Summary
Aquí, se presenta un protocolo para encapsular y cultivo de células en hidrogeles de poly(ethylene glycol) (PEG), funcionalizados con un fluorógenos matriz metaloproteinasa (MMP)-péptido degradable. MMP celular y actividad metabólica se miden directamente las culturas de hidrogel utilizando un lector de microplacas estándar.
Abstract
Sistemas de cultivo celular (3D) tridimensional a menudo más de cerca recapitulan en vivo respuestas celulares y funciones que los sistemas de dos dimensiones tradicionales de la cultura (2D). Sin embargo, medición de función de las células en cultura 3D suele ser más difícil. Muchos ensayos biológicos requieren recuperación de material celular que puede ser difícil en las culturas 3D. Una forma de enfrentar este desafío es desarrollar nuevos materiales que permitan la medición de función de la célula dentro del material. Aquí, se presenta un método para la medición de actividad de la metaloproteinasa (MMP) de matriz celular en hidrogeles 3D en un formato de 96 pozos. En este sistema, un hidrogel de poly(ethylene glycol) (PEG) es functionalized con sensor escindibles fluorógenos MMP. Actividad MMP celular es proporcional a la intensidad de fluorescencia y puede medirse con un lector de microplacas estándar. Miniaturización de este ensayo a un formato de 96 pocillos reduce el tiempo requerido para la instalación experimental por 50% y el reactivo de uso 80% condición en comparación con la versión anterior de 24 pocillos de ensayo. Este ensayo también es compatible con otras mediciones de la función celular. Por ejemplo, un análisis de la actividad metabólica es demostrado aquí, que puede realizarse simultáneamente con las mediciones de actividad de la MMP dentro el mismo hidrogel. El ensayo se demuestra con las células de melanoma humano encapsuladas en una gama de siembra la densidad para determinar la densidad de encapsulación apropiada para el rango de trabajo del ensayo de la célula. Después de 24 h de encapsulación de la célula, MMP y lecturas de la actividad metabólica fueron proporcionales a la densidad de siembra de la célula. Mientras que el ensayo se demuestra aquí con un substrato degradable fluorógenos, el ensayo y la metodología podrían ser adaptados para una gran variedad de sistemas de hidrogel y otros sensores fluorescentes. Tal un ensayo proporciona una plataforma de cultivo 3D práctica, eficiente y accesible para una amplia variedad de aplicaciones.
Introduction
Sistemas de cultivo (3D) tridimensional a menudo más de cerca recapitular en vivo respuestas celulares que los sistemas de cultivo (2D) dos dimensiones tradicionales, ver varias publicaciones excelente1,2,3 . Sin embargo, los sistemas de cultivo 3D para medir la función de la célula ha sido difícil debido a la dificultad de recuperación celular y más procesamiento de la muestra. Esta dificultad limita la medición de muchas funciones celulares en los sistemas de cultivo 3D. Para superar esta dificultad, nuevas técnicas son necesarias que permita la fácil medición de función de la célula dentro de entornos 3D. Una forma de responder a esta necesidad es el desarrollo de materiales que no sólo apoyan cultivo celular 3D sino también incorporar sensores para medir la función de la célula. Por ejemplo, varios sistemas de hidrogel han incorporado partes escindibles de la proteasa fluorógenos para habilitar la visualización de la actividad de las proteasas dentro de entornos 3D4,5,6,7. Mientras que estos sistemas fueron utilizados originalmente para la proyección de imagen microscópica, estos sistemas también pueden ser adaptados para su uso en un ensayo de actividad global de la matriz metaloproteinasa (MMP) utilizando un lector de placa estándar, que permite la medida fácil de una función de la célula en un 3D medio ambiente8.
MMPs, superfamilia de las proteasas de zinc, juegan un papel crítico en la homeostasis del tejido normal y en muchas enfermedades. MMPs degradan y remodelan la matriz extracelular (MEC), cleave citocinas y receptores de superficie celular y activan otras MMPs9,10. MMPs juegan un papel crítico en procesos fisiológicos tales como la cicatrización de heridas y en enfermedades como artritis, aterosclerosis, enfermedad de Alzheimer y cáncer (ver comentarios en 9,10,11). En el cáncer, altos niveles de expresión de la MMP se correlacionan fuertemente con metástasis de cáncer y mal pronóstico12. Además, MMPs contribuyen a la progresión del tumor mediante la promoción de cáncer células invasión y migración, procesos celulares que son fenómenos intrínsecamente 3D13,14. Por lo tanto, hay mucho interés en la capacidad para medir la actividad MMP en 3D cultura en muchos contextos, incluyendo estudios de Biología fundamentales y ensayos de detección de drogas.
