Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Forbedret gær One-hybrid skærme til at identificere transskription faktor Binding til menneskelige DNA-sekvenser

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en forbedret gær one-hybrid screening protokol for at identificere de transkriptionsfaktorer (TFs), der kan bindes til en menneskelig DNA region af interesse. Denne metode bruger en høj overførselshastighed screening rørledning, der kan forhøre bindingen af > 1.000 TFs i et enkelt eksperiment.

Abstract

At identificere sæt af transkriptionsfaktorer (TFs), der regulerer hvert menneskelige gen er en skræmmende opgave, der kræver integration af talrige eksperimentelle og beregningsmæssige metoder. En sådan metode er gær one-hybrid (Y1H) assay, i hvilke interaktioner mellem TFs og DNA regioner er testet i milieu af gær kernen bruger reporter gener. Y1H assays involverer to komponenter: en 'DNA-agn' (fx., projektledere, smagsforstærkere, lyddæmpere, etc.) og 'TF-bytte,' som kan blive screenet for reporter genaktivering. Mest publicerede protokoller til at udføre Y1H skærme er baseret på omdanne TF-bytte biblioteker eller matrixer til DNA-agn gærstammer. Her, vi beskriver en rørledning, kaldet udvidet Y1H (eY1H)-undersøgelser, hvor TF-DNA interaktioner er afhørt af parring DNA-agn stammer med en klædt samling af TF-bytte stammer ved hjælp af en høj tæthed vifte (HDA) robot platform, der giver mulighed for screening i en 1,536 koloni format. Dette giver mulighed for en dramatisk stigning i overførselshastighed (60 DNA-agn sekvenser mod > 1.000 TFs tager to uger per forsker) og reproducerbarhed. Vi illustrere de forskellige typer af forventede resultater ved at teste menneskelige promotor sekvenser mod en bred vifte af 1,086 menneskelige TFs, samt eksempler på problemer, der kan opstå under skærme og fejlfinding af dem.

Introduction

Et centralt problem i den biomedicinske felt er at fastlægge de mekanismer, hvorved hver menneskeligt gen er reguleret. Transskription er det første skridt i at kontrollere gen expression niveauer, og det er reguleret af sæt af transkriptionsfaktorer (TFs), der er unikke for hvert Gen. I betragtning af at mennesker indkode > 1.500 TFs1,2, identificerer det komplette sæt af TFs, der styrer udtryk for hvert gen forbliver en åben udfordring.

To typer af metoder kan bruges til at knytte TF-DNA interaktioner: TF-centreret og DNA-centreret metoder3 (figur 1A). I TF-centreret metoder aftestede en TF af interesse for bindende genomisk DNA regioner eller til at bestemme dens DNA bindende specificitet. Disse metoder omfatter kromatin immunoprecipitation (ChIP) efterfulgt af høj overførselshastighed sekventering, protein bindende microarrays og SELEX4,5,6. I DNA-centreret metoder, er en DNA-sekvens af interesse aftestede for at bestemme sæt af TFs, der binder sig til DNA-sekvens. De mest almindeligt anvendte af sådanne metoder er gær one-hybrid (Y1H) assays, i hvilke interaktioner mellem TFs og DNA regioner er testet i milieu af gær kernen bruger reporter gener7,8,9.

Y1H assays involverer to komponenter: en 'DNA-agn' (f.eks. promotorer, smagsforstærkere, lyddæmpere, etc.) og 'TF-bytte,' som kan blive screenet for reporter gen aktivering9,10 (figur 1B). DNA-agn er klonet opstrøms af to reporter gener (LacZ og HIS3) og begge DNA-bait::reporter konstruktioner er integreret i gær genom til at generere chromatinized 'DNA-agn stammer.» TF-bytte, kodet i et plasmid, der udtrykker en TF smeltet til aktivering domæne (AD) af gær Gal4 TF, er indført i DNA-agn stammen til at fiske efter TF-DNA interaktioner. Hvis TF-bytte binder sig til DNA-agn sekvens, vil så Annoncen aktuelle i TF-bytte føre til aktivering af begge reporter gener. Celler med en positiv interaktion kan som følge heraf valgt for vækst på plader mangler histidin, samt at overvinde en kompetitiv inhibitor, 3-Amino-1,2,4-fungiciderne (3-AT), og visualiseres som blå kolonier i overværelse af X-gal. Fordi den potente gær Gal4 AD bruges, Y1H assays kan registrere interaktioner, der vedrører transcriptional aktivatorer samt repressors. Hertil kommer, at TF-byttedyr udtrykkes fra en stærk gær promotor (ADH1), kan interaktioner påvises selv for TFs, der har lav endogen udtryk niveauer, som udfordrende for at påvise ved ChIP11,12.

