Summary
여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.
Abstract
신 경계에서 수 초 이며 glial myelinating에 의해 생성 된 복잡 한 막 구조 세포, 어떤 ensheathes 축 삭 빠른 전기 전도 용이 하 게. Myelin 변경 어디 기능적인 적자와 관련 된 다양 한 신경 질환에 표시 되었습니다. 여기, 우리는 전직에 대 한 자세한 설명을 제공 vivo 모델 마우스 organotypic 소 뇌 조각, 여러 주 및 추가 표시 myelin를 시각화를 위한 문화에서 유지 될 수 있는 구성 된.
Introduction
신경 세포는 그것의 환경 및 생성 및 다른 세포에 전기 자극의 전파를 보장 하는 축 삭에서 입력을 받는 somato 수지상 구획을 구성 하는 매우 편광된 세포 이다. 빠른 전파와 정보의 적시 납품은 신경 시스템의 적절 한 작동에 대 한 필수적입니다. 척추 동물, 그것은 myelination axonal 전도 속도1증가 수에 의해 촉진 된다. Myelin 압축된 계층 myelinating 명과 의해 생성 된 플라즈마 멤브레인의 중앙 신경 조직 (CNS)에 즉 oligodendrocytes 및 Schwann 세포는 말 초 신 경계 (PNS)에 의해 형성 된 특수 구조 이다. CNS 그리고 PNS에서 둘 다, axoglial 상호 작용 드라이브 전문된 axonal 도메인의 형성: 노드의 Ranvier와 그들의 주변 도메인, paranodes, 및 juxtaparanodes2. 수 초, 또는 internodes, 전압 개폐 나트륨 채널 (Nav)에서 풍성 하 게 하는 작은 unmyelinated 도메인에 해당 하는 노드의 Ranvier와 대체 절연 axonal 세그먼트. 높은 농도 및 노드의 Ranvier에서 나v 채널의 급속 한 활성화 활동 전위 그리고 myelin 칼 집의 단 열 속성 함께 재생을 허용, 보장의 효율적이 고 빠른 saltatory 유도 따라3축 삭 신경 충 동입니다.
신경 임펄스의 전도 속도 가속에 그것의 역할, myelinating 명과 장기 무결성을 보존 하 고 그것의 생존4,5에 참여, 축 삭에 대사 지원을 합니다. 또한, 그것은 취소 되고있다에서 최근 몇 년 동안 그 myelin는 인생, 따라서 아마도 참가 규정 및 다양 한 신 경계 기능의가 소성을 통해 동적으로 변조. 배포, 숫자, 길이, 및 축 삭을 따라 myelin 덮개의 두께 따라서 다양 한 네트워크6,,78세밀 하 게 조정 하는 소설 방법을 나타낼 수 있습니다. 따라서, myelin의 진화 인수 감각, 모터 및 인지 기능에 대 한 핵심 프로세스 이며 축 삭과 명과 사이 상호 작용의 섭 동은 점점는 발달에 기여로 간주 또는 신경 인수 질병9.
지질 (70%)의 높은 비율의 특정 기능 myelin 구성 특징 되었습니다. 단백질 (30%)에 비해 달리 다른 세포 막10. 그러나, myelin 지질, 달리 myelin 단백질의 대부분은 myelin, myelin 기본적인 단백질 (MBP), proteolipid 단백질 (PLP), 2', 3'-주기적인 뉴클레오티드 3'-포스 (CNP), myelin 연합 당단백질 (MAG)를 포함 하 여 관련 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG), PMP-22 그리고 P010. Myelin 얼룩 다양 한 조직학 방법 존재 Luxol 빠른 블루11등의 지질 구성, 수단 블랙 B12, 베이커의 산 hematin 방법13로 실버14얼룩에 따라. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 방식을 적절 한 대비와 해상도 개별 섬유를 시각화를 위한 항상 허용 하지 않습니다. 수 초를 감지 하는 양자 택일 접근 immunohistochemistry myelin 단백질에 대 한 감독을 통해 이다. 다양 한 항 체는 높은 특이성으로 myelin 특정 항 원을 대상 고 myelinated 구조를 검출 하기 위하여 정기적으로 사용할 수 있습니다. 항 체 항 원 상호 작용은 1 차 항 체에 대 한 감독 및 적절 한 형광 현미경 검사 법으로 시각 fluorophore 결합 이차 항 체를 사용 하 여 추가 공개 수 있습니다. 여기, 우리는 토론 프로토콜 얼룩 myelin에 ex vivo 소 뇌 조각, 신경 조직 아키텍처의 좋은 보존 수 있는 모델을 설명 합니다. 또한, 조직 및 Purkinje 세포 (소 뇌의 유일한 myelinated 신경)의 크기 그들 electrophysiological 연구 클래식 모델 만들고 그들은 마찬가지로 고정 또는 라이브 이미징 연구를 수행 하기 위해 이상적입니다.
소 뇌 조각 Purkinje 세포 myelination, 비보 (6-7 일 생체 외에서, DIV)15전 1 주일에 의해 주로 달성 하는 과정의 초기 증상에 해당 하는 시간, P9-P10 생쥐에서 생성 됩니다. 또한,이 모델은 적응 demyelinating 질환 다 발성 경화 증 (MS) 등을 조사 하는 광범위 한 demyelination 또는 사용 하는 myelinotoxic 복합 lysophosphatidylcholine (lysolecithin, LPC), 소 뇌 조각에 유도 될 수 있다 어떤은 자발적인 remyelination16,17옵니다. 내 인 성 remyelination 문화 매체에서 LPC 제거 후 2 일에서 그리고 거의 주 게시물 치료 완료.
이 프로토콜의 완성 등 소 뇌 조각 문화 준비 demyelination의 피크에 도달 하는 2 일 뒤 완전히 myelinated 슬라이스를 주, 그들의 전체에 대 한 다른 주에 대 한 반나절 approximatively 3 주 소요 remyelination입니다. 또한, immunohistochemistry 2 일 이내에 완료할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 6 쥐 새끼의 표준 쓰레기에 적응 그리고 계획 된 실험에 사용 되는 동물의 수에 적응 시킬 필요가 있다.
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Protocol
동물을 포함 하는 모든 작업 준수 기관 정책 및 지침 UPMC, INSERM 프랑스 및 유럽 공동체 위원회 지시 86/609/EEC에 의해 설립.
1. 준비 문화 매체와 문화의 삽입 (실습 시간 ≈ 10-15 분)
참고: 흐름 문화 후드 무 균 조건 하에서이 단계를 수행
- 50%로 구성 된 문화 매체의 40 mL를 준비 공학은, 25% 행 크의 균형 소금 솔루션 (1x), 25% 열 비활성화 말 혈 청, 2mm 글루타민 파생, 100 IU/mL 페니실린-스와 4.5 mg/mL D-포도 당 보충. PH 7.4에 조정 합니다.
- 필터-소독 매체 50 mL 플라스틱 주사기에 적응 0.22 μ m 필터를 통해.
참고: 적어도 일주일에 4 ° C에서 문화 매체를 저장할 수 있습니다. - 6 강아지의 표준 쓰레기, 대 한 두 개의 살 균 6 잘 플레이트를 사용 합니다. 각 접시에 대 한 커버를 제거 하 고 잘 당 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.
- 장소 문화 삽입 각 개별 잘 소독 집게와 플라스틱 가장자리를 눌러. 접시에 다시 커버를 넣어.
참고: 한 강아지 (6-8)에서 수집한 소 뇌 조각 두 막 (멤브레인 삽입 당 3-4 소 뇌 조각)에 파견 될 수 있다.
2. 절 개 매체의 준비 (손을 ≈ 시간 5 분)
참고: 흐름 문화 후드 무 균 조건 하에서이 단계를 수행
- 절 개 매체, Gey의 균형 소금 솔루션 4.5 mg/mL D-포도 당 및 1 x 페니실린-스 (100 IU/mL 각)와 보완으로 구성 된 100 mL를 준비 합니다.
- 필터-0.22 μ m 필터 장치를 통해 매체를 소독.
참고: 적어도 한 달에 4 ° C에서 해 부 매체를 저장할 수 있습니다. - 60 mm 셀 문화 요리에 차가운 해 부 중간의 5 mL를 추가 합니다. 각 강아지 해 부 수에 대 한 60 m m 세포 문화 접시를 준비 합니다.
- 사용까지 얼음에 해 부 요리를 유지.
3. 해 부 재료의 준비 (체험 시간 ≈ 15 분)
- 100% 에탄올과 벤치를 청소.
- 모든 해 부 도구, 면도날과 조직 헬기의 플라스틱 플랫폼 100% 에탄올으로 소독.
- 조직 헬기에 면도날과 플라스틱 플랫폼을 해결 하 고 300 µ m 절단 두께 조정.
- 해 부를 시작 하기 전에 모든 에탄올 증발 했다 다는 것을 확인 하십시오.
4. CerebellumDissection 및 섹션 준비 (체험 시간 ≈ 동물 당 15-20 분)
- 쌍 안 현미경 얼음 처럼 차가운 해 부 매체를 포함 하는 60 m m 세포 문화 요리 중 하나 고 상단 플레이트를 제거 합니다.
- (신중 하 게 동물의 눈을 만지고 피) 70% 에탄올과 머리 모피를 면봉 하 고 승인 된 절차에 따라 큰 날카로운가 위를 사용 하 여 동물을 목을 벨.
참고: 소 뇌 조각 특정 섹스 또는 스트레인 바이어스 없이 P9-P10 쥐에서 생성 됩니다. - 작은 위를 사용 하 여 목에서 시작 하 고 마우스 총구에 올라가고 머리의 중간에 따라 피부를 잘라.
- 하는 머리를 잡고 고 두개골, 머리, 아래 ventrally 피부를 다시 접어 고 하나의 손가락 사이 피부 두 겹을 꼬집어.
- 부드럽게 구멍 매그넘으로 작은 위를 삽입 하 고 하나는 측면 쪽으로 절 개 옆 머리 두개골 주위 잘라 하 여 두개골을 잘라. 절단, 뇌 조직의 손상을 방지 하면서 최대한가 위의 팁을 병렬과 두개골에 가까운 유지.
- 벌금-스트레이트 집게를 사용 하 여 두개골의 등 쪽 부분을 검색 합니다. 두개골의 등 쪽 부분을 신중 하 게 해제 하는 동안 접착 meninges (반투명 관개 막 주변 뇌 조직)를 잘라 작은 위 뇌 조직 손상을 방지 하는 데 필요한 경우.
- 조심 스럽게 소개 괜 찮 아 요-스트레이트 집게 (또는 또는 주걱을 사용 하 여) 복 부 두개골과 두뇌 사이 두뇌 밖으로 뒤집기 부드럽고 시와 삼차 신경 작은 위로 잘라.
- 바로 접시 위에 거꾸로 머리를 선회 하 여 차가운 해 부 매체를 포함 하는 60 m m 셀 문화 접시에 중력으로 뇌 고 필요 하다 면 작은 위로 마지막 유착을 풀어.
- 연구원, 직면 등 쪽과 복 부 측 접시의 바닥에 누워 뇌를 찾으시는 미세 집게를 사용 하 여.
- 손상 받을 수 있는 쌍 안 현미경 하 개 측면에 뇌를 무력화 하 고 hindbrain, 만지지 마십시오 벌금-스트레이트 집게를 사용 합니다. (앞-및 midbrain, 그림 1Aa에 회로도 참조), 뇌의 나머지에서는 hindbrain 분리 벌금-스트레이트 집게를 사용 하 여. hindbrain의 나머지에서 소 뇌를 분리, 미세 집게 잘라 사용 아래 소 뇌 소 뇌 peduncles (회로도 참조 그림 1Aa').
- 일단 소 뇌 격리, 신중 하 게 찢 어 멀리 meninges 벌금-스트레이트 집게를 사용 하 여 (에 회로도 참조 그림 1Aa').
- 고급 곡선된 겸 자와 소 뇌를 부드럽게 잡고를 지 면 위로 헬기 면도날을 수직 플라스틱 플랫폼에 ( 그림 1Bb회로도 참조).
- 어떤 과잉 발음 1 mL에 적응 하는 메 마른 얇은 끝 피 펫 팁을 사용 하 여 소 뇌 주위 절 개 매체의 플라스틱 ( 그림 1Bb회로도 참조).
- 뻗어, 단면 ( 1Bb 그림에 회로도 참조) 동안 최적의 화살 조각 플랫폼에 한 번 배치는 소 뇌 낳는 평면, 하지만 확인 합니다.
- 소 뇌의 300 μ m 두께 화살 섹션 조직 다지기와 슬라이스 (회로도 참조 그림 1Bb'). 힘과 칼 날의 속도 사이트에 최적화 될 필요가 있다.
- 부드럽게 썰어 소 뇌에 해 부 매체의 한 방울을 추가 합니다. 넓은 구멍 피 펫 팁 1 mL 피 펫에 배치를 사용 하 여 천천히 썰어 소 뇌를 발음 하 고 차가운 해 부 매체 포함 된 60 mm 셀 문화 접시에 다시 전송 (에 회로도 참조 그림 1Bb ').
- 각 소 뇌 슬라이스 사이 100% 에탄올과 조직 헬기의 플라스틱 플랫폼을 청소. 플랫폼에 다음 뇌를 배치 하기 전에 증발 하는 에탄올을 하자.
- 두 파인 직선 겸 자 (또는 양자 택일로 티타늄 바늘) 개별 분할 영역을 분리 하는 vermis에서 6-8 조각 선택를 사용 하 여 ( 그림 1Cc 에 회로도 참조 하 고 1Cc').
- 6 잘 플레이트 문화 삽입 하 고 일부 절 개 매체, 1 mL 피 펫에 적응 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 함께 한 문화 삽입에 최대 4 선택 된 분할 영역 전송 (에 회로도 참조 그림 1Cc').
- 배치 문화 삽입 밀어 하 여 올바른 위치에 그들을 부드럽게 당겨 절 개 매체 또는 집게를 사용 하 여, 그들이 서로 접촉을 피하고 중간 조각 (에 회로도 참조 그림 1Cc').
- 얇은 끝 피 펫 팁을 사용 하 여 조각 주위 절 개 매체의 어떤 과잉을 제거 합니다. 슬라이스는 멤브레인에 평평 하다 확인 (회로도 참조 그림 1Cc').
- 멤브레인에 슬라이스를 추가 하는 데 직후 인큐베이터에 6-잘 접시를 놓습니다.
5. 조각 문화와 Demyelination (실습 시간 ≈ 15-20 분)
참고: 흐름 문화 후드 무 균 조건 하에서이 단계를 수행
- 조각 준비 후 3 일 마다 미리 예 열 하 고 버퍼링 된 신선한 문화 매체의 당 1 mL와 문화 매체를 교체 합니다.
- Demyelination에 대 한 모든 문화 매체 아래 문화 6 일 체 외 (DIV) 후 삽입을 제거 하 고 0.5 mg/mL LPC를 포함 하는 미리 데워 진된 신선한 문화 매체의 잘 당 1 mL와 함께 그것을 대체 합니다. 15-17 h 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
- 부 화, 후 미리 데워 진된 문화 매체의 1 mL를 포함 하는 25 mm 페 트리 접시에 그들을 배치 하 여 삽입을 세척.
참고: 삽입 매체 접촉 해야 하지만 그것에 의해 커버 되지 않을. - 즉시 신선한 미리 데워 진된 문화 매체를 포함 하는 새로운 6 잘 플레이트에 문화 삽입 전송.
- 조각 고정 될 때까지 2-3 일 마다 미리 데워 진된 신선한 문화 매체의 1 mL와 문화 매체를 교체 합니다.
6. Immunohistochemistry (실습 시간 ≈ 1시 30분-2 h)
참고: 6.1 단계를 실시 합니다. 6.3 to. 연기 후드. 박람회 paraformaldehyde (PFA)을 방지 하 고 적절 한 조작 및 보호를 위한 제품 안전 데이터 시트를 참조.
- 각 문화 리프트를 사용 하 여 집게 플라스틱 가장자리를 눌러 삽입 하 고 각 우물에서 막 삽입 아래 문화 매체를 제거 합니다.
- 4%의 2 개 mL를 추가 하 여 30 분 동안 소 뇌 조각 해결 PFA 막 삽입에 PBS pH 7.4 x 1에서.
참고: 고정 시간 지점의 myelination 공부의 단계에 따라: 4 DIV myelination, 완전히 myelinated 조각에 7 DIV의 발병에 해당. LPC 치료의 경우 9 DIV demyelination, remyelination의 발병에 11 DIV와 완전히 remyelinated 조각에 14 DIV의 절정에 해당합니다. - 3 시간 10 분 동안 2 mL 1 x PBS 가진 조각으로 삽입을 세척.
- 25 x 30 x 확대를 부드럽게 메스 또는 브러시를 사용 하 여 그들을 밀어 하 여 쌍 안 현미경 막 삽입에서 슬라이스를 구분 합니다. 또는, 막에서 그들을 분리 하는 동안 슬라이스를 손상의 위험을 방지 하려면 여전히 연결 된 조각으로 막 잘라 메스를 사용 합니다.
- 브러시를 사용 하 여 1 x PBS를 포함 하는 4-잘 접시의 우물에 떠 있는 분할 영역을 전송 합니다.
- 각 우물에서 PBS를 발음 하 고 15 ~ 20 분 동안-20 ° C에 미리 냉각된 100% 에탄올에 슬라이스를 품 어. 이 단계는 myelinated 섬유에 항 체 침투를 촉진 한다.
- 100% 에탄올을 발음 하 고 한 번 짧게 1 PBS, x 다음 실 온에서 10 분의 1 x PBS에 두 번 세척.
- PBS를 발음 하 고 PBS, 5 %NGS, 실 온에서 0.3% 비 이온 세제 일반적인 항 체 고정 사이트를 차단 하려면 x 1을 포함 하는 솔루션으로 30 ~ 45 분에 대 한 슬라이스를 품 어.
- 차단 솔루션 발음 아니 세척이 필요 합니다.
- 4 ° c.에 솔루션을 차단에 희석 주 항 체와 하룻밤 슬라이스를 품 어 소 뇌 organotypic 조각에 myelin를 시각화 하려면 MBP (닭, 1/150 또는 마우스 IGg2b, Smi99, 1/200) 또는 PLP (쥐, hybridoma, 1/5 ~ 1/10) 항 체.
참고: 동일한 조각에 둘 이상의 항의 식을 나타내기 위해 더블-또는 트리플 얼룩이 절차 수행 (예를 들어 그림 1 참조). 부 화를 동시에 수행 하기 위해 다른 종에서 생산 되는 주요 항 체 확인 합니다. 그런 다음 다른 fluorophores에 결합 된 그들의 해당 보조 항 체를 사용 하 여 ( 테이블의 자료 를 참조 꾸벅꾸벅 졸 기 및 paranodal 마커18 항 체). - 두 번째 날, 워시 슬라이스 3 번 10 분의 1 x PBS에.
- 실 온에서 어둠 속에서 (1/500 희석) 솔루션을 차단에 희석 보조 항 체와 3 h에 품 어.
참고: 여기 설명 하는 것 보다 다른 항 체를 사용 하는 경우 항 체 희석 및 보육 시간 최적화 필요 수 있습니다. - 어둠 속에서 10 분의 1 x PBS에 슬라이스 세 번을 씻어.
- 쌍 안 현미경, 유리 슬라이드에 분할 영역을 탑재 합니다. 슬라이드에 1 x PBS의 100 µ L를 놓고 슬라이스를 브러시를 사용 하 여 PBS에 전송 합니다. 필요한 경우 슬라이스를 펼쳐 슬라이드에 그들을 평평 하 게. PBS의 어떤 과잉을 제거 합니다. 경우에 immunolabeling 막에 아직도 붙어 조각 하 여 수행 됩니다, 유리 슬라이드에 막 coverslip 직면 조각으로 탑재 합니다.
- 유리 coverslip에 직접 장착 매체의 한 방울을 배치 하 고 부드럽게 커버 조각. 어둠 속에서 4 ° C에서 몇 달 동안 탑재 된 슬라이드를 저장할 수 있습니다.
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Representative Results
Organotypic 소 뇌 조각 PLP GFP 유전자 변형 마우스 (그림 2B), 뿐만 아니라 Purkinje 세포 얼룩 함께 P9-P10 C57black6 야생-타입 (WT) (그림 2A)에서 얻은 대표 myelin immunostainings의 예. 소 뇌 조각 백색 질에서 미는 folia의 주변으로 조각의 영역 트랙과 myelination Purkinje 세포의 주로 6 ~ 7 후 달성 팀 7 DIV에서 전체 demyelination의 유도 LPC 치료 (그림 2Ci-ii)를 통해 가능 하다. 다음 demyelination, 슬라이스 자발적으로 remyelinate는 완전히 remyelinated demyelination (그림 2Ciii)의 피크 후 6-7 일.
그림 1: 소 뇌의 그림 조각 세대. 해 부는 세 가지 주요 단계로 분할 된다. (A) 소 뇌 절연 이며 meninges 제거 (4.10 및 4.11 단계). (B)는 소 뇌 헬기 플랫폼을 전송 하 고 슬라이스 (단계 4.12 4.16). (C) 마지막으로, 슬라이스는 vermis에서 격리 하 고 막 삽입에 배치. 조각으로 전송 해 부 매체 제거 되 고 6 잘 플레이트 (4.18, 4.22 단계) 인큐베이터에 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 비보 전 교양 myelinated 소 뇌 조각의 예. 이미지 스택 (직교 프로젝션)와 무료 부동 immunolabeling 및 평면 프로토콜에 설명 된 대로 설치 하는 직 립 confocal 현미경을 사용 하 여 얻은 했다. 슬라이스는 튼튼하게 11 DIV (A, PLP;에서 myelinated B, 녹색에 GFP) axonal 도메인 노드의 Ranvier 전압 개폐 나트륨 채널 (Nav, 빨간색에서) C57black6 WT (A에서에서 paranodal axoglial 접합 도메인 (Caspr, 흰색에서)에 의해 형벌에 농축 된 vivo에서 관찰로 조립 되 고 ) PLP-GFP (B) 유전자 변형 쥐 조각 뿐만 아니라. PLP GFP 마우스에서 소 뇌 조각에 관찰로 (C) 소 뇌 피 질 건축 교양된 조각, 에서 유지 됩니다. (나) Purkinje 세포 축 삭 (Calbindin, Calb, 파란색에서)는 문화에 1 주일 후 튼튼하게 myelinated (GFP, 녹색에서). (ii) LPC 치료 완전히 자발적으로 슬라이스는 remyelinate demyelinates 그리고 완전히 remyelinated 6 일 게시물 demyelination (iii, 14 DIV). 바 규모 = 20 µ m (A, B); 100 µ m (C) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 전을 생성 하는 프로토콜 세부 vivo 모델 마우스 소 뇌 organotypic 슬라이스 문화에 해당 게시 방법15,,1619 및 후속 myelin 이전에서 적응 이러한 준비의 immunostaining입니다. 이 전략 모두 건강 하 고 병 적인 상태에는 고해상도와 수 초 구성 요소를 시각화 하는 가능성을 제공 합니다.
10 일 된 쥐에서 가져온 소 뇌 organotypic 조각 문화는 가장 해 부 재현 하 수 분자 및 세포 메커니즘 myelination 및 remyelination 프로세스 기본 조사를 확고 실험 모델 및 생체 조건 뿐만 아니라 잘 정의 된 세포질 건축 뿐만 아니라 성숙 타임 라인17의 보존을 포함 하 여 해당 조직의 기능 기능. 또한, 소 뇌 조각 있다 생체 외에서 2 주 후 보존된 건축 조직 (그림 1C). 유전자 변형 PLP GFP 스트레인은 허용 하는, 특히, 특히 demyelination remyelination 연구 (그림 1C 편리한 라이브 조각에 형광 쌍 안 현미경 myelination 상태를 관찰 하는 대신, ).
서쪽 오 점 분석20, CNPase 분석 결과16 또는 PLP/Calbindin의 정량화를 포함 하 여 개발 된 자동화 된 정량화 myelination 속도 평가 하기 위해 빠른 접근으로 특별 한 관심의이 준비는 (또는 MBP / Calbindin) 얼룩17,21, 높은 처리량의 시스템 장애22,23demyelinating 약리 약물 테스트에 대 한 수를 대표 하는 따라서.
이러한 실험을 수행할 때 주요 중요 한 문제 중 하나는 소 뇌 조각의 품질 관련이 있을 수도 있습니다. 첫째, 생쥐의 세 소 뇌 organotypic 슬라이스 문화에 대 한 중요성 이다. Purkinje 세포, 소 뇌 문화에만 myelinated 신경의 생존 P7 설치류 또는 P1317보다 오래 된 기증자와 함께 문화 P2에서 준비가 경우 손상 됩니다. 더 일반적으로, organotypic 뇌 조각 문화는 성인 동물에서 얻을 어렵다. 둘째, 해 부 동안 조직 처리 기간은 중요 한 해 부로 동물 당 15-20 분 이상의 단계 리드 조각의 생존 율 감소. 또한, 경작 될 슬라이스를 선택할 때 신경 및 myelinated 섬유의 결과 부족의 가난한 생존 때문에 소 뇌의 양쪽 끝에서 그들을 사용 하지 않도록 최상 이다.
온도 및 문화에서 CO2 농도의 안정성 같은 다른 매개 변수는 슬라이스 건강 위해 요인 결정 하 고 있다. 마지막으로, 조각의 품질은 사용자가 제어할 수 없는 말 혈 청의 구성에 의해 영향을 받습니다. 따라서, 혈 청의 여러 일괄 처리를 테스트이 좋습니다.
적절 한 라벨링 얻으려면 조직 고정 중요 한 단계입니다. Myelin는 매우 컴팩트한 구조 도달 수 초 항 원, 항 체의 침투를 촉진 하기 위하여 다음 고정 절대 에탄올과 조각 전처리 권고 합니다. 트리톤 농도 vibratome의 두께에 적응 해야 할 수도 있습니다 또는 cryostat vivo에서 섹션 생성 얼룩의 유사한 프로토콜 추가 vivo에서 고정 조직에 적용할 수 있습니다. 비 상업 항 체의 여부 또한 고려 되어야 한다. PLP GFP24 등25 CNP GFP 유전자 변형 쥐에서 슬라이스를 준비 하 고 따라서 수 초 및 oligodendrocytes 프로세스를 시각화 하는 대안을 나타냅니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 토론 방법 이외에 다른 접근 myelin 건축을 일반적으로 사용 됩니다. 보완 기술 myelin 열 대권 외의, 금26되 고 전자 현미경 조사를 또한 존재 한다. 광학 일관성 단층 촬영27,28, 라만 산란28,29, 제 3 고조파 발생30 레이블 없는 접근 같은 다른 기술 존재 또는 스펙트럼 confocal 반사율 현미경31; 이러한 방식을 동적 세포질 과정의 관찰의 추가 이점이 있다. 그러나, 이러한 기술 중 일부는 복잡 하 고 더 최신의 현미경 검사 법 체제를 요구. 이러한 이유로, 면역 형광 라벨 myelin 연구 남아 myelination 다양 한 발달 또는 취득 질병 및 그들의 모델의 결함을 조사 하로 미래 치료의 잠재력을 평가 하는 표준 접근 방식을 치료입니다. 그것은 학습 및가 소성으로 노화, 우울증, 또는 자폐증 myelin 변경된32로 알려져 있다 같은 여러 컨텍스트에서 myelination 공부를 더 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
작가의 아무도 경쟁 관심사 또는 상반 되는 관심사를 있다.
Acknowledgments
우리에 대 한 귀중 한 의견 원고 박사 숀 프리먼, 닥터 나탈리 솔-Foulon와 박사 토마스 루 감사합니다. 이 작품 INSERM, ICM, ARSEP 교부 금 R13123DD, ANR R17127DD (광고)에 FRM 친목, SPF20110421435 (광고)에 의해 투자 되었다 (몬태나)를 FDT20170437332. 우리는 icm CELIS 셀 문화 시설 감사합니다. 양의 이미징 플랫폼입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60 mm and 100 mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30 mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 mm x 26 mm x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
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