Hidrogeles de PEG son ampliamente utilizados para el cultivo de celular 3D debido a su alto contenido de agua, resistencia a la adsorción de proteínas y la naturaleza armoniosa. Hidrogeles de PEG han sido funcionalizados con un número de fracciones en función directa de la célula, tales como con péptidos miméticos de ECM como RGD, RLD y IKVAV para facilitar la adhesión celular, o directamente tethering de factores de crecimiento tales como transformación de factor de crecimiento-β (TGF-β) 15,16. Más recientemente, hidrogeles PEG han sido funcionalizados con péptidos de sensores que permitan la medición de la función celular como bien5,8. Específicamente, el uso de un sistema de hidrogel PEG funcionalizados con un fluorógenos MMP-degradable medición de péptido activado de actividad celular de MMP en culturas 3D con un lector de placas estándar y no requiere ninguna transformación posterior. Estos sistemas también son compatibles con otras mediciones de la función celular, incluyendo la actividad metabólica. Aquí, se describe un protocolo para la medición de la actividad MMP de células cultivadas en un hidrogel de PEG 3D funcionalizados con un péptido MMP-degradable fluorógenos y resultados presentados demostrando los experimentos de optimización inicial necesarios para el uso de este ensayo. Células de melanoma humano (A375) fueron encapsuladas en los hidrogeles fluorógenos en un rango de densidades para determinar las densidades de siembra apropiadas que están dentro del rango de trabajo del ensayo de siembra. Después de 24 h de encapsulación, MMP y la actividad metabólica se midieron utilizando un lector de microplacas estándar. A continuación, actividad MMP fue normalizada a la actividad metabólica para determinar las densidades de siembra dentro del rango lineal del ensayo. Por último, coeficiente intra-placa de porcentajes de variación (% CV) se calcularon entre triplicados para reflejar la reproducibilidad de los resultados obtenidos. Este método permite cultivo celular 3D simple y rápido y fácil medición de la actividad de la proteasa con el procesamiento de la muestra mínima.
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Protocol
1. hidrogel preparación de componentes
- Sintetizan los péptidos proteasa degradable fluorescentes tal como se describe en otra parte8, utilizando fluoresceína como la molécula fluorescente y dabcyl como el extintor. Disolver el péptido en DMSO a una concentración de 10 mM y almacenar en un congelador de-80 ° C en pequeñas alícuotas (30 μL) para evitar ciclos de congelación y descongelación repetida.
Nota: Estos péptidos también se pueden comprar comercialmente. Este protocolo requiere una cisteína C-terminal de la secuencia del péptido para permitir incorporación covalente a la red de polímero de hidrogel. - Preparar 8 brazo 40 kDa poly (glicol de etileno) amina (PEG)-norbornene (NB) como describe en17. Verificar la funcionalización de grupo extremo superior al 90% mediante 1H NMR. PEG-NB se disuelven en solución salina tampón estéril de fosfato (PBS) en 25% w/v y almacenar en el congelador de-80 ° C en alícuotas (~ 300 μL).
Nota: PEG funcionalizados con norbornene también se pueden adquirir comercialmente. - Sintetizar el foto iniciador litio fenil 2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) como se describe en otra parte18. Disolver vuelta en agua estéril a una concentración de 68 mM y almacenar en un congelador de-80 ° C en alícuotas (~ 300 μL).
Nota: como alternativa, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) se puede utilizar como foto iniciador. VUELTA y Irgacure pueden adquirirse comercialmente. - Disolver el crosslinker MMP-degradable del péptido (KCGPQG↓IWGQCK) y los péptidos de adhesión celular (CRGDS) en agua estéril a una concentración de 200 mM y 100 mM respectivamente y almacenar en un congelador de-80 ° C (~ 300 μl y 30 μL) alícuotas, respectivamente.
2. preparación de medios de ensayo
- Preparar el inactivado con calor, carbón despojado de suero bovino fetal (SBF) para el ensayo de RPP:
Nota: Las proteasas en FBS pueden producir una señal de euforia con el ensayo MMP; por lo tanto, se recomienda que inactive por calor y carbón de leña de la FBS para los medios de prueba de la tira.- 100 mL de SBF de inactivar por calentamiento durante 30 min a 55 ° C.
