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Genetics

Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

Qui, presentiamo un lievito avanzato monoibrido protocollo per identificare i fattori di trascrizione (TFs) che possono essere associato ad una regione di DNA umana di interesse di screening. Questo metodo utilizza una pipeline di screening ad alta resa che può interrogare il legame di > 1.000 TFs in un singolo esperimento.

Abstract

Identificare i set di fattori di trascrizione (TFs) che regolano ogni gene umano è un compito arduo che richiede l'integrazione di numerosi approcci sperimentali e computazionali. Uno di questi metodi è il lievito monoibrido (Y1H) test, nelle quali interazioni tra DNA e TFs regioni vengono testate nell'ambito del nucleo di lievito utilizzando geni reporter. Y1H saggi riguardano due componenti: una 'DNA-bait' (ad es.., promotori, enhancers, silenziatori, ecc.) e una 'TF-preda,' che possa essere sottoposti a screening per l'attivazione del gene reporter. Più i protocolli pubblicati per l'esecuzione di Y1H schermi si basano sulla trasformazione TF-preda librerie o matrici in ceppi di lievito DNA-esca. Qui, descriviamo una pipeline, chiamato Y1H avanzata (eY1H) assays, dove interazioni TF-DNA sono interrogati dall'accoppiamento del DNA-esca ceppi con una collezione di serie di TF-preda ceppi utilizzando una matrice ad alta densità piattaforma robotica (HDA) che permette la proiezione in un 1.536 formato di Colonia. Questo permette un notevole aumento della velocità effettiva (60 sequenze di DNA-esca contro > 1.000 TFs richiede due settimane per ricercatore) e riproducibilità. Illustriamo i diversi tipi di risultati attesi dalla prova sequenze promotore umano contro una matrice di 1.086 umano TFs, nonché esempi di problemi che possono sorgere durante gli schermi e come risolverli.

Introduction

Un problema centrale in campo biomedico consiste nel determinare i meccanismi con cui viene regolato ogni gene umano. Trascrizione è il primo passo nel controllo dei livelli di espressione genica, ed è regolato da un insieme di fattori di trascrizione (TFs) che sono unici per ogni gene. Dato che gli esseri umani codificano per > 1.500 TFs1,2, identificando il set completo di TFs che controllano l'espressione di ogni gene rimane una sfida aperta.

Due tipi di metodi possono essere utilizzati per mappare le interazioni TF-DNA: Metodi TF-centrato e DNA-centrato3 (Figura 1A). Nei metodi TF-centrato, è sondato un TF di interesse per l'associazione a regioni del DNA genomiche o per determinare la specificità di legame del DNA. Questi metodi includono l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) seguita da sequenziamento ad alta produttività, microarrays della proteina vincolante e SELEX4,5,6. Nei metodi del DNA-centrato, una sequenza di DNA di interesse è sondata per determinare l'insieme di TFs che si legano alla sequenza di DNA. Il più ampiamente applicata di tali metodi è saggi di lievito monoibrido (Y1H), nelle quali interazioni tra DNA e TFs regioni vengono testate nell'ambito del nucleo di lievito utilizzando reporter geni7,8,9.

Y1H saggi riguardano due componenti: una 'DNA-bait' (ad es., promotori, enhancers, silenziatori, ecc.) e una 'TF-preda,' che possa essere sottoposti a screening per reporter gene attivazione9,10 (Figura 1B). Il DNA-esca è clonato a Monte di due reporter geni (LacZ e HIS3) e due costrutti di DNA-bait::reporter sono integrati nel genoma del lievito per generare cromatinici 'DNA-esca ceppi.' La TF-preda, codificata in un plasmide che esprime un TF fuso per il dominio di attivazione (AD) del lievito Gal4 TF, è stato introdotto nel ceppo di DNA-esca per i pesci per le interazioni di TF-DNA. Se la TF-preda si lega alla sequenza di DNA-esca, quindi l'annuncio presente nella TF-preda porterà all'attivazione di entrambi i geni reporter. Di conseguenza, cellule con un'interazione positiva possono essere selezionate per la crescita sulle piastre carente istidina, come pure di superare un inibitore competitivo, 3-ammino-1,2,4-triazolo (3-AT) e visualizzate come colonie blu in presenza di X-gal. Perché il potente lievito Gal4 è utilizzato AD, saggi di Y1H in grado di rilevare le interazioni che coinvolgono attivatori trascrizionali come repressori. Inoltre, dato che TF-prede sono espressi da un promotore forte lievito (ADH1), interazioni possono essere rilevati anche per TFs che hanno livelli di bassa espressione endogena, che sono difficili da rilevare da ChIP11,12.

