Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Измерение глобального сотовой матрицы металлопротеиназ и метаболической активности в 3D гидрогели

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/59123
Automatic Translation
1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

Summary

Здесь представлены протокол для инкапсуляции и культивирования клеток в poly(ethylene glycol) (PEG) гидрогели функционализированных с fluorogenic матрицы металлопротеиназы (СПП)-разложению пептида. Клеточных ММП и метаболической активности измеряются непосредственно из гидрогеля культур с использованием стандартного Гонав читателя.

Abstract

Часто трехмерные (3D) клетки культуры системы более тесно пилки в vivo клеточных реакций и функции чем систем традиционной культуры двухмерный (2D). Однако измерение функции клеток в 3D культуры зачастую является более сложным. Многие биологические анализы требуют поиска клеточного материала, который может быть затруднено в 3D культур. Одним из способов решения этой задачи является разработка новых материалов, позволяющих измерение функции клеток внутри материала. Здесь для измерения активности клеточных матрицы металлопротеиназы (СПП) в 3D гидрогели в формате 96-луночных представлен метод. В этой системе является функционализированных Гидрогель poly(ethylene glycol) (PEG) с датчиком fluorogenic горные ММП. ММП клеточную активность пропорциональна интенсивности флуоресценции и может быть измерена с читателем стандартного микроплиты. Миниатюризация этот assay в 96-луночных формат сократить время, необходимое для экспериментальной установки, использование 50% и реагента на 80% за состояние по сравнению с предыдущей версией 24-ну assay. Этот assay также совместим с другими измерениями клеточных функций. Например метаболической активности пробирного показано здесь, который может проводиться одновременно с измерений активности ММР в пределах же гидрогеля. Assay продемонстрировал с инкапсулирован в различных клеток, заполнение плотности для определения плотности соответствующие инкапсуляции для Рабочий диапазон assay клетки человека меланомы. После 24 ч клеток инкапсуляции ММП и метаболической активности показаний были пропорциональны посева плотность клеток. В то время как assay продемонстрировали здесь с одной fluorogenic разложению субстрата, пробирного и методологии могут быть адаптированы для широкого спектра других флуоресцентные датчиков и систем гидрогеля. Такие assay обеспечивает практических, эффективных и легко доступных 3D культивирования платформу для широкого спектра приложений.

Introduction

Трехмерная (3D) культуры системы часто более тесно пилки в vivo клеточных реакций чем систем традиционной культуры двухмерный (2D), увидеть несколько отличные публикаций1,2,3 . Однако используя 3D культуры систем для измерения функция ячейка была сложной из-за сложности поиска сотовой и далее пример обработки. Эта сложность ограничивает измерения многих клеточных функций в системах 3D культуры. Для преодоления этой трудности, новые методы необходимы позволяют легко измерения функции клеток в трехмерных средах. Один из способов решения этой задачи является разработка материалов, которые не только поддерживают 3D клеточной культуры, но также включать датчики для измерения функции клеток. Например несколько систем гидрогеля включили fluorogenic протеазы горные постановление возможность визуализации активности протеаз в трехмерных средах4,5,6,7. Хотя первоначально эти системы использовались для микроскопических изображений, эти системы также могут быть адаптированы для использования в глобальной матрицы металлопротеиназы (СПП) деятельности пробирного с помощью стандартной плиты читатель, позволяя снисходительный измерения функции клеток в 3D окружающей среды8.

Равенству, надсемейства цинка протеаз, играют важную роль в нормальной ткани гомеостаза и многих заболеваний. Равенству деградировать и переделывать внеклеточного матрикса (ECM), Клив поверхности рецепторы клеток и цитокинов и активировать другие равенству9,10. Равенству играют решающую роль в физиологических процессах, таких как заживление ран и болезней, как артрит, атеросклероз, болезнь Альцгеймера и рак (см. обзоры в 9,10,11). В рак высокие уровни выражения MMP сильно коррелируют с метастазами рака и плохой прогноз12. Кроме того равенству способствуют прогрессии опухоли путем поощрения вторжение раковых клеток и миграции, клеточных процессов, которые являются по своей сути 3D явлений13,14. Таким образом существует большой интерес в способность измерения активности ММР в 3D культуры во многих контекстах, включая основные биологические исследования и наркотиков скрининг анализов.