Nota: 100 mL de SBF se utilizó aquí para alicuotar y almacenamiento a-20 ° C para su uso futuro. Volúmenes más pequeños se pueden utilizar según sea necesario. - Añadir 0,25% p/v de carbón de leña activado y 0.025% peso/volumen de dextrano a una pequeña cantidad de FBS (aproximadamente 5 mL) y remover hasta que se forma una mezcla. A continuación, añadir el resto de los equipos y agitar durante 30 min a 55 ° C.
- Centrifugar a 1.962 x g por 20 min a 4 ° C. Luego transferir el sobrenadante a otro buque.
- Repetir el paso de la 2.1.2 pero a 37 ° C seguida por paso 2.1.3. Esterilizar el sobrenadante utilizando un 0.45 μm filtro y luego un 0,2 μm.
- 100 mL de SBF de inactivar por calentamiento durante 30 min a 55 ° C.
- Preparar los medios de ensayo medio suplementado con 1% carbón despojado SFB, 2 mM L-glutamina, 10 U/mL de penicilina, estreptomicina 10 de μg/mL.
Nota: Los medios de comunicación sin rojo de fenol se recomiendan porque tiene menos interferencia de fluorescencia. Otras adiciones a los medios de prueba tales como insulina, factores de crecimiento, etcetera. se puede Agregar tanto como la absorbancia y picos del espectro de fluorescencia no se superponen con el sensor (494 nm/521 nm). - Enzima colagenasa bacteriana diluida tipo I en 10 y 1.000 μg/mL en los medios de ensayo como control positivo.
3. hidrogel preparación y célula encapsulado
- Preparar la solución precursora de hidrogel.
- Añadir los reactivos en un tubo de 1,5 mL en el siguiente orden, vórtex después de la adición de cada componente: 20 m m 8 brazo 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM crosslinker MMP-degradable péptido, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM LAP y péptido de 0.25 mM fluorógenos MMP-degradable.
Nota: La tabla 1 muestra hidrogel precursor solución contenidos, concentraciones de población, las concentraciones de trabajo, fórmulas de cálculo de volumen y los volúmenes requeridos necesitan para hacer 120 μl de la solución precursora de hidrogel, que es suficiente para llevar a cabo un experimento con 10 hidrogeles. Para tener en cuenta la pérdida de la solución de hidrogel por pipeteo, aumentar el volumen total en un 20%. Los péptidos comerciales a menudo se suministran en una solución de cloruro de hidrógeno ácidos; por lo tanto, se agrega NaOH para alcanzar un pH final de 7. pH de la solución final debe confirmarse por el usuario. - Dividir la solución precursora de hidrogel en múltiples tubos de 1.5 mL, un tubo por condición ensayada.
Nota: Se sugieren varias condiciones de control en el que los hidrogeles se preparan sin la adición de células. Para un control negativo, para tener en cuenta la degradación no específico del sensor fluorógenos, una condición de hidrogel puede incubarse con el control del vehículo o los medios de comunicación experimental sólo si no hay condiciones tratamiento. Para un control positivo y de calibración entre experimentos, hidrogeles pueden ser incubados con una proteasa que hienden el sensor fluorógenos. Por ejemplo, dos concentraciones de colagenasa bacteriana se utilizan aquí.
- Añadir los reactivos en un tubo de 1,5 mL en el siguiente orden, vórtex después de la adición de cada componente: 20 m m 8 brazo 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM crosslinker MMP-degradable péptido, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2 mM LAP y péptido de 0.25 mM fluorógenos MMP-degradable.
- Encapsular las células en los hidrogeles.
- Preparar una suspensión unicelular como apropiado para el tipo de célula se utiliza. Por ejemplo, lavar un plato de 10 cm de las células del melanoma A375 con 10 mL de PBS. Trypsinize células con 0.05% tripsina e incubar a 37 ° C y 5% CO2 para 3 minutos cuenta las células con un hemocitómetro para determinar el número total de la célula.
- Centrifugue la solución celular 314 x g durante 3 min, aspirar el medio de cultivo y resuspender las células en PBS en aproximadamente tres veces la densidad más alta requiere siembra para el experimento. Por ejemplo, una suspensión con una densidad de 21 x 106 células fue utilizada aquí para lograr una densidad encapsulada final de 7 x 106 células/mL.