Più i protocolli pubblicati per eseguire dosaggi Y1H si basano sull'introduzione di TF-prede nei ceppi di lievito DNA-esca trasformando in pool librerie di TF-preda seguite da selezione, Colonia raccogliendo e sequenziamento per identificare il TF interagenti, o da trasformazione di singoli cloni8,9. Si tratta di protocolli che richiede tempo, limitando il numero di sequenze di DNA che può essere testato per ricercatore. Un recente miglioramento delle analisi Y1H, chiamato enhanced Y1H (eY1H), ha aumentato drammaticamente il throughput screening utilizzando una piattaforma robotica di matrice (HDA) ad alta densità di accoppiarsi ceppi di lievito DNA-esca con una collezione di ceppi di lievito ognuno esprimendo un diverso TF-preda10,13 (Figura 1). Questi schermi utilizzano un formato di 1.536 Colonia che permette di testare più umano TFs in quadruplice copia utilizzando solo tre piastre. Inoltre, dato che interazioni TF-DNA sono testati in maniera pairwise, questo approccio consente per confrontare le interazioni tra DNA-esche (ad esempio, due varianti non codificanti singolo nucleotide) e tra diversi TFs o TF varianti11,12 ,14.

Facendo uso delle analisi di eY1H, abbiamo delineato l'umano più grande e Caenorhabditis elegans TF-DNA DNA-centrato interazioni reti a-data. In particolare, abbiamo identificato 2.230 interazioni tra 246 rinforzatori inerente allo sviluppo umani e 283 TFs12. Ulteriormente, abbiamo impiegato le analisi eY1H per scoprire associazione TF alterata a 109 varianti non codificante di singolo nucleotide associate a malattie genetiche come la malformazione inerente allo sviluppo, il cancro e disturbi neurologici. Più recentemente, abbiamo usato eY1H per delineare una rete formata da 21.714 interazioni tra 2.576 promotori di geni di c. elegans e 366 TFs11. Questa rete è stato determinante per scoprire il ruolo funzionale di decine di c. elegans TFs.

I protocolli per generare macchie di DNA-esca e valutare i livelli di attività del reporter di sfondo sono state segnalate altrove15,16,17. Qui, descriviamo una pipeline di eY1H che può essere utilizzata per qualsiasi regione di DNA genomico umano contro una matrice di 1.086 TFs umano a schermo. Una volta che viene generato un DNA-esca ceppo di lievito e una matrice di TF-preda è macchiata sulle piastre corrispondente, l'intero protocollo può essere eseguita in due settimane (tabella 1). Ancora più importante, il protocollo può essere parallelizzato in modo che un singolo ricercatore può schermo 60 sequenze di DNA-esca simultaneamente. Per illustrare il protocollo, abbiamo proiettato i promotori di due geni di citochine CCL15 e IL17F. Inoltre, mostreremo risultati dalla fallita schermate per illustrare i tipi di problemi che possono sorgere durante l'esecuzione di analisi di eY1H e come risolverli.

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Protocol

1. preparati

  1. Piastre di SC −U −H (150mm di Petri)
    Nota: Queste piastre verranno utilizzate per la coltivazione i ceppi di lievito DNA-esca.
    1. Sciogliere il drop-out mix, lievito azoto base (YNB), adenina hemisulfate e solfato di ammonio in 920 mL di acqua e pH 5.9 con 5 M NaOH (circa 1 mL per litro di media; si veda tabella 2 per la composizione). Versare in un pallone da 2 L e aggiungere una barra per l'agitazione.
    2. In un secondo pallone da 2 L, aggiungere l'agar a 950 mL di acqua (non aggiungere un ancoretta come causerà l'agar a traboccare in autoclave).
    3. Autoclave per 40 min a 15 psi su un ciclo di liquido.
    4. Versare immediatamente il contenuto del pallone primo, tra cui l'ancoretta, dentro l'agar contenente boccetta. Aggiungere il glucosio, mescolare bene su un piatto di mescolare e raffreddare a 55 ° C in un bagno d'acqua.
    5. Aggiungere la leucina ed il triptofano ai media. Mescolare bene su un piatto di mescolare e versare in Petri sterili 150 mm (~ 80 mL per ogni piatto). Secco per 3 – 5 giorni a temperatura ambiente, avvolgere in sacchetti di plastica e conservare a temperatura ambiente fino a 6 mesi.
  2. Lastre rettangolari YAPD
    Nota: Queste piastre verranno utilizzate per la coltivazione di prato per il ceppo di DNA-esca e per l'accoppiamento con la raccolta di matrice TF.
    1. Dissolvere polveri (Vedi tabella 3 per composizione), ad eccezione di agar, in 950 mL di acqua in un pallone da 2 L e aggiungere una barra per l'agitazione.
    2. In un secondo pallone da 2 L, aggiungere l'agar a 950 mL di acqua (non aggiungere un ancoretta come causerà l'agar a traboccare in autoclave).
    3. Autoclave per 40 min a 15 psi su un ciclo di liquido.
    4. Versare immediatamente il contenuto del pallone primo, tra cui l'ancoretta, dentro l'agar contenente boccetta.
    5. Aggiungere il glucosio, mix bene su una piastra di mescolare e lasciare raffreddare a 55 ° C. Versare le piastre rettangolari di media (Vedi Tabella materiali; ~ 70 mL per piastra) utilizzando una pompa peristaltica (5 mL/sec) e un tubo di 6 mm. Secco per 1 giorno a temperatura ambiente, avvolgere in sacchetti di plastica e riporre in camera fredda per fino a 6 mesi.
      Nota: Anche se il volume dei supporti suggeriti è 70 mL per piastra, 50 – 80 mL per piastra può essere utilizzato. I tre punti critici da considerare quando versando le piastre sono 1) che sono livellate in modo che i media di agar ha lo stesso spessore in tutta la piastra (utilizzare livellato tavolo o una superficie per il versamento della piastra e non versare in pacchi da più di sette) 2) per garantire l'assenza di bolle nell'agar media (bolle dovrebbero essere spuntate con un ago sterile) e 3) le piastre di secchezza per un solo giorno e le piastre d'imballaggio in sacchetti di plastica per evitare rotture in aggiunta di lievito.
  3. SC −Trp e Sc −U −Trp piastre rettangolari
    Nota: Queste piastre verranno utilizzate per la raccolta di matrice TF (Sc −Trp) in crescita e per selezionare diploide lievito dopo l'accoppiamento (Sc −U −Trp).
    1. Sciogliere il mix di abbandono, YNB, adenina hemisulfate e solfato di ammonio in 920 mL di acqua e pH 5.9 con NaOH 5M (circa 1 mL per litro di media) (Vedi tabella 4 per composizione). Versare in un pallone da 2 L e aggiungere una barra per l'agitazione.
    2. In un secondo pallone da 2 L, aggiungere l'agar a 950 mL di acqua (non aggiungere un ancoretta come causerà l'agar a traboccare in autoclave).
    3. Autoclave per 40 min a 15 psi su un ciclo di liquido.
    4. Versare immediatamente il contenuto del pallone primo, tra cui l'ancoretta, dentro l'agar contenente boccetta. Aggiungere il glucosio, mescolare bene su un piatto di mescolare e raffreddare fino a 55 ° C.
    5. Aggiungere la leucina, l'istidina e l'uracile (omettere l'uracile per le piastre di −Trp −U Sc).
    6. Mescolare bene su un piatto di mescolare e versare in lastre rettangolari (~ 70 mL per piastra) utilizzando una pompa peristaltica (5 mL/sec) e tubi di 6 mm. Asciugare per 1 giorno a temperatura ambiente, avvolgere le piastre in sacchetti di plastica e conservare in camera fredda fino a 3 mesi.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + piastre rettangolari X-gal
    Nota:     queste piastre verranno utilizzate come piastre di lettura per le analisi di eY1H.
    1. Sciogliere il mix di abbandono, YNB, adenina hemisulfate e solfato di ammonio in 850 mL di acqua (vedere tabella 5 per composizione). Fare non pH. Versare in un pallone da 2 L e aggiungere una barra per l'agitazione.
    2. In un secondo pallone da 2 L, aggiungere l'agar a 850 mL di acqua (non aggiungere un ancoretta come causerà l'agar a traboccare in autoclave).
    3. Autoclave per 40 min a 15 psi su un ciclo di liquido.
    4. Preparare 10 x BU sali (1L) combinando 900 mL di acqua, 70 g di Na2HPO4∙7H2O e 34,5 g di NaH2PO4∙H2O. Mix utilizzando un ancoretta dissolvere polveri e regolare il pH a 7.0 utilizzando 5 M NaOH. Aggiungere acqua per portare a 1 L e autoclave.
    5. Preparare la soluzione X-gal aggiungendo un tubo di plastica da 50 mL contenente 42,5 mL di dimetilformammide 3,5 g di polvere di X-gal. Aggiungere polvere di X-gal a dimetil formammide per sciogliere più facilmente (tempo di percorrenza 30 min). Mantenere la soluzione stock al buio (l'uso del tubo opaco 50 ml o copertina in carta stagnola). Conservare a-20 ° C.
    6. Versare immediatamente il contenuto del pallone primo, tra cui l'ancoretta, dentro l'agar contenente boccetta. Aggiungere il glucosio e le 10 x BU sali (vedere tabella 5 per composizione), mescolare bene su un piatto di mescolare e raffreddare fino a 55 ° C.
    7. Aggiungere la leucina, 3AT e il X-gal (vedere tabella 5 per composizione).
    8. Mescolare bene su un piatto di mescolare e versare nei piatti rettangolari (~ 70 mL per piastra) utilizzando una pompa peristaltica (5 mL/sec) e un tubo di 6 mm. Secco per 1 giorno a temperatura ambiente, avvolgere in sacchetti di plastica e riporre nella stanza fredda rivestita in lamina di alluminio (3AT e X-gal sono sensibili alla luce) per fino a 1 mese.

2. spotting una matrice TF

  1. La matrice di TF-preda di scioglimento
    1. Scongelare le piastre stock di glicerolo di lievito con la matrice di TF-preda sul ghiaccio.
      Nota: TF-preda matrici possono essere generate come precedentemente pubblicati10,12,13,18.
    2. Risospendere il lievito usando una pipetta di 12 canali entro 1 – 3 min prima del passaggio successivo.
  2. Spotting il lievito in Sc −Trp lastre rettangolari
    1. Nel robot HDA (Vedi Tabella materiali), selezionare Multi-96 pozzetti come fonte, 96 piastre di agar come destinazione e lungo 96 pin pad.
      Nota: Rilievi di pin non sono riutilizzabili e dovrebbero essere scartati.
    2. Selezionare il programma Replicare molti di fare due copie a piastra a 96 pozzetti. Non utilizzare il riciclo o rivisitare opzioni per evitare la contaminazione posteriore delle scorte congelate.
    3. Selezionare l'opzione a girare su e giù nell'origine di mescolare il lievito.
    4. Borsa la matrice maculata e incubare agar lato fino a 30 ° C per 2 – 3 giorni.
  3. Generazione di 384 matrici di Colonia in lastre rettangolari di Sc −Trp
    1. Nel robot, selezionare 96 piastre di agar come fonte, 384 piastra di agar come destinazione e 96 breve pin pad.
    2. Selezionare il programma matrice 1:4 . In questo modo, piastre quattro 96 Colonia (ognuno dei quali contiene un diverso TF) saranno consolidate nella piastra una 384 Colonia. Non utilizzare il riciclo o rivisitare opzioni per evitare la contaminazione tra diversi piatti.
    3. Le piastre del sacchetto e incubare lato agar maculato 384-Colonia matrice fino a 30 ° C per 2 giorni.
  4. Generazione di 1.536 matrici di Colonia in lastre rettangolari di Sc −Trp
    Nota: Questo si tradurrà in matrici che contengono quattro colonie per ogni TF-preda.
    1. Nel robot, selezionare 384 piastre di agar come origine, le piastre di 1.536 agar come destinazione e 384 breve pin pad.
    2. Selezionare il programma di singola origine di analisi 1:4. L'obiettivo è quello di copiare ogni colonia in quattro colonie di ottenere quadruplicato. Utilizzare il riciclo e rivisitare opzioni come comporta la copia quattro volte ogni Colonia.
    3. Le piastre del sacchetto e incubare lato agar maculato 1536-Colonia matrice fino a 30 ° C per 3 giorni.
  5. Amplificando la matrice di 1.536 Colonia in lastre rettangolari di Sc −Trp
    1. Nel robot, selezionare 1.536 piastre di agar come fonte, 1.536 piastre di agar come destinazione e 1.536 breve pin pad.
    2. Selezionare il programma Replicare molti per replicare copie di 3 – 4. Utilizzare il riciclo e rivisitare opzione, ma buttare fuori il pad quando si passa a un piatto diverso della matrice per evitare la contaminazione incrociata.
    3. Le piastre del sacchetto e incubare lato agar maculato 1536-Colonia matrice fino a 30 ° C per 3 giorni per utilizzare per gli accoppiamenti passaggi (Vedi sotto). Dopo di che, è necessario tenere le piastre a temperatura ambiente e copiare nuovamente dopo 7 giorni per un nuovo round di screening.

3. eY1H schermo

  1. Preparazione del DNA-esca ceppo prati per accoppiamento
    1. Individuare il lievito DNA-esca ceppi su un piatto −H Sc −U e crescere per 3 giorni a 30 ° C.
    2. Striscia il lievito in un 15 cm Sc −U −H piastra utilizzando uno stuzzicadenti sterile, affinché ogni piatto si adatta 12 – 16 diversi ceppi. Incubare un giorno a 30 ° C.
    3. Striscia il lievito in un 15 cm Sc −U −H piastra utilizzando uno stuzzicadenti sterile, affinché ogni piatto si adatta 4 diversi ceppi. Incubare per un giorno a 30 ° C.
    4. Raschiare il lievito utilizzando uno stuzzicadenti sterile, facendo attenzione a non rimuovere qualsiasi agar e aggiungerla in una provetta da 1,5 con 500 µ l di acqua sterile.
    5. Aggiungere 10 – 15 perline di vetro sterile su una piastra rettangolare di YAPD. Aggiungere la sospensione di lievito sulla piastra ed agitare accuratamente in tutte le direzioni per 1 min affinché che il lievito si sviluppa attraverso tutto il piatto.
    6. Capovolgere la piastra immediatamente e toccare in modo che le perline andare al coperchio. Rimuovere e riciclare le perline.
    7. Le piastre del sacchetto e incubare agar-lato giù per 1 – 2 giorni a 30 ° C. Quindi procedere al passaggio degli amori.
  2. Accoppiamento di lievito DNA-esca e TF matrice ceppi
    1. Trasferire la matrice TF in un piatto rettangolare YAPD con il robot. Selezionare la piastra di 1.536 agar come origine e destinazione e il breve 1.536 pin pad. Selezionare il programma di Replicare molti . Ogni piastra di matrice TF può essere utilizzato per trasferire a piastre YAPD 3 – 4 (a seconda del numero di piastre della matrice). Le piastre di matrice TF utilizzate per l'accoppiamento devono essere vecchio di 2 – 3 giorni, ma non più come accoppiamento potrebbe essere inefficiente.
    2. Trasferire il prato di un ceppo di DNA-esca per le piastre YAPD già contenente la matrice TF con il robot. Selezionare la piastra di 1.536 agar come origine e destinazione e il breve 1.536 pin pad. Selezionare il programma di Replicare molti . Utilizzare un offset casuale nell'origine con un raggio di ~0.6 mm per evitare l'assunzione di lievito dal punto stesso e mescolare il bersaglio per facilitare il contatto tra ceppi di lievito. Utilizzare il prato contenente i ceppi di DNA-esca (sezione 3.1) come fonte e le piastre YAPD che contiene la matrice TF ha notato al punto 3.2.1 come destinazione.
    3. Le piastre del sacchetto e incubare agar lato fino a 30 ° C per 1 giorno.
  3. Selezione di lievito diploide
    1. Trasferire il lievito accoppiato dalle piastre YAPD per piastre di Sc −U −Trp con il robot. Selezionare la piastra di 1.536 agar come origine e destinazione e il breve 1.536 pin pad. Selezionare il programma di replicare . Mescolare sull'origine e sulla destinazione.
    2. Le piastre del sacchetto e incubare agar lato fino a 30 ° C per 2 – 3 giorni (incubazione più lungo porta ad attività del reporter di alta priorità bassa).
  4. Trasferimento a piastre della lettura
    1. Trasferire il lievito diploide dalle piastre −Trp Sc −U a lettura lastre rettangolari Sc −U −H −Trp + 5mm 3AT + 0,4 mM X-gal utilizzando il robot. Selezionare le piastre di 1.536 agar come origine e destinazione e il breve 1.536 pin pad. Selezionare il programma di replicare .
    2. Le piastre del sacchetto e incubare agar lato fino a 30 ° C fino a 7 giorni.
  5. Imaging delle piastre della lettura
    1. Per i ceppi di DNA-esca con attività del reporter di alta priorità bassa, è possibile scattare foto nei giorni 2, 3 e 4. In caso contrario, è possibile scattare foto ai giorni 4 e 7. Interazioni positive sono identificati dal colore blu e la crescita delle colonie di lievito e possono essere determinate manualmente, o può essere determinato utilizzando software di analisi di immagine.

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Representative Results

Tre fattori principali da considerare quando analizzando i risultati dalle analisi eY1H: l'attività del reporter sfondo del ceppo del DNA-esca, la forza dell'attività di giornalista corrispondente a interazioni TF-DNA e il numero di colonie positive. L'attività del reporter sfondo (cioè, autoactivity) del ceppo del DNA-esca si riferisce al colore delle colonie di lievito nella piastra di lettura, anche in assenza di un TF-preda e alla crescita complessiva. Idealmente, non autoactive ceppi mostrano un sfondo bianco o chiaro colore marrone, con colonie per interazioni positive che è più grande e blu. Autoactive DNA-esca ceppi mostrano la crescita del lievito in media privo di istidina e un colore blu in presenza di X-gal per tutte le colonie nella piastra, che è probabilmente correlata all'associazione di attivatori trascrizionali di lievito al DNA-esca8. La forza dell'attività giornalista corrispondente per le interazioni di TF-DNA rilevate (cioè, la dimensione della Colonia) e l'intensità del blu dipende da molti parametri come l'affinità, il livello di espressione di TF in lievito, il numero di associazione siti e distanza i promotori di lievito minimo situati a Monte dei geni reporter e l'attività del reporter sfondo del ceppo del DNA-esca. Ad esempio, un'interazione debole può essere facilmente rilevata in un esca basso fondo ma può essere difficile da rilevare in un autoactive o esca fondo irregolare. È anche importante notare che l'attività del reporter livelli in lievito necessariamente non correlano con l'attività regolatoria in cellule umane, come la struttura della cromatina, nucleosoma posizionamento, ed effetti della distanza sono diversi tra lievito e umano. Ulteriormente, interazioni in umani sono destinate a essere influenzati dall'associazione di altri TFs e cofattori o possono essere mascherate da funzionalmente ridondanti TFs8. Infine, interazioni vengono considerati positivi nelle analisi di eY1H quando almeno due delle quattro colonie mostrano espressione reporter sopra livelli di fondo. Tuttavia, abbiamo osservato che ~ 90% di interazioni identificate risultato da tutti i quattro colonie corrispondente a un TF essendo positivo10,12,19.

Per illustrare il tipo di risultati che possono essere ottenuti utilizzando dosaggi di eY1H abbiamo proiettato le regioni promotrici (2 kb a Monte i siti di inizio della trascrizione) dei geni CCL15 e IL17F, contro una matrice di 1.086 umano TFs (Figura 2). Il promotore di CCL15 è un esempio di un DNA di non-autoactive-esca dove interazioni, anche quelli deboli, può essere facilmente rilevato (Figura 2A). Il promotore di IL17F è un esempio di un autoactive del DNA-esca con attività del reporter di fondo irregolare, dove alcune interazioni possono essere rilevati mentre per diversi TFs è incerto se l'attività del reporter è superiore a sfondo (Figura 2B).

Problemi che possono essere rilevati durante l'esecuzione di saggi di eY1H

Anche se lo screening eY1H protocollo è straight-forward e robusto, diversi problemi possono essere incontrate durante la schermata:

1) colonie sono troppo piccole e non riescono a trasferimento (Figura 3A): anche se si prevede che alcuni lieviti esprimendo TFs esogeno possono visualizzare crescita lenta dato che l'espressione genica di lievito può essere dysregulated, tipicamente ~ 95% delle colonie di TF-preda visualizzazione normale crescita. Se più del 10% delle colonie non riescono a svilupparsi, le cause più frequenti sono problemi con i media o con il trasferimento di lievito. Non ottimale crescita è spesso legato ad uno dei componenti media perdere attività (ad es., uracile, istidina o leucina), che può essere risolto da preparare fresco media con fresche soluzioni di riserva. In alternativa, questo può anche essere collegato a un offset di blocco che riguarda il trasferimento di Colonia. In questo caso, verificare che le 1.536 pastiglie pin al centro delle colonie lievito nelle piastre di origine.

2) nessuna crescita del lievito in una porzione della piastra (Figura 3B): questo problema è generalmente correlato con un errore nel passaggio degli amori se il 1.536 pin pad non riesce a fare contatto con il lievito nel prato di ceppo di DNA-esca, la matrice TF, o nella piastra di accoppiamento. In quasi ogni caso, questo è a causa di livello mediatico agar irregolare durante il piatto versando o eccessiva essiccazione della piastra.

3) nessun interazioni rilevate (Figura 3 e D): questo problema è spesso legato a entrambi non intenzionale mutazioni inattivanti nei geni reporter, in particolare LacZ (Figura 3), o a autoactivity alta che mascherare interazioni (Figura 3D). per risolvere questo problema, si consiglia di schermare un altro ceppo indipendentemente ottenuto corrispondente per la stessa DNA-esca.

4) la piastra presenta macchie blu casuale (Figura 3E): questo problema è spesso legato alla contaminazione batterica. Per risolvere questo problema, inoculare il lievito per ottenere diverse colonie e ripetere lo schermo.

Quanto sopra sono i più frequenti problemi incontrati durante l'esecuzione di analisi di eY1H. Qualora sorgano altri problemi, preparando nuovi media, confermando che sono state usate le impostazioni appropriate per il robot HDA, e test più ceppi per DNA-esca probabilmente risolverebbe la maggior parte dei problemi.

Figure 1
Figura 1 : Muta di schermate di test eY1H. (A) confronto tra metodi TF-centrato e centrata sul DNA per identificare le interazioni proteina-DNA. (B) schemi di saggi eY1H. Una sequenza di DNA di interesse (promotore, enhancer, silenziatore, ecc.) clonato a Monte del reporter HIS3 e LacZ geni è integrato nel genoma del lievito. Il ceppo di DNA-esca risultante è abbinato ad una collezione di ceppi di lievito che harboring TFs fusa per il dominio di attivazione Gal4 (AD). Interazioni positive sono determinati dalla capacità di lievito a crescere senza istidina e superando inibitore competitivo 3-AT e diventano di colore blu in presenza di X-gal. (C) Pipeline per gli schermi eY1H. Un prato di un lievito DNA-esca ceppo coltivato in un piatto YAPD è accoppiato a un piatto YAPD in una matrice di 1.536 Colonia esprimendo TFs fusa annuncio cresciuto su un piatto di −Trp Sc. Dopo un giorno, il lievito viene trasferito in un −Trp −U Sc per selezionare per lievito diploide. Dopo un'incubazione di 2-3 giorni, il lievito viene trasferito ad un Sc −U −H −Trp, 3AT + piastra X-gal (piastra di lettura) di identificare le interazioni proteina-DNA. Ogni interazione è testato in quadruplice copia.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Esempi di piastre di lettura eY1H. (A) interazioni che coinvolgono il promotore della CCL15, un'esca non-autoactive. Attività del reporter sfondo per questa esca è basso (ridotta crescita in assenza di istidina e assenza di colore blu per TFs non interagenti). (B) interazioni che coinvolgono il promotore di IL17F, un'esca di autoactive. Attività del reporter sfondo per questa esca è alta (colore in tutta la piastra di crescita in assenza di istidina e sfondo blu) e irregolare, rendendo difficile per identificare le interazioni proteina-DNA. Forte, medio e interazioni deboli vengono squadrati in rosso, arancio e giallo, rispettivamente. Vengono visualizzati i nomi HGNC di TFs interagenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Problemi nelle schermate di eY1H. (A) TF-preda di matrice dove più colonie non è riuscito a crescere. (B) lettura del piatto dove colonie in basso a sinistra non sono riusciti a trasferire. (C) ceppo di DNA Non-autoactive-esca che non presenta interazioni positive. (D) altamente ceppo di autoactive DNA-esca che non presenta interazioni positive. (E) piastra di lettura visualizzazione più colonie blu a causa della contaminazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Spotting una matrice TF
1 ° giorno Spot di lievito nella piastra Sc – Trp in formato 96 Colonia (2.1 e 2.2)
4 ° giorno Generare la matrice di 384 Colonia TF (2.3)
6 ° giorno Generare la matrice di 1.536 Colonia TF (2.4)
Giorno 9 Amplificare la matrice di 1.536 Colonia TF (2.5)
Preparazione del DNA-esca ceppo prati per accoppiamento
6 ° giorno Individuare il lievito DNA-esca ceppi (3.1.1)
Giorno 9 Lievito di striatura, 12-16 ceppi per piastra (3.1.2)
Giorno 10 Lievito di striatura, 4 ceppi per piastra (3.1.3)
Giorno 11 Preparare il DNA-esca prati (3.1.4 e 3.1.5)
Accoppiamento di lievito DNA-esca e TF matrice ceppi
Giorno 12 Accoppiamento a piastre YAPD (3.2)
Selezione di lievito diploide
Giorno 13 Selezione di lievito diploide in piastre di Sc – U – Trp (3.3)
Trasferimento a piastre della lettura
Giorno 15 Lievito diploide trasferimento alle piastre della lettura (3.4)
Imaging delle piastre della lettura
Giorni 17-22 Acquisizione di immagini di piastre di lettura a seconda della priorità bassa (3.5)

Tabella 1: Matrice di TFF.

REAGENTE QUANTITÀ (per 2 L)
Drop-out miscela sintetica meno istidina, leucina, triptofano e uracile, adenina, ricco (2 g) senza azoto lievito base 2,6 g
Azoto di lievito base senza aminoacidi e senza solfato di ammonio (YNB) 3,4 g
Adenina hemisulfate diidrato 160 mg
Solfato di ammonio 10 g
Agar 35 g
Glucosio (40%, p/v) in acqua, sterile 100 mL
Leucina (100 mM), sterile filtrata 16 mL
Triptofano (40 mM), sterile filtrato 16 mL

Tabella 2: Reagente elenco I.

REAGENTE QUANTITÀ (per 2 L)
Peptone 40 g
Estratto di lievito 20 g
Adenina hemisulfate diidrato 0,32 g
Glucosio (40%, p/v) in acqua, sterile 100 mL
Agar 35 g

Tabella 3: Elenco di reagente II.

REAGENTE QUANTITÀ (per 2 L)
Drop-out mix sintetico meno istidina, leucina, triptofano e uracile, ricchi di adenina (2 g) w/o azoto lievito base 2,6 g
Azoto di lievito base senza aminoacidi e senza solfato di ammonio (YNB) 3,4 g
Adenina hemisulfate diidrato 160 mg
Solfato di ammonio 10 g
Agar 35 g
Glucosio (40%, p/v) in acqua, sterile 100 mL
Leucina (100 mM), sterile filtrata 16 mL
Istidina (100 mM), sterile filtrata 16 mL
Uracile (20 mM), sterile filtrata (omettere per piastre di Sc – U – Trp) 16 mL

Tabella 4: Reagente elenco III.

REAGENTE QUANTITÀ (per 2 L)
Drop-out mix sintetico meno istidina, leucina, triptofano e uracile, ricchi di adenina (2 g) w/o azoto lievito base 2,6 g
Azoto di lievito base senza aminoacidi e senza solfato di ammonio (YNB) 3,4 g
Adenina hemisulfate diidrato 160 mg
Solfato di ammonio 10 g
Agar 35 g
Glucosio (40%, p/v) in acqua, sterile 100 mL
10 x BU sali 200 mL
Leucina (100 mM), sterile filtrata 16 mL
3AT (2 M), filtrato sterile 5 mL
X-gal (80 mg/mL) in DMF 4 mL

Tabella 5: Reagente elenco IV.

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Discussion

L'approccio di screening degli amori robotici eY1H descritto qui notevolmente aumenta il throughput per identificare l'insieme di TFs che si legano ad una regione di DNA di interesse, rispetto al precedente screening libreria o screening allinearono approcci basati sulla trasformazione. Inoltre, le interazioni di TF-DNA rilevate da eY1H le analisi sono altamente riproducibili come il 90% delle interazioni rilevate sono testati positivi per tutte le quattro colonie in TF e 90% delle interazioni verificare nuovamente in uno schermo indipendente del ceppo stesso lievito DNA-esca10 , 12 , 19. ancora più importante, interazioni di TF-DNA rilevati dal eY1H convalidare ad un tasso di 40 – 70% quando testati in reporter umano saggi12,20, in cellule umane primarie (dati non pubblicati) e negli animali knockout di c. elegans 11. si tratta di un tasso di convalida simile a quello osservato per ChIP-seq dati21.

Anche se interazioni identificati da eY1H sono altamente riproducibili quando riprove il lievito stesso ceppo di DNA-esca, prova diversi ceppi di lievito per lo stesso DNA-esca a volte produce diversi, sebbene insiemi delle interazioni TF-DNA, sovrapposti. Questo è solitamente dovuto le differenze nell'attività di reporter di sfondo tra i ceppi. Inoltre, test di frammenti di una sequenza di DNA si traduce nella rilevazione di altre interazioni di TF-DNA prova la sequenza completa, in particolare quando frammenti sovrapposti vengono testati. Questo può essere correlato con il dosaggio più efficienti nell'identificazione di interazioni che si trovano anche i promotori di minimo di reporter, e perché test sovrapposizione frammenti riduce le probabilità che un sito di legame può essere occlusi da nucleosomi lievito. Così, per progetti su piccola scala, è consigliabile che sovrapposti 0,5 – 1 kb frammenti di una regione regolatrice sono testati e che due sforzi indipendenti sono proiettati per ogni sequenza di DNA-esca8.

Ci sono diversi passaggi critici nella eY1H screening protocollo per evitare alcuni dei problemi presentati in Figura 3. In primo luogo, anche se la maggior parte degli ingredienti di supporto sono stabile per diversi mesi (eccetto 3AT e X-gal), una mancanza di crescita corretta Colonia probabile indica che almeno uno degli ingredienti può aver perso attività e deve essere sostituito. In secondo luogo, è importante preparare le piastre rettangolari, così che l'agar è livellato ed in modo che essi non a secco per più di un giorno evitare il fallimento in blocco quando si utilizza la piattaforma robotica. Infine, è la chiave per utilizzare i programmi di piattaforma robotica come indicato nel protocollo (rivisitare, riciclare, miscelazione, ecc.) per il lievito per essere trasferiti in modo efficace, per l'accoppiamento di essere efficiente e di evitare la contaminazione incrociata tra cloni di lievito.

Gli esempi che abbiamo scelto per illustrare l'utilizzo di schermi eY1H corrispondono ai promotori dei geni umani. Tuttavia, altre regioni regolarici possono anche essere testati tra cui esaltatori e silenziatori. Ad esempio, utilizziamo eY1H saggi per valutare l'associazione di TF al rinforzatori inerente allo sviluppo umani e al c. elegans primo introni12,22. Inoltre, dato che le interazioni sono testati in maniera pairwise, saggi eY1H utilizzabile per confrontare interazioni tra varianti non codificanti e tra le varianti di sequenza codifica TF. Ad esempio, utilizzando dosaggi di eY1H che abbiamo identificato alterato legame TF 109 non codificanti varianti associate a diverse malattie genetiche e anche profili di interazioni differenziale per 58 TF mutazioni missenso12,14. Questo protocollo si concentra sulla valutazione associazione TF a umane regioni regolative, regioni di DNA da altre specie possono anche essere testate purché un TF-preda è disponibile o può essere generato. Infatti, le matrici TF-preda sono state generate per10di c. elegans, Drosophila melanogaster23, Mus musculus24, Arabidopsis thaliana25,26, e Zea mays 27. così, con risorse sempre più disponibili, saggi di eY1H possono essere applicati a sistemi aggiuntivi.

Anche se eY1H saggi sono stati strumentali per identificare il repertorio di TFs che si legano a diverse regioni regolatorie nella specie umana e altri, essi non sono liberi di avvertimenti8,11,12,19 ,20,25. Uno dei limiti è che interazioni vengono testati nell'ambito del nucleo di lievito e, anche se i DNA-esche sono cromatinici, struttura della cromatina in lievito potrebbe non riflettere la struttura della cromatina nelle specie da cui ha avuto origine il DNA-esca e non riflette le differenze di tipo delle cellule osservate in vivo. Così, interazioni identificate dalle analisi di eY1H devono essere convalidati in reporter o altri saggi funzionali. Di nota, noi e gli altri hanno trovato interazioni TF-DNA rilevati dal eY1H convalidare ad un tasso di 40%-70% in saggi funzionali11,12,20,23. Un'altra limitazione di saggi di eY1H è che non riesce a rilevare le interazioni che coinvolgono TFs che richiedono modifiche post-traduzionali assente nel lievito per associare a DNA, TFs che non sono correttamente piegato in lievito quando fusa all'annuncio e TFs che mancano dalla matrice 8. Inoltre, nel formato corrente, eY1H saggi non rilevare le interazioni che coinvolgono heterodimeric TFs, come ogni colonia di lievito nella matrice TF esprime un singolo TF-preda. Così, ulteriori miglioramenti nel test aumenterà l'ampiezza di TFs che possono essere testati ed espandere le funzionalità di analisi eY1H per identificare interazioni romanzo di TF-DNA

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health [R35-GM128625 a J.I.F.B.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

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References

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Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

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