PEG гидрогели широко используются для 3D клеточной культуры благодаря их высоким содержанием воды, устойчивость к адсорбции белка и перестраиваемые характер. PEG гидрогели были функционализированных с числом постановление для прямого клеточной функции, такие как с ECM подражательный пептидов как РСЗ, RLD и IKVAV для облегчения клеточной адгезии, или прямой, привязывая факторов роста, такие как преобразование фактор роста β (TGF-β) 15,16. Совсем недавно гидрогели PEG были функционализированных с пептидами датчиков, позволяющих измерение клеточной функции как хорошо5,8. В частности использование системы гидрогеля PEG функционализированных с fluorogenic MMP-разложению пептид включено измерение клеточной активности ММР в 3D культур с читателем стандартной плиты и требуется дальнейшая обработка не. Эти системы также совместимы с другими измерениями клеточной функции, в том числе метаболической активности. Здесь описывается протокол для измерения активности ММР клетки культивировали в 3D PEG гидрогеля функционализированных с fluorogenic пептид MMP-разложению и представлены результаты демонстрируют первоначальной оптимизации эксперименты, необходимые для использования этого анализа. Клетки человека меланомы (A375) были инкапсулированы в fluorogenic гидрогелей в диапазоне посева плотности, чтобы определить соответствующие плотности посева, которые находятся в пределах Рабочий диапазон assay. После 24 ч инкапсуляции ММП и метаболической активности были измерены используя стандартный Гонав читателя. Далее деятельности МЦП нормализована метаболической активности для определения плотности посева в пределах диапазона линейной assay. Наконец между triplicates отразить воспроизводимость полученных результатов были рассчитаны интра плита коэффициент вариации в процентах (% CV). Этот метод позволяет просто и быстро 3D клеточной культуры и легко измерения активности протеаз с минимальным образец обработки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. гидрогеля подготовка компонентов

  1. Синтезируют флуоресцентный протеаз разложению пептидов как описано других8, используя флуоресцеин как флуоресцентные молекулой и dabcyl качестве утоления. Растворите пептида в ДМСО до концентрации 10 мм и хранить в морозильной камере-80 ° C в малых (~ 30 мкл) аликвоты избегать повторного замораживания оттаивания циклов.
    Примечание: Эти пептиды можно также приобрести коммерчески. Этот протокол требует C-терминал цистеина в пептидной последовательности для включения ковалентных включения в сеть полимерного гидрогеля.
  2. Подготовка 8 руки 40 кДа поли (этиленгликоля) Амин (PEG)-норборненом (NB) как описано17. Проверьте конец группы функционализации более чем на 90%, с использованием 1H ЯМР. ПЭГ-NB растворяют в стерильной фосфатный буфер (PBS) на 25% w/v и хранить в морозильной камере-80 ° C в аликвоты (~ 300 мкл).
    Примечание: PEG функционализированных с норборненом также может быть приобретен коммерчески.
  3. Синтезировать trimethylbenzoylphosphinate фенил 2,4,6 литий фото инициатор (LAP), как описано в других разделах18. Распустить круг в стерильной воде для концентрации 68 мм и хранить в морозильной камере-80 ° C в аликвоты (~ 300 мкл).
    Примечание: в качестве альтернативы, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) может использоваться в качестве фото инициатора. КОЛЕНИ и Irgacure могут быть приобретены коммерчески.
  4. Распустить MMP-разложению пептид сшивателя (KCGPQG↓IWGQCK) и пептида адгезии клеток (CRGDS) в стерильной воде для концентрации 200 мм и 100 мм, соответственно и хранить их в холодильнике-80 ° C (~ 300 мкл и ~ 30 мкл) аликвоты, соответственно.