- Contar las células otra vez para asegurar una concentración exacta de la célula.
- Añadir las células suspendidas y PBS a cada tubo de la solución precursora de hidrogel según la densidad de siembra requerida (0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 x 106 células/mL en este ejemplo). Añadir PBS a condiciones sin las células en lugar de células suspendidas.
Nota: Todas las condiciones deben tener el mismo volumen de solución de precursor de hidrogel final para asegurar la relación entre los componentes del hidrogel y el PBS es constante. No no los tubos de vórtice que tienen células en ellos, y arriba pipetear enérgicamente sin crear burbujas para mezclar la solución precursora. - Dispensar 10 μl de la solución precursora de hidrogel en una estéril negra redonda placa de 96 pocillos de fondo, asegurando que la punta esté centrada en el medio de cada pozo mientras.
- Polimerice solución precursora de hidrogel al exponer la placa a la luz (UV) violeta ultra a 4 mW/cm2 durante 3 minutos.
Nota: La lámpara UV (lámpara UV portátil de UVL 56, UVP, Upland, CA) produce UV-A luz en una longitud de onda larga de rayos UV (365 nm), que no afecta la viabilidad celular. - Añadir 150 μL del medio de ensayo a excepción de las condiciones de control positivo sin las células encapsuladas. A los controles positivos, añadir 150 μL de solución de enzima colagenasa.
- Añadir 150 μL de PBS a los pozos de exteriores de la placa para reducir la evaporación durante la incubación.
4. MMP y medición de la actividad metabólica
- Medir fluorescencia inmediatamente posterior encapsulación para establecer una medida de la fluorescencia basal y asegurar la uniformidad en la polimerización de hidrogel. Lea la placa con una microplaca de fluorescencia lector utilizando un protocolo de opaco placa de 96 pozos con un área de exploración ajuste a 494 nm/521 nm (excitación/emisión). Esta será la 0 h leer.
- Incube la placa en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO2 para 18 h.
- Añadir reactivo de actividad metabólica (resazurina) en 1:10 (v/v) para cada bien.
- Incube la placa en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% de CO2 por un adicional de 6 horas.
Nota: Este tiempo de incubación puede variar dependiendo del tipo de la célula. - Medida de fluorescencia en la encapsulación después de 24 h. Lea la placa con una microplaca de fluorescencia lector utilizando un protocolo de opaco placa de 96 pozos con un área de análisis entorno a 494 nm/521 nm (excitación/emisión) para la actividad MMP y 560 nm/590 nm (excitación/emisión) para la actividad metabólica.
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Representative Results
El ensayo actual fue adaptado de un sistema de cultivo previamente desarrollado y caracterizado 3D hidrogel funcionalizado con un fluorógenos MMP escindibles sensor8. El sensor MMP fluorógenos utilizado aquí consiste en una secuencia del péptido, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ indica el sitio de clivaje) que previamente fue optimizado para la hendidura MMP-14 y MMP-1119. El péptido es marcado con una molécula fluorescente (fluoresceína) y una molécula de extinguidor de arcos (dabcyl) a ambos lados del sitio de clivaje (figura 1). A la exposición del sensor fluorógenos la proteasa adecuada, el fluoróforo y el quencher se separan, y la fluorescencia aumenta. Aquí, el ensayo fue miniaturizado de una placa de 24 pocillos a un formato de placa de 96 pocillos, eliminando varios pasos en el proceso de encapsulación y reduciendo el tiempo necesitado para llevar a cabo un experimento en un 50%. Además, reduce el volumen de reactivo consumido en un 80%, volúmenes de hidrogel se redujeron de 50 μl 10 μl por pocillo. Por otra parte, usando una placa de 96 pocillos, podrían probarse 20 condiciones en triplicado en lugar de las 12 condiciones de duplicados por placa de 24 pozos. Un esquema del proceso de encapsulación de la célula se ilustra en la figura 2. Etiqueta 1 y 2 corresponden a los pasos 3.1 y 3.2 en el protocolo, respectivamente. Etiquetas de 3 a 5 corresponden a los pasos 3.2.5 a 3.2.7 en el protocolo. Etiquetas de 6 a 9 corresponden a los pasos de 4.2 a 4.5 en el protocolo.
Para establecer los límites de detección y rango del ensayo de la señal, los hidrogeles funcionalizados con el péptido MMP-degradable fluorógenos se incubaron con un rango de concentraciones (0 a 2.000 μg/mL) del tipo de enzima colagenasa bacteriana I. Después de 24 h de incubación a 37 ° C, un lector de placas se utilizó para medir la fluorescencia (figura 3). De estas mediciones, la dinámica (más bajo y más alto detectado señales) y se determinó rango de trabajo (3 desviaciones estándar por encima de la señal detectada más baja) y 3 desviaciones estándar por debajo de la más alta señal detectada. Después de 24 h de incubación, se observó que la menor señal detectada fue producida por controles negativos (ruido de fondo) en 0 colagenasa μg/mL, mientras que el más alto detectado señal fue producida por 1.000 colagenasa μg/mL o superior, donde la señal comienza a Meseta (figura 3). De la gama dinámica, se calculó el rango de trabajo entre ≈0.16 μg/mL y ≈474 μg/mL de colagenasa, una gama amplia de la señal a través de tres órdenes de magnitud.
Para los ensayos de cultivo celular, la densidad apropiada de la célula que produce lecturas de fluorescencia dentro de la gama de trabajo del ensayo debe ser determinada para cada tipo de célula. Aquí, se presentan datos representativos para la línea celular de melanoma A375, encapsulado en una gama de densidades de 0.25 a 7 x 106 células/mL. Intensidad de la fluorescencia fue adquirida utilizando un lector de microplacas estándar en dos momentos diferentes: 1) directamente después de la encapsulación (0 h) y 2) después de 24 h de encapsulación. A las 0 h, lecturas de fluorescencia fueron bajas en densidades de siembra (figura 4A), como era de esperar. Después de 24 h de cultivo (figura 4B), la actividad de la MMP era directamente proporcional a la densidad de siembra, en la que más células dio lugar a más escote de la fluorógenos MMP escindibles sensor y mayor intensidad de fluorescencia. Como controles internos, hidrogeles que contienen no las células se incubaron con 0, 10 y 1000 μg/mL de colagenasa tipo I enzima para indicar los niveles bajos, medianos y altos de la señal respectivamente (según la caracterización de rango de señal de colagenasa en Figura 3) y representado por las líneas punteadas en la figura 4B. Además, los límites de la gama de trabajo fueron calculados a partir de las señales de 0 y 1 000 μg/mL y representados por las líneas punteadas en la figura 4B. Densidades de siembra en o superior a 1 x 106 células/mL caen dentro de los límites de la gama de trabajo. Las mediciones de la actividad metabólica de las células A375 eran también directamente proporcionales a la celda siembra densidad (figura 4C). Previamente, actividad MMP ha normalizadas a la actividad metabólica como un control interno para determinar la actividad MMP en una base de la célula por8. Normalizar la actividad MMP a la actividad metabólica a través de densidades de siembra produjo ninguna diferencia significativa en la actividad MMP en densidades de siembra mayores a 2 x 106 células/mL (figura 4D). Para determinar variabilidad entre triplicado en cada placa (variabilidad dentro de la placa), el coeficiente de porcentaje de variación (% CV) se calculó para MMP y la actividad metabólica y se resume en la tabla 2. % CV por debajo del 20% indica que la variabilidad intra-placa en triplicado es aceptable para el sistema producir resultados coherentes20,21.
Figura 1 : Fluorógenos MMP-degradable diseño péptido. El péptido fluorógenos MMP-degradable consiste en una columna vertebral peptídica GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ indica el sitio de clivaje) que determina la especificidad del sensor. El péptido está etiquetado con un extintor (dabcyl) y un fluoróforo (fluoresceína), que es insaciable (fluorescencia) cuando el péptido de la columna vertebral es dividido por el MMP. Un grupo tiol es conjugado con el péptido de la columna vertebral para permitir la reacción covalente con norbornene grupos funcionales en la molécula de PEG, el sensor de acoplamiento para el hidrogel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Análisis esquemático. Los componentes de la solución de hidrogel precursor se mezclan con las células suspendidas en PBS. La solución precursora es entonces pipetearse en negro, Ronda de fondo, placas de 96 pocillos y polimerizado por la exposición a UV luz de 3 minutos de ensayo se agrega los medios de comunicación, y las placas se incuban por 18 h (37 ° C, 5% CO2). Luego se agrega la resazurina reactivo de actividad metabólica y las placas se incuban durante un adicional h. 6 MMP y actividad metabólica se miden utilizando un lector de microplacas fluorescente con un protocolo de exploración bien en las longitudes de onda de excitación/emisión indicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Dinámica y rango de trabajo del ensayo. Hidrogeles funcionalizados con péptidos MMP-degradable fluorógenos se incubaron con una gama de concentraciones del tipo de enzima colagenasa que durante 24 h a 37 ° C y fluorescencia intensidad me medí. Las líneas punteadas representan la gama dinámica y de trabajo. n = 3, media ± desviación estándar (SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Efecto de siembra densidad de línea celular de melanoma A375 actividad MMP. (A) inicial de medición (0 h) de la actividad MMP para línea de celular A375 encapsulado en un rango de densidades de siembra. n = 3 media ± SD. (B) medición de la actividad MMP en 24 h. 0, 10 y 1000 μg/mL de colagenasa son representados por líneas punteadas. Las líneas punteadas representan el rango de trabajo (WR) calculado a partir de controles de colagenasa. n = 3, promedio ± SD. (C) Measurement de la actividad metabólica para línea de células A375 encapsulado durante 24 h en un rango de densidades de siembra y se incubaron con resazurina h. 6 n = 3, promedio ± SD (D) actividad de MMP A375 normalizada a la actividad metabólica. n = 3, promedio ± SD. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Preparación de hidrogel precursor solución.
