צריכה להתבצע רק עם ספריות באיכות גבוהה.
כל הספריות היו רציף של עומק ממוצע של יותר מ 40 מיליון לקרוא לכל דגימה. בעוד פרוטוקולים האטא ק-seq נפוץ לאיוב מזהמות רצף קריאות של דנ א מיטוכונדריאלי יכול לנוע מ- 50% - 60% מכלל רצף קריאות1 פרוטוקול משופרת זה מבטל את הנושא. ספריות שהוכן בעקבות פרוטוקול זה מכיל 3% בממוצע רק מיטוכונדריאלי קריאות (איור 3 א). האחוז הגבוה של קריאות שמיש הוא מספיק קבוע על פני ביולוגי משכפל (איור 3B). הפרוטוקול היה מסוגל לספק תוצאות מאוד לשחזור מעבר טכני משכפל (איור 4A, B) כמו גם ביולוגי משכפל (איור 4C, יח). בנוסף, הפרוטוקול עבור CD4 + הפעלת תא T הציגה נמשכת 48 שעות במקום שבוע אחד או יותר ותוצאות הפעלה עקבית ויעילה, כפי שמגלה לשחזור רצף תוצאות (איור 4A, ב'). פסגות האטא ק-seq החזוי נקראים במדויק על-ידי הצבר ניתוח (איור 4E). ניתוח של רצף תוצאות מזוהה נקה שינויים במצב כרומטין במהלך הפעלת תא T אנושיים. נגיש באופן שונה מחוזות כרומטין פתוחים אותרו בין שש דוגמאות לפני ואחרי 48 שעות של הפעלה (איור 5).
איור 1: ניסיוני מבט כולל על פרוטוקול האטא ק-seq ששונה. (א) לטעום רכישה וסלולרי עיבוד, מ-15 מיליליטר דם המטופל דרך CD4 + T בידוד, ציפוי והפעלה של תאי T, וכן בידוד גרעינים עם המאגר פירוק משופרת. (B) transposase התגובה ואת ה-PCR הגברה של הספרייה רצף. (ג) ניתוח איכות, רצף, ניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ספריות האטא ק-seq נציג באיכות גבוהה מפלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה עבור שינוי גודל, כימות, בקרת איכות של דנ א. (א) תמונה אלקטרונית ג'ל של דגימות B1 ו- D1 עם פסים בין 200 ל 1000 בסיסים. (B ו- C) Electropherogram מעקב תוצאה של דגימות B1 (B), D1 (C), עם פסגות בין 200 ל 1000 בסיסים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ירידה זיהום דנ א מיטוכונדריאלי עם התוצאות פרוטוקול seq האטא ק משופר לגידול במספר קריאות שמיש של רצפי דנ א. (א) השוואה של שמיש קורא (סגול), שכפל קורא (ירוק), קריאות מיטוכונדריאלי (אדום) מ- CD4 + T תאים האטא ק-seq פרופיל בספרות. (B) השוואה של שמיש קורא (סגול), שכפל קורא (ירוק), מיטוכונדריאלי קורא (אדום), שאינן ממופות קריאות (כחול) של CD4 + T תאים האטא ק-seq מאפיינת אנשים בריאים מרובים (n = 22). דמות זו שונתה Cheng et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: שיפור האטא ק-seq פרוטוקול הפארמצבטית ודיוק. פיזור החלקות של נגישות כרומטין (האטא ק-seq אות, x ו- y-axes) עבור שני לשכפל את הניסויים של unstimulated (A; פסגות Th 36,486) או מופעל (B; פסגות Thstim 52,154) ותאי T מדגים הפארמצבטית טכני. כרומטין נגישות עבור תאי T מופעל מאנשים IGTB1191 (ציר y) ו IGTB1190 (ציר x) (C) ומדגים הפארמצבטית היסטוגרמה של מתאמים בין כל זוגות של בודדים על הפסגות Thstim 52,154 (ד) בין יחידים. (E) האטא ק-seq פסגות התקשרה עם פרוטוקול seq האטא ק משופר שלנו-כרומוזום 19 Q13.12. דמות זו שונתה Cheng et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: נציג האטא ק-seq תוצאות של שינויים במצב כרומטין לאחר הפעלת CD4 + T-cell- (א) סקירה על ניסיוני (משמאל), במינוח (צודק). מחוזות נגיש באופן שונה (B) פתוח כרומטין (עמודות) שש הדגימות (שורות) לפני (למעלה, Th) ואחרי (למטה, תאנוןסאונד) 48 שעות ההפעלה של תאי CD4 + T העיקרי. דמות זו שונתה Cheng et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| 2 x מאגר TD | 25 ΜL |
| TN5 אנזימים | 5 ΜL |
| מים חינם נוקלאז | 20 ΜL |
| הנפח הכולל | 50 ΜL |
טבלה 1: שלב 3.2 רכיבי התגובה transposase.