2. анализа СМИ подготовка

  1. Подготовить тепло инактивированная, древесный уголь раздели плода бычьим сывороточным (ФБС) для assay ММП:
    Примечание: Протеазы в FBS может производить высокий фоновый сигнал с ММП assay; Поэтому, рекомендуется инактивирует тепла и древесного угля Стрип FBS для анализа СМИ.
    1. Инактивирует 100 мл FBS топлением 30 мин при температуре 55 ° C.
      Примечание: 100 мл FBS была использована здесь для aliquoting и хранения при температуре-20 ° C для использования в будущем. Меньшие объемы может использоваться при необходимости.
    2. Добавить 0,25% w/v активированного угля и 0,025% w/v декстрана в небольшое количество ФБС (примерно 5 мл) и перемешать до получения суспензии образуется. Затем добавьте остальные FBS и перемешать в течение 30 мин при температуре 55 ° C.
    3. Центрифуга на 1,962 x g 20 мин при 4 ° C. Супернатант затем перенесите другому судну.
    4. Повторите шаг 2.1.2, но при 37 ° C, а затем шаг 2.1.3. Стерилизуйте супернатанта, используя 0,45 мкм фильтром и затем 0.2 мкм фильтром.
  2. Подготовить анализ средств массовой информации с помощью СМИ, дополнен с 1% уголь раздели FBS, 2 мм L-глютамином, 10 ед/мл пенициллин, стрептомицин 10 мкг/мл.
    Примечание: СМИ без фенола Красного рекомендуется, потому что она имеет меньше помех флуоресценции. Другие дополнения к assay СМИ как инсулин, факторы роста, и т.д.. могут быть добавлены как поглощение и пики спектр флуоресценции не перекрываются с датчиком (494 Нм/521 Нм).
  3. Разбавить бактериальных коллагеназы фермента типа на 10 и 1000 мкг/мл в Пробирной СМИ как позитивный элемент управления.

3. гидрогеля подготовка и ячейки Инкапсуляция

  1. Приготовляют раствор прекурсоров гидрогеля.
    1. Добавьте реагентов на 1,5 мл в следующем порядке, vortexing после добавления каждого компонента: 20 мм 8 руки 40 кДа PEG-NB, 12,75 мм сшивателя MMP-разложению пептид, 17.8 мм NaOH, 1 мм CRGDS, 2 мм круг и пептида fluorogenic MMP-разложению 0,25 мм.
      Примечание: В таблице 1 показаны гидрогеля прекурсоров решение содержание, запасов концентрации, рабочие концентрации, формулы расчета объема и необходимых объемов необходимо сделать 120 мкл гидрогеля прекурсоров решения, которое является достаточным для проведения эксперимент с 10 гидрогели. Для учета потери гидрогеля решения благодаря закупорить, увеличьте общий объем на 20%. Коммерческие пептиды часто поставляются в растворе кислой хлористого водорода; Таким образом NaOH добавляется к достижению окончательного рН 7. pH окончательного решения должны быть подтверждены пользователем.
    2. Гидрогель прекурсоров решение разделить несколько 1.5 мл пробирок, одна трубка условие тестируемого.
      Примечание: Предлагаются несколько управления условий, в которых гидрогели готовятся без добавления клеток. Для отрицательного контроля для учета деградации неспецифические fluorogenic датчика, одно условие гидрогеля может быть инкубирован с управления транспортного средства или экспериментальных средств массовой информации только если нет условий лечения. Для позитивного управления и для калибровки между эксперименты гидрогели может инкубировали с протеазы, известно прилепится датчик fluorogenic. Например две концентрации бактериальной коллагеназы были использованы здесь.
  2. Инкапсуляция клетки в гидрогели.
    1. Подготовьте одну ячейку подвеска в зависимости от используемого типа ячейки. Например мыть 10 см блюдо A375 меланома клеток с 10 мл ФСБ. Trypsinize ячеек с помощью 0,05% трипсина и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 на 3 мин Подсчет ячеек с Горяева для определения числа общей ячейки.
    2. Центрифуга клетки решение на 314 x g на 3 мин, аспирационная культуры средств массовой информации, а затем вновь приостановить клетки в PBS на примерно в три раза высоких требуемых посева плотности для эксперимента. Например суспензию клеток с плотностью 21 x 106 клеток был использован здесь для достижения окончательного инкапсулированные плотности 7 х 106 клеток/мл.
    3. Подсчет ячеек снова для обеспечения точной ячейки концентрации.
    4. Добавьте подвесной клетки и PBS в каждую пробирку гидрогеля прекурсоров решения согласно необходимые плотности посева (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 x 106 клеток/мл в этом примере). Добавьте PBS в условиях с клеток не вместо подвесной клетки.
      Примечание: Все условия должны быть того же объема окончательный гидрогеля прекурсоров решения для обеспечения соотношения между компонентами гидрогеля и PBS является константой. Сделать не вихревой трубы, которые имеют клетки в них, энергично Пипетка вверх и вниз без создания пузыри для того, чтобы смешать раствор прекурсоров.
    5. Обойтись 10 мкл раствора гидрогеля прекурсоров в стерильных черный раунд 96-луночных днище, обеспечивая, что кончик центрируется в середине каждой скважины во время отпуска.
    6. Полимеризоваться гидрогеля прекурсоров решение, разоблачение пластины ультра фиолетовый (УФ) света в 4 МВт/см2 за 3 мин.
      Примечание: УФ-лампа (Карманный УФ-лампа UVL-56, UVP, возвышенности, CA) производит УФ-свет на длинные волны УФ (365 Нм), которая не влияет на клеточной жизнеспособности.
    7. Добавьте 150 мкл пробирного СМИ для всех скважин за исключением положительный контроль условий без инкапсулированные клетки. К позитивным элементам управления 150 мкл раствора фермент коллагеназа.
    8. Добавьте 150 мкл PBS внешних скважин пластину для уменьшения испарения во время инкубации.