Tabla 2: Intra-placa % CV de la prueba con la línea de células A375.
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Discussion
Cultivo de células in vitro 3D recapitula muchos aspectos importantes del medio ambiente en vivo. Sin embargo, cultura 3D también hace evaluación de función celular y señalización desafiante, como muchos ensayos biológicos requieren recuperación celular y gran número de células. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema de simple cultura 3D que permite la medición de la función celular sin muestra más procesamiento aumentaría enormemente la utilidad de los sistemas de cultivo 3D. El sistema 3D aquí descrito puede ser adaptado para una variedad de diferentes aplicaciones. Puede cambiar la secuencia del sensor fluorógenos para detectar otras proteasas. Por ejemplo, la fluorógenos sensor escindibles secuencia (GPQG↓IWGQK) que puede ser dividida por el MMP-1, -2, -3, -7, -8 y -9, anteriormente fue utilizado para detectar la actividad MMP de melanoma en respuesta a la quimioterapia22. El uso del sistema de hidrogel PEG también permite la optimización independiente precisa del microambiente celular, incluyendo las propiedades mecánicas, la degradabilidad y las moléculas de adherencia de la matriz dentro del hidrogel. La molécula de adhesión RGD utilizado en este trabajo es una secuencia derivada de fibronectina y permite la adhesión mediada por integrinas. Otras moléculas de adhesión como (RLD) y (IKVAV) que se derivan de fibrinógeno y laminina respectivamente podría utilizarse para activar otros tipos de receptores de integrina. Por ejemplo, se demostró que alterando las moléculas de adherencia cambiado la elongación de células intersticiales valvulares aórticas (CIV), que puede tener un efecto sobre la válvula aórtica estenosis15. La secuencia de crosslinker del hidrogel puede controlar la degradabilidad del hidrogel y comportamiento celular encapsulada dentro del hidrogel. Por ejemplo, se demostró que los fibroblastos habían aumentado proliferación y células separarse cuando cultivadas en degradar más rápidamente los hidrogeles, que pueden acelerar el proceso curativo en vivo23. Propiedades mecánicas del microambiente también pueden regular la función de la célula, y rigidez del hidrogel puede modificarse alterando el número de armas en el macromer PEG, peso molecular de PEG y la relación entre PEG y crosslinker.
Porque la actividad MMP varía según el tipo de la célula, para cada nuevo tipo de células es importante para llevar a cabo un experimento de optimización de densidad de encapsulado como demostrado aquí. Después de 24 h de encapsulación, MMP y la actividad metabólica fueron directamente proporcionales a la densidad de siembra de la célula. Sin embargo, en el tiempo de que la señal fluorescente puede meseta, por lo tanto el momento del ensayo puede tener que ser optimizado por el usuario8. El sensor específico de la proteasa también puede afectar el alcance y el momento del ensayo. El rango de trabajo del ensayo se puede determinar mediante la realización de un experimento de rango de señal con ninguna célula y una enzima proteolítica sobre una gran concentración. Inclusión de varios sin condiciones de hidrogel células incubadas con establecimiento de permite controles de enzima de bajo (ruido de fondo), medianos y altos niveles de señal dentro de cada ensayo (0, 10 y 1000 μg/mL de colagenasa aquí). Esto da una indicación de donde caen las señales producidas por las células dentro de la gama de trabajo del ensayo. Este ensayo también es compatible con otros sensores fluorescentes que no tengan superposición de excitación y espectros de emisión, como el ensayo de actividad metabólica utilizada aquí como un control interno para el cálculo de la actividad MMP en base al celular, según lo divulgado previamente8 . Actividad MMP actividad normalizada a metabólico no demostró la validez de este enfoque para la siembra de densidades o por encima de 2 x 106 células/mL, en el que ningún cambio significativo en las densidades de siembra. Esta normalización es crucial identificar las densidades de siembra apropiadas dentro de la gama de trabajo de la curva de actividad MMP y dentro de la porción lineal de la curva de normalización.
Si bien el análisis puede ser adaptado para varios propósitos, hay varias limitaciones y aspectos críticos, que el usuario debe considerar, específicamente con respecto a la interferencia con la señal fluorescente y preparación de los hidrogeles. En primer lugar, debe tenerse cuidado con la elección de los medios de cultivo y tratamientos adicionales, ya que estos pueden tener un espectro de absorción traslapados u opacidad que puede interferir con la detección de fluorescencia o apagar la señal. Se recomienda utilizar medios de cultivo que no contiene rojo de fenol. Además, algunos tratamientos farmacológicos son fluorescentes (por ejemplo, doxorrubicina), o espectro de absorbancia que se traslapa con el espectro de excitación/emisión del fluoróforo (p. ej., curcuminoides). Un segundo aspecto que puede afectar al rendimiento de la prueba es la preparación del hidrogel. Debido a la alta viscosidad de la solución precursora de hidrogel, cuidado debe tenerse para asegurar una mezcla completa de la solución de hidrogel y prácticas pipeteo cuidadoso para evitar fluoróforo desigual contenido o hidrogel volumen de la solución en cada pocillo. Preremojo de las puntas de pipetas y con baja retención consejos pueden ayudar a reducir la variabilidad. Otro aspecto importante de la preparación del hidrogel es el hidrogel forma y ubicación de pozos. El hidrogel debe estar centrado dentro del pozo y de una forma uniforme para permitir mediciones precisas de la fluorescencia con menos variabilidad15. Aquí, ayuda a la utilización de placas de fondo redondo en la punta de la pipeta en cada pozo y la producción de hidrogeles semiesféricas de centrado consistentemente en todos los pocillos.
Adaptando el sistema 3D hidrogel proteasa-degradable, proteasa en tiempo real y lectura de la actividad metabólica puede detectarse en un microambiente 3D con el procesamiento de la muestra mínima. Además, el uso del PEG del hidrogel sintético reduce la variabilidad de lote a lote con origen natural hidrogeles de ECM. Además, utilizando hidrogeles de PEG permite ajuste de señales químicas y mecánicas de los hidrogeles para un mejor control del microambiente. Por otra parte, la polimerización de hidrogel PEG descrita aquí es un proceso iniciado por foto, lo que es rápido y más susceptibles a las metodologías de alto rendimiento de hidrogeles de ECM naturales clásico (es decir., colágeno o Matrigel), que son más lentos y sensibles a la temperatura. Esta polimerización rápida, controlada por el usuario permite el escalado del sistema más automatizarse mediante robóticas manipuladores de líquidos, según lo demostrado por otros15.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer Ohio cáncer investigación (OCR), OH, Estados Unidos para la financiación de este trabajo, así como Rey Saud University (KSU), Riyadh, KSA para patrocinar al primer autor. Peso molecular del sensor péptido fluorescente se midió usando matriz asistida, láser de desorción-ionización, espectrometría de masas (MALDI-TOF) tiempo de vuelo con la ayuda de la química instrumento Campus centro de espectrometría de masas y proteómica Instalación en la Universidad Estatal de Ohio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C3345 | |
| Black round bottom 96-well plate | Brand-Tech | 89093-600 | |
| Cell adhesion peptide (CRGDS) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| Collagenase enzyme type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | |
| DMEM High Glucose Media | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek | Cytation 3 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MMP-degradable peptide crosslinker (KCGPQG↓IWGQCK) | GenScript USA Inc. | custom made | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318500 | |
| Penicillin /streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Resazurin (Alamar Blue) | Life Technologies | DAL1100 | |
| UV light | UVP | 95-0006-02 |
References
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