Mest publicerede protokoller til at udføre Y1H assays er baseret på at indføre TF-byttedyr i DNA-agn gærstammer ved at omdanne poolede TF-bytte biblioteker efterfulgt af udvælgelse, koloni picking og rækkefølge for at identificere de interagerende TF, eller ved omdanne enkelte kloner8,9. Disse er tidskrævende protokoller, begrænse antallet af DNA-sekvenser, der kan testes pr. forsker. En nylig forbedring af Y1H assays, kaldet udvidet Y1H (eY1H), steget dramatisk screening overførselshastighed ved hjælp af en høj tæthed array (HDA) robot platform for at parre gærstammer DNA-agn med en samling af gærstammer hver udtryk for en anden TF-bytte10,13 (figur 1 c). Disse skærme anvender en 1,536 koloni format gør det muligt at teste mest menneskelige TFs i fire eksemplarer ved hjælp af kun tre plader. Yderligere, at TF-DNA interaktioner er testet på en måde, parvis, denne tilgang giver mulighed for sammenligning af interaktioner mellem DNA-lokkemad (f.eks. to noncoding enkelt nucleotid varianter) og mellem forskellige TFs eller TF varianter11,12 ,14.

Bruger eY1H assays, har vi afgrænset største menneskelige og Caenorhabditis elegans DNA-centreret TF-DNA interaktioner netværk til dato. Især har vi identificeret 2,230 interaktioner mellem 246 menneskelige udviklingsmæssige smagsforstærkere og 283 TFs12. Derudover har vi ansat eY1H assays til at afdække ændrede TF binding til 109 enkelt nucleotid noncoding varianter forbundet med genetiske sygdomme som udviklingsmæssige misdannelser, kræft og neurologiske lidelser. Mere nylig, vi brugte eY1H til at afgrænse et netværk bestående af 21,714 interaktioner mellem 2,576 C. elegans gen initiativtagere og 366 TFs11. Dette netværk var medvirkende til at afdække snesevis af C. elegans TFs funktionelle rolle.

Protokoller til at generere DNA-agn pletter og vurdere niveauet af baggrunden reporter aktivitet har været rapporteret et andet sted15,16,17. Her, beskriver vi en eY1H rørledning, der kan bruges til at screene nogen humant genomisk DNA region mod en bred vifte af 1,086 menneskelige TFs. Når en gær DNA-agn stamme er genereret og en TF-bytte array er spottet på de tilsvarende plader, kan den hele protokol udføres i to uger (tabel 1). Endnu vigtigere, kan protokollen parallelized således at en enkelt forsker kan skærmen 60 DNA-agn sekvenser samtidigt. For at demonstrere protokollen, screenet vi initiativtagerne til to cytokin gener CCL15 og IL17F. Derudover viser vi resultater fra mislykkede skærme til at illustrere typerne problemer, der kan opstå, når du udfører eY1H assays og fejlfinding af dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. præparater