4. ММП и метаболической активности измерения

  1. Измерения флуоресценции сразу после инкапсуляции установить базовые измерения флуоресценции и обеспечения единообразия в гидрогеля полимеризации. Читайте пластину с помощью флуоресценции Гонав читателя, используя протокол непрозрачной 96-луночных пластины с площадью сканирования параметр 494 Нм/521 Нм (возбуждение/излучение). Это будет 0 h читать.
  2. Инкубируйте пластины в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5% CO2 для 18 h.
  3. Добавление метаболической активности реагента (резазурина) в 1:10 (v/v) для каждой скважины.
  4. Инкубируйте пластины в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5% CO2 для дополнительных 6 ч.
    Примечание: Время инкубации может отличаться в зависимости от типа ячейки.
  5. Измерения флуоресценции в 24 ч после инкапсуляции. Читайте пластину с помощью флуоресценции Гонав читателя, используя протокол непрозрачной 96-луночных пластины с площадью сканирования параметр 494 Нм/521 Нм (возбуждение/излучение) для деятельности ММП и 560 Нм/590 Нм (возбуждение/излучение) для метаболической активности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Текущий анализ был адаптирован от ранее развитых и характеризуется 3D гидрогеля культуры системы функционализированных с ММП горные датчик fluorogenic8. Fluorogenic MMP датчике здесь состоит из последовательности пептид, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ указывает на сайте расщепления), ранее был оптимизирован для расщепления MMP-14 и MMP-11-19. Пептид обозначено с молекулой флуоресцентные (флуоресцеин) и утоления молекулы (dabcyl) по обе стороны от расщепления сайта (рис. 1). Под воздействием fluorogenic датчика соответствующие протеаз Флюорофор и утоления отделены, и флуоресценции увеличивается. Здесь в формат 96-луночных пластины, устраняя ряд шагов в процессе инкапсуляции и уменьшения времени, необходимого для выполнения эксперимента на 50% от 24-ну пластины был миниатюрных assay. Кроме того она сократила объем реагентов, потребляется на 80%, как Гидрогель томов было сокращено с 50 мкл до 10 мкл в колодец. Кроме того с помощью 96-луночных плита, 20 условий в triplicates могут быть опробованы вместо 12 условий в дубликаты на 24-ну пластину. Схематическое изображение процесс инкапсуляции клеток проиллюстрирована на рисунке 2. Метка 1 и 2 соответствуют этапам 3.1 и 3.2 в протоколе, соответственно. Этикетки от 3 до 5 соответствуют этапам 3.2.5 для 3.2.7 в протоколе. Этикетки 6-9 соответствуют этапам 4.2-4.5 в протоколе.

Для установления пределов обнаружения и диапазон assay сигнала, гидрогели функционализированных с ММП разложению пептидные fluorogenic инкубировали с диапазоном концентраций (0 до 2000 мкг/мл) коллагеназы бактериальный фермент типа I. После 24 ч инкубации при 37 ° C плита читатель был использован для измерения флуоресценции (рис. 3). Из этих измерений, динамический (низкие и высокие обнаруженных сигналов) и рабочий диапазон (3 стандартных отклонения выше низких обнаруженный сигнал) и 3 стандартных отклонения ниже высоких обнаруженного сигнала были определены. После 24 ч инкубации было отмечено, что низкие обнаруженный сигнал был спродюсирован негативный контроль (фоновый шум) в 0 мкг/мл коллагеназы, в то время как самой обнаружен сигнал был выпущен 1000 мкг/мл коллагеназы или выше, где сигнал начинает плато (рис. 3). Из динамического диапазона Рабочий диапазон был рассчитан между ≈0.16 мкг/мл и ≈474 мкг/мл коллагеназы, диапазон широкий сигнала через трех порядков.

