Summary
نقدم هنا، تعزيز خميرة مختلطة واحدة فحص بروتوكول لتحديد عوامل النسخ (TFs) التي يمكن أن تربط إلى منطقة الحامض النووي البشري من الفائدة. هذا الأسلوب يستخدم خط أنابيب فرز الفائق الذي يمكن استجواب الربط > TFs 1,000 في تجربة واحدة.
Abstract
تحديد مجموعات عوامل النسخ (TFs) التي تنظم كل الجينات البشرية هو مهمة شاقة تتطلب إدماج العديد من النهج التجريبي والحسابية. أحد هذه الأساليب هو الإنزيم (Y1H) واحد-الهجين الخميرة، في التفاعلات التي بين TFs والحمض النووي يتم اختبار المناطق في وسط نواة الخميرة استخدام الجينات مراسل. فحوصات Y1H تنطوي على عنصرين هما: 'الحمض النووي-طعم' (.على سبيل المثال، والمروجين، والقدرة على، وكواتم الصوت، إلخ) و 'TF-فريسة،' التي يمكن فحصها لتنشيط الجينات مراسل. وتستند معظم البروتوكولات المنشورة لأداء شاشات Y1H تحويل مكتبات TF-فريسة أو صفائف إلى سلالات الخميرة الطعم الحامض النووي. هنا، يمكننا وصف خط أنابيب، ودعا Y1H المحسن (eY1H) فحوصات، حيث استجوبه التفاعلات الحمض النووي TF تزاوج سلالات الطعم الحامض النووي مع مجموعة أراييد من سلالات فريسة TF استخدام صفيف عالية كثافة منصة الروبوتية (HDA) أن يسمح للفحص في 1,536 تنسيق مستعمرة. وهذا يسمح بزيادة كبيرة في الإنتاجية (60 تسلسل الحمض النووي-الطعم ضد > 1,000 TFs تستغرق أسبوعين كل باحث) وإمكانية تكرار نتائج. نحن توضيح أنواع مختلفة من النتائج المتوقعة عن طريق اختبار تسلسل المروج البشرية ضد صفيف TFs البشرية 1,086، فضلا عن أمثلة للمسائل التي يمكن أن تنشأ من خلال الشاشات وكيفية استكشاف أخطاء وإصلاحها لهم.
Introduction
مشكلة مركزية في مجال الطب الحيوي هو تحديد الآليات التي تنظم كل الجينات البشرية. النسخ هو الخطوة الأولى في السيطرة على مستويات التعبير الجيني، وأنه يخضع لمجموعات من عوامل النسخ (TFs) التي تكون فريدة لكل الجينات. ونظرا لأن البشر ترميز > 1,500 TFs1،2، تحديد مجموعة كاملة من TFs التي تتحكم في التعبير عن كل الجينات لا يزال يشكل تحديا مفتوحاً.
يمكن استخدام نوعين من أساليب لخريطة التفاعلات الحمض النووي TF: أساليب محورها TF وتتمحور حول الحمض النووي3 (الشكل 1A). في أساليب محورها TF، يتم سبر TF الاهتمام لربط المجينية الحمض النووي المناطق أو تحديد خصوصيته ربط الحمض النووي. وتشمل هذه الأساليب الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) متبوعاً بالتسلسل الفائق والبروتين ملزمة [ميكروارس] سيليكس4،،من56. في أساليب تتمحور حول الحمض النووي، هو سبر تسلسل الحمض النووي من الفائدة لتحديد مجموعة TFs ربط تسلسل الحمض النووي. على أوسع نطاق تطبيق هذه الأساليب هو الخميرة مختلطة واحدة فحوصات (Y1H)، في التفاعلات التي بين TFs والحمض النووي يتم اختبار المناطق في وسط نواة الخميرة استخدام مراسل الجينات7،،من89.
فحوصات Y1H تنطوي على عنصرين هما: 'الحمض النووي-طعم' (مثلاً المروجين، والقدرة على، وكواتم الصوت، إلخ) و 'TF-فريسة،' التي يمكن فحصها لمراسل الجينات التنشيط9،10 (الشكل 1B). هو استنساخ الحمض النووي-الطعم المنبع مراسل اثنين تتكامل الجينات (لاكز و HIS3) وكل بنيات bait::reporter الحمض النووي في جينوم الخميرة لتوليد تشروماتينيزيد 'سلالات الطعم الحامض النووي'. يتم إدخال TF الفريسة، ترميز في بلازميد يعبر عن TF تنصهر إلى مجال التنشيط (AD) من الخميرة TF Gal4، في سلالة الحمض النووي-الطعم لصيد السمك للتفاعلات TF-الحمض النووي. إذا كان يربط TF-الفريسة لتسلسل الحمض النووي-الطعم، ثم الإعلان الحالي في TF-الفريسة سيؤدي إلى تفعيل كلا الجينات مراسل. نتيجة لذلك يمكن المحددة للنمو في اللوحات التي تفتقر إلى الحامض الأميني، فضلا عن التغلب على مثبط تنافسي، 3-أمينو-1,2,4-تريازولي (3-ات)، الخلايا مع تفاعل إيجابي وتصور كمستعمرات الأزرق حضور X-غال. لأن الخميرة قوية Gal4 يستخدم الإعلانية، وفحوصات Y1H يمكن الكشف عن التفاعلات التي تنطوي على تفعيل النسخي، فضلا عن ريبريسورس. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأن يتم التعبير عن TF يفترس من مروج خميرة قوية (ADH1)، ويمكن الكشف عن التفاعلات حتى بالنسبة TFs التي لديها مستويات منخفضة من التعبير الذاتية، التي تشكل تحديا للكشف عن طريق رقاقة11،12.
وتستند معظم البروتوكولات المنشورة لإجراء فحوصات Y1H إدخال سلالات الحمض النووي-الطعم الخميرة يفترس TF بتحويل مكتبات فريسة TF المجمعة متبوعاً بالتحديد ومستعمرة الانتقاء والتسلسل لتحديد TF متفاعلة فيما بينها، أو تحويل كل استنساخ8،9. هذه هي بروتوكولات تستغرق وقتاً طويلاً، مما يحد من العدد تسلسل الحمض النووي التي يمكن أن يكون اختبار كل باحث. عزز تحسن الذي حدث مؤخرا لفحوصات Y1H، تسمى Y1H (eY1H)، زاد زيادة كبيرة الإنتاجية الفحص باستخدام منصة روبوتية صفيف (HDA) كثافة عالية لرفيقه سلالات الخميرة الطعم الحامض النووي مع مجموعة من سلالات الخميرة كل التعبير عن مختلف TF-فريسة10،13 (الشكل 1). تستخدم هذه الشاشات تنسيق مستعمرة 1,536 السماح لاختبار TFs معظم البشرية في البيلوروسية استخدام لوحات ثلاثة فقط. علاوة على ذلك، ونظرا لأن اختبار الحمض النووي TF التفاعلات بطريقة عشوائية ويسمح هذا النهج بمقارنة التفاعلات بين الحمض النووي-الطعوم (مثل الخيارين فضله النوكليوتيدات واحدة) وبين TFs مختلفة أو TF متغيرات11،12 ،14.
استخدام فحوصات eY1H، نحن قد تتحدد بالإنسان أكبر و ايليجانس كاينورهابديتيس TF تتمحور حول الحمض النووي-DNA التفاعلات الشبكات إلى تاريخ. على وجه الخصوص، قمنا بتحديد 2,230 التفاعلات بين القدرة على التنمية البشرية 246 و 283 TFs12. علاوة على ذلك، لقد استخدمنا eY1H فحوصات للكشف عن تغيير الربط TF إلى 109 النوكليوتيدات واحدة فضله المتغيرات المرتبطة بالأمراض الوراثية مثل تشوه التنموية، والسرطان، والاضطرابات العصبية. في الآونة الأخيرة، كنا eY1H تحدد شبكة تتألف من 21,714 التفاعلات بين مروجي الجينات C. ايليجانس 2,576 و 366 TFs11. وكان هذه الشبكة مفيدة للكشف عن الدور الوظيفي لعشرات من TFs C. ايليجانس .
البروتوكولات لتوليد بقع الحمض النووي-الطعم وتقييم مستويات النشاط مراسل الخلفية قد ذكرت في مكان آخر من15،،من1617. وهنا يصف لنا خط أنابيب eY1H التي يمكن استخدامها لفحص أي منطقة الحمض النووي الجينوم البشري ضد مجموعة من 1,086 TFs البشرية. حالما يتم إنشاؤها من خميرة سلالة الحمض النووي-الطعم ورصدت مجموعة TF-فريسة على لوحات المقابلة، يمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في الأسبوعين الماضيين (الجدول 1). الأهم من ذلك، يمكن أن باراليليزيد البروتوكول حيث أن باحث واحد يمكن أن الشاشة 60 تسلسل الحمض النووي-الطعم في وقت واحد. وللتدليل على البروتوكول، ونحن فحص المروجين لاثنين من الجينات سيتوكين CCL15 و IL17F. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض النتائج من شاشات الفاشلة لتوضيح أنواع المشاكل التي قد تنشأ عند إجراء فحوصات eY1H وكيفية استكشاف لهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الأعمال التحضيرية
-
اتفاقية استكهولم −U −H لوحات (أطباق بيتري 150 مم)
ملاحظة: سيتم استخدام هذه اللوحات لزراعة سلالات الخميرة الطعم الحامض النووي.- حل ميكس التسرب، الخميرة قاعدة النيتروجين (YNB)، هيميسولفاتي الأدنين، وسلفات الأمونيوم في 920 مل من الماء، ودرجة الحموضة إلى 5.9 مع هيدروكسيد الصوديوم م 5 (حوالي 1 مل لتر من وسائل الإعلام؛ انظر الجدول 2 لتكوين). صب في قارورة 2 ل وإضافة شريط إثارة.
- في قارورة 2 ل ثانية، إضافة أجار إلى 950 مل من الماء (عدم إضافة شريط ضجة كما أنه سيتسبب في أجار غلى في اﻷوتوكﻻف).
- اﻷوتوكﻻف لمدة 40 دقيقة في 15 رطل/بوصة مربعة على دورة سائل.
- فورا من أجل محتويات قارورة الأولى، بما في ذلك شريط إثارة، في أجار تحتوي على قارورة. إضافة الجلوكوز، تخلط جيدا على طبق من إثارة، وبارد إلى 55 درجة مئوية في حمام مائي.
- إضافة لوسين والتربتوفان إلى وسائل الإعلام. خلط جيدا على طبق من إثارة وتصب في أطباق بيتري معقمة 150 مم (~ 80 مل في الطبق). الجافة لمدة 3 – 5 أيام في درجة حرارة الغرفة، التفاف في أكياس من البلاستيك، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
-
لوحات مستطيلة YAPD
ملاحظة: سيتم استخدام هذه اللوحات لزراعة الحشيش لسلالة الحمض النووي-الطعم والتزاوج مع مجموعة الصفيف TF.- حل مساحيق (انظر الجدول 3 للتكوين)، باستثناء أجار، في 950 مل من الماء في قارورة 2 ل وإضافة شريط إثارة.
- في قارورة 2 ل ثانية، إضافة أجار إلى 950 مل من الماء (عدم إضافة شريط ضجة كما أنه سيتسبب في أجار غلى في اﻷوتوكﻻف).
- اﻷوتوكﻻف لمدة 40 دقيقة في 15 رطل/بوصة مربعة على دورة سائل.
- فورا من أجل محتويات قارورة الأولى، بما في ذلك شريط إثارة، في أجار تحتوي على قارورة.
- إضافة الجلوكوز، المزيج جيدا على لوحة ضجة وباردة إلى 55 درجة مئوية. صب وسائط الإعلام في لوحات مستطيلة الشكل (انظر الجدول للمواد؛ ~ 70 مل للوحة الواحدة) باستخدام مضخة تمعجية (5 مل/ثانية) وأنابيب 6 مم. الجافة لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة، التفاف في أكياس من البلاستيك، وتخزينها في غرفة باردة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
ملاحظة: على الرغم من أن حجم الوسائط المقترحة 70 مل للوحة الواحدة، يمكن استخدام 50 – 80 مل كل لوح. ثلاث مسائل حاسمة للنظر عندما تكون لوحات صب 1) أن تعادل بحيث يكون لوسائط الإعلام أجار نفس سمك في جميع أنحاء اللوحة (استخدام جدول تعادل أو سطح لصب صفيحة ولا تصب في أكوام من ألواح أكثر من سبعة) ، 2) التأكد من عدم وجود فقاعات في أجار وسائل الإعلام (فقاعات ينبغي أن برزت باستخدام إبرة معقمة)، و 3) التجفيف اللوحات ليوم واحد فقط، والتفاف اللوحات في أكياس من البلاستيك لتجنب الفشل في تثبيت الخميرة.
-
−Trp اتفاقية استكهولم واتفاقية استكهولم −U −Trp لوحات مستطيلة
ملاحظة: سيتم استخدام هذه اللوحات لزراعة مجموعة الصفيف TF (Sc −Trp) وحدد الخميرة مثنوية بعد التزاوج (Sc −U −Trp).- حل ميكس التسرب، YNB، هيميسولفاتي الأدنين، وسلفات الأمونيوم في 920 مل من الماء، ودرجة الحموضة إلى 5.9 مع هيدروكسيد الصوديوم 5 متر (حوالي 1 مل لتر من وسائل الإعلام) (انظر الجدول 4 للتكوين). صب في قارورة 2 ل وإضافة شريط إثارة.
- في قارورة 2 ل ثانية، إضافة أجار إلى 950 مل من الماء (عدم إضافة شريط ضجة كما أنه سيتسبب في أجار غلى في اﻷوتوكﻻف).
- اﻷوتوكﻻف لمدة 40 دقيقة في 15 رطل/بوصة مربعة على دورة سائل.
- فورا من أجل محتويات قارورة الأولى، بما في ذلك شريط إثارة، في أجار تحتوي على قارورة. إضافة الجلوكوز، تخلط جيدا على طبق من إثارة، وبارد إلى 55 درجة مئوية.
- إضافة لوسين، الحامض الأميني واليوراسيل (تجاهل اليوراسيل لوحات −Trp −U اتفاقية استكهولم).
- خلط جيدا على طبق من إثارة وتصب في لوحات مستطيلة (~ 70 مل للوحة الواحدة) باستخدام مضخة تمعجية (5 مل/ثانية) وأنابيب 6 مم. الجاف لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة والتفاف اللوحات في أكياس من البلاستيك، وتخزينها في غرفة باردة لمدة 3 أشهر.
-
اتفاقية استكهولم −U −H −Trp + 3AT + X-غال لوحات مستطيلة
ملاحظة: ستستخدم هذه اللوحات كلوحات قراءات لفحوصات eY1H.- حل ميكس التسرب، YNB، هيميسولفاتي الأدنين، وسلفات الأمونيوم في 850 مل مياه (انظر الجدول 5 للتكوين). عدم الأس الهيدروجيني. صب في قارورة 2 ل وإضافة شريط إثارة.
- في قارورة 2 ل ثانية، إضافة أجار إلى 850 مل من الماء (عدم إضافة شريط ضجة كما أنه سيتسبب في أجار غلى في اﻷوتوكﻻف).
- اﻷوتوكﻻف لمدة 40 دقيقة في 15 رطل/بوصة مربعة على دورة سائل.
- إعداد 10 × بو الأملاح (1 لتر) عن طريق الجمع بين 900 مل من الماء و 70 غ غ2هبو4∙7H2س ز 34.5 NaH2بو4∙H2ميكس O. استخدام شريط إثارة حل المساحيق وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم م 5. إضافة الماء لكي 1 لتر والاوتوكلاف.
- إعداد الحل X-غال بإضافة 3.5 غم مسحوق X-غال إلى أنبوب بلاستيكي 50 مل تحتوي على 42.5 مل من ثنائي ميثيل ميثلامين. إضافة مسحوق X-غال إلى ثنائي ميثيل ميثلامين حل أكثر سهولة (وهذا يستغرق 30 دقيقة). يبقى الحل الأسهم في الظلام (غير شفاف 50 مل استخدام أنبوب أو غطاء في إحباط). مخزن في-20 درجة مئوية.
- فورا من أجل محتويات قارورة الأولى، بما في ذلك شريط إثارة، في أجار تحتوي على قارورة. إضافة الجلوكوز و 10 × بو الأملاح (انظر الجدول 5 للتكوين)، تخلط جيدا على طبق من إثارة، وبارد إلى 55 درجة مئوية.
- إضافة لوسين، 3AT، والعاشر--غال (انظر الجدول 5 للتكوين).
- خلط جيدا على طبق من إثارة وتصب في لوحات مستطيلة (~ 70 مل للوحة الواحدة) باستخدام مضخة تمعجية (5 مل/ثانية) وأنابيب 6 مم. الجافة لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة، التفاف في أكياس من البلاستيك، وتخزينها في غرفة باردة المشمولة في رقائق الألومنيوم (3AT والعاشر--غال وحساسة للضوء) لمدة تصل إلى شهر واحد.
2-اكتشاف مجموعة TF
-
ذوبان الجليد الصفيف فريسة TF
- ذوبان الجليد والغليسيرول الخميرة لوحات الأسهم مع الصفيف فريسة TF على الجليد.
ملاحظة: يمكن إنشاء صفائف فريسة TF ك منشور مسبقاً10،،من1213،18. - ريسوسبيند الخميرة استخدام ماصة 12-قناة حدود 1 – 3 دقيقة قبل الخطوة التالية.
- ذوبان الجليد والغليسيرول الخميرة لوحات الأسهم مع الصفيف فريسة TF على الجليد.
-
اكتشاف الخميرة في اتفاقية استكهولم −Trp لوحات مستطيلة
- في الروبوت HDA (انظر الجدول للمواد)، حدد لوحات 96 جيدا متعددة كمصدر، ولوحات أجار 96 كهدف، ومنصات دبوس طويل 96.
ملاحظة: دبوس منصات ليست قابلة لإعادة الاستخدام، ويجب أن يتم تجاهل. - حدد البرنامج تكرار العديد من جعل نسختين كل لوح 96-جيدا. عدم استخدام سلة المحذوفات، أو إعادة النظر في خيارات لتفادي التلوث مرة أخرى من الأرصدة المجمدة.
- حدد الخيار لدوامة صعودا وهبوطاً في المصدر إلى مزيج الخميرة.
- حقيبة الصفيف رصدت واحتضان أجار-الجانب حتى عند 30 درجة مئوية لمدة 2 – 3 أيام.
- في الروبوت HDA (انظر الجدول للمواد)، حدد لوحات 96 جيدا متعددة كمصدر، ولوحات أجار 96 كهدف، ومنصات دبوس طويل 96.
-
توليد 384 مستعمرة صفائف في اتفاقية استكهولم −Trp لوحات مستطيلة
- في الروبوت، حدد 96 أجار لوحات كمصدر، 384 طبق أجار كهدف، ومنصات دبوس قصيرة 96.
- حدد البرنامج الصفيف 1:4 . وبهذه الطريقة، ستدمج مستعمرة 96 أربع لوحات (تحتوي كل منها على TF مختلفة) في لوحة واحدة 384 مستعمرة. عدم استخدام سلة المحذوفات، أو إعادة النظر في خيارات لتفادي التلوث بين لوحات مختلفة.
- حقيبة اللوحات واحتضان الجانب أجار رصدت 384-مستعمرة صفيف حتى عند 30 درجة مئوية لمدة يومين.
-
إنشاء صفائف مستعمرة 1,536 في اتفاقية استكهولم −Trp لوحات مستطيلة
ملاحظة: وهذا سيؤدي إلى المصفوفات التي تحتوي على أربع مستعمرات لكل TF-فريسة.- في الروبوت، حدد 384 أجار لوحات كمصدر ولوحات 1,536 أجار كهدف 384 دبوس قصيرة منصات.
- حدد البرنامج المصدر واحد المقايسة 1:4. الهدف أن انسخ كل مستعمرة من المستعمرات الأربع للحصول على كوادروبليكاتيس. استخدام سلة المحذوفات وإعادة النظر في خيارات كما أنها تنطوي على نسخ أربع مرات كل مستعمرة.
- حقيبة اللوحات واحتضان الجانب أجار رصدت 1536-مستعمرة صفيف حتى عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
-
تضخيم الصفيف مستعمرة 1,536 في اتفاقية استكهولم −Trp لوحات مستطيلة
- في الروبوت، حدد 1,536 أجار لوحات كمصدر، ولوحات أجار 1,536 كهدف، ومنصات دبوس قصيرة 1,536.
- حدد البرنامج العديد من إجراء نسخ متماثل لتكرار نسخ 3 – 4. استخدام سلة المحذوفات وإعادة النظر في الخيار، ولكن التخلص من لوحة المفاتيح عند التبديل إلى لوحة مختلفة في الصفيف لتجنب التلوث المتبادل.
- حقيبة اللوحات واحتضان الجانب أجار رصدت 1536-مستعمرة صفيف حتى عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام لاستخدام للتزاوج الخطوات (انظر أدناه). وبعد ذلك، تبقى اللوحات في درجة حرارة الغرفة ونسخة مرة أخرى بعد 7 أيام لإجراء جولة جديدة من الفحص.
3-eY1H الشاشة
-
إعداد الطعم الحامض النووي سلالة المروج للتزاوج
- بقعة الخميرة سلالات الطعم الحامض النووي على طبق −H −U اتفاقية استكهولم وتنمو لمدة 3 أيام في 30 درجة مئوية.
- متتالية الخميرة في 15 سم −U Sc −H لوحة استخدام مسواك عقيمة، حيث يناسب كل لوحة سلالات مختلفة 12 – 16. احتضان يوم واحد في 30 درجة مئوية.
- متتالية الخميرة في 15 سم −U Sc −H لوحة استخدام مسواك عقيمة، حيث يناسب كل لوح 4 سلالات مختلفة. احتضان لمدة يوم واحد في 30 درجة مئوية.
- تتخلص من الخميرة استخدام مسواك عقيمة، مع التأكد من عدم كشط أي أجار، وإضافة إلى أنبوب 1.5 مع 500 ميليلتر من الماء المعقم.
- إضافة 10 – 15 حبات زجاجية معقمة على صفيحة مستطيلة YAPD. أضف تعليق الخميرة على اللوحة ويهز جيدا في جميع الاتجاهات لمدة 1 دقيقة لضمان الخميرة وينتشر من خلال كل لوحة.
- عكس اللوحة فورا والاستفادة من ذلك الخرز الذهاب إلى الغطاء. إزالة وإعادة تدوير الخرز.
- حقيبة اللوحات واحتضان أجار-الجانب الأسفل لمدة 1 – 2 في 30 درجة مئوية. ثم انتقل إلى الخطوة التزاوج.
-
التزاوج من الخميرة الحمض النووي-الطعم وسلالات الصفيف TF
- نقل الصفيف TF إلى صفيحة مستطيلة YAPD مع الروبوت. حدد لوحة أجار 1,536 كالمصدر والهدف، ومن لوحة دبوس قصيرة 1,536. حدد البرنامج العديد من النسخ المتماثل . يمكن استخدام كل لوحة الصفيف TF نقل إلى 3 – 4 لوحات YAPD (اعتماداً على عدد اللوحات في الصفيف). لوحات الصفيف TF المستخدمة للتزاوج يجب أن يكون 2-3 أيام ولكن ليس أكثر كالتزاوج قد تكون غير فعالة.
- نقل العشب من سلالة الطعم الحامض النووي إلى لوحات YAPD الفعل الذي يحتوي على صفيف TF مع الروبوت. حدد لوحة أجار 1,536 كالمصدر والهدف، ومن لوحة دبوس قصيرة 1,536. حدد البرنامج العديد من النسخ المتماثل . تستخدم إزاحة عشوائية في المصدر مع دائرة نصف قطرها مم ~0.6 لتجنب أخذ الخميرة من نفس المكان، وخلط في الهدف لتسهيل الاتصال بين سلالات الخميرة. استخدام العشب تحتوي على سلالات الطعم الحمض النووي (قسم 3.1) كمصدر، ولوحات YAPD الذي يحتوي على صفيف TF رصدت في خطوة 3.2.1 كهدف.
- حقيبة اللوحات واحتضان أجار-الجانب حتى عند 30 درجة مئوية لمدة يوم واحد.
-
اختيار الخميرة مثنوية
- نقل الخميرة تفعيل من لوحات YAPD إلى لوحات −Trp −U اتفاقية استكهولم مع الروبوت. حدد لوحة أجار 1,536 كالمصدر والهدف، ومن لوحة دبوس قصيرة 1,536. حدد البرنامج النسخ المتماثل . مزيج في المصدر والهدف.
- حقيبة اللوحات واحتضان أجار-الجانب حتى عند 30 درجة مئوية لمدة 2 – 3 أيام (حضانة أطول يؤدي إلى نشاط مراسل خلفية عالية).
-
نقل إلى لوحات قراءات
- نقل الخميرة مثنوية من لوحات −Trp −U اتفاقية استكهولم إلى قراءات لوحات مستطيلة Sc −U −H −Trp + 5 مم 3AT 0.4 مم X-غال استخدام الروبوت. حدد لوحات أجار 1,536 كالمصدر والهدف، ومن لوحة دبوس قصيرة 1,536. حدد البرنامج النسخ المتماثل .
- حقيبة اللوحات واحتضان أجار-الجانب حتى عند 30 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.
-
تصوير لوحات قراءات
- لسلالات الطعم الحامض النووي مع خلفية عالية النشاط الصحافي، التقاط صور في أيام 2 و 3 و 4. وبخلاف ذلك، التقاط صور في أيام 4 و 7. التفاعلات الإيجابية هي المحددة باللون الأزرق ونمو المستعمرات الخميرة ويمكن تحديد يدوياً، أو يمكن تحديده باستخدام برمجيات تحليل الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ينبغي النظر في العوامل الرئيسية الثلاثة عند تحليل النتائج من فحوصات eY1H: النشاط مراسل الخلفية من سلالة الطعم الحامض النووي، وقوام النشاط مراسل المقابلة للتفاعلات TF-الحمض النووي، وعدد المستعمرات الإيجابية. النشاط مراسل الخلفية (أي، أوتواكتيفيتي) من سلالة الطعم الحامض النووي تشير إلى النمو ولون المستعمرات الخميرة في لوحة قراءات، حتى في غياب TF-فريسة عموما. ومن الناحية المثالية، تظهر سلالات غير أوتواكتيفي خلفية بيضاء أو فاتحة لون بني، مع المستعمرات للتفاعلات الإيجابية يجري أكبر والأزرق. وتظهر سلالات أوتواكتيفي الحمض النووي-الطعم نمو الخميرة في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الحامض الأميني ولون أزرق حضور X-غال لجميع المستعمرات في اللوحة، الذي يرجح أن يتصل بالربط من الخميرة المنشط النسخي ل الحمض النووي-الطعم8. تعتمد قوة النشاط مراسل المقابلة للكشف عن التفاعلات TF-الحمض النووي (أي، حجم المستعمرة) وكثافة اللون الأزرق على معلمات كثيرة مثل التقارب، مستوى التعبير TF في الخميرة، وعدد المواقع والمسافة إلى ملزمة الخميرة المروجين الحد الأدنى يقع المنبع للجينات مراسل، ونشاط مراسل الخلفية من سلالة الطعم الحامض النووي. على سبيل المثال، تفاعل الضعيف قد يمكن اكتشافها بسهولة في طعم خلفية منخفضة لكن قد يكون من الصعب على الكشف في أوتواكتيفي أو الطعم الخلفية غير متكافئ. كما أنها هامة ملاحظة أن نشاط مراسل مستويات في الخميرة بالضرورة ترتبط بالنشاط التنظيمي في الخلايا البشرية، كهيكل الكروماتين، نوكليوسومي لتحديد المواقع، وتختلف آثار المسافة بين الخميرة والبشر. علاوة على ذلك، من المرجح أن يتأثر بربط TFs والعوامل المساعدة الأخرى التفاعلات في الإنسان أو قد يخفيها وظيفيا زائدة TFs8. وأخيراً، تعتبر التفاعلات إيجابية في فحوصات eY1H عندما اثنين على الأقل من المستعمرات الأربع إظهار التعبير مراسل فوق مستويات الخلفية. ومع ذلك، لاحظنا أن ~ 90% تفاعلات المحددة نتيجة من جميع المستعمرات الأربعة تناظر TF يجري الإيجابية10،،من1219.
لتوضيح نوع النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام فحوصات eY1H نحن فحص مناطق المروج (2 كيلو بايت المنبع من المواقع بدء النسخ) الجينات CCL15 و IL17F، ضد مجموعة TFs البشرية 1,086 (الشكل 2). مروج CCL15 مثال للحمض النووي غير أوتواكتيفي-الطعم حيث التفاعلات، حتى الضعيفة منها، يمكن بسهولة الكشف عن (الشكل 2A). مروج IL17F مثال أوتواكتيفي الطعم الحامض النووي مع نشاط مراسل الخلفية غير متساو، حيث يمكن اكتشاف بعض التفاعلات بينما ل TFs عدة من غير المؤكد ما إذا كان النشاط الصحافي الذي أعلى من الخلفية (الشكل 2).
المشاكل التي يمكن مواجهتها عند إجراء فحوصات eY1H
على الرغم من أن الفحص بروتوكول eY1H مباشرة إلى الأمام، وقوية، يمكن أن تواجه مشاكل عدة خلال الشاشة:
1) مستعمرات صغيرة جداً وتعجز عن نقل (الشكل 3A): على الرغم من أنه من المتوقع أن الخميرة بعض الإعراب عن TFs خارجية قد تعرض النمو البطيء نظراً لأن قد يكون التعبير الجيني الخميرة dysregulated، ~ 95% مستعمرات TF-فريسة عادة عرض عادي النمو. إذا كان أكثر من 10% مستعمرات تفشل في النمو، أكثر الأسباب شيوعاً هي المشاكل مع وسائل الإعلام أو مع نقل الخميرة. وكثيراً ما يرتبط النمو الأمثل بأحد مكونات وسائط فقدان النشاط (مثلاً، اليوراسيل الحامض الأميني أو لوسين)، التي يمكن حلها بواسطة إعداد وسائط جديدة مع حلول الأسهم جديدة. بدلاً من ذلك، وهذا أيضا قد تكون متعلقة إزاحة تثبيت الذي يؤثر على نقل مستعمرة. وفي هذه الحالة، تحقق من أن منصات 1,536 دبوس مركز المستعمرات الخميرة في لوحات المصدر.
2) أي نمو الخميرة في جزء من اللوحة (الشكل 3B): هي عموما وتتصل هذه المسألة مع فشل في الخطوة التزاوج إذا فشل لوحة 1,536 pin لجعل الاتصال مع الخميرة في الحديقة سلالة الطعم الحامض النووي، الصفيف TF، أو في لوحة التزاوج. في كل حالة تقريبا، وهذا هو سبب أجار تفاوت مستوى وسائل الإعلام خلال لوحة صب أو بسبب الإفراط تجفيف اللوحة.
3) أي تفاعلات الكشف عن (الشكل 3 و دال): غالباً ما يرتبط هذه المسألة أما الطفرات إيناكتيفاتينج غير مقصودة في الجينات مراسل في لاكز خاصة (الشكل 3)، أو إلى أوتواكتيفيتي العالية التي تحجب التفاعلات (الشكل 3D)-لاستكشاف هذه المشكلة وإصلاحها، من المستحسن أن الشاشة السلالة التي تم الحصول عليها بشكل مستقل آخر المقابلة لنفس الحمض النووي-الطعم.
4) اللوحة يعرض بقع زرقاء عشوائي (رقم 3E): هذه المسألة كثيرا ما تتصل بالتلوث البكتيري. لحل هذه المشكلة، متتالية الخميرة للحصول على مستعمرات فردية، وكرر الشاشة.
ما ورد أعلاه هي المشاكل الأكثر شيوعاً التي تواجه عند إجراء فحوصات eY1H. وينبغي أن تنشأ مشاكل أخرى، إعداد وسائط الإعلام الجديدة، ويؤكد أن تستخدم الإعدادات المناسبة للروبوت HDA، واختبار سلالات متعددة كل الطعم الحامض النووي من شأنه أن يحل معظم المسائل المحتمل.
الشكل 1 : مخطط تفصيلي لشاشات الإنزيم eY1H. (أ) مقارنة بين أساليب محورها TF وتتمحور حول الحمض النووي لتحديد تفاعلات البروتين-الحمض النووي. (ب) الخطط لفحوصات eY1H. تسلسل الحمض النووي للفائدة (المروج، محسن، كاتم الصوت، إلخ) المستنسخة المنبع للمراسل HIS3 ولاكز إدماج الجينات في جينوم الخميرة. هو تزاوج سلالة الطعم الحامض النووي الناتجة إلى مجموعة من سلالات الخميرة إيواء TFs تنصهر إلى مجال التنشيط Gal4 (AD). التفاعلات الإيجابية تتحدد قدرة الخميرة النمو دون الحامض الأميني والتغلب على مثبطات تنافسية، وفي 3، وتشغيل الأزرق حضور X-غال. (ج) خط أنابيب لشاشات eY1H. هو تزاوج حشيش الخميرة سلالة الحمض النووي-الطعم نمت في صفيحة YAPD في صفيحة YAPD إلى صفيف مستعمرة 1,536 الإعراب عن TFs تنصهر فيها الإعلانية نمت على لوحة −Trp اتفاقية استكهولم. بعد يوم واحد، يتم نقل الخميرة −Trp −U Sc لتحديد للخميرة مثنوية. بعد حضانة يوم 2-3، يتم نقل الخميرة Sc −U −H −Trp + 3AT + X-غال لوحة (لوحة قراءات) لتحديد التفاعلات البروتين-الحمض النووي. يتم اختبار كل تفاعل البيلوروسية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : أمثلة للوحات قراءات eY1H. (أ) التفاعلات التي تنطوي على مروج CCL15، طعم غير أوتواكتيفي. النشاط مراسل الخلفية لهذا الطعم منخفض (انخفاض النمو في الغياب من الحامض الأميني وعدم وجود اللون الأزرق لعدم التفاعل TFs). (ب) التفاعلات التي تنطوي على مروج IL17F، طعم أوتواكتيفي. النشاط مراسل الخلفية لهذا الطعم مرتفع (النمو في الغياب من الحامض الأميني وخلفية زرقاء اللون في جميع أنحاء اللوحة) وغير متساو، مما يجعل صعوبة تحديد تفاعلات البروتين-الحمض النووي. قوية، متوسطة، والتفاعلات الضعيفة هي التربيعية في الأحمر والبرتقالي، والأصفر، على التوالي. وترد أسماء حنك TFs متفاعلة فيما بينها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : مشاكل في شاشات eY1H. (A) TF-فريسة الصفيف حيث فشلت مستعمرات متعددة في النمو. (ب) قراءات لوحة حيث فشلت المستعمرات في الزاوية السفلي اليسرى لنقل. (ج) سلالة أوتواكتيفي عدم الحمض النووي-الطعم الذي لا يعرض التفاعلات الإيجابية. (د) سلالة أوتواكتيفي الطعم الحامض النووي الذي لا يعرض التفاعلات الإيجابية جداً. (ﻫ) قراءات لوحة عرض المستعمرات الزرقاء متعددة بسبب التلوث. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اكتشاف مجموعة TF | |
| 1 يوم | بقعة الخميرة في لوحة اتفاقية استكهولم – الحزب في شكل مستعمرة 96 (2، 1 و 2-2) |
| 4 يوم | إنشاء صفيف TF مستعمرة 384 (2، 3) |
| 6 يوم | إنشاء صفيف TF مستعمرة 1,536 (2.4) |
| يوم 9 | تضخيم الصفيف TF مستعمرة 1,536 (2.5) |
| إعداد الطعم الحامض النووي سلالة المروج للتزاوج | |
| 6 يوم | بقعة الخميرة سلالات الطعم الحمض النووي (3.1.1) |
| يوم 9 | الخميرة متواصلة، 12-16 سلالات كل لوح (3.1.2) |
| يوم 10 | الخميرة متواصلة، 4 سلالات كل لوح (3.1.3) |
| يوم 11 | إعداد مروج الطعم الحمض النووي (3.1.4 و 3.1.5) |
| التزاوج من الخميرة الحمض النووي-الطعم وسلالات الصفيف TF | |
| 12 يوم | التزاوج في لوحات YAPD (3.2) |
| اختيار الخميرة مثنوية | |
| يوم 13 | اختيار الخميرة مثنوية في مقرر اتفاقية استكهولم – يو – الحزب ألواح (3.3) |
| نقل إلى لوحات قراءات | |
| 15 يوم | نقل الخميرة مثنوية لقراءات لوحات (3، 4) |
| تصوير لوحات قراءات | |
| أيام 17-22 | الحصول على الصور من لوحات قراءات اعتماداً على الخلفية (3.5) |
الجدول 1: مصفوفة النموذجي.
| كاشف | الكمية (بالنسبة ل 2) |
| التسرب ميكس الاصطناعية ناقص اليوراسيل، التربتوفان والادنين، غنية، الحامض الأميني، لوسين (ز 2) ث/س النيتروجين الخميرة قاعدة | ز 2.6 |
| نيتروجين الخميرة قاعدة دون الأحماض الأمينية ودون كبريتات الأمونيوم (YNB) | ز 3.4 |
| الأدنين هيميسولفاتي ثنائي هيدرات | 160 ملغ |
| كبريتات الأمونيوم | ز 10 |
| أجار | ز 35 |
| الجلوكوز (40 ٪، w/v) في الماء، والعقيمة | 100 مل |
| لوسين (100 ملم)، العقيمة التي تمت تصفيتها | 16 مل |
| تريبتوفان (40 مم)، العقيمة التي تمت تصفيتها | 16 مل |
الجدول 2: قائمة الكاشف أنا.
| كاشف | الكمية (بالنسبة ل 2) |
| ببتون | 40 ز |
| استخراج الخميرة | ز 20 |
| الأدنين هيميسولفاتي ثنائي هيدرات | ز 0.32 |
| الجلوكوز (40 ٪، w/v) في الماء، والعقيمة | 100 مل |
| أجار | ز 35 |
الجدول 3: قائمة الكاشف الثاني-
| كاشف | الكمية (بالنسبة ل 2) |
| ميكس التسرب الاصطناعية ناقص الحامض الأميني، لوسين، التربتوفان واليوراسيل، الغنية الأدنين (ز 2) ث/س النيتروجين الخميرة قاعدة | ز 2.6 |
| نيتروجين الخميرة قاعدة دون الأحماض الأمينية ودون كبريتات الأمونيوم (YNB) | ز 3.4 |
| الأدنين هيميسولفاتي ثنائي هيدرات | 160 ملغ |
| كبريتات الأمونيوم | ز 10 |
| أجار | ز 35 |
| الجلوكوز (40 ٪، w/v) في الماء، والعقيمة | 100 مل |
| لوسين (100 ملم)، العقيمة التي تمت تصفيتها | 16 مل |
| الحامض الأميني (100 ملم)، العقيمة التي تمت تصفيتها | 16 مل |
| اليوراسيل (20 مم)، العقيمة التي تمت تصفيتها (تجاهل لمقرر اتفاقية استكهولم – U – الحزب ألواح) | 16 مل |
الجدول 4: قائمة كاشف الثالث-
| كاشف | الكمية (بالنسبة ل 2) |
| ميكس التسرب الاصطناعية ناقص الحامض الأميني، لوسين، التربتوفان واليوراسيل، الغنية الأدنين (ز 2) ث/س النيتروجين الخميرة قاعدة | ز 2.6 |
| نيتروجين الخميرة قاعدة دون الأحماض الأمينية ودون كبريتات الأمونيوم (YNB) | ز 3.4 |
| الأدنين هيميسولفاتي ثنائي هيدرات | 160 ملغ |
| كبريتات الأمونيوم | ز 10 |
| أجار | ز 35 |
| الجلوكوز (40 ٪، w/v) في الماء، والعقيمة | 100 مل |
| 10 × أملاح بو | 200 مل |
| لوسين (100 ملم)، العقيمة التي تمت تصفيتها | 16 مل |
| 3AT (م 2) والعقيمة التي تمت تصفيتها | 5 مل |
| العاشر-غال (80 ملغ/مل) في DMF | 4 مل |
الجدول 5: قائمة الكاشف الرابع-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EY1H الروبوتية التزاوج فحص النهج الموصوفة هنا إلى حد كبير يزيد من سرعة النقل لتحديد المجموعة TFs التي تربط منطقة الحمض النووي من اهتمام، مقارنة بفحص المكتبة السابقة أو الفرز صفت النهج القائمة على التحول. علاوة على ذلك، التفاعلات الحمض النووي TF الكشف عنها بواسطة eY1H فحوصات يتم استنساخه بدرجة عالية كما يتم الكشف 90% تفاعلات الإيجابية لجميع المستعمرات الأربع اختبار كل TF، وتجربتها 90% تفاعلات في على شاشة مستقلة الحمض النووي-الطعم الخميرة نفس السلالة10 , 12 , 19-والأهم، TF-الحمض النووي تفاعلات الكشف عنها بواسطة eY1H التحقق من صحة بمعدل 40%-70% عند اختباره في البشرية مراسل فحوصات12،20خلايا الإنسان الأولية (نتائج غير منشورة)، وفي الحيوانات خروج المغلوب C. ايليجانس 11-هذا معدل التحقق من صحة مماثلة للتي لوحظت بالنسبة لشرائح seq البيانات21.
على الرغم من أن التفاعلات التي حددها eY1H استنساخه بدرجة عالية عند إعادة الاختبار الخميرة نفس السلالة الطعم الحامض النووي، اختبار سلالات الخميرة مختلفة لنفس الطعم الحامض النووي في بعض الأحيان تنتج مختلفة، على الرغم من تداخل، مجموعات من التفاعلات TF-الحمض النووي. وهذا عادة بسبب الاختلافات بين السلالات في الخلفية مراسل النشاط. وبالإضافة إلى ذلك، نتائج اختبار أجزاء من تسلسل الحمض النووي في الكشف عن المزيد من التفاعلات TF-الحمض النووي من اختبار التسلسل الكامل، وبخاصة عندما يتم اختبار الأجزاء المتداخلة. وهذا قد تكون ذات صلة بالتحليل يجري أكثر كفاءة في تحديد التفاعلات التي قريبة من المروجين الحد الأدنى مراسل، ونظرا لأن الاختبار متداخلة الأجزاء يقلل من فرص موقع ربط يمكن أن تغطي من nucleosomes الخميرة. وهكذا، للمشاريع الصغيرة الحجم، ومن المستحسن أن تداخل 0.5 – 1 كيلو بايت أجزاء من منطقة تنظيمية يتم اختبارها، وأن يجري فحص اثنين من سلالات مستقلة لكل تسلسل الحمض النووي-الطعم8.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة في eY1H فحص بروتوكول لتجنب بعض المسائل المعروضة في الشكل 3. أولاً، على الرغم من أن معظم وسائل الإعلام المكونات مستقرة لعدة أشهر (باستثناء 3AT والعاشر--غال)، يشير انعدام النمو السليم مستعمرة المحتمل واحد على الأقل من المكونات قد فقدت النشاط ويجب استبداله. وثانيا، من المهم إعداد لوحات مستطيلة حتى يتم تسويته في أجار وحتى أن لم تجف لأكثر من يوم واحد لتجنب الفشل في تثبيت عند استخدام منصة الروبوتية. وأخيراً، هو المفتاح لاستخدام البرامج الروبوتية منصة كما هو مبين في البروتوكول (إعادة النظر، وإعادة تدوير، وخلط، إلخ) للخميرة ستنقل فعلياً، للتزاوج لتكون فعالة، وتجنب التلوث المتبادل بين استنساخ الخميرة.
أمثلة اخترنا لتوضيح استخدام شاشات eY1H تتوافق مع مروجي الجينات البشرية. ومع ذلك، مناطق تنظيمية أخرى يمكن أيضا اختبار بما في ذلك القدرة على وكواتم الصوت. على سبيل المثال، أننا استخدمنا فحوصات eY1H لتقييم TF ملزمة للقدرة على التنمية البشرية و introns C. ايليجانس أول12،22. وباﻹضافة إلى ذلك، ونظرا لأن التفاعلات يتم اختبارها بطريقة عشوائية، يمكن استخدام فحوصات eY1H مقارنة التفاعلات بين المتغيرات غير الترميز، وبين TF الترميز تسلسل المتغيرات. على سبيل المثال، باستخدام فحوصات eY1H وحددنا غيرت TF ملزمة للمتغيرات فضله 109 المرتبطة بالأمراض الوراثية المختلفة، وأيضا ملامح التفاعلات التفاضلية للطفرات مغلطه TF 5812،14. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز على تقييم TF ملزمة للمناطق التنظيمية البشرية، مناطق الحمض النووي من الأنواع الأخرى يمكن أيضا اختبار شريطة أن يتوفر TF-فريسة أو يمكن إنشاؤها. وفي الواقع، تم إنشاؤها صفائف TF-فريسة ايليجانس جيم-10، melanogaster المورفولوجية23، موس موسكولوس24،25، التمويل نبات26، و ميس زيا 27-وهكذا، مع الموارد المتاحة على نحو متزايد، eY1H فحوصات يمكن تطبيقها على أنظمة إضافية.
على الرغم من أن فحوصات eY1H قد ساعدت على تحديد مرجع TFs التي تربط مختلف المناطق التنظيمية في الأنواع البشرية وغيرها، فليست خالية من المحاذير8،11،،من1219 ،،من2025. واحدة من القيود هو أن يتم اختبار التفاعلات في وسط نواة الخميرة، وعلى الرغم من أن يتم تشروماتينيزيد الحمض النووي-الطعوم، هيكل الكروماتين في الخميرة قد لا تعكس هيكل الكروماتين في هذه الأنواع من حيث نشأت الحمض النووي-الطعم و وسوف لا تعكس اختلافات نوع الخلية لاحظ المجراة. وهكذا، يجب أن يمكن التحقق من صحة التفاعلات تحددها فحوصات eY1H مراسل أو الاختبارات الوظيفية الأخرى. ملاحظة ونحن وآخرون وجدوا التفاعلات الحمض النووي TF الكشف عنها بواسطة eY1H التحقق من صحة بمعدل 40 – 70% في الاختبارات الوظيفية11،12،،من2023. قيد آخر من فحوصات eY1H هو أنه لا يمكن الكشف عن التفاعلات التي تنطوي على TFs التي تتطلب تعديلات بوستترانسلاشونال غائبة في الخميرة لربط الحمض النووي و TFs التي لا يتم طيها بشكل صحيح في الخميرة عندما تنصهر فيها الإعلان TFs مفقودة من الصفيف 8-وبالإضافة إلى ذلك، في الشكل الحالي، فحوصات eY1H عدم الكشف عن التفاعلات التي تنطوي على TFs هيتيروديميريك، كما يعرب عن كل مستعمرة الخميرة في الصفيف TF TF-فريسة واحدة. وهكذا، إدخال تحسينات الفحص سوف زيادة اتساع TFs التي يمكن اختبارها وتوسيع قدرات فحوصات eY1H التعرف على التفاعلات الحمض النووي TF رواية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" [R35-GM128625 على J.I.F.B.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
| Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
| Agar High Gel Strength - Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
| Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
| D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
| Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
| edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
| Flat Toothpicks 750 ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
| Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
| Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
| L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
| Petri Dish, 150 mm x15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
| RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
| Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
| Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
| Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |
References
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
- Lambert, S. A., et al.
- Arda, H. E., Walhout, A. J.
- Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
- Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
- Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J.
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
- Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
- Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
- Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
- Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
- Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
- Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
- Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
- Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).
