Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att skapa en immunkompetenta ICR (Institute of cancer Research) murin modell av centralanervsystemet infektion för att visa utvecklingen av neuropati. Övervakning av akuta virala encefalitiska störningar med identiska sjukdoms Poäng kan utföras för att Visa denguevirusinducerad neuropati in vivo.
Abstract
Denguefeber virus (DENV), ett arthropod-burna virus som överförs av myggor, kan orsaka svår sjukdom som kallas denguefeber hemorragisk Fever, som kännetecknas av dödliga komplikationer på grund av plasmas läckning, ascites, pleurautgjutning, andnöd, allvarlig blödning och organskada. Några fall av DENV infektion närvarande neurologiska manifestationer; emellertid, studier har inte undersökt DENV-inducerad neuropathogenes ytterligare. I denna studie presenterar vi ett protokoll för att använda en immunkompetenta outavlade ICR (Institute of cancer Research) mus för att undersöka induktion av centralanervsystemet (CNS) infektion med DENV, följt av progression av akut viral encefalit-liknande Sjukdom.
Introduction
DENV, ett arthropod-burna virus av Flaviviridae familjen, innehåller en positiv-Sense RNA genomet som kodar tre virala strukturella proteiner (Capsid, premembrane, och kuvert) och sju virala icke-strukturella proteiner (ns1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B och NS5). De fyra serotyperna av DENV (DENV1-4), som infekterar cirka 390 000 000 personer årligen, orsakar en global börda även om regeringarna har riktat betydande ansträngningar mot Mosquito Vector och sjukdomskontroll1. För närvarande är skydds vacciner och terapeutiska antivirala läkemedel under utveckling och kräver ytterligare långtids validering2. I klinisk praxis, även om en denguefeber patient med CNS-infektion är sällsynt, det måste undersökas ytterligare för att förstå mångfalden av denguefeber sjukdomsutveckling3. Ytterligare utredning och validering behövs. särskilt Världshälsoorganisationen (WHO) har inkluderat inblandning av CNS-försämring, såsom kognitiv svikt, konvulsioner, encefalopati, och encefalit, i klassificeringen av svår denguefeber3,4. Konstruera djurmodeller av DENV infektion är oumbärlig för att utforska neuropathogenes av DENV infektion.
För att generera CNS-infektion av DENV, flera studier har utfört olika vägar av DENV infektion, inklusive (1) intracerebral inympning av C57BL/6 möss som fick 4 x 103 plack-Forming enheter (PFU) av NONANPASSAD DENV35, 6, (2) intraperitoneal inokulering av Balb/c-möss som fick 7 x 104 PFU av in vitro-neuroanpassad DENV47, (3) intracerebral inokulering av schweiziska möss som fick 1 x 105 PFU av in vivo neuroanpassad DENV18, och (4) intracerebral och intraperitoneal samtidig inympning av ICR suckande möss som fick 1 x 106 PFU av icke-anpassade DENV29. Enligt resultaten av dessa studier5,6,7,8,9, denV infektion hos möss resultera i viral replikation i hjärnan, vilket leder till akut viral encefalit-liknande syndrom, beteendemässiga förändringar åtföljs av lem förlamning och postural instabilitet, CNS neurotoxicitet och inflammation, allmän och lokaliserad plasmas läckaget genom blod-hjärnbarriären (BBB), och dödlighet. Alla resultat från dessa studier5,6,7,8,9 har visat förmågan hos denV att infektera CNS och induktion av akut viral encefalit-liknande sjukdom efter infektion.
Baserat på våra aktuella fynd9,10,11,12,13,14,15, har vi skapat en murina modell av denV-infektion som en in vivo plattform för att undersöka den terapeutiska effekten av riktade agenter/faktorer mot viral replikation, samt neurotoxicitet. Här rapporterar vi det protokoll som används för att skapa en immunkompetenta outavlade ICR-mus för att studera CNS-infektion och för att övervaka utvecklingen av neuropatier med olika svårighetsgrader orsakade av DENV. Resultaten visar den signifikanta utvecklingen av encefalit-liknande sjukdom hos DENV-infekterade möss på ett tidsberoende sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentella protokoll av djurstudie godkändes av den institutionella djuromsorg och användarkommitté av National Defense Medical Center (IACUC nummer: 16-261), enligt riktlinjer som fastställts av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan.
1. infektions förfarande
- Förbered icke-anpassade DENV2 (stam PL046) lager9 (ursprungligen erhållits från centra för sjukdomsbekämpning i Taiwan, allt från 2,5 x 107 till 1 x 109 PFU/ml).
- Späd ut virus beståndet till 1 x 106 PFU med Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium till en total volym av 40 μl.
- Fyll en 0,3 mL spruta försedd med en 30 G nål med 10 μL (2,5 x 105 PFU) av utspätt virus, och fyll ytterligare en 0,3 ml spruta försedd med en 30 g nål med 30 μl (7,5 x 105 PFU) av utspädd virus.
-
Hålla den 7 dag-gammal ICR diande mus och utföra den följande stammen.
- För den intracerebral injektion, håll musen i en liggande position genom att trycka på örat mellan pekfingret och tummen, och ympats intracerebralt injicera 10 μl av utspädd virus i lambda-området, den punkt i skärningspunkten mellan sagittal och lambdoid suturen 16.
- Efter den intracerebral injektion, håll musen i en ryggläge med hjälp av pekfingret och tummen och intraperitonealt injicera 30 μL av utspädd virus försiktigt in i murina abdomenl.
Anmärkning: för att undvika kannibalism, 75% alkohol används för att skapa en tillfällig förlust av moderns luktsinnet sensation. Dessutom, som täcker kullar med sin mors avföring och urin föreslås.
- Lägg späda möss tillbaka i sina burar och vänta i 5 min för att kontrollera deras säkerhet poststimulation med aviditet av möss, inklusive promenader och mor mjölk sugande.
Anmärkning: Oftast visar möss normal aktivitet poststimulering och det verkar inte vara några skadliga effekter efter den tekniska utmaningen. Under detta experiment, djuren upprätthölls av den institutionella djuromsorg och användarkommitté av National Defense Medical Center, Taiwan. - Utvärdera den dagliga utvecklingen av möss i form av kroppsvikt (genom att använda en mikrogrambalans), akut viral encefalit-liknande sjukdom (genom sjukdomsbedömning som beskrivs i avsnitt 2), och överlevnadsgrad9,10,11 ,12,13,14,15.
2. bedömning av sjukdomar
- Övervaka graden av akut viral encefalit-liknande sjukdomar. Tilldela en poäng på 0 till friska möss; 1 till möss med mindre sjukdomssymtom, inklusive viktminskning, nedsatt rörlighet, och en Ringaren i kropps orientering; 2 till möss som uppvisar limbiska beslag; 3 till möss uppvisar limbiska svaghet, inklusive rörliga med svårighet och främre extremiteterna eller bakre extremiteten svaghet; 4 för förlamning; 5 för döden.
Anmärkning: När poängen når 3, sjukdomssymtomen anses utvecklas snabbt. - Plotta poängsättningen av sjukdomen, enligt steg 2,1, för varje dag som en kurva-baserad siffra genom att använda medelvärdet ± SD av de dagliga test poängen i varje grupp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Svåra denguerelaterade neurologiska komplikationer har rapporterats hos patienter för denguefeber4. Även om dessa fall är sällsynta på kliniken, skapa en immunkompetenta murina modell av DENV infektion kan användas inte bara för att studera immunopathogenes men också för att utforska CNS-infektion, neuroinflammation, neurotoxicitet, och akut viral encefalit-liknande sjukdom. I denna studie, enligt vår nuvarande modell9,10,11,12,13,14,15, 7 dag gamla ICR suckande möss inokulerades samtidigt med DENV2 genom en intracerebral mikroinjektion (2,5 x 105 PFU) och en intraperitoneal injektion (7,5 x 105 PFU) (figur 1). Efter infektionen utförde vi ett flertal analyser för att visa närvaron av dsRNA-replikation, virus proteinuttryck och virus frisättning i den denV-infekterade hjärnan9,10,11,12 ,13,14,15. Dessa experiment visade att en lyckad in vivo-modell av DENV-infektion, replikering och frisättning har upprättats.
För att utvärdera induktion av akuta virala encefalit-liknande sjukdomar9,10,11,12,13,14,15, övervakade vi förändringarna i kroppsvikt hos DENV-infekterade möss. Jämfört med kroppsvikt förändringarna i den Mock-gruppen (där mössen inokulerades med endast RPMI-medium) visar figur 2 en ökning av den håna gruppen men en signifikant (P < 0,01) minskning av kroppsvikten hos de infekterade mössen. Enligt symptomen på encefalit-liknande sjukdomar, inklusive Ringaren i hållning, limbiska beslag, limbiska svaghet, förlamning, och död, som manifesteras i denV-infekterade möss, diagram 3 visar en signifikant (P < 0,05) ökning av kliniska poängen i de DENV-infekterade möss. Överlevnadsanalysen i figur 4 visar en tidsberoende reduktion av överlevnadsfrekvensen (P < 0,001) av de denV-infekterade mössen. Uppgifterna indikerar inrättandet av en smittsam modell av DENV i CNS, som visar utvecklingen av akuta viral encefalit-liknande sjukdomar.
Figur 1: experimentell design för denguefeber-virusinfektion hos diande möss. Sju dag gamla ICR suckande möss inokulerades med DENV2 PL046 av samtidiga intrakraniella och intraperitoneala injektioner. Vi mätte förändringar i kroppsvikt, sjukdoms Poäng och dödlighet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kroppsvikt hos diande möss under denguevirusinfektion (DENV). I DENV2-infekterade ICR diande möss (n = 12), förändringar i kroppsvikt mättes per dag. Efter en Wilcoxon Signed-rank test, värdena presenteras som medelvärdet ± SD. * *p < 0,01. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: den encefalitiska sjukdomen poäng hos diande möss under denguefeber virus (DENV) infektion. Efter DENV2 infektion i ICR suckande möss (n = 12), tid-Kinetic förändringar i kliniska Poäng för Ringaren i kroppshållning (poäng 1), limbiska beslag (Poäng 2), limbisk svaghet (betyg 3), förlamning (betyg 4), och död (Poäng 5) mättes. Efter en Wilcoxon Signed-rank test, värdena presenteras som medelvärdet ± SD. *p < 0,05. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: överlevnaden hos diande möss under denguevirus (DENV) infektion. Tid-Kinetic förändringar i överlevnaden mättes i DENV2-infekterade ICR suckande möss (n = 12). Efter ett log-rank-test visas värdena som medelvärdet ± SD. * * *p < 0,001. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DenV-infektion har upptäckts i CNS hos svåra denguepatienter3,17, vilket tyder på möjligheten att manifestationen av akut viral encefalit inträffade under denguefeber patogenes. Här rapporterar vi en in vivo murina modell av DENV infektion för att studera inblandning av CNS dysfunktion i svår Dengue, särskilt med fokus på DENV-inducerad akut viral encefalit-liknande sjukdomar. Jämfört med tidigare modeller, särskilt för en-Route infektion (endast intravenös, intraperitoneal endast, eller intracerebral endast), en extremt hög titer (1 x 108 PFU) av denV utnyttjas hos immunkompetenta möss. Men hos möss med nedsatt immunförsvar kan en relativt låg men variant titer (1 x 105 till 1 x10 8 PFU) av denV utföras18,19,20. I denna studie, vi använde två-Route infektion att inducera samtidiga CNS och systemisk infektion med en låg titer (intrakraniell: 2,5 x 105 PFU; intraperitoneal: 7,5 x 105 PFU) av denV hos immunkompetenta ICR suckande möss. Progressionen av encefalit-liknande sjukdom är helt reproducerbar9,10,11,12,13,14,15 . Den möjliga begränsningen av denna studie är därför mildras genom att använda en samtidig intrakraniell och intraperitoneal injektion. Även om det är konstgjort-dock, i överensstämmelse med tidigare verk av andra5,6,7,8 och US9,10,11, 12,13,14,15-denV är aktivt replikeras i den experimentella murina hjärnan9,10,11, 12 , 13 , fjorton , 15, och de möjliga effekterna av virala faktorer och värd svar på neuroinflammation, liksom neurotoxicitet, är därför av intresse.
För neuropathogenes, stimulering av neuronala Cell apoptos utlöses av denV infektion samt CNS-inflammation, såsom mikrogliala cell aktivering följt av proinflammatorisk cytokin tumörnekrosfaktor-α (TNF-α) produktion8, 12,15. Direkt neurotoxicitet orsakad av DENV-infektion och indirekt neuroinflammation initierad av värd immunsvar spekuleras för att vara involverade i dengueencefalit. Akut viral encefalit orsakas av virusinducerad CNS-inflammation i hjärnan3,21. Vanliga kliniska symtom är hög feber, huvudvärk, stel nacke och rygg, kräkningar och förvirring, medan svåra fall också utveckla kramper, förlamning, och koma21. Genom att övervaka förändringarna i score med Ringaren i hållning, limbiska beslag, limbiska svaghet, förlamning, och död, utvecklingen av dessa sjukdomar visar progression av akut viral encefalit-liknande sjukdom i denV-infekterade möss9, 10 , elva , 12 , 13 , fjorton , 15. generellt har de denV-infekterade möss med en poäng på 3 (enligt den sjukdoms Poängmetod som presenteras i protokollet) snabbt utvecklats till förlamning och död. De sjukdomsframkallande mekanismer som orsakar dessa sjukdomar kräver ytterligare utredning. emellertid, det spekuleras att neuronala dysfunktion följt av neuropati induktion är inblandade21. Riktade mot viral replikation, liksom TNF-α-medierad CNS-inflammation10,11,12,13,14, åtminstone delvis, ger terapeutiska effekter utvecklingen av denguefeber-associerad akut viral encefalit-liknande sjukdom. Protokollet av denna studie skulle kunna användas för att skapa en encefalit-liknande patologisk modell av DENV infektion.
Vissa studier har beskrivit induktion av intracerebral blödning induceras av denV infektion i hjärnan22,23. Vi har tidigare visat induktion av BBB-störningar i DENV-infekterade möss9. Även om DENV inte är erkänd som en neurotrop virus, kan DENV producera en effektiv infektion i neuronala celler in vivo och in vitro-8,11. Dopamin D2-receptorn (D2R) spekuleras i att vara en neuronala receptor för DENV-infektion, och farmakologiskt inriktade D2R effektivt minskar DENV-infektion i neuronala celler in vivo och in vitro, samt DENV-inducerad encefalitiska sjukdomar11, 24. Möjliga terapeutiska strategier mot akut viral encefalit är viktiga att utveckla så att allvarliga denguefeber fall med neurologiska komplikationer kan behandlas. För sin framtida tillämpning, detta protokoll av en sjukdoms modell som använder DENV infektion i hjärnan kan bli en in vivo plattform för att avskärma inte bara de virala och värd faktorer som förknippas med neuropatiogenes men också möjliga antivirala och anti-encephalitic droger. När det gäller förekomsten av variant neurologiska sjukdomar orsakade av DENV infektion25 av detta etablerade protokoll, skillnaden mellan variabeltyper och/eller stammar av denV för att orsaka neurologiska dysfunktion behövs för validering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från ministeriet för vetenskap och teknik (MOST107-2321-B-038-001) och interna finansiering 106tmu-CIT-01-2, Taipei, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Gibco | 11875-085 | Diluting virus |
| 0.3 mL Insulin Syringe | BD Ultra-FineII | 328838 | Intracerebral and intraperitoneal injection |
| Microbalance | METTLER TOLEDO's LabX | AL104 | Weight mouse |
| Non-adapted DENV2 (strain PL046) | The Centers for Disease Control of Taiwan | - | Infect mouse |
| Institute of Cancer Research (ICR) suckling mouse | BioLASCO Taiwan Co., Ltd | - | Our murine model |
References
- Guzman, M. G., Gubler, D. J., Izquierdo, A., Martinez, E., Halstead, S. B.
- Katzelnick, L. C., Coloma, J., Harris, E. Dengue: knowledge gaps, unmet needs, and research priorities. Lancet Infectious Diseases. 17 (3), e88-e100 (2017).
- Carod-Artal, F. J., Wichmann, O., Farrar, J., Gascon, J. Neurological complications of dengue virus infection. Lancet Neurology. 12 (9), 906-919 (2013).
- Geneva: World Health Organization. Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control: New Edition. , WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee (2009).
- Amaral, D. C., et al. Intracerebral infection with dengue-3 virus induces meningoencephalitis and behavioral changes that precede lethality in mice. Journal of Neuroinflammation. 8, 23 (2011).
- de Miranda, A. S., et al. Dengue-3 encephalitis promotes anxiety-like behavior in mice. Behavioural Brain Research. 230 (1), 237-242 (2012).
- Velandia-Romero, M. L., Acosta-Losada, O., Castellanos, J. E. In vivo infection by a neuroinvasive neurovirulent dengue virus. Journal of Neurovirology. 18 (5), 374-387 (2012).
- Despres, P., Frenkiel, M. P., Ceccaldi, P. E., Duarte Dos Santos, C., Deubel, V. Apoptosis in the mouse central nervous system in response to infection with mouse-neurovirulent dengue viruses. Journal of Virology. 72 (1), 823-829 (1998).
- Tsai, T. T., et al. Microglia retard dengue virus-induced acute viral encephalitis. Scientific Reports. 6, 27670 (2016).
- Cheng, Y. L., et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF-alpha production by mononuclear phagocytes. Scientific Reports. 6, 32000 (2016).
- Ho, M. R., et al. Blockade of dengue virus infection and viral cytotoxicity in neuronal cells in vitro and in vivo by targeting endocytic pathways. Scientific Reports. 7 (1), 6910 (2017).
- Jhan, M. K., et al. Anti-TNF-alpha restricts dengue virus-induced neuropathy. Journal of Leukocyte Biology. 104 (5), 961-968 (2018).
- Kao, J. C., et al. The antiparasitic drug niclosamide inhibits dengue virus infection by interfering with endosomal acidification independent of mTOR. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), e0006715 (2018).
- Tsai, T. T., Chen, C. L., Tsai, C. C., Lin, C. F. Targeting heat shock factor 1 as an antiviral strategy against dengue virus replication in vitro and in vivo. Antiviral Research. 145, 44-53 (2017).
- Jhan, M. K., et al. Dengue virus infection increases microglial cell migration. Scientific Reports. 7 (1), 91 (2017).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Intraparenchymal Stereotaxic Delivery of rAAV and Special Considerations in Vector Handling. Methods in Molecular Biology. , 199-215 (2016).
- Fong, C. Y., et al. Mild encephalitis/encephalopathy with reversible splenial lesion (MERS) due to dengue virus. Journal of Clinical Neuroscience. 36, 73-75 (2017).
- Sarathy, V. V., et al. A lethal murine infection model for dengue virus 3 in AG129 mice deficient in type I and II interferon receptors leads to systemic disease. Journal of Virology. 89 (2), 1254-1266 (2015).
- Schul, W., Liu, W., Xu, H. Y., Flamand, M., Vasudevan, S. G. A dengue fever viremia model in mice shows reduction in viral replication and suppression of the inflammatory response after treatment with antiviral drugs. The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 665-674 (2007).
- Tyler, K. L.
- Yauch, L. E., Shresta, S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral Research. 80 (2), 87-93 (2008).
- Assir, M. Z., Jawa, A., Ahmed, H. I. Expanded dengue syndrome: subacute thyroiditis and intracerebral hemorrhage. BMC Infectious Diseases. 12, 240 (2012).
- Kumar, R., Prakash, O., Sharma, B. S. Intracranial hemorrhage in dengue fever: management and outcome: a series of 5 cases and review of literature. Surgical Neurology. 72 (4), 429-433 (2009).
- Simanjuntak, Y., Liang, J. J., Lee, Y. L., Lin, Y. L. Repurposing of prochlorperazine for use against dengue virus infection. Journal of Infectious Diseases. 211 (3), 394-404 (2015).
- Rocha, B. A. M., et al. Dengue-specific serotype related to clinical severity during the 2012/2013 epidemic in centre of Brazil. Infectious Disease Poverty. 6 (1), 116 (2017).