Для анализов культуры клеток плотность соответствующие клеток, что приводит к флуоресцирования чтений в рабочий диапазон assay должны быть определены для каждого типа клеток. Здесь репрезентативных данных представлен на линии клеток меланомы A375, инкапсулированные в диапазоне плотностей от 0,25 до 7 х 106 клеток/мл. Интенсивность флуоресценции была приобретена, используя стандартный Гонав читателя в двух разных временных точках: 1) непосредственно после инкапсуляции (0 h) и 2) после 24 ч инкапсуляции. В 0 ч флуоресценции чтений были низкими по плотности посева (рис. 4A), как ожидалось. После 24 ч культуры (Рисунок 4B) активности ММР был прямо пропорционален посева плотности, в котором больше ячеек привели к более расщепление fluorogenic MMP горные датчика и более высокую интенсивность флуоресценции. Как внутреннего контроля, гидрогели, содержащие ячейки не инкубировали с 0, 10 и 1000 мкг/мл коллагеназы типа фермента для обозначения низкого, среднего и высокого уровней сигнала соответственно (как определено коллагеназы характеристика диапазон сигнала в Рисунок 3) и представленный пунктирные линии на рисунке 4B. Кроме того границы диапазона рабочих были рассчитаны от сигналов 0-1000 мкг/мл и представлены пунктирными линиями в Рисунок 4B. Плотность посева на больше чем 1 x 106 клеток/мл или попадают в пределах рабочего диапазона. Измерения метаболической активности клеток линии A375 были также прямо пропорциональна клеток, заполнение плотности (рис. 4C). Ранее для метаболической активности как внутреннего контроля для определения активности ММП на за ячейкой8нормализован MMP активность. Нормализация деятельности МЦП метаболической активности через плотность посева привело к статистически значимого различия в деятельности ММП на посевной плотностью больше чем 2 х 106 клеток/мл (рис. 4D). Чтобы определить вариабельность между triplicates в каждой пластинке (Интра плита изменчивость), коэффициент вариации в процентах (% CV) было рассчитано для СПП и метаболической активности и приводится в таблице 2. % CV ниже 20% указывает, что внутри плита изменчивость в triplicates является приемлемым для системы производить последовательные результаты20,21.

Figure 1
Рисунок 1 : Fluorogenic MMP-разложению дизайн пептид. Пептидные fluorogenic MMP-разложению состоит из магистральных пептидные GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ указывает на сайте расщепления), который определяет специфику датчика. Пептид помечается утоления (dabcyl) и Флюорофор (флуоресцеин), который является неутоленной (флуоресцирует) когда основу пептидной расщепляется по избирательным Округам. Группа тиоловых конъюгированных к магистральной пептид для включения ковалентных реакции с норборненом функциональных групп в молекуле PEG, сцепка датчик гидрогеля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Assay схема. Компоненты решения прекурсоров гидрогеля смешиваются с клеток, приостановлено в PBS. Решение прекурсоров, затем накапаны в черный, раунд внизу, 96-луночных пластины и полимеризуется под воздействием УФ-излучения на 3 мин Assay добавляется СМИ, и пластины инкубируют для 18 h (37 ° C, 5% CO2). Затем добавляется метаболической активности реагента резазурина и пластины инкубируют для дополнительных 6 ч. ММП и метаболической активности измеряются с помощью флуоресцентных Гонав читателя с протоколом хорошо сканирования на длинах волн указанных возбуждения/выбросов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Динамика и рабочий диапазон assay. Гидрогели функционализированных с fluorogenic MMP-разложению пептид инкубировали с диапазоном концентраций коллагеназы фермента типа, который я за 24 ч при 37 ° C и флуоресценции интенсивности было измерено. Пунктирные линии обозначают диапазон динамических и рабочих. n = 3, означает ± стандартное отклонение (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 4
Рисунок 4 : Эффект посева плотность меланома клеток линии A375 на деятельности МЦП. (A) первоначальные измерения (0 h) ММП деятельности для A375 клеточной линии, инкапсулированные в диапазоне плотностей посева. n = 3 среднее ± SD. (B) измерение активности ММР в 24 ч. 0, 10 и 1000 мкг/мл коллагеназы представлены пунктирными линиями. Пунктирные линии обозначают диапазон рабочих (WR), рассчитывается от коллагеназы элементов управления. n = 3, означает ± SD. (C) измерение метаболической активности для A375 клеточной линии инкапсулируются за 24 ч в диапазоне плотности посева и инкубировали с резазурина для 6 h. n = 3, означает ± SD. (D) A375 СПП активности нормированы метаболической активности. n = 3, значит ± SD. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Table 1
Таблица 1: Приготовления раствора прекурсоров гидрогеля.

Table 2
Таблица 2: Интра плита % CV пробу с линией клеток A375.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3D в пробирке клеточной культуры резюмирует многие важные аспекты в естественных условиях окружающей среды. Однако 3D культуры также делает оценки функции клеток и сигнализации сложной, как многие биологические анализы требуют поиска сотовой и большое количество клеток. Таким образом, разработка простой 3D культуры системы, которая позволяет измерение клеточной функции без дальнейшего образец обработки будет значительно увеличить полезность систем 3D культуры. 3D система, описанная здесь могут быть адаптированы для ряда различных приложений. Последовательность fluorogenic датчика могут быть изменены для обнаружения других протеаз. К примеру, fluorogenic горные датчик последовательности (GPQG↓IWGQK) который можно расщепляется MMP-1, -2 -3 -7, -8 и, -9, ранее использовался для выявления меланомы MMP деятельности в ответ на химиотерапевтические22. Использование системы гидрогеля PEG также позволяет точные независимой настройки сотовой микроокружения, включая механические свойства, разложению и постановление адгезии матрицы в рамках гидрогеля. Межмицеллярная молекула РСЗ, используемые в этой работе — это последовательность, фибронектин, полученных и позволяет при посредничестве Интегрин адгезии. Другие молекулы адгезии как (RLD) и (IKVAV), являются производными от фибриногена и Ламинин соответственно могут быть использованы для того чтобы активировать другие виды Интегрин рецепторов. Например было продемонстрировано, что изменения молекулы адгезии изменил удлинение аортального клапанов интерстициальных клеток (VIC), которые могут иметь влияние на стеноз аортального клапана15. Гидрогель сшивателя последовательности можно управлять разлагаемость гидрогеля и инкапсулированные клеточного поведения в пределах гидрогеля. Например было продемонстрировано, что фибробласты увеличилось распространения и распространения при культивировали в быстрее унижающего достоинство гидрогели, который может ускорить заживление процесс в естественных условиях23ячеек. Механических свойств микроокружения также может регулировать функции клеток, и жесткость гидрогеля можно изменить, изменяя количество оружия в macromer КОЛЫШЕК, PEG молекулярный вес и соотношение между PEG и сшивателя.

Потому что ММП деятельности варьируется в зависимости от типа клеток, для каждого нового типа клеток важно для проведения эксперимента по оптимизации Инкапсуляция плотность, как показано здесь. После 24 ч инкапсуляции прямо пропорциональна ячейки плотность посева ММП и метаболической активности. Однако на длиннее время флуоресцентного сигнала может плато, поэтому сроки assay может потребоваться быть оптимизированы пользователя8. Конкретные протеазы датчик может также повлиять на рабочий диапазон и сроков анализа. Рабочий диапазон assay может определяться путем проведения эксперимент диапазон сигнала без клетки и протеолитического фермента над большой концентрации. Включение нескольких никаких условий гидрогеля клеток, инкубировали с фермента контроля позволяет создание самой низкой (фоновый шум), средний и высокий уровни сигнала в пределах каждого пробирного (0, 10-1000 мкг/мл коллагеназы здесь). Это дает указание где сигналы, производимые клетки попадают в рабочий диапазон assay. Этот assay также совместим с другими флуоресцентные датчиками, которые не имеют совпадающих возбуждения и спектры выбросов, такие как assay метаболической активности используется здесь как внутреннего контроля для расчета активности ММП на основе за клеток, как сообщалось ранее8 . ММП активность нормализованное для метаболической активности показали, что действительность этого подхода для посева плотности на уровне или выше 2 x 106 клеток/мл, в котором есть никаких существенных изменений по плотности посева. Такая нормализация важно определить соответствующие плотности посева, которые находятся в диапазоне рабочей кривой активности ММР и в линейной части кривой нормализации.

В то время как assay может быть адаптирована для нескольких целей, существует несколько ограничений и критических аспектов, которую пользователь следует рассмотреть, специально относительно вмешательства с флуоресцентного сигнала и подготовка гидрогелей. Во-первых необходимо позаботиться с выбором культуры средств массовой информации и дополнительные процедуры, как они могут иметь перекрывающиеся спектра поглощения или непрозрачность, которые могут помешать с обнаружением флуоресценции или утолить сигнала. Рекомендуется использовать средства массовой информации культуры, который не содержит фенола красного. Кроме того, некоторые виды лечения наркотиков флуоресцентные (например, доксорубицин), или иметь спектра поглощения, который перекрывается с возбуждения/выбросов спектр Флюорофор (например, curcuminoids). Второй аспект, который может повлиять на производительность анализа является подготовка гидрогеля. Из-за высокой вязкости раствора прекурсоров гидрогеля необходимо принять для обеспечения тщательного перемешивания раствора гидрогеля и тщательного дозирования практики для предотвращения неравного Флюорофор содержание или гидрогеля объема раствора в каждой скважине. Предварительное смачивание наконечники и низким сохранение советы могут помочь снизить изменчивость. Еще одним важным аспектом подготовки гидрогеля является гидрогеля форма и расположение в скважинах. Гидрогель должен быть центризован в колодец и единой формы для включения измерения точные флуоресценции с меньше изменчивости15. Здесь использование круглых нижней пластин СПИД в центрирование кончиком пипетки в каждой скважины и производства полусферических гидрогели последовательно через все скважины.

По адаптации системы 3D протеаз разложению гидрогеля, реального времени протеазы и метаболической активности показаний могут быть обнаружены в 3D микроокружения с минимальным образец обработки. Кроме того использование синтетических гидрогеля PEG снижает изменчивость партии партии, с естественно производных гидрогели ECM. Кроме того используя PEG гидрогели позволяет тонкой настройки химических и механических подсказки гидрогелей для улучшения управления микроокружения. Кроме того, полимеризации гидрогеля PEG, описанные здесь является фото инициировал процесс, делает его быстро и более пригодным для методологии высокой пропускной способности, чем классические природные ECM гидрогели (т.е.., коллагена или Matrigel), которая медленнее и чувствительна к температуре. Этот быстрый, контролируемые пользователем полимеризации позволяет масштабирования системы для дальнейшего автоматизировать с помощью роботов жидкого обработчики, как показано на другие15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы признать Огайо исследования рака (OCR), Огайо, США для финансирования этой работы, а также король университет Сауд (КГУ), Эр-Рияд, Саудовская Аравия для авторов первого автора. Молекулярная масса датчика флуоресцентные пептид была измерена с помощью матрицы помощь, лазерной десорбции ионизации, время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии с помощью кампуса химических инструмент центр масс спектрометрии и протеомики Фонд в университете штата Огайо.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 10-010-049
Activated charcoal  Sigma-Aldrich C3345
Black round bottom 96-well plate Brand-Tech 89093-600
Cell adhesion peptide (CRGDS) GenScript USA Inc. custom made
Collagenase enzyme type I  Life Technologies 17100-017
Dextran Sigma-Aldrich D4876
DMEM High Glucose Media Invitrogen 11965118
Fetal bovine serum (FBS)  Seradigm 1500-500
Fluorescence microplate reader  BioTek Cytation 3
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
L-glutamine Life Technologies 25030-081
MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) GenScript USA Inc. custom made
NaOH Fisher Scientific S318500
Penicillin /streptomycin Life Technologies 15140-122
Resazurin (Alamar Blue) Life Technologies DAL1100
UV light  UVP 95-0006-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  3. Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
  4. Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
  5. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  6. Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
  7. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
  8. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  9. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  10. Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178 (2016).
  11. Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
  12. Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
  13. Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
  14. Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
  15. Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
  16. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  17. Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
  18. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  19. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  20. Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
  21. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
  22. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  23. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).

Tags

Биоинженерия выпуск 143 гидрогели 3D мобильных инкапсуляции матрицы металлопротеиназ метаболической активности меланома флуоресценции
Измерение глобального сотовой матрицы металлопротеиназ и метаболической активности в 3D гидрогели
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fakhouri, A. S., Leight, J. L.… More

Fakhouri, A. S., Leight, J. L. Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels. J. Vis. Exp. (143), e59123, doi:10.3791/59123 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter