Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Yalıtım ve yüksek tuz evlat edinen Transfer dendritik hücreler antijen sunan tedavi

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59124
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Burada, manyetik hücre sıralama ve içine saf fareler sonraki evlat edinen transfer tarafından fare dalağı dendritik hücreleri izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yüksek tuz aktif dendritik hücre modeli evlat edinen transfer ve Akış Sitometresi adım adım yordamlar açıklamak için seçildi.

Abstract

Aşırı diyet tuz tüketiminizi iltihap için katkıda bulunur ve hipertansiyon gelişiminde önemli bir rol oynar. Daha önce dendritik hücreler (DC) antijen sunan lider NADPH oksidaz aktivasyonu ve isolevuglandin (IsoLG) oluşumu için yükseltilmiş ekstraselüler sodyum hissedebiliyorum bulduk-protein adducts. Bu IsoLG protein tepki öz-proteinler ile adducts ve bir devlet gibi otoimmün ve hipertansiyon tanıtmak. Biz geliştirdik ve hipertansiyon işlevinde DC incelemek için state-of--art yöntemleri en iyi duruma getirilmiş. Burada, detaylı bir protokol yalıtımı için içinde sağlamak yüksek sodyum ve fare dalak CD11c evlat edinen transferi ile in vitro tedavi+ hücreleri hipertansiyon içindeki rollerine çalışmaya alıcı fareler içine.

Introduction

Aşırı diyet tuz hipertansiyon için önemli bir risk faktörüdür. 1 , 2 Amerikan Kalp Derneği en fazla 2,300 miligram (mg) sodyum (Na+) alımı günlük, ancak önerir; ABD nüfusunun % 10'dan daha az bu öneriye gözlemler. 3 , 4 mütevazı indirimleri Na+ alımı düşük kan basıncı ve Koroner kalp hastalığı ve inme ABD'de yıllık yeni olgu % 20 oranında azaltmak. 5 hipertansif nüfusunun % 50 tuz-duyarlılık, sergiler aşırı tuz tüketimi ile önemli bir sorun olduğunu Na+ yükleme veya benzer bir damla kan basıncında Nasonra aşağıdaki tansiyon 10 mmHg artış olarak tanımlanan + kısıtlama ve diyürez. 6 tuz-hassasiyet Ayrıca normotansif kişilerin % 25 oluşur ve ölüm ve kardiyovasküler olaylar bağımsız bir tahmin. 7 , 8 tuz algılama mekanizmaları böbrek içeren hipertansiyonda de incelenmiştir; Ancak son yıllarda yapılan çalışmalarda bağışıklık hücreleri Na+hissi olabilir düşündürmektedir. 9 , 10

Son kanıtlar işleme değişiklikleri ekstra renal Na+ iltihabı teşvik ve interstitium Na+ birikimi neden olabilir gösteriyor. 11 , 12 bizim laboratuvar ve diğerleri doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemi hücrelerinin hipertansiyon alevlenmesi için katkıda göstermiştir. 9 , 13 , 14 , 15 Anjiyotensin II, norepinefrin ve tuz neden makrofajlar, monosit ve T lenfositleri böbrek ve damarlara sızmak ve teşvik Na+ saklama, vazokonstriksiyona, kan basıncı da dahil olmak üzere çeşitli hipertansif bir çekim gücü, bakış açısını ve uç-organ hasarı. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 önceki çalışmalarda, DCs isolevuglandin (IsoLG) birikir bulduk-protein adducts Anjiyotensin II ve DOCA-tuz hipertansiyon da dahil olmak üzere çeşitli hipertansif uyaranlara yanıt olarak. 14 IsoLGs lysines üzerinde proteinler için hızla ve kovalent adduct büyük ölçüde reaktif lipid peroksidasyon ürünleri vardır ve onların birikimi DC harekete geçirmek ile ilişkilidir. Biz son zamanlarda yükseltilmiş Na+ IsoLG-protein için güçlü bir uyarıcı olduğunu kurduk 14 adduct DCs.9 Na+ girmesinden DCs amiloride hassas taşıyıcıları aracılık ettiği antikorundan oluşumu. Na+ sonra kalsiyum (Ca2 +) Na+/Ca2 + Eşanjör üzerinden için değiştirilir. CA2 + protein kinaz C (PKC) artan süperoksit için (O2· -) önde gelen NADPH oksidaz etkinleştirir etkinleştirir ve IsoLG-protein adduct oluşumu. 9 yanıt olarak Anjiyotensin II alt pressor bir doz DCs asal hipertansiyon tuz maruz evlat edinen transferi. 9

CD11c tanımlaması+ DCs dan doku immünhistokimya ve RT-PCR ile daha önce sınırlı olmuştur, ve yalıtım DC'lerin Akış Sitometresi tarafından sıralama hücreye sınırlı olmuştur. Akış Sitometresi hücre sıralama bağışıklık hücreleri yalıtım için güçlü bir yöntem olsa da, pahalı, zaman alıcı ve hücrelerin bir düşük verim için yol açar. Bu nedenle, biz bir adım adım protokol doku sindirim, tüp bebek stimülasyon ve evlat edinen transferi CD11c için optimize+ hipertansiyon çalışmaya DCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vanderbilt Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi burada açıklanan yordamları onayladı. Fareler yer alan ve uygun olarak Kılavuzu bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı (Ulusal akademiler Press. için bakım Yeniden düzenlenen 2010).

1. yalıtım dalağı fare dan

  1. 1640 RPMI hazırlayın: %10 FBS, 0.10 mM HEPES, 1 mM sodyum pyruvate, 50 µM β-mercaptoethanol ve % 1 penisilin/streptomisin.
  2. 10-12 hafta ötenazi-CO2 Solunduğunda eski C57bl/6 erkek fareler. Göğüs ve fare kenarlarında % 70 etanol ile sprey. Sol taraftaki dikkatle cilt ve dalak ortaya çıkarmak için Periton boşluğuna açın.
  3. Küçük forseps, ihtiyatlı bağırsak ve karaciğer ve farenin sol kenarına taşınır ve yavaşça iyi makas kullanarak dalak tüketim.
    Not: Bu adım yapmanız gerekir çok dikkatli gastrointestinal sistem zarar kirlenme tetikleyebilir.
  4. Her eksize dalak RPMI 1640 orta 3 mL içeren etiketli 15 mL konik tüp yerleştirin.

2. tek hücre süspansiyonlar dalağı gelen nesil

Not: Dalak bir tek hücre süspansiyon mekanik ayrışma artı Enzimatik sindirim birleştirerek ayrışmış.

  1. Collagenase D (1 mg/mL; 0.29 U/mg liyofilize) ekleyerek dalak sindirim çözüm hazırlamak ve Dnaz (0.1 mg/mL) için hazırladım RPMI 1640 orta (bkz. Adım 1.1)
  2. Forseps 3 mL dalak sindirim çözeltisi içeren dalak C tüp (ayrılma tüp) içine aktarmak için kullanın.
  3. Üreticinin yönergelerine göre yarı otomatik bir homogenizer kullanarak mekanik ayrışma gerçekleştirin.
    1. C tüp C tüp üzerinde dönen kol sıkıca yerleştirilir sağlanması yarı otomatik homogenizer üzerine yerleştirin. C tüp yerleştirilir sonra yarı otomatik homogenizer 60 için dalak 04.01 protokolü çalıştırmak için Başlat düğmesine basın s.
      Not: Mekanik ayrışma da 40 mikron filtre 50 mL konik tüp üstüne yerleştirip yavaşça dalak filtreden taşlama gerçekleştirilir. Dalak taşlama sonra üzerinden 40 µm filtre 10 mL RPMI medya ile yıkayın.
  4. Mekanik ayrışma sonra homogenizer tüpünden ayırmak ve Enzimatik sindirim gerçekleştirin. Sürekli rotasyon (20 devir/dakika) altında 37 ° C'de 15 dakika örnekleri kuluçkaya.
  5. Çözüm 40 µm süzgeç aracılığıyla filtreleme sonra 50 mL konik tüp içine pipetting tarafından aktarın. Dulbecco'nın PBS (dPBS) 10 mL ile 40 µm süzgeç yıkayın. Hücreleri, 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
  6. Santrifüjü sonra tamamen süpernatant Aspire edin ve 10 mL dPBS resuspending tarafından Pelet yıkayın. 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g , santrifüj