  1. SC −U −H plader (150 mm petriskåle)
    Bemærk: Disse plader vil blive brugt til dyrkning af DNA-agn gærstammer.
    1. Opløse drop-out blanding, gær nitrogen base (YNB), adenin hemisulfate og ammonium sulfat i 920 mL vand, og pH til 5,9 med 5 M NaOH (ca 1 mL pr liter medier, se tabel 2 for sammensætning). Hæld i en 2 L målekolbe og tilføje en røre bar.
    2. I en anden 2 L målekolbe, tilsættes agaren 950 mL vand (Tilføj ikke røre bar, da det vil forårsage agar til at koge over i autoklaven).
    3. Autoklave i 40 min. på 15 psi på en flydende cyklus.
    4. Straks hælde indholdet af den første kolbe, herunder bar opsigt i agar indeholdende kolbe. Tilføje glukose, bland godt på en røre plade og afkøles til 55 ° C i et vandbad.
    5. Tilføj leucin og tryptofan til medierne. Bland godt på en røre tallerken og hæld i 150 mm sterile petriskåle (~ 80 mL pr parabol). Tør i 3-5 dage ved stuetemperatur, wrap i plast poser, og opbevares ved stuetemperatur i op til 6 måneder.
  2. YAPD rektangulære plader
    Bemærk: Disse plader vil blive brugt til dyrkning af plænen for DNA-agn stamme og parring med samlingen TF array.
    1. Opløses pulvere (Se tabel 3 for sammensætning), bortset fra agar, i 950 mL vand i et 2 L målekolbe og tilsættes en røre bar.
    2. I en anden 2 L målekolbe, tilsættes agaren 950 mL vand (Tilføj ikke røre bar, da det vil forårsage agar til at koge over i autoklaven).
    3. Autoklave i 40 min. på 15 psi på en flydende cyklus.
    4. Straks hælde indholdet af den første kolbe, herunder bar opsigt i agar indeholdende kolbe.
    5. Tilføje glukose, bland godt på en røre plade og afkøles til 55 ° C. Hæld medier i de rektangulære plader (Se Tabel af materialer; ~ 70 mL pr. plade) ved hjælp af en peristaltisk pumpe (5 mL/sekund) og et 6 mm slanger. Tørre i 1 dag ved stuetemperatur, wrap i plast poser, og opbevares i kølerum for op til 6 måneder.
      Bemærk: Selv om den foreslåede media volumen er 70 mL pr. plade, 50-80 mL pr. plade kan bruges. De tre kritiske spørgsmål at overveje, når hælde plader er 1) at de udjævnes, således at agar medier har samme tykkelse over hele pladen (brug en fladede tabel eller overflade for plade hælde og ikke hælde i stakke af mere end syv plader) 2) for at sikre fravær af bobler i agaren medier (bobler bør være poppet, ved hjælp af en steril nål), og 3) tørring pladerne for kun én dag og indpakning af plader i plastikposer til at undgå fejl i pinning gær.
  3. SC −Trp og Sc −U −Trp rektangulære plader
    Bemærk: Disse plader vil blive brugt til dyrkning af samlingen TF array (Sc −Trp) og at vælge diploide gær efter parring (Sc −U −Trp).
    1. Opløse drop-out mix, YNB, adenin hemisulfate og ammonium sulfat i 920 mL vand, og pH til 5,9 med NaOH 5M (ca. 1 mL per liter medier) (Se tabel 4 for sammensætning). Hæld i en 2 L målekolbe og tilføje en røre bar.
    2. I en anden 2 L målekolbe, tilsættes agaren 950 mL vand (Tilføj ikke røre bar, da det vil forårsage agar til at koge over i autoklaven).
    3. Autoklave i 40 min. på 15 psi på en flydende cyklus.
    4. Straks hælde indholdet af den første kolbe, herunder bar opsigt i agar indeholdende kolbe. Tilføje glukose, bland godt på en røre plade og afkøles til 55 ° C.
    5. Tilsæt leucin, histidin og uracil, (udelad uracil for Sc −U −Trp plader).
    6. Bland godt på en røre tallerken og hæld i rektangulære plader (~ 70 mL pr. plade) ved hjælp af en peristaltisk pumpe (5 mL/sekund) og 6 mm slanger. Tørre i 1 dag ved stuetemperatur, wrap plader i plastikposer og opbevares i kølerum for op til 3 måneder.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal rektangulære plader
    Bemærk:     disse plader skal bruges som udlæsning plader til eY1H assays.
    1. Drop-out mix, YNB, adenin hemisulfate og ammonium sulfat i 850 mL vand opløses (Se tabel 5 for sammensætning). Gør ikke pH. Hæld i en 2 L målekolbe og tilføje en røre bar.
    2. I en anden 2 L målekolbe, tilsættes agaren 850 mL vand (Tilføj ikke røre bar, da det vil forårsage agar til at koge over i autoklaven).
    3. Autoklave i 40 min. på 15 psi på en flydende cyklus.
    4. Forberede 10 x BU salte (1L) ved at kombinere 900 mL vand, 70 g Na2HPO4∙7H2O og 34,5 g NaH2PO4∙H2O. Mix ved hjælp af et rør bar at opløse pulvere og justeres til pH 7,0 med 5 M NaOH. Tilsæt vand til 1 L og autoklave.
    5. Forberede X-gal løsningen ved at føje 3,5 g X-gal pulver til en 50 mL plastik rør indeholdende 42,5 mL dimethyl formamid. Tilføj X-gal pulver til dimethyl formamid at opløse lettere (dette tager 30 min). Holde stamopløsning i mørke (enten brug uigennemsigtig 50 ml tube eller cover i folie). Opbevares ved-20 ° C.
    6. Straks hælde indholdet af den første kolbe, herunder bar opsigt i agar indeholdende kolbe. Tilføje glukose og 10 x BU salte (Se tabel 5 for sammensætning), bland godt på en røre plade og afkøles til 55 ° C.
    7. Tilsæt leucin, 3AT og X-gal, (Se tabel 5 for sammensætning).
    8. Bland godt på en røre tallerken og hæld i de rektangulære plader (~ 70 mL pr. plade) ved hjælp af en peristaltisk pumpe (5 mL/sekund) og et 6 mm slanger. Tørre i 1 dag ved stuetemperatur, wrap i plast poser, og opbevares i kølerum, der er omfattet af aluminiumsfolie (3AT og X-gal er lysfølsomt) for op til 1 måned.