| Ad1_noMX: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG |
| Ad2.1_TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.2_CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.3_AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.4_TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.5_GGACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.6_TAGGCATG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.7_CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.8_CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.9_GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.10_CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.11_AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.12_GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.13_GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.14_ACCACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGTGGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.15_TGGATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.16_CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.17_TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.18_GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.19_AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.20_GTGTGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.21_TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.22_TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.23_TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| Ad2.24_CCACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
בטבלה 2: עיצובים oligos האטא ק-seq המשמש עבור ה-PCR.
| מים חינם נוקלאז | 11.9 ΜL |
| פריימר Nextera מותאם אישית 100 מיקרומטר 1 (טבלה 2) | 0.6 ΜL |
| NEBNext אמינות גבוהה 2 x מיקס מאסטר PCR | 25 ΜL |
| ספריית Seq האטא ק | 10 ΜL |
| פריימר Nextera מותאם אישית מיקרומטר 25 2 (טבלה 2) | 2.5 ΜL |
| הנפח הכולל | 50 ΜL |
טבלה 3: 3.5 בשלב הראשוני PCR התגובה מיקס.
| שלב מחזור | טמפרטורה | זמן | מחזורים |
| סיומת | 72 ° C | 5 דקות | 1 |
| דנטורציה הראשונית | 98 ° C | 30 s | 1 |
| דנטורציה | 98 ° C | 10 s | 10 |
| חישול | 63 ° C | 30 s | |
| סיומת | 72 ° C | 1 דקות | |
| . תחזיק | 4 ° C | אינסוף | 1 |
בטבלה 4: 3.5 בשלב הראשוני PCR הגברה אופניים התוכנית.
| PCR התגובה Aliquot | 5 ΜL |
| PCR קוקטייל בלוח 3 עם 0.6 x Syber ירוק | 10 ΜL |
טבלה 5: שלב 3.6 qPCR התגובה מיקס.
| שלב מחזור | טמפרטורה | זמן | מחזורים |
| דנטורציה הראשונית | 98 ° C | 30 s | 1 |
| דנטורציה | 98 ° C | 10 s | 20 |
| חישול | 63 ° C | 30 s | |
| סיומת | 72 ° C | 1 דקות | |
| . תחזיק | 4 ° C | אינסוף | 1 |
טבלה 6: שלב 3.6 qPCR אופניים התוכנית.
| שלב מחזור | טמפרטורה | זמן | מחזורים |
| דנטורציה הראשונית | 98 ° C | 30 s | 1 |
| דנטורציה | 98 ° C | 10 s | כפי שנקבע |
| חישול | 63 ° C | 30 s | |
| סיומת | 72 ° C | 1 דקות | |
| . תחזיק | 4 ° C | אינסוף | 1 |
טבלה 7: שלב 3.7 PCR תוכנית אופניים עבור הגברה PCR הסופי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול האטא ק-seq ששונה שהוצגו במאמר זה מספק תוצאות לשחזור עם זיהום דנ א מיטוכונדריאלי מינימלי. הפרוטוקול כבר להתרגל בהצלחה לאפיין כרומטין הארכיטקטורה של האדם העיקרי PBMCs10, ומונוציטים אנושי, העכבר תאים דנדריטים (לא פורסם), ו מלנומה בתרבית תאים קווים מספר11. אנו צופים זה פירוק משופרת מצב יש פוטנציאל לעבוד עבור סוגי תאים אחרים גם כן. זה צפוי גם כי פרוטוקול בידוד זה גרעינים יהיה תואם עם גרעינים יחיד האטא ק-seq פרוטוקולים, צמצום זיהום דנ א מיטוכונדריאלי לשיפור רצף תוצאות.
יתרון נוסף של הפרוטוקול שונה היא היכולת להקפיא קבוצות של תאים מבודדים CD4 + T PBMCs בזמנים שונים בהתאם לזמינות של דגימות החולה. כפי האטא ק-seq ואז ניתן לבצע בו-זמנית על כל הדגימות, אצווה פוטנציאל השפעה הטיית התגובה transposase, רצף הוא ממוזער10. . זה קריטי שבינוני הקפוא הזה להיות טרי טרי עם כל שימוש, על מנת לשמור על הכדאיות גבוהה כי מושגת עם פרוטוקול זה הפשרת ההקפאה הכדאיות של תאי CD4 + T מבודד צריכים להישאר מעל 90% כדי למנוע עיכול לא ספציפית התגובה של transposase1.
שימו לב שאופטימיזציה נוספים עשויים להידרש כדי להשתמש בפרוטוקול זה עם סוגי תאים משתנים וכמויות. מאז היחס transposase-כדי-גרעינים Tn5 כבר מותאם ל- 500,000 גרעינים של פרוטוקול זה, אם מבצע האטא ק-seq עם מספר שונה של גרעינים, הסכום של Tn5 transposase צריך להיות מותאם בהתאם. פירוק יתר של גרעינים בשל עודף של Tn5 עשויה להוביל רקע גבוה מכרומטין סגור, מורכבות מעטה של רצף ספריות, בזמן פירוק תת לא מספקות של PCR מלאה מוגבר הספרייה1. על מנת להימנע מסיבוכים אלו, מומלץ לבצע גרעינים זהיר ספירת ולמטב את היחס Tn5 לפי הצורך. כדי לשפר את איכות הנתונים, מומלץ למטב את מחזורי הגברה PCR על-ידי ניטור qPCR. אם הספריה הסופי עובר מחזורי הגברה רבות מדי, ייתכן הטיה הציג את רצף נתונים2. מומלץ לבצע בקרת איכות נאותה של ספריות האטא ק-seq לפני הדור הבא רצפי כדי לחסוך זמן וכסף.
כפי, הראו מאגר פירוק ששונה הוא מפתח ההפחתה של זיהום דנ א מיטוכונדריאלי והוא יעיל במגוון רחב של סוגי תאים. פרוטוקולים אחרים עסקו בנושא זיהום מיטוכונדריאלי עם פירוק אלטרנטיבי מאגרי7,19 או על-ידי תהליך אינטנסיבי של בתיווך CRISPR מיטוכונדריאלי DNA דלדול20. פרוטוקול האטא ק-seq חלופי שלנו תורמת המאמץ כדי להקטין זיהום דנ א מיטוכונדריאלי הקריאות רצף עם מאגר פירוק שיפור ושימור של הפשטות של האטא ק-seq שעושה את זה כזה טכניקה נגיש. יחד עם ה-RNA-seq ורצף מתא בודד, האטא ק-seq הוא כלי רב עוצמה עבור חקר תקנה epigenetic. זה שיפור האטא ק-seq פרוטוקול, חבילת ניתוח נתונים יעזור להפחית עלויות רצף ולהפקת תוצאות באיכות גבוהה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים Atsede Siba לקבלת תמיכה טכנית. C.S.C. נתמך על ידי NIH גראנט 1R61DA047032.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
- Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