3. CD11c yalıtım+ DCs dan dalak tek hücre süspansiyon

  1. Hücre Pelet 5 mL dPBS resuspend ve hemasitometre ve trypan kullanarak hücreleri saydırmak mavi dışlama.
  2. 300 x g, 4 ° C'de 10 dakika için centrifuging tarafından hücreleri cips
  3. Süpernatant tamamen Aspire edin ve Pelet manyetik olarak aktif hücre sıralama (Mac) arabellek 400 µL içinde resuspend.
  4. (Bkz. Tablo reçetesi) CD11c lastikteki 1 x 108 hücre başına 100 µL ekleyin.
  5. Girdap hücre süspansiyon ve buzdolabında 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
  6. Hücreleri yıkamak için MACs arabellek 10 mL ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g , santrifüj
  7. Süpernatant tamamen Aspire edin ve Mac'ler arabellek 500 µL içinde resuspend.

4. manyetik ayırma CD11c+ DCs

Not: Manyetik Ayırma el ile manyetik ayırıcı ile yapılır ( Tablo malzemelerigörmek) LS sütun ile donatılmış. Manyetik Ayırma da otomatik olarak bir otomatik manyetik ayırıcı ile yapılabilir. (bkz. Tablo malzeme).

  1. LS sütun Mac'ler ve akışı aracılığıyla toplamak için her sütunu altında 15 mL konik tüp manyetik alanına koyun.
  2. LS sütun arabellek 3 mL ile yıkayın.
  3. Hücre süspansiyon her LS sütun üzerine yerleştirin ve etiketsiz hücreleri içeren aracılığıyla akış-toplamak.
  4. LS sütun geçmesine etiketlenmemiş hücreleri toplama Mac'ler arabellek 3 mL ile yıkayın. LS sütun 2 daha kere yıkayın.
  5. LS sütun manyetik ayırıcı kaldırın. Her sütun için MACs arabellek 5 mL ekleyin ve hemen sıkıca LS sütun temiz 15 mL konik tüp içine dalan tarafından manyetik olarak etiketli hücreleri floş.
    Not: Yüksek saflıkta hücre süspansiyon elde etmek için CD11c hücre çift yalıtım gerçekleştirmek önemlidir. Bu nedenle, adımları 3.1 4.5 ile yineleyin. ve şekil 4 saflık standartları için başvuru. Bu adımı CD11c saflığı geliştirir+ hücreleri % 90-95.
  6. CD11c belirlemek+ DC trypan mavi dışlama kullanarak bir hemasitometre üzerinde numara. Hücre örneği bir 1:1 seyreltme % 0,4 trypan mavi çözümünde'oranında seyreltin.
    Not:     sigara-hücrelerin lekeli mavi, hücrelerin günahı kalır iken.
    1. Bunu yapmak için dikkatli bir hemasitometre hücre Numune dilüsyonu 10 µL ile doldurun ve kuluçkaya 1 dakikadır.
    2. 1 x 1 mm2 uygun cep numarasını belirlemek için yüklenen odasında 4 meydanlarda hücreleri hesaplama.

5. tedavisinde Vitro yüksek tuz CD11c+ DCs

  1. %10 FBS, 0,1 mM HEPES, 1 mM sodyum pyruvate, 50 µM β-mercaptoethanol ve % 1 penisilin/streptomisin 500 mL 1640 ekleyerek DC kültür ortamı hazırlamak RPMI.
  2. NaCl 1.17 g ağırlığında ve steril 50 mL Şahin tüp içine yerleştirerek 10 x DC yüksek tuz hücre kültür medya (400 mM) hazırlayın. NaCl çözümdür kadar steril DC hücre kültür medya (5.1 adımda hazırlanan) 50 mL 50 mL Şahin tüp ve girdap ekleyin.
  3. Hemen yüksek tuz DC kültür 0,2 mikron filtre bir hücre kültür Hood ile vakum filtrasyon kullanarak medya filtre.
  4. Dalağı 300 x g 10 dk 4ºC az için gelen her hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi. 1 x 106 hücre/mL bir konsantrasyon, DC kültür medyada her hücre Pelet resuspend.
  5. 900 μL (yaklaşık 1 x 106 hücreler) 24-şey düz dipli Falcon plaka DC süspansiyon pipet. Her şey için nihai sodyum konsantrasyonu 190 mm 100 µL yüksek tuz DC kültür medya ekleyin. Plaka etiket ve 37 ° C yer CO2 kuluçka 48 h için humified.