2. spotting en TF array

  1. Optøning matrixen TF-bytte
    1. Tø gær glycerol stock plader med TF-bytte array på is.
      Bemærk: TF-bytte arrays kan oprettes som tidligere udgivne10,12,13,18.
    2. Resuspend gær ved hjælp af en 12-kanals pipette indenfor 1-3 min før det næste skridt.
  2. Spotting gæren i Sc −Trp rektangulære plader
    1. I HDA robot (Se Tabel af materialer), Vælg multi godt 96 plader som kilde, 96 agar plader som målet, og 96 lang pin pads.
      Bemærk: PIN pads er ikke genanvendelige og bør kasseres.
    2. Vælg programmet Kopiere mange at lave to kopier pr. 96-brønd plade. Brug ikke genanvende eller gense muligheder for at undgå tilbage forurening af de frosne bestande.
    3. Vælg indstillingen til at hvirvle op og ned i kilden til Bland gær.
    4. Taske matrixen plettede og Inkuber agar-side op på 30 ° C i 2-3 dage.
  3. Generere 384 koloni arrays i Sc −Trp rektangulære plader
    1. Robotten, Vælg 96 agar plader som kilde, 384 agar plade som mål og 96 kort pin pads.
    2. Vælg programmet 1:4 matrix . På denne måde skal fire 96 koloni plader (hver indeholder en forskellig TF) konsolideres til ét 384 koloni plade. Brug ikke genanvende eller gense muligheder for at undgå kontaminering mellem forskellige plader.
    3. Taske til plader og inkuberes plettede 384-koloni array agar-side op på 30 ° C i 2 dage.
  4. Generere 1,536 koloni arrays i Sc −Trp rektangulære plader
    Bemærk: Dette vil resultere i arrays som indeholder fire kolonier for hver TF-bytte.
    1. Robotten, Vælg 384 agar plader som kilde, 1,536 agar plader som mål og 384 kort pin pads.
    2. Vælg 1:4 assay enkeltkilde program. Målet er at kopiere hver koloni i fire kolonier til at opnå quadruplicates. Bruge genanvende og gense muligheder, da det indebærer kopiering fire gange hver koloni.
    3. Taske til plader og inkuberes plettede 1536-koloni array agar-side op på 30 ° C i 3 dage.
  5. Forstærke matrixen 1,536 koloni i Sc −Trp rektangulære plader
    1. Robotten, Vælg 1,536 agar plader som kilde, 1,536 agar plader som mål og 1,536 kort pin pads.
    2. Vælg programmet Kopiere mange til at replikere 3-4 eksemplarer. Bruge genanvende og gense indstilling, men smide puden når du skifter til en anden plade af matrixen til at undgå krydskontaminering.
    3. Taske til plader og inkuberes plettede 1536-koloni array agar-side op ved 30 ° C i 3 dage for at bruge til parring trin (se nedenfor). Efter at holde pladerne ved stuetemperatur og afskrift igen efter 7 dage for en ny runde af screening.

3. eY1H skærm

  1. Forberede DNA-agn stamme græsplæner til parring
    1. Spot gæren DNA-agn stammer på en Sc −U −H plade og vokse i 3 dage ved 30 ° C.
    2. Streak gæren i et 15 cm Sc −U −H plade ved hjælp af en steril tandstikker, således at hver plade passer 12 – 16 forskellige stammer. Inkuber én dag ved 30 ° C.
    3. Streak gæren i et 15 cm Sc −U −H plade ved hjælp af en steril tandstikker, således at hver plade passer 4 forskellige stammer. Der inkuberes i en dag på 30 ° C.
    4. Skrabe gær ved hjælp af en steril tandstikker, og sørg for ikke at skrabe nogen agar og tilføje til en 1,5 tube med 500 µL sterilt vand.
    5. Tilføje 10 – 15 sterile glasperler på en YAPD rektangulær plade. Tilsæt gær suspension på pladen og ryst grundigt i alle retninger for 1 min at sikre gær er spredes gennem alle plade.
    6. Vend pladen straks og så at perlerne gå til låget. Fjerne og genanvende perlerne.
    7. Taske til plader og inkuberes agar-side ned til 1-2 dage ved 30 ° C. Derefter videre til parring trin.
  2. Parring af gær DNA-agn og TF array stammer
    1. Overføre TF array til en YAPD rektangulær plade med robotten. Vælg 1,536 agar pladen som kilde og mål og 1,536 kort pin-pad. Vælg programmet Kopiere mange . Hver TF array plade kan bruges til at overføre til 3-4 YAPD plader (afhængigt af antallet af plader i array). TF array plader anvendes til parring skal være 2-3 dage gamle, men ikke mere som parring kan være ineffektivt.
    2. Overføre græsplæne af en DNA-agn stamme de YAPD plader der allerede indeholder matrixen TF med robotten. Vælg 1,536 agar pladen som kilde og mål og 1,536 kort pin-pad. Vælg programmet Kopiere mange . Bruge en tilfældig forskydning i kilde med en radius på ~0.6 mm til at undgå at tage gær fra samme sted, og blandes på målet at lette kontakten mellem gærstammer. Bruge plænen der indeholder DNA-agn stammer (afsnit 3.1) som kilde, og de YAPD plader der indeholder matrixen TF spottet i trin 3.2.1 som mål.
    3. Taske til plader og inkuberes agar-side op på 30 ° C i 1 dag.
  3. Udvalg af diploide gær
    1. Overføre skytterne gær fra YAPD plader til Sc −U −Trp plader med robotten. Vælg 1,536 agar pladen som kilde og mål og 1,536 kort pin-pad. Vælg programmet replikere . Bland på source og target.
    2. Taske til plader og inkuberes agar-side op på 30 ° C i 2-3 dage (længere inkubation fører til høje baggrund reporter aktivitet).
  4. Overføre til udlæsning plader
    1. Overføre den diploide gær fra Sc −U −Trp plader til udlæsning rektangulære plader Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal ved hjælp af robotten. Vælg 1,536 agar plader som kilde og mål og 1,536 kort pin-pad. Vælg programmet replikere .
    2. Taske til plader og inkuberes agar-side op på 30 ° C i op til 7 dage.
  5. Billeddannelse af udlæsning plader
    1. For DNA-agn stammer med høj baggrund reporter aktivitet, skal du tage billeder på dag 2, 3 og 4. Ellers Tag billeder på dag 4 og 7. Positive interaktioner er identificeret ved vækst og blå farve af gær kolonier og kan bestemmes manuelt, eller det kan bestemmes ved hjælp af billede analyse software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre vigtigste faktorer skal overvejes når analysere resultater fra eY1H assays: baggrund reporter aktivitet af DNA-agn stamme, styrken af reporter aktivitet svarende til TF-DNA interaktioner, og antallet af positive kolonier. Baggrund reporter aktiviteten (dvs. autoactivity) i DNA-agn stamme refererer til den samlede vækst og farve af gær kolonier i udlæsning plade, selv i mangel af en TF-bytte. Ideelt set, ikke-autoactive stammer vise en hvid eller lys brun baggrundsfarve, med kolonier for positive interaktioner bliver større og blå. Autoactive DNA-agn stammer Vis gær vækst i medier mangler histidin og en blå farve i overværelse af X-gal for alle kolonier på den plade, som hænger sandsynligvis sammen med bindingen af gær transcriptional aktivatorer til DNA-agn8. Styrken af reporter aktivitet svarende til TF-DNA interaktioner opdaget (dvs. størrelsen af kolonien) og intensiteten af blå afhænger af mange parametre såsom affinitet, TF udtryk niveau i gær, antallet af bindende websteder og afstand til gær minimal initiativtagerne beliggende opstrøms reporter gener, og baggrunden reporter aktivitet af DNA-agn stamme. For eksempel, en svag interaktion let kan påvises i en lav baggrunden agn men kan være svære at opdage i en autoactive eller ujævn baggrund agn. Det er også vigtigt for at bemærke, at reporter aktivitet niveauer i gær ikke nødvendigvis korrelerer med den lovgivningsmæssige aktivitet i humane celler, som strukturen kromatin nucleosome positionering, og afstand effekter er forskellige mellem gær og menneskelige. Yderligere, interaktioner i menneskelige risikerer at blive påvirket af bindingen af andre TFs og cofaktorer eller kan være maskeret af funktionelt redundante TFs8. Endelig betragtes interaktioner som positive i eY1H assays når mindst to af de fire kolonier Vis reporter udtryk over baggrundsværdier. Vi har dog observeret, at ~ 90% af interaktioner identificeret resultatet fra alle fire kolonier svarende til en TF bliver positiv10,12,19.

For at illustrere typen af resultater, der kan opnås ved hjælp af eY1H assays vi screenet promotor regioner (2 kb opstrøms transskription start steder) af generne, CCL15 og IL17F, mod en bred vifte af 1,086 menneskelige TFs (figur 2). CCL15 promotor er et eksempel på en ikke-autoactive DNA-agn hvor interaktioner, selv svage regioner, kan være let opdaget (figur 2A). IL17F promotor er et eksempel på en autoactive DNA-agn med ulige baggrund reporter aktivitet, hvor nogle interaktioner kan registreres, mens for flere TFs det er usikkert om reporter aktivitet er højere end baggrunden (figur 2B).

Problemer, der kan opstå, når du udfører eY1H assays

Selv om screeningen eY1H protokol er ligetil og robust, flere problemer kan opstå under skærmen:

1) kolonier er for lille og ikke overførsel (figur 3A): selv om det forventes, at nogle gær udtrykker eksogene TFs kan vise langsom vækst gær genekspression kan være dysregulated, typisk ~ 95% af TF-bytte kolonier vise normale vækst. Hvis mere end 10% af kolonier ikke vokse, er de hyppigste årsager problemer med medierne eller gær overførsel. Suboptimal vækst er ofte relateret til en af de medier komponenter at miste aktivitet (f.eks. uracil, histidin eller leucin), som kan løses ved at forberede friske medier med friske stamopløsninger. Alternativt, kan dette også være relateret til en fastgørelse forskydning, der påvirker koloni overførsel. I dette tilfælde skal du kontrollere at 1,536 puder pin midten af gær kolonier i kilde plader.

2) ingen gær vækst i en del af pladen (figur 3B): problemet er generelt forbundet med en fiasko i parring trin mislykkes 1,536 pin-pad til at gøre kontakt med gæren i DNA-agn stamme græsplæne, TF array, eller i parring plade. I næsten alle tilfælde, dette på grund af ulige agar media niveau under pladen hælde eller på grund af overdreven tørring af pladen.

3) ingen interaktioner opdaget (figur 3 c og D): dette spørgsmål er ofte relateret til enten utilsigtet inactivating mutationer i reporter gener i særlige LacZ (figur 3 c), eller til høje autoactivity, der maske interaktioner (figur 3D). Hvis du vil foretage fejlfinding af dette problem, anbefales det at skærmen en anden uafhængigt fremstillet belastning svarende til den samme DNA-agn.

4) pladen præsenterer tilfældige blå steder (figur 3E): dette spørgsmål er ofte relateret til bakteriel forurening. For at løse dette problem, streak gær for at få enkelte kolonier, og Gentag skærmen.

Ovenstående er de hyppigste problemer, når du udfører eY1H assays. Andre problemer skulle opstå, forberede nye medier, bekræfter at passende indstillinger for HDA robot blev brugt, og afprøvning flere stammer pr. DNA-agn vil sandsynligvis løse de fleste problemer.

Figure 1
Figur 1 : Oversigt over eY1H assay skærme. (A) sammenligning mellem TF-centreret og DNA-centreret metoder til at identificere protein-DNA interaktioner. (B) skemaer af eY1H assays. En DNA-sekvens af interesse (promotor, enhancer, lyddæmper, etc.) klonede opstrøms af HIS3 og LacZ reporter gener er integreret i gær genom. Den resulterende DNA-agn stamme er parret til en samling af gærstammer husly TFs smeltet til domænet Gal4 aktivering (AD). Positive interaktioner bestemmes af gærs evne til at vokse uden histidin og overvinde kompetitiv inhibitor 3-AT og blaat i overværelse af X-gal. (C) Pipeline for eY1H skærme. En græsplæne af en gær DNA-agn stamme dyrkes i en YAPD plade er parret i en YAPD plade til en 1,536 koloni array udtrykker TFs smeltet til annonce dyrkes på en Sc −Trp plade. Efter en dag, er gær overført til en Sc −U −Trp til at vælge for diploide gær. Efter en 2-3 dages inkubation, er gær overført til en Sc −U −H −Trp + 3AT + X-gal plade (udlæsning plade) at identificere protein-DNA interaktioner. Hver interaktion er testet i fire eksemplarer.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Eksempler på eY1H udlæsning plader. (A) interaktioner, der vedrører promotor af CCL15, en ikke-autoactive agn. Baggrund reporter aktivitet for denne agn er lav (reduceret vækst i mangel af histidin og fravær af blå farve for ikke-interagere TFs). (B) interaktioner, der vedrører promotor af IL17F, en autoactive agn. Baggrund reporter aktivitet for denne agn er høj (vækst i mangel af histidin og baggrunden blå farve i hele pladen) og ujævne, at gøre det udfordrende for at identificere protein-DNA interaktioner. Stærk, medium og svage interaktioner er firkantede i røde, orange og gul, henholdsvis. HGNC navnene på de interagerende TFs er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Problemer i eY1H skærme. (A) TF-bytte array-hvor flere kolonier undladt at vokse. (B) udlæsning plade hvor kolonier i nederste venstre hjørne har undladt at overføre. (C) ikke-autoactive DNA-agn stamme, der ikke viser positive interaktioner. (D) meget autoactive DNA-agn stamme, der ikke viser positive interaktioner. (E) udlæsning plade vise flere blå kolonier på grund af forurening. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Spotte en TF array
Dag 1 Spot gær i Sc-Trp plade i 96 koloni format (2.1 og 2.2)
Dag 4 Generere 384 koloni TF array (2.3)
Dag 6 Generere 1,536 koloni TF array (2.4)
Dag 9 Forstærke 1,536 koloni TF array (2,5)
Forberede DNA-agn stamme græsplæner til parring
Dag 6 Spot gæren DNA-agn stammer (3.1.1)
Dag 9 Streak gær, 12-16 stammer pr. plade (3.1.2)
Dag 10 Streak gær, 4 stammer pr. plade (3.1.3)
Dag 11 Forberede DNA-agn græsplæner (3.1.4 og 3.1.5)
Parring af gær DNA-agn og TF array stammer
Dag 12 Parring i YAPD plader (3.2)
Udvalg af diploide gær
Dag 13 Udvalg af diploide gær i Sc-U-Trp plader (3.3)
Overføre til udlæsning plader
Dag 15 Overføre diploide gær til udlæsning plader (3.4)
Billeddannelse af udlæsning plader
Dage 17-22 Billede erhvervelse af udlæsning plader afhængigt af baggrunden (3,5)

Tabel 1: TFF Array.

REAGENS ANTAL (for 2 L)
Drop-out mix syntetiske minus histidin, leucin, tryptophan og uracil, adenin, rige (2 g) gær nitrogen base 2.6 g
Gær nitrogen base uden aminosyrer og ammonium sulfat (YNB) 3,4 g
Adenin hemisulfate dihydrat 160 mg
Ammonium sulfat 10 g
Agar 35 g
Glukose (40%, w/v) i vand, steril 100 mL
Leucin (100 mM), sterile filtreret 16 mL
Tryptophan (40 mM), sterile filtreret 16 mL

Tabel 2: Reagens liste I.

REAGENS ANTAL (for 2 L)
Pepton 40 g
Gærekstrakt 20 g
Adenin hemisulfate dihydrat 0,32 g
Glukose (40%, w/v) i vand, steril 100 mL
Agar 35 g

Tabel 3: Reagens liste II.

REAGENS ANTAL (for 2 L)
Drop-out mix syntetiske minus histidin, leucin, tryptophan og uracil, adenin rige (2 g) gær nitrogen base 2.6 g
Gær nitrogen base uden aminosyrer og ammonium sulfat (YNB) 3,4 g
Adenin hemisulfate dihydrat 160 mg
Ammonium sulfat 10 g
Agar 35 g
Glukose (40%, w/v) i vand, steril 100 mL
Leucin (100 mM), sterile filtreret 16 mL
Histidin (100 mM), sterile filtreret 16 mL
Uracil (20 mM), sterile filtreret (udelad for Sc-U-Trp plader) 16 mL

Tabel 4: Reagens liste III.

REAGENS ANTAL (for 2 L)
Drop-out mix syntetiske minus histidin, leucin, tryptophan og uracil, adenin rige (2 g) gær nitrogen base 2.6 g
Gær nitrogen base uden aminosyrer og ammonium sulfat (YNB) 3,4 g
Adenin hemisulfate dihydrat 160 mg
Ammonium sulfat 10 g
Agar 35 g
Glukose (40%, w/v) i vand, steril 100 mL
10 x BU salte 200 mL
Leucin (100 mM), sterile filtreret 16 mL
3AT (2 M), sterile filtreret 5 mL
X-gal (80 mg/mL) i DMF 4 mL

Tabel 5: Reagens liste IV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Robotic eY1H parring screening tilgang beskrevet her kraftigt øger gennemløb for at identificere sæt af TFs, der binder sig til DNA region af interesse, i forhold til tidligere bibliotek screening eller klædt screening tilgange baseret på transformation. Yderligere, TF-DNA interaktioner opdaget af eY1H assays er yderst reproducerbare som 90% af interaktioner opdaget er positiv for alle fire kolonier testet pr. TF, og 90% af interaktioner retest i en uafhængig skærm af samme gær DNA-agn stamme10 , 12 , 19. vigtigere, TF-DNA interaktioner opdaget af eY1H validere på en 40-70% sats når testet i menneskelige reporter assays12,20, primær menneskelige celler (ikke-offentliggjorte resultater) og C. elegans knockout dyr 11. Dette er en lignende validering sats at der er konstateret for ChIP-seq data21.

Selv om interaktioner identificeret ved eY1H er meget reproducerbare, når råvarerne den samme gær DNA-agn stamme, producerer teste forskellige gærstammer for den samme DNA-lokkemad sommetider forskellige, selvom overlappende, sæt af TF-DNA interaktioner. Dette er normalt på grund af forskelle i baggrunden reporter aktivitet mellem stammer. Derudover test fragmenter af en DNA-sekvens resulterer i påvisning af flere TF-DNA interaktioner end test fuld sekvensen, især når overlappende fragmenter er testet. Dette kan være forbundet med analysen at være mere effektiv i at identificere interaktioner, der er tæt på reporter minimal initiativtagere, og fordi test overlappende fragmenter mindsker chancerne for, at en bindingssted kan blive tilstoppet af gær nucleosomes. Således, for små projekter, kan det anbefales at overlappende 0,5 – 1 kb fragmenter af en regulerende region er testet, og at to uafhængige stammer er screenet for hver DNA-agn sekvens8.

Der er flere kritiske trin i eY1H screening protokol for at undgå nogle af de spørgsmål, der er præsenteret i figur 3. Først, selv om de fleste medier ingredienser er stabil i flere måneder (undtagen 3AT og X-gal), en mangel på ordentlig koloni vækst sandsynligvis angiver at mindst én af ingredienserne kan have mistet aktivitet og bør udskiftes. For det andet er det vigtigt at forberede de rektangulære plader, så agaren er jævnet med jorden, og så de ikke tør for mere end en dag at undgå fiasko i pinning når ved hjælp af robot platform. Endelig er det vigtigt at bruge robot platform programmer som det fremgår af protokollen (gense, genanvende, blanding, etc.) for gær til at overføres effektivt, til parring skal være effektive, og for at undgå krydskontaminering mellem gær kloner.

De eksempler, vi har valgt for at illustrere brugen af eY1H skærme svarer til menneskeligt gen projektledere. Men andre lovgivningsmæssige områder kan også testes herunder smagsforstærkere og lyddæmpere. For eksempel har vi brugt eY1H assays til at evaluere TF bindende menneskelige udviklingsmæssige smagsforstærkere og C. elegans første introner12,22. Hertil kommer, at interaktioner er testet på en måde, parvis, kan eY1H assays bruges til at sammenligne interaktioner mellem ikke-kodende varianter, og TF kodende sekvens varianter. For eksempel ændret ved hjælp af eY1H assays vi identificeret TF binding til 109 noncoding varianter tilknyttet forskellige genetiske sygdomme, og også differentieret interaktioner profiler for 58 TF missense mutationer12,14. Selv om denne protokol fokuserer på evaluering TF binding til menneskelige regulerende regioner, kan DNA regioner fra andre arter også blive testet, forudsat at en TF-bytte er tilgængelige eller kan genereres. Ja, TF-bytte arrays er blevet genereret for C. elegans10, Drosophila melanogaster23, Mus musculus24, Arabidopsis thaliana25,26, og Zea mays 27. således, med stadig mere tilgængelige ressourcer, eY1H assays kan anvendes på flere systemer.

Selvom eY1H assays har været medvirkende til at identificere repertoire af TFs, der binder til forskellige administrative regioner i menneskelige og andre arter, der ikke er fri for forbehold8,11,12,19 ,20,25. En af begrænsningerne er at interaktioner er testet i milieu af gær kernen, og selv om DNA-lokkemad er chromatinized, den kromatin i gær kan ikke afspejle kromatin strukturen i arterne fra hvor DNA-agn stammer fra og vil ikke afspejle celle type forskelle observeret in vivo. Således skal interaktioner identificeret ved eY1H assays valideres i reporter eller andre funktionelle assays. Bemærk, vi og andre har fundet TF-DNA interaktioner opdaget af eY1H validere i en 40%-70% fald i funktionelle assays11,12,20,23. En anden begrænsning af eY1H assays er, at det ikke kan registrere interaktioner, der vedrører TFs, der kræver posttranslationelle modifikationer fraværende i gær til at binde til DNA, TFs, der ikke er ordentligt foldet i gær når smeltet til Annoncen og TFs, der mangler fra arrayet 8. Desuden, i det aktuelle format, eY1H assays ikke registrere interaktioner, der vedrører heterodimerisk TFs, som hver gær koloni i matrixen TF udtrykker en enkelt TF-bytte. Således vil yderligere forbedringer i analysen øge bredden af TFs, der kan afprøves og udvide funktionaliteten af eY1H assays til at identificere roman TF-DNA interaktioner

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [R35-GM128625 til J.I.F.B.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

Tags

Genetik spørgsmålet 144 gær one-hybrid Y1H transskription faktor menneskelige gen forordning DNA eY1H
Forbedret gær One-hybrid skærme til at identificere transskription faktor Binding til menneskelige DNA-sekvenser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter