Summary
该方案涉及房室瓣膜小叶的表征与力控制, 置换控制, 和应力松弛双轴机械测试程序。该协议获得的结果可用于本构模型的开发, 以模拟功能阀在有限元仿真框架下的力学行为。
Abstract
广泛的双轴力学测试房室心脏瓣膜小叶可以用来推导出本构模型中使用的最佳参数, 提供了这些结构的机械功能的数学表示。提出的双轴机械测试协议涉及 (一) 组织采集, (二) 组织标本的制备, (iii) 双轴机械测试, (四) 所获得数据的后处理。首先, 组织采集需要从当地食品和药物管理局批准的屠宰场获得猪或牛的心脏, 以便以后进行解剖, 以回收瓣膜传单。其次, 组织准备需要在小叶组织上使用组织标本切割机, 以提取一个清晰的区域进行测试。第三, 单板试样的双轴机械测试需要使用商业双轴机械测试仪, 其中包括力控、位移控制和应力松弛测试方案, 以表征单板组织的机械性能。最后, 后处理需要使用数据图像相关技术以及力和位移读数来总结组织在外部载荷下的机械行为。一般情况下, 双轴试验结果表明, 小孔组织产生非线性, 各向异性的机械响应。所介绍的双轴测试程序对其他方法有利, 因为这里介绍的方法允许在一个统一的测试方案下对阀门小叶组织进行更全面的表征, 而不是在不同的组织标本。所提出的测试方法有其局限性, 即剪切应力可能存在于组织样品中。然而, 任何潜在的剪切被认为是可以忽略不计的。
Introduction
正确的心脏功能依赖于心脏瓣膜小叶的适当的机械行为。在心脏瓣膜传单机制受到损害的情况下, 会发生心脏瓣膜疾病, 这可能会导致其他与心脏有关的问题。了解心脏瓣膜疾病需要彻底了解传单的正确机械行为, 用于计算模型和治疗发展, 因此, 必须制定一个测试方案, 以准确地检索健康小叶的机械性能。在以往的文献中, 这种机械特性是使用双轴机械测试程序进行的。
在整个文献中, 软组织的双轴机械测试程序各不相同, 不同的测试框架用于检索不同的特性1、2、3、4、 5,6,7,8,9, 10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19. 为调查心脏瓣膜小叶的机械特性, 扩大了试验方法。一般来说, 双轴机械测试包括在两个主要方向上同时加载心脏瓣膜组织, 但这种测试是如何进行的, 取决于要观察到的生物力学特性。其中一些测试协议包括 (i) 应变率、(ii) 蠕变、(iii) 应力松弛和 (iv) 力控测试。
首先, 利用应变率检测来确定组织传单 18,20的时间依赖性行为。在这个测试协议中, 传单在不同的半周期时间 (即 1, 0.5, 0.1 和 0.5s) 被加载到最大的膜张力, 以确定加载时间之间的峰值拉伸或滞后是否有显著差异。然而, 这些测试在观察到的拉伸中显示了可以忽略不计的差异, 其应变率也各不相同。其次, 在蠕变试验中, 组织被加载到膜的峰值张力, 并保持在膜张力的峰值。通过此测试, 可以演示组织的移位如何蠕动以保持膜的峰值张力。然而, 它已经表明, 蠕变是微不足道的心脏瓣膜小叶在生理功能3,20。第三, 在应力松弛试验中, 组织被加载到膜的峰值张力, 相关的位移在3、21、22 保持较长时间的不变。在这种类型的测试中, 组织应力与膜的峰值张力相比有显著的降低。最后, 在力控试验中, 组织在每个方向 17、23的膜峰值张力的不同比率下循环加载。这些试验揭示了材料的各向异性和非线性应力应变响应, 通过在不同比例下加载组织, 可以更好地了解潜在的生理变形。最近的这些研究表明, 应力松弛和力控制协议被证明是最有益的执行心脏瓣膜传单的机械表征。尽管在心脏瓣膜生物力学表征方面取得了这些进展, 但测试并没有在一个统一的测试方案下进行, 研究方向之间耦合的方法有限。
该方法的目的是通过统一的双轴机械测试方案, 方便心脏瓣膜小叶的完整材料表征。一个统一的测试方案被认为是一个测试传单在一个会话中根据所有测试协议进行测试的方案。这是有利的, 因为组织属性是固有的可变传单之间, 所以一个完整的表征每个传单被证明更准确的描述符比执行每个协议独立在各种传单。测试方案由三个主要部分组成, 即 (一) 力控双轴测试协议; (二) 位移控制双轴测试协议; (三) 双轴应力松弛测试协议。所有测试方案均采用 4.42 N/min 的加载率和10个加载卸载周期, 以确保应力-应变曲线在第十个周期之前可复制 (如以前的工作所示)23。所有协议也是基于膜张力假设构建的, 该假设要求厚度小于有效试样长度的10%。
该方法采用的力控协议分别为二尖瓣 (mv) 和三尖瓣 (tv) 的10个加载和卸载周期, 峰值膜张力为100nm和 75 n。在这种力控测试协议中考虑了五个负载比率, 即12:1、0.75:1、1:0.75、0.5:1 和1:0.5。这五个加载比被证明是有用的描述的压力和菌株对应于所有潜在的生理变形的传单在体内。
该方法提出的位移控制协议由两种变形场景组成, 即 (i) 约束单轴拉伸和 (二) 纯剪切。在约束单轴拉伸中, 组织的一个方向在固定另一个方向时被移位到膜的峰值张力。在纯剪切装置中, 组织在一个方向上拉伸, 在另一个方向上明智地缩短, 因此组织的面积在变形下保持恒定。这些位移控制的测试程序中的每一个都是对两个组织方向 (圆周方向和径向方向) 进行的。
该方法中使用的应力松弛协议是通过将组织加载到双向的峰膜张力和在相应的位移处将组织保持15分钟来监测组织的应力松弛行为来实现的。接下来将讨论详细的实验过程。
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Protocol
所描述的所有方法都得到了俄克拉荷马大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的批准。所有动物组织都是从美国农业部 (USDA) 批准的屠宰场 (乡村肉类公司, Edmond, OK) 获得的。
1. 组织采集和清洗
- 在动物被宰杀的同一天找回动物的心脏, 并将心脏存放在冰柜中, 以确保组织的新鲜度。把心脏运送到实验室空间。
- 到达实验室后, 将心脏浸入一桶磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液中, 冲洗掉多余的血液。寻回钳子、胎盘、手术刀、一桶 PBS 溶液、漂白剂和塑料袋。准备胎盘, 将其放置在解剖柜台上, 以便更容易清理与血液有关的烂摊子。心脏被充分冲洗后, 将心脏放在胎盘上 (图 1a)。
- 使用钳子, 定位心脏两侧心房和心室之间的分离线。使用剃须刀片, 小心地沿着这条分型线做一个切口, 露出心脏瓣膜和心室 (图 1b)。沿着心脏的整个外周进行切口, 使心房和所有高于心室的心脏物质都能被切除。
- 使用钳子, 小心地取出心室中观察到的任何血块 (图 1c)。如果试图去除血块, 但它不动, 确保脊索肌腱或传单没有被抓住。将血块放入生物危害袋中进行废物处理。
- 当所有血块都从心室中取出后, 用 PBS 溶液最后一次用 PBS 溶液冲洗心脏。将干净的心脏放入塑料袋中, 并将其存放在冰柜中。
- 使用10% 漂白剂和90% 水的溶液, 将血液与漂白剂溶液混合, 连续搅拌约 10分钟, 寻找成功的漂白剂处理, 通过从红色过渡到黄色的溶液来表示。通过引流处理漂白剂治疗的血液。
注意: 漂白剂是一种有毒物质, 摄入可能有害。
注: 协议可以在此处暂停。
2. 心脏解剖和解剖检查
- 找回先前净化的心脏, 让它在温水浴中解冻。解剖所需的材料包括钳子、手术刀片、胎盘、PBS 和小型储存容器。心脏完全解冻后, 把它放在胎盘上, 吸收任何剩余的血液。
- 保持心脏的自上而下 (高级) 视图, 以最佳方式观察阀门结构。从心脏左侧的 MV 开始, 用钳子仔细地操纵传单, 并在传单之间找出一条同情或离别线。
- 沿着交割做一个切口, 小心地穿过心室壁, 确保不要损坏小叶。在这个过程中, 可能需要切断和弦的附件, 以完全打开心室。一旦完成全切口, 打开心室 (图 2a)。
- 识别 MV 前和后小叶 , 并使用手术刀片切断状肌肉的脊索附件。使用钳子, 伸展小叶拉紧, 并作出削减, 以分离的传单从环。将切除的小叶放在一个贴有适当标签的容器中, 容器中充满了 PBS 溶液, 并将其存放在大约4°c 的冰箱中。
- 保持心脏的自上而下的看法, 并识别心脏右侧的电视。找到该通讯, 并通过其中一个共和心室壁进行切口 (图 2b)。
- 识别电视隔膜、后叶和前叶, 并执行第2.4 步中的小叶提取。将所有获得的小叶放入充满 PBS 溶液的标签容器中, 并将容器存放在大约4°c 的冰箱中。
注: 协议可以在此处暂停。然而, 组织生物力学测试和随后的组织学分析应在心脏解剖后2天内进行。
3. 组织解剖
- 从冰箱中取出宣传单张, 为指定的切片尺寸的组织切割机, 外科笔, 钳子, 剃须刀片, 和切割垫。
- 使用钳子, 从 PBS 溶液中取出试样, 并将其平放在切割垫上, 径向方向 (R) 与 y 方向对齐, 圆周方向 (C) 与 x 方向对齐 (图 3a)。确定传单的中心区域为测试部分。
- 对齐组织切割机, 使所需的组织测试区域位于剃须刀刀片的边界内。使一个水平切割, 另一个垂直切割, 形成所需尺寸的正方形区域 (图 3b)。使用手术笔, 标记组织的径向 (图 3b)。
- 使用剃须刀刀片, 修剪任何和弦附件, 用钳子将小叶上的和弦拉上, 并在不对小叶造成任何损坏的情况下进行仔细的切割。
注: 协议可以在此处暂停。如果协议暂停, 将切片组织存储在充满 PBS 解决方案的标记容器中, 并将容器存储在大约4°c 的冰箱中 (如步骤2.6 中所述)。然而, 组织测试应在解剖后2天内进行。
4. 厚度测量和双轴测试仪设置
- 检索切片组织标本、数字卡钳和一个小金属铲子。使用数字卡钳, 测量和记录金属铲子的厚度。
- 使用钳子, 将组织标本平放在金属铲子上。使用数字卡钳, 测量三个不同的传单位置的 spatula-tissue-组织对的厚度 (图 3c)。从每次测量中减去铲子的厚度, 并记录平均厚度。
- 在37°c 时准备一个 PBS 浴, 这与组织的生理条件相对应。
5. 组织安装和基准标记放置
- 回收钳子、组织标本、安装硬件、细尖工具、玻璃珠 (直径 300–500μm) 和超级胶。
- 将组织安装到双轴测试系统 (图 3d, e)。安装时, 确保组织的周向和径向方向与机器的 x 和 y 方向对齐。
- 对于基准标记位置, 将玻璃珠放入一个小的朝面容器中, 将一个小池的超级胶水放入另一个容器中。使用细尖工具, 用少量的超级胶水覆盖尖端, 并将单个珠子贴在工具的尖端。
- 小心地使用该工具将珠子转移到组织测试区域的中间三分之一的一个角落 (图 3f)。重复此步骤, 直到形成由四个珠子组成的正方形数组 (图 3g)。
注: 避免多余的胶水是至关重要的, 基准标记不粘在一起, 因为后来的数字图像相关性 (DIC) 技术将产生无用的跟踪结果。重要的是, 正方形阵列必须位于组织测试区域的中间三分之一以内。
6. 预处理步骤和持续时间时间
- 要计算适当的膜张力, 请获取组织的有效测试边缘长度, 并使用以下公式。
(2)
注: 这里, t是膜张力在一个单位的力长度, f是力,和 l是样品的有效测试长度。 - 创建预调理协议, 使组织在与膜峰值张力相关的力处进行10次加载/卸载周期, 加载速率为 4.42 N/min, 包括最大力2.5% 的预加载 (图 4)。
- 创建一个新的任意测试目录来临时存储预适应数据, 因为这对于将来的计算来说不是必需的。为后续测试建立 4.42 nnmin 的装载率。
- 创建一组新的测试参数, 并将协议的名称设置为Preconditioning0 (图 4a)。对于 x 轴和 y 轴, 将控制模式设置为强制,将控制功能设置为步骤。将负载大小设置为与目标峰膜张力相关的力 (参见步骤 6.1) (图 4b)。将预紧幅度设置为仅第一次重复的最大力的 2.5% (图 4c)。将拉伸持续时间和恢复持续时间都设置为 25秒,将重复次数设置为 10 (图 4e)。
- 当预处理步骤完成时, 记下组织在 x 和 y 方向上的变形。准备一个协议, 从记录的大小开始, 将试样移动到最大力。
- 为计时目的检索秒表。启动最大力加载协议, 并在机器启动时同时启动秒表 (图 5a)。当驱动停止时停止秒表。停止将是显而易见的通过听觉暗示。
- 记录预调理后组织变形与秒表的时间一起, 代表组织的最佳拉伸时间 (图 5b)。
(2)7. 双轴机械测试
- 以 4.42 nmin 的负载速率准备力控制协议。
- 打开一个新的测试目录并命名测试。将数据设置为保存到已知位置, 以便在以后的应力和应变计算中使用。将样品移回原来的安装配置。
- 创建名为"第一映像" 的协议集。将x 轴和y 轴控制模式设置为强制, 并将控制功能设置为步进。将负载幅度设置为0 mn。将拉伸持续时间和恢复持续时间分别设置为1秒。将重复次数设置为1。将数据输出频率和图像输出频率分别设置为1 hz。
- 构造一个新的测试集, 名为preprediinginga。建立测试参数, 使组织将经历10次重复的循环加载/卸载到目标的力量所需的膜张力完全一样, 在步骤6.2 中准备。请注意, 现在, 拉伸时间和恢复时间应该是步骤6.3.2 中记录的时间。A测试集中不捕获图像, 但以 15 hz 捕获数据。
- 构建另一个测试集, 名为preprediingingb。所有测试参数都应与上一步中提到的参数相同, 但图像输出频率设置为15 hz, 并且不应用预加载。
- 在预处理协议之后, 创建测试协议, 以便在以下周至径向加载比率下, 以 4.42 N/min 的加载速率将组织加载到峰值膜张力, 负载速率为 4.42 N/mepe:1, 0.75: 1, 1:0.75, 0.5:1 和 1:0.5 (图 6)).从每个加载比率的最后两个周期中检索数据, 以便进行第10节中描述的后续数据处理和分析。有关要建立的协议的详细说明, 请参阅表 1 。
- 以 4.42 nmin 的加载速率准备一个位移控制的测试协议, 如下所示。(i) x 方向和 y 方向的双轴拉伸,使其与峰值圆周和径向拉伸有关 (图 7a)。(ii) 沿 x 方向的纯剪切--在与峰值圆周拉伸相关的 x 方向上拉伸, 在 y 方向上缩短, 同时保持虚线面积在变形下保持不变 (图 7b)。(三) 沿 x 方向的约束单轴拉伸(图 7c)。(四) 沿 y 方向的纯剪切(图 7d)。(v)沿 y 方向的单轴拉伸受约束(图 7e)。
- 在每个步骤之间, 构造1分钟的休息 "循环", 将组织固定在原始安装的配置处。从每个加载比率的最后两个周期中检索数据, 以便进行数据处理和分析 (第9节)。有关要建立的协议的详细说明, 请参阅表 2 。
- 准备一个应力松弛协议, 以便在每个方向加载组织, 加载速率为 4.42 np min, 以与峰值膜张力 (步骤 7.2) 相关的位移, 并在该位移处保持 15分钟 (图 8和图 9)。15分钟后, 应将协议设置为将组织恢复到其原始安装配置。
注: 在组织撕裂的情况下, 立即中止测试, 以防止对双轴测试系统造成任何潜在的损害。
8. 组织固定用于组织学分析
- 从双轴测试系统中卸载组织。将组织放入装满10% 福尔拉林的容器中, 然后将容器放置在约4°C 的冷藏环境中。根据组织的厚度, 将组织固定24-48小时。
注意: 福尔马林是一种已知的致癌物质, 如果吸入, 过量可能会导致肺部固定。所有使用福尔拉林的工作都应在通风良好的通风室内进行。 - 在福尔马林固定组织24-48小时后, 将组织转移到80% 乙醇溶液中, 以便以后进行组织学检查。组织应在4°C 的冷藏环境中储存在溶液中。
注: 协议可以在此处暂停。一旦组织被固定, 标本可以在任何时候进行分析。如果暂停了协议, 请将组织存放在装满80% 乙醇的标记容器中, 并将容器存放在大约4°c 的冰箱中 (如步骤8.2 所述)。 - 根据供应商的指示准备用于商业组织学分析的组织。如果某一传单成分, 如胶原蛋白, 弹性蛋白, 糖胺多糖等, 是研究的兴趣, 确保使用适当的组织学染色。
注: 可以使用显微镜对组织学幻灯片进行可视化, 以观察所需成分 (图 10)。 - 使用图像处理程序 ImageJ, 执行颜色反褶积方法来确定组织中每个染色成分的百分比。有关这些程序的更多详情, 请参见 Ruifrok 和 Johnston24。
9. 双轴测试数据后处理程序
- 对双轴机械测试期间拍摄的图像中的四个基准标记执行基于 dic 的跟踪 (图 11), 以确定与时间相关的标记位置。
(3)- 如果需要对安装配置执行分析, 请让xi 作为双轴测试开始时处于未变形状态的标记位置。如果需要对预处理后的变形进行分析, 请让xi 作为预处理协议末尾的标记位置。
注: 无论选择何种引用配置, 后续步骤都将以相同的方式执行。
注: 此处, xi和Xi 分别是标记的未变形和变形位置, di 是每个标记的位移向量。
- 如果需要对安装配置执行分析, 请让xi 作为双轴测试开始时处于未变形状态的标记位置。如果需要对预处理后的变形进行分析, 请让xi 作为预处理协议末尾的标记位置。
- 利用四节点双线性有限元 2、23、25计算基准标记的变形梯度 (f)。
(2)
注: 在这里, bxi和byi分别是节点 i 和 u i (t) 和vi( t) 分别是以前从步骤9.1 中确定的与时间相关的 x-和 y 位移。请注意, x-坐标和 y 坐标与组织的周向和径向方向对齐。 - 计算右侧柯西-绿色变形张量 (c) 和绿色应变张量 (e)。
(2)
注: 在这里,我是二阶标识张量。用c的主要值的平方根确定圆周和径向拉伸。 - 确定第一个 Piola-Kirchhoff (1-pk) 应力张量 (p)。
(3)
注:这里是试样的厚度, t c 和tr 分别是在圆周和径向方向上施加的膜张力。 - 此外, 计算其他应力张量, 如柯西应力张量 () 和第二个皮奥拉-基什霍夫 (2nd-pk) 应力张量 (s)。
(5)
注: 这里, j是变形梯度张量 f的雅可比。
(3)
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Representative Results
来自力控制的双轴机械试验的应力拉伸数据揭示了一个与指数曲线有些相似的非线性曲线 (图 12)。对于各主要方向的响应, 材料行为是横向各向同性的, 径向拉伸大于周向变形。在某些情况下, 各向异性的方向可能会翻转, 圆周方向比径向方向表现出更强的合规性。这种翻转的反应在电视上比在 m v 中观察到的频率更高。
从位移控制的测试中, 应力拉伸数据遵循对发生张力的主要方向 (纯剪切、约束单轴张力 [图 13]) 的非线性响应。当组织在另一个主要方向缩短时, 会观察到 "负 (压缩) 应力"。在约束单轴张力协议中, 在约束方向上也表现出越来越大的应力拉伸响应, 证明了应用拉伸在另一个主方向上的耦合。
从应力松弛测试中, 归一化膜张力时间数据遵循非线性衰减曲线 (图 14a, b)。与圆周方向相比, MV 和电视小叶组织在径向方向上都表现出更大的应力减少。
图 10给出了马松三丁质二尖瓣前叶 (mval) 和三尖瓣前小叶 (tval) 组织的代表性组织学结果。马松的三色染色显示了在房室心脏瓣膜中发现的典型成分, 如胶原纤维 (蓝色) 和瓣膜间质细胞 (红色细胞质和黑色细胞核)。其他污渍可以用来可视化成分, 如弹性蛋白 (Verhoeff-van Gieson 染色) 和糖胺多糖 (Alcian 蓝色染色)。
图 1: 从当地屠宰场回收的猪心脏实验照片.(a) 用 pbs 溶液冲洗整个心脏的血液。(b) 在心房和心室之间进行切割, 以显示二尖瓣和三尖瓣。(c) 然后在储存前从心脏中取出血块。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 打开的猪心脏的实验照片显示五个房室心脏瓣膜小叶和其他组件的瓣膜装置.(a) 二尖瓣, 左心解剖沿两个小叶之间, 显示前小叶 (mval) 和后小叶 (mitral), 和 (b) 三尖瓣与类似的解剖的右侧心脏, 露出前小叶 (TVAL)、后小叶 (TVPL) 和隔膜小叶 (TVSL)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 为双轴机械测试准备的切除传单的实验照片.心脏瓣膜传单测试要求 (a) 将散装传单切割成 (b) 10 毫米 x10 毫米测试区域 (手术笔标记注明的径向方向)。(c) 测量传单厚度。样品被安装到 (d) 双轴测试系统中, 通过 (e) 用金属尖头刺穿组织。安装后, (f) 基准标记物粘附在组织表面, 然后在37°c 的 pbs 溶液中 (g) 浸入。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 7.5 mm x7.5 mm 测试区域二尖瓣前小叶预处理测试的示例协议参数.预处理协议是通过设置 (a) 协议名称、(b) x 轴上的测试控制模式和力、(c) 预加载条件、(d) y 轴参数与x 轴中的参数相同以及 (e) 创建的.) 循环参数。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 7.5 mm x 7.5 mm 测试区域的二尖瓣前传单的定时步骤的示例协议参数.定时步骤要求 (a) 将组织从预处理后的变形移动到峰值膜张力 (和相应的峰值变形), 同时启动秒表以记录拉伸时间。当目标力达到时, (b) 记录预处理后的变形。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 力控双轴检测程序的原理图, 用于检测二尖瓣和三尖瓣小叶.测试方案包括一个等轴加载预处理步骤, 以锻炼组织到其体内状态, 然后是每个组织方向 (Tx:ty) 的峰值膜张力的各种加载比率: 1:1, 0.75: 1, 1:0.75, 0.5:1 和1:0.5。力控制测试协议的每个小节都在10个装载/卸载周期内执行。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 二尖瓣和三尖瓣小叶的位移控制双轴检测程序示意图.测试协议包括: (a) 与峰值膜张力相关的双轴位移, (b) x 方向的纯剪切, (c) x 方向的约束单轴位移; (d) x方向的纯剪切Y 方向和 (e) 在 y 方向上约束单轴位移。位移控制测试协议的每个小节都在10个装载/卸载周期内执行。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: 有效检测区域为 7.5 mm x 7.5 mm 的二尖瓣前传单的应力松弛测试参数示例.测试设置了应力松弛测试的参数, 二尖瓣前传单, 其中目标位移是该组织特有的峰值组织变形。请点击这里查看此图的较大版本.
图 9: 用于检测二尖瓣和三尖瓣小叶的15分钟应力松弛测试程序示意图.测试协议涉及将与峰值膜张力相关的双轴位移保持 15分钟, 之后组织返回到安装配置。请点击这里查看此图的较大版本.
图 10: 房室性心脏瓣膜前叶的组织学数据.有代表性的组织学图像 (a) 二尖瓣前小叶和 (b) 三尖瓣后小叶。两者都被马松的三色染色: 蓝色的胶原蛋白, 红色的细胞质和角蛋白, 黑色的细胞核。刻度栏 = 200μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 11: 使用数据图像相关 (DIC) 技术在双轴机械测试过程中跟踪四个基准标记坐标的代表性图像.(a) 组织安装配置。(b) 预处理步骤后的配置。(c) 机械载荷作用下与组织标本有关的变形构型。请点击这里查看此图的较大版本.
图 12: 二尖瓣前传单 (mval) 的力控协议的代表性数据.代表性数据表明, 在每个组织方向的膜峰值张力的不同载荷比下, 组织在双轴载荷作用下的材料各向异性和非线性应变响应 (Tx:ty): (a) 1,(b) 0.75:1, (c)1:0.75, (d) 0.5:1 和 (e) 1:0.5。请点击这里查看此图的较大版本.
图 13: 二尖瓣前传单 (mval) 的位移控制方案的代表性数据.代表性数据表明了组织在 (a) 与峰膜张力相关的双轴位移、(b) x 方向的纯剪切 (c) 过程中的材料各向异性和非线性应变响应在 x 方向上约束单轴位移, (d) y 方向的纯剪切, (e) 在 y 方向上约束单轴位移。请点击这里查看此图的较大版本.
图 14: 来自二尖瓣和三尖瓣前瓣的应力松弛协议的代表性数据.(A) mval 和 (b) tval 的代表性数据, 说明随着时间的推移, 应力呈指数级下降。请点击这里查看此图的较大版本.
| 设置名称 | X 轴 | Y 轴 | 拉伸 (s) | 保持 (s) | 恢复 (s) | 休息 (s) | XPreload (mN) | YPreload (mN) | 代表 | 数据 (赫兹) | 图像 (Hz) | |
| 第一张图片 | 步骤 0.0 (mN) | 步骤 0.0 (mN) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0.0 (第一次) | 0.0 (第一次) | 1 | 1 | 1 | |
| 普雷定 a | 步骤f (mn) | 步骤f (mn) | t | 0 | t | 0 | 0.025 *f (第一) | 0.025 *f (第一) | 8 | 15 | 0 | |
| 先决条件 b | 步骤f (mn) | 步骤f (mn) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 2 | 15 | 15 | |
| 1: 1 | 步骤f (mn) | 步骤f (mn) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 10 | 15 | 0 | |
| 1:1B | 步骤f (mn) | 步骤f (mn) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 2 | 15 | 15 | |
| 0.75: a | 步骤 (0.75 *f) (mn) | 步骤f (mn) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 10 | 15 | 0 | |
| 0.75: 1b | 步骤 (0.75 *f) (mn) | 步骤f (mn) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 2 | 15 | 15 | |
| 1: 0.75 a | 步骤f (mn) | 步骤 (0.75 *f) (mn) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 10 | 15 | 0 | |
| 1: 0.75 b | 步骤f (mn) | 步骤 (0.75 *f) (mn) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 2 | 15 | 15 | |
| 0.5: a | 步骤 (0.5 *f) (mn) | 步骤f (mn) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 10 | 15 | 0 | |
| 0.5: 1b | 步骤 (0.5 *f) (mn) | 步骤f (mn) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 2 | 15 | 15 | |
| 1: 0.5 a | 步骤f (mn) | 步骤 (0.5 *f) (mn) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 10 | 15 | 0 | |
| 1: 0.5 b | 步骤f (mn) | 步骤 (0.5 *f) (mn) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 2 | 15 | 15 | |
表 1: 强制控制测试方案的所有协议的完整测试参数.力 (单位单位) 被写成f , 以表示与目标峰膜张力相关的力。拉伸时间写为t , 以表示被测试组织特有的拉伸时间 (以秒为单位)。
| X 轴 | Y 轴 | 拉伸 (s) | 保持 (s) | 恢复 (s) | 休息 (s) | XPreload (mN) | YPreload (mN) | 代表 | 数据 (赫兹) | 图像 (Hz) |
| 步骤 0.0 (mN) | 步骤 0.0 (mN) | 1 | 0 | 1 | 0 | 0.0 (第一次) | 0.0 (第一次) | 1 | 1 | 1 |
| 坡道dx (%) | 坡道d y (%) | t | 0 | t | 0 | 0.025 *f (第一) | 0.025 *f (第一) | 10 | 15 | 0 |
| 坡道dx (%) | 坡道d y (%) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 2 | 15 | 15 |
| 坡道 0.0 (%) | 坡道 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | 没有 | 没有 | 1 | 15 | 0 |
| 坡道dx (%) | 坡道 1/d y( %) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 10 | 15 | 0 |
| 坡道dx (%) | 坡道 1/d y( %) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 2 | 15 | 15 |
| 坡道 0.0 (%) | 坡道 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | 没有 | 没有 | 1 | 15 | 0 |
| 坡道 1/dx (%) | 坡道d y (%) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 10 | 15 | 0 |
| 坡道 1/dx (%) | 坡道d y (%) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 2 | 15 | 15 |
| 坡道 0.0 (%) | 坡道 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | 没有 | 没有 | 1 | 15 | 0 |
| 坡道dx (%) | 坡道 0.0 (%) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 10 | 15 | 0 |
| 坡道dx (%) | 坡道 0.0 (%) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 2 | 15 | 15 |
| 坡道 0.0 (%) | 坡道 0.0 (%) | 0 | 0 | 0 | 60 | 没有 | 没有 | 1 | 15 | 0 |
| 坡道 0.0 (%) | 坡道d y (%) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 10 | 15 | 0 |
| 坡道 0.0 (%) | 坡道d y (%) | t | 0 | t | 0 | 没有 | 没有 | 2 | 15 | 15 |
表 2: 位移控制测试方案的所有协议的完整测试参数.置换 (百分比) 分别写成dx和 dy, 表示 x-方向和 y 方向上的预处理后伸长率峰值。拉伸时间写为t , 以表示被测试组织特有的拉伸时间 (以秒为单位)。缩写: PS = 纯剪切;CU = 约束单轴。
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Discussion
这种双轴机械测试的关键步骤包括: (i) 传单的正确方向, (ii) 可忽略不计的剪切的适当双轴测试仪设置, 以及 (iii) 基准标记的仔细应用。传单的取向是至关重要的获得的机械表征的传单组织, 因为材料是各向异性的性质。因此, 需要知道径向和圆周方向, 以便正确地将组织标本与测试的 x-和 y 方向对齐。同样重要的是, 双轴测试仪必须正确校准, 以便将试样安装到引入可忽略不计的剪切应力的系统上。如果观察到不可忽略的剪切量, 则在随后的组织应变和应力计算中, 结果可能会出现很大偏差。需要特别注意四个基准标记的应用, 以确保没有一个标记粘附在其他标记上, 以避免不准确的组织菌株计算。关于组织应变计算, 感兴趣的读者参考了以前的研究2、23、25中详细介绍的程序。
可以对当前协议进行一些修改, 包括在测试框架中添加应变速率和蠕变测试。这些测试可以深入了解主动脉瓣 (AHV) 小叶的不同粘弹性特性, 但在以往的文献中已经证明, 在生理条件下, 心脏瓣膜小叶组织的应变率和蠕变是微不足道的工作条件。
这种方法的局限性包括在试样的平面对齐不当的情况下可能引入剪切, 如前所述, 卡住的基准标记使数据无效。这种方法的其他限制包括使用刺安装样品, 因为样品在每个边缘只控制五个点, 而不是完全夹紧以控制试样边缘。在夹紧方法上使用的方法会导致单轴测试方案的问题, 因此, 尽管连接在双轴测试系统上的细端的位移是恒定的, 但锡可能会允许小变形。然而, 这种变形从个别的时间运动可以推测可以忽略不计。
与其他方法相比, 这种方法具有显著的优势, 因为所有的测试方案 (力控、位移控制和应力松弛) 都是在一个统一的组织标本中进行的。所提供的方法的替代方案只能对每个组织执行一个测试协议, 而不是三个组合测试协议。这就意味着这些替代品在描述组织行为时可能并不准确, 因为不同动物受试者的组织之间的组织特性可能会有很大的差异。
该方法可应用于房室心脏瓣膜小叶以外的其他材料。例如, 这些方法可能是有用的表征其他软组织, 或聚合物/橡胶类型的材料。所提供的方案将规定与双轴测试装置兼容的任何此类材料的完整特性, 但必须有适当的设置, 例如适当的称重传感器容量和试样尺寸。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国心脏协会科学家发展补助金16SDG27760143 的支持。作者还想感谢俄克拉荷马大学本科生研究办公室的指导研究奖学金, 感谢他们支持科尔顿罗斯和德文劳伦斯。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin Solution, Neutral Bufffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 40X-2500X LED Lab Trinocular Compound Microscope | AmScope | SKU: T120C | |
| BioTester - Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5N Load Cell Capacity | |
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2018b | |
| Phosphate-Buffered Saline | n/a | Recipe for 1L 1X PBS Solution: 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | Razord blades for tissue retrieval and preparation procedures |
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