6. yüksek tuz evlat edinen Transfer tedavi CD11c+ DCs

  1. 48 h için tüp bebek stimülasyon sonra Kaldır 37 ° C plaka CO2 kuluçka humified.
  2. Hücre kültür medya yukarı ve aşağı resuspend CD11c+ DCs. pipet tüm CD11c pipette+ DC karşılık gelen bir içine süspansiyon etiketli 1.6 mL tüp. De kaplama her birey için bu adımı yineleyin.
  3. Her CD11c santrifüj kapasitesi+ DC süspansiyon 300 x g 4 ° C'de 10 dk de Süpernatant Aspire edin. DC Pelet steril dPBS 100 µL ile resuspend.
  4. Beraberlik DC süspansiyon 27 G ½ inç iğne ile donatılmış bir 1 mL şırınga içine.
  5. Saf erkek 10 haftalık C57bl/6 fareler % 2'in altında yer isoflurane istikrarlı bir cerrahi uçak elde etmek için. Anestezi düzeyini pedal refleks eksikliği ile kontrol edin. İstikrarlı bir cerrahi uçak elde sonra yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde iğne yaklaşık 30 ° açılı retro-orbital alanı tanıtmak.
    Not: 27 G iğne eğimi aşağı, oküler zarar görmesini önlemek için göz uzak dönük.
  6. Yavaş yavaş ve sorunsuz CD11c enjekte+ DC süspansiyon (yaklaşık 1 x 106 hücreleri). Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra iğneyi retro-orbital alan göz zarar vermemesi için bilinçli olmak için dikkatli bir şekilde çıkarın.
    Not: Enjeksiyon sonra orada az veya hiç kanama olmalı. Üvey CD11c transferini+ DCs da enjeksiyon (örneğin kuyruk ven) bir damardan yöntemini kullanarak gerçekleştirilebilir. Denetim fare CD11c almak+ normal tuz medyada kültürlü DCs.
  7. Fareler burun konisi kaldırmak ve onları anestezi kurtarma sırasında yaklaşık 30 dakika izlemek.

7. 14 gün düşük doz Anjiyotensin II hazırlanması (140 ng/kg/dk)

  1. Anjiyotensin II arabellek 5 M NaCl 500 μL ve Asetik asit 300 μL ekleyerek hazırlayın. Kuantum satış (QS) ilâ 30 mL deiyonize H20.
  2. Anjiyotensin II 5 mg/mL stok çözüm Anjiyotensin II arabelleği ile geçiyoruz. Anjiyotensin II stok çözüm ozmotik minipump Anjiyotensin II a oran-in 140 ng/kg/dk her fare, vücut ağırlığına bağlı olarak teslim edecek böyle bir nihai toplama ulaşmak için ek arabellek ile sulandırmak.
    Not: Temel Anjiyotensin II (mg) = (fare ağırlık (g) x 0.2 mg / gün x 14 gün) / 1000
    Anjiyotensin II (mg) hazırlanan (temel Anjiyotensin II x 260 µL) = / Pompa hızı (0,25 μL/saat)
    Anjiyotensin II stok birimi (μL) hazırlanan Anjiyotensin II = / stok konsantrasyonu (5 mg/mL) x 1,000
    Birim (μL) seyreltik 270 - Anjiyotensin II stok birimi =
  3. Anjiyotensin II stok birimi için seyreltik ekleyin (Anjiyotensin II arabellek) 7.2 adımda hesaplanan birim dayalı.
  4. Steril hücre kültür başlık altında ozmotik minipump açın.
  5. Seyreltilmiş Anjiyotensin II çözüm ekleyin ve herhangi bir hava şırınga ve iğne sınırdışı. Sağlanan iğne ozmotik minipump dibine yerleştirin ve yavaş yavaş yavaş ve dikkatli mesane iğneden geri çeker iken Anjiyotensin II çözüm enjekte.
  6. Ozmotik minipump kafa ozmotik mesane tam olarak, herhangi bir hava kesesi almak için dikkat yerleştirin.

8. 14 gün düşük doz Anjiyotensin II ozmotik Minipumps implantasyonu

  1. On gün sonra üvey CD11c transferini+ DCs, anestezi başlatmak ve sürekli olarak elde etmek ve uygun cerrahi düzlemin korumak için % 2 isoflurane almak için burun konisi için fare taşımak için bir isoflurane odasında yerde fareler.
  2. Kürk boyun sırt tarafındaki makasları ile cerrahi sitesi hazırlamak için kaldırın. % 7.5 betadin ameliyat başlamadan önce ardından % 70 etanol ile traş alanı temizleyin.
  3. Küçük bir insizyon attım (yaklaşık 1,5 cm) Deride oluşturun. Ozmotik minipump yerleşimini için subkutan bir cep oluşturmak için belgili tanımlık kesme hemostats takın.
  4. Minipump subkutan cep içine yerleştirin. Yakın Cilt 2-3 cerrahi zımba ile yara ve başka bir uygulamada % 7.5 betadin yaraya uygulayın ve enfeksiyonu önlemek için zımba.
  5. Onları onların kafes için dönmeden önce anestezi kurtarma sırasında fareler için 30-60 dk izlemek.
    Not: Fareler olman lazım 3-4 gün sonra ozmotik minipump implantasyonu izlenir.

9. akış sitometrik çözümlemesi için alıcı farelerin dalağı yalıtım

  1. Düşük doz Anjiyotensin II infüzyonu 14 gün izole sonra tüp bebek yüksek tuz alma fareler gelen dalağı DCs evlat edinen transferi ile tedavi. (Adım 1 ve 2) listelenen kesin adımları izleyin.

10. yüzey boyama

  1. 1 x PBS polistiren FACS tüp ve 4 ° C'de 8 min için 350 x g , santrifüj resuspended splenocytes aktarma Santrifüjü sonra süpernatant Aspire edin. Mac'ler tampon ve Santrifüjü (350 x g, 8 dk, 4 ° C) iki kez 1 mL ile yıkayın.
    1. Splenocytes istenen akış sitometrik panelleri sayısına göre farklı polistiren FACS tüpler eşit bölün.
  2. Canlı/ölü hücre canlılığı boyama gerçekleştirmek için 1 x PBS ve santrifüj (350 x g, 8 dk, 4 ° C) hücrelerle yıkayın. 1 mL 1 x PBS resuspend ve hücre canlılık 1 µL ekleyin (malzeme tabloya bakın) leke. 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya (buzdolabı veya buz üzerinde) ışıktan korumak için folyo kaplı.
  3. Hücre canlılığı leke kuluçka sırasında MAC'ler arabellek uygun bir birim içinde boyama hücre yüzeyine antikorlar kokteyl hazırlamak.
  4. MAC'ler arabelleği, santrifüj (350 x g, 8 dk, 4 ° C), 1 mL hücrelerle yıkama ve ile antikor kokteyl 100 µL her hücre Pelet resuspend. Işık 4 ° C'de 30 dk için korumalı kuluçkaya
    Not: Her Akış Sitometresi antikor benzersizdir ve son derece yararlı ve önerilen doz titrasyon eğrisi her spesifik antikor için gerçekleştirerek gerekli antikor en uygun miktarını belirlemek için.
  5. 1 mL MAC'ler arabelleği iki kez hücrelerle yıkama ve MAC'ler arabelleği akış sitometrik analiz için uygun bir miktar splenocytes resuspend.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1 bir şematik yukarıda açıklanan adımları temsil eder. İzole fare dalağı CD11c için sıralanır+ DCs sıralama ve normal tuz ortamları (NS; 150 mmol NaCl) veya yüksek tuz medya (HS; 190 mmol NaCl) 48 h. CD11c kaplama manyetik hücre+ DCs sonra adoptively retro-orbital tarafından aktarılır enjeksiyon saf alıcı fareler için. On gün sonra 14 gün boyunca düşük doz Anjiyotensin II (140 ng/kg/dk) infüzyon için ozmotik minipumps ile fareler implante edilir. Anjiyotensin II 14 günlük infüzyon sırasında kan basıncı radyo telemetri veya kuyruk-manşet pletismografisi tarafından kaydedilir.

Normal kan basıncı analiz temsil edilir (Barbaro vd.9' dan değiştirilmiş) Şekil 2 ' deki DCs ve düşük doz Anjiyotensin II infüzyon için ozmotik minipumps evlat edinen devri implante. Notun, Anjiyotensin II bu düşük doz (140 ng/kg/dk) normal bir farenin kan basıncı artmaz bir alt pressor doz olduğunu. Fareler yüksek alma tedavi CD11c tuz iken normal tuz tedavi CD11c alma fareler+ DCs (siyah daireler) normal kan basıncı Anjiyotensin II infüzyon sırasında korumak+ sistolik kan basıncında artış bir DCs (kırmızı daireler) sergi. Şekil 2 gösterir yüksek tuz CD11c tedavi+ yanıt olarak Anjiyotensin II alt pressor doz DCs Başbakan hipertansiyon.

İzole CD11c saflığı belirlemek için+ hücreleri, şekil 3' teAresimli gating bir strateji kullanarak Akış Sitometresi Analizi yapılır. Bunu bulduğumuz için toplam splenocytes göre CD11c artan zenginlik elde+ hücreleri (şekil 3B). Biz farklı CD11c microbead konsantrasyonları şekil 4protokolünde üreticinin sorunlarını gidermek için kullanılan. 100 μL (şekil 4A) kullanarak splenocytes manyetik ayrılması 200 μL (şekil 4B) veya 300 μL (şekil 4C) CD11c lastikteki verimleri yaklaşık % 65, % 55 ve % 50'sini CD11c+ pozitif sırasıyla hücreleri. Biz o zaman dahil bir FcR engelleyici (5 μL/dalak) + 100 μL CD11c microbead, manyetik olarak ayrılmış ve bulunan bu abluka FcR yaklaşık % 65 CD11c pozitif hücrelerinin (şekil 4D) verimleri. Ek deneylerde, biz splenocytes içinde 100 μL CD11c lastikteki inkübe ve manyetik bir LS sütunu boyunca ayrılmış. Biz CD11c lastikteki ek bir 100 μL ayrılmış hücrelerle inkübe ve tekrar bir LS sütunu boyunca ayrılmış. Çift yalıtım vermiştir splenocytes %92 CD11c+ (şekil 4E) hücreleri.

Figure 1
Resim 1 : Resimde evlat edinen transferi tüp bebek tedavi CD11c + DCs. CD11c+ DCs farelerin dalağı izole edilmiştir ve her iki normal tuz veya yüksek tuz ortamı içinde 24 h CD11c+ DCs kaplama sonra adoptively retro-orbitally saf alıcı fareler aktarılır. Düşük doz Anjiyotensin II implante ve kan basıncı beslerken bir ozmotik minipump 14 gün boyunca izlenir. Bu rakam Barbaro ark dan adapte olduğunu.) 9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Yüksek tuz etkisi tedavi CD11c + Sistolik kan basıncı üzerinde DCs. Dendritik hücreleri izole edildi ve kültürlü normal tuz (NS) veya yüksek tuz (HS) 48 h. için DCs adoptively vahşi türü saf fareler için transfer edildi. Kan basıncı radyo telemetri tarafından izlenen ve Ang II minipumps (140 ng/dk) implante edildi. Sistolik radyo telemetri (ortalama ± SEM) tarafından ölçülen tansiyon (SBP). Bu rakam Barbaro vd.9' dan adapteBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Akış sitometrik analizinde manyetik olarak ayrılmış splenocytes. (A)CD11c + DC nüfus analizi tanımlama strateji geçişi. Hücreler enkazı ayrılır ve canlı hücreler canlı/ölü hücre leke dışlanma göre seçilir. Singlet hücreler seçilir ve CD45 pozitifliği için analiz. CD45 hücreler daha sonra analiz için CD11c. (B) manyetik ayırma, CD11c + hücre önemli zenginleştirme yoktur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Akış sitometrik analizinde manyetik olarak ayrılmış CD11c+ splenocytes farklı yalıtım protokolleri sonra. Hücreleri enkaz ve canlı hücreler ayrı kaldık. Canlı hücreleri-Ab ve CD11c pozitif için analiz edildi. CD11c(a)%+ hücreleri izole 100 μL, (B) 200 µL, (C) 300 μL CD11c lastikteki, manyetik ayırma takip. CD11c (D) %+ hücreleri FcR (anti-FcR; 5 μL) + 100 μL CD11c lastikteki abluka ile izole edildi manyetik ayırma takip. CD11c (E) %+ hücreleri çift manyetik hücre sıralama ile izole edildi manyetik ayırma takip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Geçerli protokol yordamlar CD11c yalıtmak için optimize edilmiş+ DCs dalağı fareler ve adoptively onları DCs rol tuz kaynaklı hipertansiyonda çalışmaya naif hayvanlar içine transfer. Bu iletişim kuralı yalıtmak ve adoptively makrofajlar, monosit ve T ve B lenfositleri de dahil olmak üzere edinilmiş bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücre alt kümeleri aktarmak için adapte edilebilir. Biz yeterli hücre hayatta kalma ve istikrar DC yüzey ifade işaretleyicilerin görünümünü elde etmek için dalak sindirim süreci optimize. Ayrıca, fare DCs tüp bebek uyarılması için iletişim kuralı en iyi DC hayatta kalmak için yükseltilmiş sodyum ile optimize edilmiş.

Bu iletişim kuralı kritik bir adımda manyetik hücre sıralama. Manyetik hücre sıralama hastalığında bağışıklık hücre işlevi eğitim için belirli fare hücre tipleri yalıtmak için güçlü ve kullanışlı bir araçtır. Ancak, çoğunlukla birden çok bağışıklık hücre türü ifade edilir CD11c de dahil olmak üzere temel hücre yüzey ifade işaretleri temel alır ve genellikle daha az arzu belirli hücre zenginleştirme verimleri. Böylece, hücreleri çok özel bir nüfusa gerektiren uygulamalar için birkaç antikorlar ile leke ve bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırmak için Akış Sitometresi tarafından sıralamak gerekli olabilir. Zenginleştirme ve saflık izole hücre şekil 3 ve şekil 4gösterildiği gibi Akış Sitometresi kullanarak onaylamak önemlidir. Geçerli protokol CD11c boncuk, abluka FcR, farklı konsantrasyonlarda kullanımı dahil ve ikinci bir manyetik hücre iletişim kuralı izole hücrelere sıralama uygulayarak çeşitli sorun giderme adımları gerçekleştirdiniz. Çift manyetik hücre sıralama CD11c en üst düzeyde elde bulduk+ hücre saflık.

İzole DCs işlevini anlama başka bir kritik yüksek tuz ve kültür ile tüp bebek stimülasyon adımdır. Biz bu DCs etkinleştirir bulmak onları fareler hipertansiyon,9yatkınlık neden olur tüp bebek stimülasyon ve kültür hücre ölümüne neden ve potansiyel olarak araştırma bulguları ile karışabilir diğer koşullar tanıtmak. Ayrıca, uygun yeterli DCs elde etmek için bu havuzu dalağı bir başarılı evlat edinen aktarması için birkaç fare için gerekli olabilir. Ex vivo hücre kültürü çalışmalarının potansiyel artifakı etkilerini ortadan kaldırmak için adoptively yüksek tuz beslenen farelerin izole DCs aktarmak gerekli olabilir. Önceki çalışmalar, Anjiyotensin II ile infüzyon farelerde vivo uyarılmış DCs izole ve alıcı farelerde bu asal hipertansiyon bulundu. 14 gelecekte çalışmaları, biz DCs içinde tuz kaynaklı hipertansiyon DOCA tuz veya L-adı/yüksek tuz gibi kullanarak vivo teşvik ve onlar T hücreleri etkinleştirmek ve hipertansiyon prime belirlemek.

Bu protokol başka sınırlama bağışıklık hücreleri Intravenöz evlat edinen transferini başarılı teknik yönü ile ilgili. Retro-orbital ven enjeksiyon DC'lerin zor olabilir ve çok iyi eğitilmiş bir cerrah tarafından yapılmalıdır. Alternatif olarak, adoptively transfer DC'lerin kuyruk ven sızdırma yoluyla elde edilebilir ama bu siyah fareler için karşılaştırıldığında beyaz daha kolay olma eğilimindedir.

Bu teknik sınırlamaları rağmen DCs manyetik hücre sıralama ve aynı zamanda evlatlık transferi kimlik ve DCs kardiyo-böbrek hastalığı Birleşik Devletleri işlevsel rolü karakterizasyonu sağlar son derece güçlü bir tekniktir. Engraftment ve posta evlat edinen transferden sonra kalp-damar hastalıkları ile ilgili çeşitli organlarında hücre değerlendirmek önemlidir. Önceki çalışmalarda, biz adoptively DCs fareler için gelişmiş yeşil flüoresan proteini transgenic saf alıcı fareler transfer. Daha sonra çeşitli dokuların Akış Sitometresi alıcı farelerde 10 gün sonra gerçekleştirilen ve bu hücreler ağırlıklı olarak alıcı fare ve daha az bir ölçüde de aort böbrek ve dalak birikir bulundu. Donör fare Anjiyotensin II ile tedavi edildi bu artış olmuştur. Normal tuz tedavi DCs ve araştırılması için belirli doku siteleri hala ihtiyaçları karşısında göreli engraftment.

Sonuç olarak, biz özetlenen ve manyetik olarak, ayrı adoptively aktarmak ve DC nüfus Akış Sitometresi tarafından değerlendirmek için detaylı ve tekrarlanabilir bir iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş. Bu iletişim kuralı diğer bağışıklık hücre popülasyonlarının (bazı değişikliklerle) ve diğer modeller, kardiyovasküler hastalık için uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser tarafından desteklenen Amerikan Kalp Derneği için N.R.B. POST290900 verir, 17SDG33670829 L.X. ve ulusal sağlık Enstitüleri vermek K01HL130497 için A.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC/Cy7 anti-mouse CD11c Biolegend 117324
autoMACS Running Buffer  Miltenyi Biotec 130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure  Miltenyi Biotec 130-108-338
Collagenase D Roche 11088866001
DNase I Roche 10104159001
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec  130-092-575
FITC anti-mouse CD45 Biolegend 103108
GentleMACS C tube Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Invitrogen L34964
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACs Seperator  Miltenyi Biotec 130-090-976
RPMI 1640 medium  Gibco 11835-030

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
  2. Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).
  3. Lev-Ran, A., Porta, M. Salt and hypertension: a phylogenetic perspective. Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).
  4. Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort. The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).
  5. He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).
  6. Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance. Hypertension. 8, 127-134 (1986).
  7. Morimoto, A., et al. Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension. Lancet. 350, 1734-1737 (1997).
  8. Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans. Hypertension. 37, 429-432 (2001).
  9. Barbaro, N. R., et al. Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension. Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).
  10. Kirabo, A. A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).
  11. Machnik, A., et al. Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism. Nat Med. 15, 545-552 (2009).
  12. Kopp, C., et al. 23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients. Hypertension. 61, 635-640 (2013).
  13. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).
  14. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).
  15. McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage. Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).
  16. Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. Role of the adaptive immune system in hypertension. Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).
  17. Madhur, M. S., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55, 500-507 (2010).
  18. Harrison, D. G., et al. Inflammation, immunity, and hypertension. Hypertension. 57, 132-140 (2011).
  19. Crowley, S. D., et al. Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension. American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).
  20. Zhang, J. D., et al. A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension. Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).

Tags

Sıralama Akış Sitometresi İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 145 iltihap evlat edinen Transfer dendritik hücre izolasyon dendritik hücreler hipertansiyon bağışıklık hücre
Yalıtım ve yüksek tuz evlat edinen Transfer dendritik hücreler antijen sunan tedavi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van Beusecum, J. P., Xiao, L.,… More

Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (145), e59124, doi:10.3791/59124 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter