Medicine

分离脂肪衍生的再生细胞用于治疗根治性前列腺切除术后的勃起功能障碍

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/59183

Sabrina T. Hansen^1,2, Charlotte H. Jensen^2,3,4, Jens A. Sørensen^2,4,5, Søren P. Sheikh^2,3,4, Lars Lund^1,2,4

¹Department of Urology, Odense University Hospital, ²Clinical Institute, University of Southern Denmark, ³Laboratory of Molecular and Cellular Cardiology, Department of Clinical Biochemistry and Pharmacology, Odense University Hospital, ⁴Center for Vascular Regeneration, Odense University Hospital, ⁵Research Unit for Plastic Surgery, Odense University Hospital

Summary

准确披露方法和方案对于大规模采用干细胞疗法至关重要。在这里，我们提出了一种分离脂肪来源的再生细胞的方案，用于根治性前列腺切除术（RP）后的单次海绵体内注射作为勃起功能障碍（ED）的治疗。

Abstract

干细胞被用于再生医学的许多研究领域，部分原因是这些治疗方法可以是治愈性的，而不是有症状的。干细胞可以从不同的组织获得，并且已经描述了几种分离方法。所提出的用于分离脂肪来源的再生细胞（ADRCs）的方法可以在许多治疗领域中使用，因为该方法是一种通用程序，因此不限于勃起功能障碍（ED）治疗。ED是根治性前列腺切除术（RP）的常见和严重的副作用，因为ED通常不能用常规治疗得到很好的治疗。使用ADRC作为ED的治疗方法引起了极大的兴趣，因为在将细胞单次注射到海绵体后，最初的阳性结果。用于分离ADRC的方法是一个简单的自动化过程，具有可重复性并确保均匀的产品。此外，由于整个过程在封闭系统中进行，因此确保了分离产物的无菌性。重要的是要最大限度地降低污染和感染的风险，因为干细胞用于人类注射。整个过程可以在2.5-3.5小时内完成，并且不需要分类实验室，这消除了将组织运送到异地的需要。然而，该程序有一些局限性，因为隔离装置起作用的排出脂质吸液的最小量为100g。

Introduction

干细胞具有分化成不同细胞类型的能力，并且它们分泌被认为可以促进受损组织中愈合过程的旁分泌因子¹^，²^，³^，⁴。因此，它们在再生医学领域具有吸引力，因为它们可以代表一种可能的治疗。

根治性前列腺切除术（RP）是低/中风险局限性前列腺癌患者的最佳治愈性治疗方法，预期寿命>10年。手术的目的是根除癌症，但它有几个副作用。前列腺切除术后尿失禁的患病率为2-60%，20-90%的患者出现勃起功能障碍（ED）⁵。神经保留技术是某些患者的一种选择（格里森评分 < 7，包膜外疾病风险低）⁵。这种技术可以避免负责勃起的神经，但即使这是可能的，许多患者仍然在术后报告ED。

RP 后康复的治疗选择主要包括 PDE - 5 抑制剂治疗，注射或滴注治疗以及真空泵。用于康复的药物在药理学上有所不同，但它们的作用机制包括松弛海绵体中的平滑肌细胞。然而，许多患者经历治疗失败，从未达到 ^使6 的药物的效果。

RP之后发生的ED被认为是由于结构上不可逆的变化⁷。这些变化发生在海绵组织中，包括平滑肌和内皮细胞的凋亡和纤维化。负责勃起中心部分的静脉闭塞机制受到这些变化的损害，导致的填充和硬度较差 ⁷ 。

许多患者报告说，他们所经历的ED对他们的生活质量有负面影响⁸。他们还没有准备好在手术后放弃性活动，因此，当其他可用的康复治疗失败时， ED 的治愈性治疗是有吸引力的。

在以前的试验中，包括对人类的动物和小型1期试验，干细胞作为ED 2，⁹，^10，11^，¹²的替代治疗方法显示出有希望的结果。结果表明，使用ADRC是安全的，并且在单次注射到海绵体2^，⁹，^10，11，¹²后勃起功能显着改善。脂肪来源的再生细胞（ADRCs）被认为通过释放多种激素，神经营养因子和其他生长因子，细胞因子以及可能的微RNA来支持旁分泌机制的组织再生¹³。此外，ADRCs能够分化成几种成熟的细胞类型，包括内皮和血管肌肉细胞、软骨细胞、骨细胞和神经元¹⁴^，¹⁵。这些特性使干细胞对开发ED的永久性新疗法很感兴趣。

干细胞分为几组，基本上是来自早期胚胎（胚胎干细胞）的干细胞和来自成体组织（成体干细胞）的干细胞。成体干细胞包括多能的间充质干细胞（MSC），可以在骨髓，脂肪组织，脐带血，胎盘和牙髓^中找到17。

来自脂肪组织的干细胞很容易获得，这与来自骨髓的干细胞不同。与抽脂相比，从骨髓中采集干细胞是一个危险而痛苦的过程。可以从骨髓中收获的细胞数量将受到限制，而只有患者的脂肪组织库才设定了可以收获的细胞数量的限制。因此，可以从脂肪组织中分离出大量的干细胞，而无需随后培养细胞以获得令人满意的量。脂肪来源的再生细胞，通常也称为基质血管部分（SFV），由许多细胞类型组成，包括MSCs，内皮细胞，周细胞，免疫细胞和祖细胞¹⁸。这些都可能在再生过程中发挥作用。

本研究的目的是通过使用注射到海绵体后从新鲜收获的脂肪组织中分离的4 mL自体ADRC来研究干细胞对RP后ED的影响。

Protocol

协议中描述的所有方法均已获得丹麦国家伦理委员会（No. 37054），丹麦卫生和药物管理局（EUDRA-CT编号2013-004220-11）和丹麦数据保护局（2008-58-0035）的批准。该研究在 ClinicalTrials.gov（NCT02240823）注册。该研究是根据欧登塞大学医院良好临床实践（GCP）部门监测的赫尔辛基宣言进行的。ADRC制剂在欧登塞大学医院（丹麦卫生和药品管理局，授权号29035）的授权组织机构中进行，用于处理人体组织和细胞。

1. 招募患者/参与者

为了参与试验，招募符合以下纳入标准的患者。
1. 招募 18 岁以上、RP 前性活跃且未感染性传播疾病（例如人类免疫缺陷病毒感染、梅毒或肝炎）的患者。
2. 确保他们在由于前列腺癌而进行的RP后患有勃起功能障碍。
  注意：在这项研究中，患者在RP后5-18个月被纳入研究，并且无论手术方法如何：开放/机器人辅助或神经分离/非神经分离，都被纳入。
3. 确保前列腺特异性抗原（PSA）的值在RP后的临床随访中必须检测不到。
4. 确保患者在 RP 之前具有性活跃性，并且在 RP 之后仍表示希望保持性活跃。确保在参与之前已尝试使用磷酸二酯酶 5 型抑制剂（PDE5 抑制剂）或前列腺素 E1 （PGE1）合成类似物进行药物干预，并认为该干预不足。
5. 此外，确保患者腹部或大腿上有足够的皮下脂肪。
如果患者在 RP 期间麻醉下发生严重事件或接受抗凝剂治疗，则将患者排除在试验之外。

2. 抽脂

注意：抽脂是一种从皮下区域去除脂肪或脂肪细胞的手术。该方案的这一部分作为标准抽脂术进行，并且该过程在手术室的无菌条件下进行。根据手术使用的所有器械必须是无菌的，外科医生必须戴磨砂膏，无菌手术服，无菌手套，外科口罩和帽子。

麻醉患者。
1. 确保患者在手术过程中处于全身麻醉状态，并且该部分由麻醉师进行。
2. 用氯己定0.5%消毒腹部和阴囊的皮肤（氯己定精神，96%乙醇药用氯己定二葡萄糖酸盐77%W / W = 83%v / v）。使用手术标记来绘制腹部将要进行抽脂的区域。该区域通常是联合和脐带之间的区域。
用手术刀在腹部皮肤上做两个6毫米宽的切口（数字11）。从抽脂的上抽屉区域对称和横向放置切口。
1. 在切口上放一点凡士林等润滑剂，以确保在抽脂过程中渗透套管容易地滑入和滑出切口。
通过皮肤的切口引入14 G尺寸的浸润套管。将改良的Kleins溶液皮下注射在与皮肤表面平行的标记区域。注入如此多的溶液，使目标组织变得肿胀和坚硬，或肿胀。
注意：改良的Kleins溶液由1，000 mL林格斯乳酸盐和1mg肾上腺素（肾上腺素（1：1，000，000））的溶液组成。不要对溶液进行局部麻醉，因为它可能对ADRC产生负面影响。
1. 注入一定体积的改性Kleins溶液，其对应于与脂肪组织的比例为1：1。
2. 等待10分钟，以最大限度地发挥肾上腺素的作用，并减少收获的脂肪组织中的血液量。
使用喷射输液抽脂术进行标准抽脂，以收获200-300 mL脂肪组织。使用中空的钝插管，输液管和喷嘴集成在其上。将套管连接到抽吸装置上进行抽脂。
注意：连续的扇形水输注将脂肪组织松动成碎片，这些碎片可以通过套管的开口轻松吸出。
1. 引入一个3毫米注射器，通过腹部切口钝尖
将脂肪组织收集在脂肪收集器中，以在无菌环境中保存脂肪吸汗物。脂肪代汗液将开始与水相分离。
使用50 mL无菌注射器从脂肪收集器中吸出脂肪吸汗。
1. 尽量减少注射器中吸入的水的体积，并拧上注射器尖端的塞子以保持脂肪组织无菌。
将尖端向下的注射器放在无菌塑料袋中，开始将脂肪吸汗物与水相分离。将袋子放入无菌容器中，尖端朝下以继续分离。
1. 用无菌垂坠覆盖容器，以确保运输过程中的无菌环境。
  注意：根据用于隔离的机器的用户手册，脂质吸汗物在分离ADRC之前最多可以储存4小时，但是，我们总是立即处理它。
用外科医生首选的缝合材料关闭皮肤切口。在腹部周围放置一件压缩衣，腹部粘合剂，以减少术后水肿。
通过注射 20mL 布比卡因 5mg / mL 含有5μg肾上腺素来制造阻滞。
1. 使用20 mL注射器，用23 G针头涂抹，1 1/4英寸长。
2. 在皮下皮的每个象限上应用5mL布比卡因。
3. 将布比卡因注射到两个部位，一个位于腹侧，另一个位于背部。将针头的整个长度引入皮下组织中，将针头横向指向右侧，并在针头缩回时注射麻醉剂。重复注射，将针头指向左侧。
  注意：患者现在可以由麻醉师从全身麻醉中唤醒。

3. 隔离

注：ADRC的隔离过程按照设备后用户手册中的详细描述执行（参见 材料表）。重要的是，该程序在无菌条件下进行，以确保脂质吸汗物在ADRC纯化过程中不会暴露于任何污染物中。分离ADRC所需的时间取决于脂质吸汗物的体积，但使用半自动装置的整个过程大约需要2.5小时，如此处所述。

将所有耗材和酶无菌地放在用无菌一次性手术巾覆盖的桌子上。
注意：手术包包含从一名患者中分离ADRC所需的所有必要耗材和酶。除此之外，还必须提供三个37-39°C，一升的乳酸林格氏剂输液袋以及无菌衣物，手套和毛巾以及乙醇进行消毒。记下所有批次的耗材和酶，以及连接到系统时乳酸林格氏菌的温度。
1. 用乙醇擦拭设备，并按照制造商的说明进行操作
2. 将耗材套装装载到设备上，并将一袋乳酸振铃器连接到系统。
3. 在添加脂质吸汗物之前，执行一系列半自动测试（系统检查和泄漏测试）。
让脂质吸气剂静置在50 mL管中，同时执行3.1中的步骤。这将使脂肪从液相中分离出来。记下脂肪组织的总量（以mL为单位），并使用它来确保负载脂肪的量在设备容量的范围内。
在设备提示时加载组织。现在，该机器将排出多余的液体，并在用乳酸林格清洗之前称重脂肪组织的量。
1. 当组织被洗涤并再次排干时，根据机器的要求，将新的输液袋与37-39°C的乳酸林格连接。
2. 在5 mL乳酸林格子中重建含有胶原酶和蛋白酶混合物的市售酶（一小瓶酶足以容纳高达270 mL的脂肪量）。
3. 确保设备显示与脂肪组织一起注射到罐中的酶的量（基于组织重量）。注射后，在搅拌下进行的酶消化将持续约20分钟。
组织消化后，让搅拌器停止并检查内容物是否分为两个阶段：含有上脂质的黄色相和含有ADRC的下部粉红色层。让后一层排出到耗材组的细胞处理室（进入设备内置离心机）中，同时留下脂质层。
在多轮离心过程中，让ADRC浓缩在细胞处理室中。现在加入10毫升内压酶（含有DNA酶，有助于避免在最终的ADRC悬浮液中结块）在乳酸林格子中重组。酶促反应持续10分钟，然后洗涤ADRC。
注意：此步骤是全自动的，当该过程完成时，机器将通知。
当ADRC的分离完成后，将细胞重悬于5mL林格乳酸盐中。将溶液吸入5 mL注射器中。
将 3 通旋塞阀雌性 Luer-lock 安装在装有 ADC 的 5 mL 注射器上，并将 4 mL ADRC 吸入另一个 5 mL 无菌注射器中。
将最后 1 mL 转移到 1 mL 注射器中。使用此 1 mL 进行 ADRC 表征，例如细胞计数、细胞活力、流式细胞术分析表面标志物和 ADRC 分化能力。
在装有4 mL ADRC的5 mL注射器上放上25 G针头，然后将其包装在无菌悬垂物中。使用 ADRC 注入接收方。在这种情况下，ADRCs的溶液平均将包含840-3270万个细胞。

4. 将ADRC植入海绵体

注意：这是一个无菌程序。所有器械必须无菌，将含有干细胞的溶液注入海绵体的人必须戴无菌手套。患者在此过程期间处于清醒状态，并将接受自己的干细胞。注射ADRC时，在注射前不计数细胞。

通过轻轻倾斜注射器直到将其注入海绵体，保持ADRC溶液均匀。
在阴茎上放置一个光圈。使用硅胶血管环在阴茎根部放置止血带。拧紧环并用镊子弯曲的镊子固定。使止血带足够紧，以阻止血液从阴茎流出。
使用两个消毒交换剂在注射部位（海绵体的外侧部位）消毒皮肤。将1mL含有ADRC的溶液以直接角度注入右侧两个不同位置的海绵体中，然后在左侧海绵体中重复此步骤。注射的ADRC的总体积为4 mL。
等待30分钟，然后取下止血带。
注射ADRC后观察2小时后出院，以确保患者在麻醉后恢复良好。

5. 术后护理

建议患者在第一周内不要做任何可以升高血压的身体表现，以防止血肿的发展。
建议患者在手术后的前14天佩戴腹部粘合剂24小时，此后在白天佩戴14天。
使用口服对乙酰氨基酚（例如对乙酰氨基酚;1，000 mg，每日 4 次）和口服抗炎药（例如布洛芬;400 mg，每日 3 次）治疗术后疼痛。

Representative Results

所提出的程序已被用于开放标签的1期临床试验，包括21名患者^19名。该试验的主要终点是ADRC在人类中的安全性，次要终点是ADRC对勃起功能的影响。

该试验纳入了21名男性，平均年龄为60岁（范围46-69），并且在前列腺癌引起的RP之前具有正常的勃起和活跃的性生活。他们在 RP 后都患有 ED ，没有从可用于康复的药物中恢复的迹象。六名男子患有尿失禁，这是RP的副作用。所有男性均接受一次海绵体内注射ADRC的分离方法。

所有21名男子在注射后1，3，6和12个月在门诊就诊进行了4次随访。使用经过验证的问卷评估性功能 - 勃起功能国际指数-5（IIEF-5）和勃起硬度评分（EHS）（作为附录附上）。

在观察期间没有发生任何严重事件。八名男子报告注射部位出现短暂的发红和肿胀，三名男性报告区域出现反应。报告了八个与抽脂相关的经历可逆的轻微事件，如轻微的腹部不适和轻微的腹部血肿。在 1 个月的随访中，没有患者报告不适。在大陆组中，十五分之八（ 53% ）报告勃起功能足以在 12 个月时进行。6名失禁男性组没有显示出勃起功能的任何改善。

	大陆	失禁
纳入的患者	15	6
显著效果	8	0

表1：该表显示了大陆和失禁患者之间治疗效果显着的差异。

Discussion

所提出的分离ADRC的程序不仅限于用于ED治疗，而且可用于多种其他形式的治疗和实验。我们的试验表明，自体、新鲜分离的ADRC可以安全使用，并且在12个月的随访中治疗是可以耐受的。

在使用该过程之前，需要考虑一些因素。该手术的缺点是患者在抽脂期间必须处于全身麻醉状态。抽脂可以在局部麻醉下进行，但先前的一项试验表明，局部麻醉剂和肾上腺素的组合可能对成纤维细胞的细胞生长产生负面影响²⁰。全身麻醉的风险通常较低，但仍可见阴性结果。在选择患者进行治疗时，必须牢记这种风险。抽脂是一种外科手术，因此总是有并发症的风险。与所有其他外科手术一样，存在术后出血的风险，导致血肿的形成和感染的风险。我们的一些患者也确实报告了腹部皮肤的短暂敏感性降低。抽脂术的直接并发症是出血。众所周知，当大量组织被切除时，患者有患全身并发症的风险。该手术中的抽脂相对较小，因此不被视为危险因素。

据报道，细胞注射的并发症为一过性发红、压痛和血肿。

之所以选择用于隔离ADRC的器件，是因为该系统已通过CE认证。在丹麦，必须使用CE批准的设备，因为当局将干细胞治疗归类为药物测试试验，当ADRC用于人体注射时。

该设备确实具有诸如整个过程标准化并在封闭的无菌环境中执行而无需高度分类的实验室等优点。因此，污染风险得以降低。这确保了程序是统一和可重复的，并且最终产品的质量每次都始终相同（但是，这也取决于输入组织的质量）。在设备上执行隔离很容易，不需要经过专门培训的操作员。

该设备的一个限制是机器的最小输入是100克排空的脂肪吸气。根据我们的经验，由于抽脂在细胞处理开始之前完全完成（在我们的例子中，在不同的位置，而不是在OR中），这将需要使用50 mL注射器的粗略测量，脂质吸汗物的量至少为125 mL。否则，存在没有足够的材料供机器使用的风险。此外，使用上限（最大输入为425 mL）将导致非常长的隔离过程。

来自脂肪组织和骨髓的成体干细胞似乎具有自我更新和分化的能力，就像胚胎干细胞一样。与造血干细胞相比，ADRCs的优势之一是每组织体积的产量比骨髓^{21，22高100-500}^倍，因此不需要培养ADRC。此外，从患者身上采集造血干细胞比脂肪组织更困难、更痛苦。在许多情况下，脂肪组织只是手术后的废物。培养干细胞以提供适合血管生成的更高产量是可能的，但是新鲜分离的ADRC可能比培养的²³具有更高的血管生成潜力。

Disclosures

作者Søren P. Sheikh是丹麦哥本哈根Blue Cell Therapeutics的首席执行官。

Acknowledgments

这项工作由欧登塞大学医院（11/31936），丹麦再生医学中心（14/50427）和丹麦癌症协会创立。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liposuction
Abdominal Binder	Dale		Size depent of the patient
Adhessive OP-towel	Mölnlycke Health Care	906677	90x75 cm
Adrenalin 1 mg/ml	Amgros I/s	74 44 23	1 ml
Basic OP supplies	Mölnlycke Health Care	97010873-07
Carbon Steel blade 11	Swann-Morton
Chlorhixidine Ethanol	Faarborg Pharma	5% colored
Disposable set Lipocollector 3	Human Med	670200
Extension hoses	Extrudan		5.8/8.3 mm, Ch 25, 3,5 M long
Gaze Rags	Barrier	175201	30x45 cm
Jelonet	Smith and Nephew Medical Ltd	90509225	10 x 10 cm
Marcaine 5 mg/ml + Adrenaline 5 micrigram	Astra Zeneca		20 mL
Mesorb Bandage	Mölnlycke Health Care	677001	10x13 cm
Microlance	Becton Dickinson	304622	18 G + 23 G
Monocryl suture	Ethicon		04:00
Ringer-lactat	Fresinus Kabi
Sterile gloves	Gammex	330052065
Surgical Gown	Mölnlycke Health Care	690103-01
Surgical Marker	Richard-Allan
Surgical Mask	3M
Syringe	Codan Medical	6,28,402	50/60 ml cath tip
Syringe	Becton Dickinson	700016181	1 ml
WAL- Applikator for cannulae 25/30 cm	Human Med	REF 500001

Isolation of ADRC's
1 ml Syringe	Becton Dickinson	REF 303172
3 way stopcock	One Med	REF 10554-01
Adhesive OP-towel	Mölnlycke Health Care AB	REF 906677	90x75 cm
Cytori Celution 800IV device	Cytori
Desinfection swaps	Mediq Danmark	3340010
Microlance	Becton Dickinson		25G (0,5*25 mm)
Nitril Gloves	Abena		Powder free
OR drape Sheet, 2 layers	Lohmann & Rauscher	REF 33005
Ringers Lactate	Fresinus Kabi	06756 (DK)
Sterile gloves
Sterile gown
Supplemental kit for Cytori Celution 800IV devise	Cytori
Termometer	Thomas Scientific		traceable

Injection of ADRC's
Aperture drape	One Med	REF1565-01	75*90 cm
Desinfection swap	Mediq Danmark	3340010
Pean	Leibinger	32-01257
Silicone Vessel Loop	Purple Surgical	REF PS3203
Sterile gloves	Sempermed		Or Use your favorite