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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

ट्यूमर प्रतिरक्षा Profiling और उपचार प्रतिक्रिया आकलन के लिए चूहों में स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं की intramucosal टीका

Published: April 22, 2019 doi: 10.3791/59195
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1
1Department of Radiation Oncology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 2Department of Anesthesiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 3Division of Radiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus

Summary

यहां हम सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के एक orthotopic murine मॉडल के विकास के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि वर्तमान । ट्यूमर परिगलन, गरीब भेदभाव, नोडल मेटास्टेसिस, और प्रतिरक्षा घुसपैठ सहित रोग के नैदानिक प्रासंगिक histopathological सुविधाओं का प्रदर्शन । ट्यूमर असर चूहों, निगलने में कठिनाई, जबड़े विस्थापन, और वजन घटाने सहित नैदानिक प्रासंगिक लक्षण विकसित करना ।

Abstract

सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNSCC) पुनरावृत्ति और उपचार की विफलता की एक उच्च व्यापकता के साथ एक दुर्बल और घातक रोग है । बेहतर चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए, ट्यूमर microenvironmental कारक है कि उपचार प्रतिरोध करने के लिए योगदान को समझना महत्वपूर्ण है । रोग तंत्र को समझने और चिकित्सा में सुधार करने के लिए एक प्रमुख बाधा murine कोशिका लाइनों है कि मानव HNSCCs की आक्रामक और मेटास्टेटिक प्रकृति के समान की कमी रही है । इसके अलावा, murine मॉडल के बहुमत ट्यूमर के चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण जो उच्च संवहनी घनत्व, व्यापक लसीका वाहिकान्यास, और निवासी श्लैष्मिक वनस्पति सहित सिर और गर्दन क्षेत्र के महत्वपूर्ण शारीरिक सुविधाओं की कमी को रोजगार । इस अध्ययन का उद्देश्य विकसित करने के लिए और HNSCC के एक orthotopic मॉडल की विशेषता है । हम दो आनुवंशिक रूप से अलग murine कोशिका लाइनों को रोजगार और चूहों की बुक्कल म्यूकोसा में ट्यूमर की स्थापना की । हम की स्थापना की ट्यूमर से एकल कोशिकाओं के इष्टतम वसूली के लिए collagenase आधारित ट्यूमर पाचन तरीकों का अनुकूलन । यहां प्रस्तुत आंकड़ों से पता चलता है कि चूहों अत्यधिक vascularized ट्यूमर है कि क्षेत्रीय लिम्फ नोड्स के लिए metastasize विकसित । एकल कोशिका बहुप्राचलिक द्रव्यमान कोशिका मिति विश्लेषण सभी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बहुमत का प्रतिनिधित्व माइलॉयड कोशिकाओं के साथ विविध प्रतिरक्षा आबादी की उपस्थिति से पता चलता है. इस अध्ययन में प्रस्तावित मॉडल कैंसर जीव विज्ञान, ट्यूमर इम्यूनोलॉजी, और उपंयास चिकित्सा विज्ञान के पूर्व नैदानिक विकास में आवेदन किया है । मानव रोग के नैदानिक सुविधाओं के लिए orthotopic मॉडल की समानता बढ़ाया अनुवाद और बेहतर रोगी परिणामों के लिए एक उपकरण प्रदान करेगा ।

Introduction

HNSCC दुनिया भर में पांचवां सबसे आम द्रोह है, ६००,००० प्रति वर्ष का निदान1से अधिक रोगियों के साथ. कीमोथेरेपी और रेडियोथेरेपी (आरटी) के साथ आक्रामक उपचार के बावजूद, मानव पेपिलोमा वायरस (एचपीवी) संक्रमण के बिना hnscc रोगियों के लिए समग्र अस्तित्व (ओएस) 5 साल2के बाद ५०% से नीचे रहता है । यह काफी हद तक एक अत्यधिक जटिल ट्यूमर microenvironment के लिए जिंमेदार के रूप में ट्यूमर सिर और गर्दन क्षेत्र के भीतर कई अलग संरचनात्मक साइटों से उत्पन्न कर सकते हैं, मुख mucosa सहित, जीभ, मुंह के फर्श, नाक गुहा, मौखिक गुहा, ग्रसनी, पर्वतक, और हाइपोफेरिंक्स । इसके अलावा, सिर और गर्दन क्षेत्र अत्यधिक vascularized है और शरीर3में सभी लिंफ नोड्स के लगभग आधे शामिल हैं । सिर और गर्दन ट्यूमर जीवविज्ञान की जांच अध्ययन के बहुमत पार्श्व क्षेत्र में ट्यूमर मॉडल पर भरोसा करते हैं । इस तरह के मॉडल ट्यूमर आंतरिक तंत्र में अंतर्दृष्टि की पेशकश कर सकते हैं, लेकिन देशी सिर और गर्दन microenvironment की कमी काफी ऐसे निष्कर्षों के स्थानांतरीय क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं । एक तरीका है कि मौखिक ट्यूमर प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कैंसरकारक के माध्यम से है 9, 10-dimethyl-1, 2-benzanthracene (डीएमबीए)4. हालांकि, इस विधि एक लंबी प्रक्रिया के साथ जुड़ा हुआ है, चूहों में नहीं बल्कि चूहों और hamsters में ट्यूमर लाती है, और जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर विभेदक sccs5,6के ऊतकीय सुविधाओं के कई अधिकारी नहीं है । Carcinogen4 के परिचय-nitroquinoline 1-ऑक्साइड (4-nqo), एक पानी में घुलनशील क्विनोलोन व्युत्पंन, माउस मौखिक ट्यूमर के परिणामस्वरूप जब मौखिक रूप से लागू किया है, लेकिन यह भी लंबे समय से जोखिम समय से सहा (16 सप्ताह) और एक सीमित दर ले भीतर और बैचों के बीच 7,8,9चूहों की । आदेश में नैदानिक प्रासंगिक मॉडल विकसित करने के लिए, कई समूहों के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर TP53, TGFB, KRAS, HRAS सहित ड्राइवर oncogenes या ट्यूमर शमन जीन, के हेरफेर शामिल मॉडलों का उपयोग किया, और SMAD410। इन मॉडलों ज्ञात चालक जीन के साथ ट्यूमर में अंतर्दृष्टि की पेशकश कर सकते हैं, लेकिन मानव hnsccs की जटिल विषमता संक्षेप नहीं है ।

इस काम में, हम चूहों में स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं की एक इंट्रायूकोसल टीका प्रदर्शन की व्यवहार्यता का प्रदर्शन । Inoculated कोशिकाओं इंजेक्शन के 1 सप्ताह के भीतर आक्रामक ट्यूमर में विकसित । मानव HNSCCs के लिए इसी प्रकार, ट्यूमर क्षेत्रीय लिम्फ नोड्स के लिए metastasize. हम रोग के ऊतकीय और नैदानिक सुविधाओं की विशेषता है और ट्यूमर प्रतिरक्षा microenvironment में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । हम प्रस्ताव है कि HNSCC के इस orthotopic मॉडल कैंसर जीव विज्ञान, ट्यूमर इम्यूनोलॉजी, और पूर्व नैदानिक अध्ययन में आवेदन किया है । प्रतिरक्षा चोरी, ट्यूमर प्रगति, उपचार प्रतिरोध के तंत्र, और मेटास्टेसिस नैदानिक महत्व के क्षेत्रों है कि प्रस्तावित मॉडल का उपयोग कर संबोधित किया जा सकता का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं एक अनुमोदित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया कोलोराडो विश्वविद्यालय के डेनवर (प्रोटोकॉल # ००२५०) ।

1. ट्यूमर कोशिका संस्कृति

नोट: B4B8 और LY2 कोशिका लाइनों के लिए orthotopic hnscc ट्यूमर उत्पंन किया गया: B4B8 ट्यूमर कोशिकाओं कैसरजन से व्युत्पंन-श्लैष्मिक keratinocytes बदल रहे थे (balb से/ LY2 ट्यूमर कोशिकाओं एक अनायास बदल balb के लिम्फ नोड मेटास्टेसिस से व्युत्पंन किए गए थे २१२/ डॉ नदीराजह विग्नेश्वरन (UTHealth, ह्यूस्टन, TX, संयुक्त राज्य अमेरिका) द्वारा दोनों सेल लाइनों कृपया प्रदान की गई ।

  1. का प्रयोग करें Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) F/12 पूरक के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% रोगाणुरोधी अभिकर्मक सेल लाइन के रखरखाव के लिए. ३७ ° c और 5% CO2पर एक बाँझ इनक्यूबेटर में इन सेल लाइनों को बनाए रखें । कोशिकाओं का उपयोग 15 मार्ग से अधिक होने से पहले टीका लगाने के लिए किया जाना चाहिए ।
  2. प्लेट 2 x 106 से 4 x 106 १७५ सेमी में कोशिकाओं2 सेल संस्कृति flasks है ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं से कम ९०% है एक तनाव प्रतिक्रिया उत्प्रेरण से बचने के लिए संगम ।
  3. जब कोशिकाएं ७०% प्रतिवर्ती (~ ४८ h) होती हैं, तो क्यूबेटर से फ्लास्क निकालें और 3x को कोल्ड फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS) से धोएं ।
  4. ०.२५% trypsin का उपयोग कर फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग, काफी थाली की सतह को कवर करने के लिए ।
    1. ऐसा करने के लिए, एक १७५ सेमी में ट्रिपसिन के 4 मिलीलीटर वितरित2 फ्लास्क जिसमें ७०% संगम कोशिकाओं । 3 के लिए ट्रिपसिन के साथ कोशिकाओं को सेते-4 मिनट में सेल संस्कृति इंक्यूबेटर में ३७ ° c और 5% CO2।
    2. कोशिका टुकड़ी को सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कक्षों को विज़ुअलाइज़ करें.
    3. ट्रिपसिन गतिविधि बेअसर करने के लिए fbs युक्त dmem F/12 मीडिया के 12 मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. कोशिका निलंबन को महाप्राण दें और इसे ५० मिलीलीटर शंक्वाकार नली में रखें ।
  6. हिला यह 3x – 4x प्रतिलोम द्वारा कोशिकाओं से युक्त ट्यूब ।
  7. वैकल्पिक रूप से, एक microcentrifuge ट्यूब में Trypan नीले रंग की 10 μL के साथ सेल निलंबन की एक 10 μL aliquot मिश्रण और एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती । Trypan-नीला-धनात्मक कक्षों की कुल संख्या से कक्षों की संख्या घटाकर और कक्षों की कुल संख्या से विभाजित करके कक्ष व्यवहार्यता निर्धारित करें ।
  8. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर सेल निलंबन ।
  9. एक उचित मात्रा में सीरम मुक्त और एंटीबायोटिक मुक्त DMEM में कोशिकाओं को फिर से निलंबित ताकि 1 x 106 कोशिकाओं मीडिया के ५० μl में मौजूद हैं ।
    नोट: के आधार पर vivo में सेल लाइन आक्रामकता (निर्धारित अनुभवहीनता), प्रति माउस इंजेक्शन साइट के प्रति 1 x 106 कोशिकाओं B4B8 और LY2 कोशिकाओं के लिए उपयुक्त समझा गया था ।
  10. बर्फ पर कोशिका निलंबन युक्त शीशी रखें ।
  11. बर्फ पर पूर्व thawed तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्लेस ।
    नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात thawed था ।

2. चूहों में सेल इंजेक्शन

  1. एक 1:1 कोशिकाओं का मिश्रण तैयार: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (५० μL प्रत्येक) ।
  2. पहले कक्षों को जोड़ें; फिर, धीरे से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पिपेट । हवा बुलबुले शुरू करने से बचें । सुनिश्चित करें कि मिश्रण तुरंत पशु इंजेक्शन से पहले किया जाता है । तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के लिए समय की एक विस्तारित अवधि के लिए कक्षों को जोड़ने मैट्रिक्स मिश्रण है, जो मिश्रण को कड़ाई से हिला मुश्किल बनाता है में बसने सेल में परिणाम कर सकते हैं । यह चूहों के बीच ट्यूमर के आकार में एक काफी परिवर्तनशीलता का कारण होगा ।
  3. धीरे से मिलाएं । सुनिश्चित करें कि सभी चरणों को शामिल मैट्रिक्स बर्फ पर प्रदर्शन कर रहे हैं । बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स, कमरे के तापमान पर बहुलकीकरण करेगी ।
  4. टीका लगाने के लिए सिरिंज तैयार करें ।
  5. भार ०.५ मिलीलीटर इंसुलिन सीरिंज (23 ग्राम) १०० μL के साथ कोशिका/
  6. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बहुलकीकरण से बचने के लिए बर्फ पर सीरिंज रखो ।
  7. चूहों को आइसोफ्लूरेन और ऑक्सीजन (२.५%) के साथ एक चैंबर में रखकर संवेदनीकरण करें ।
  8. सुनिश्चित करें कि चूहों गहरी (एक पैर की अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी सुनिश्चित करने के द्वारा) इंजेक्शन प्रदर्शन करने से पहले संवेदनेपन कर रहे हैं ।
  9. सुई को दाईं या बाईं मुख क्षेत्र में डालें । यह मुंह के दोनों ओर उपलब्ध खुली जगह के माध्यम से किया जाता है ।
  10. यह सुनिश्चित करें कि माउस की जीभ रास्ते में नहीं है ।
    नोट: जीभ को पोक करना आसान होता है, जिसका परिणाम जीभ के ट्यूमर में होगा । जरूरत पड़ने पर जीभ को विपरीत दिशा में ले जाएं ।
  11. मौखिक गुहा के अंदर जबकि बुक्कल क्षेत्र के समानांतर सिरिंज रखें ।
  12. जब सुई करने के लिए तैयार है, वापस सिरिंज खींचने के लिए और धीरे से एक 10 डिग्री कोण पर सिरिंज डालने.
  13. 5 एस की अवधि के दौरान कोशिका/तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के १०० μL के इंजेक्शन ।
  14. एक अतिरिक्त 5 एस सुनिश्चित करने के लिए सभी सामग्री इंजेक्ट किया जाता है के लिए जगह में सिरिंज पकड़ो ।
    नोट: नियंत्रण nontumor असर चूहों के लिए, सीरम का एक मिश्रण मुक्त मीडिया और मैट्रिक्स (के रूप में ऊपर वर्णित के रूप में) ट्यूमर कोशिकाओं के बिना सुई ।
  15. सिरिंज को धीरे से वापस लें ।
  16. शेष चूहों के साथ उपरोक्त कार्यविधि जारी रखें ।
  17. 1 सप्ताह के लिए अनुमति दें जब तक ट्यूमर मोटे तौर पर प्रकट करने के लिए शुरू (B4B8 और LY2 कोशिकाओं के लिए 50-200 मिमी3 ).

3. माउस की निगरानी

  1. पहला माप कैलिपर्स का उपयोग कर 1 सप्ताह में ट्यूमर कोशिका इंजेक्शन के बाद प्रदर्शन करते हैं । आदेश में बाहरी नली का व्यास का उपयोग कर ट्यूमर की मात्रा की गणना करने के लिए, सबसे बड़ी अनुदैर्ध्य (लंबाई) और सबसे बड़ी अनुप्रस्थ व्यास (चौड़ाई) का निर्धारण और संशोधित दीर्घवृत् तजीय फार्मूला14,15का उपयोग करें ।
    Equation
  2. ट्यूमर की मात्रा (नियमित अंतराल पर प्रति सप्ताह 1x – 2x) के लिए नियमित रूप से कैलिपर माप करने के लिए जारी रखें ।
  3. पशु वजन उपाय खिलाने पर ट्यूमर के विकास के प्रभाव का आकलन करने के लिए ।

4. संचयन ट्यूमर

  1. जब प्रयोगात्मक समापन बिंदु तक पहुँच गया है, उपयुक्त उपायों का उपयोग कर जानवरों euthanize (जैसे, सीओ2 asphyxiation, decapitation, या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था).
    नोट: इस अध्ययन में, समापन बिंदु अगर चूहों मरणासन्न हो गया था (अपने प्रारंभिक वजन के > 15% की एक वजन घटाने के साथ, सौंदर्य की कमी, cachexia) और १,०००/
  2. गर्दन क्षेत्र में मध्य रेखा के माध्यम से एक लंबा चीरा बनाने के द्वारा पशु विदारक शुरू करते हैं ।
    1. त्वचा और तेज कैंची हड़पने के लिए कुंद संदंश का उपयोग करने के लिए त्वचा में कटौती ।
  3. ट्यूमर को कवर त्वचा के नीचे धीरे कैंची डालें और भर में और त्वचा में कैंची धक्का द्वारा हवा जेब पैदा करते हैं ।
  4. एक बार त्वचा पर्याप्त ट्यूमर से अलग है, draining लिम्फ नोड्स (DLNs) की पहचान करने और उंहें ट्यूमर ऊतक लिम्फ नोड्स की उपस्थिति से चकित होने से बचने के लिए उत्पाद शुल्क ।
    नोट: बड़े ट्यूमर तक पहुँचने और/या DLN को कवर कर सकते हैं । परख के प्रकार पर निर्भर करता है प्रदर्शन किया जा रहा है, अक्षुण्ण लिम्फ नोड्स के अलगाव को ट्यूमर है, जो परख परिणाम विघूर्णन में परिणाम होगा में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बिखराव से बचने के लिए आवश्यक है ।
  5. ट्यूमर की सीमाओं के माध्यम से काट जब तक पूरी मात्रा अलग है ।

5. डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए ट्यूमर प्रसंस्करण

  1. डाउनस्ट्रीम हिस्टोलॉजिक एग्जामिनेशन के लिए, कमरे के तापमान पर 10% फॉर्मेलिन में ट्यूमर रखें । Overfixation से बचने के लिए, फॉर्मेलिन के साथ ७०% इथेनॉल की जगह । प्रवाह कोशिका मिति विश्लेषण के लिए, ट्यूमर नीचे वर्णित के रूप में प्रक्रिया ।
    नोट: ऊतक ७२ h के लिए फॉर्मेलिन में रखा जा सकता से पहले overfixation धुंधला के कुछ प्रकार के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है ।
  2. 1-2 मिमी-एक बाँझ ब्लेड या तेज कैंची का उपयोग टुकड़ों के आकार में ट्यूमर काट ।
  3. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कटौती ट्यूमर टुकड़े प्लेस collagenase III के साथ (नमूना प्रति ४,२५० इकाइयों), dnase मैं (०.१ मिलीग्राम प्रति नमूना), और ट्रिपसिन अवरोध करनेवाला (नमूना प्रति मिलीग्राम 1) ।
  4. हर 10 मिनट मिलाते हुए 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेक्यूबेट ।
    नोट: नमूनों को एक रेसीयोग्य बैग में रखा जा सकता है, ९०% इथेनॉल के साथ निष्फल, और एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखा जाता है ।
  5. 30 मिनट के बाद, हैंक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 20 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर स्पिन ।
    नोट: एचबीएसएस में पोटेशियम क्लोराइड, सोडियम क्लोराइड, सोडियम बाइकार्बोनेट, सोडियम फॉस्फेट डीबेसिक, सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक और ग्लूकोज शामिल है ।
  6. Supernatant फेंक और लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर के 2-3 मिलीलीटर में गोली resuspend । पिपेट कड़ाई से ।
    नोट: आरबीसी lysis बफर में अमोनियम क्लोराइड, सोडियम बाइकार्बोनेट, और डाइसोडियम होता है ।
  7. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    नोट: अब ऊष्मायन अंय सेल आबादी के लिए विषाक्त हो सकता है ।
  8. Lysis बफर के प्रभाव को बेअसर करने के लिए HBSS के 20 मिलीलीटर जोड़ें ।
  9. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर अपकेंद्रित्र और supernatant त्यागने ।
  10. HBSS के 10 मिलीलीटर में गोली फिर से निलंबित ।
  11. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर एक ७० μm नायलॉन निरोधक और अपकेंद्रित्र के माध्यम से समाधान गुजारें ।
  12. चरणों को दोहराएं 5.8 – 5.10 और एक ४० μm नायलॉन निरोधक के माध्यम से सेल निलंबन पारित करने के लिए किसी भी अतिरिक्त मलबे निलंबन से हटा दिया जाता है सुनिश्चित करने के लिए ।

6. सेल धुंधला और डेटा अधिग्रहण

  1. HBSS के 1 मिलीलीटर में सेल गोली फिर से निलंबित ।
  2. एक hemocytometer या एक स्वचालित कक्ष काउंटर, चरण १.७ में वर्णित के रूप में का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना
  3. कुल सेल संख्या और धुंधला के लिए उपयुक्त एकाग्रता निर्धारित करें ।
    नोट:     प्रवाह कोशिका मिति के लिए आदर्श कोशिका एकाग्रता 1 – 2 मिलियन कोशिकाओं है । उदाहरण के लिए, यदि धुंधला एक ९६-well थाली में किया जाता है और वहां १०,०००,००० कोशिकाओं रहे हैं, 1 मिलीलीटर और थाली १०० μl में नमूना प्रति अच्छी तरह १,०००,००० कोशिकाओं के लिए resuspend ।
  4. 1:100 की एकाग्रता पर Fc ब्लॉक (CD16/CD32) जोड़ें nonantigen-विशिष्ट fcγiii और fcγii रिसेप्टर्स करने के लिए इम्युनोग्लोबुलिन की बाइंडिंग को रोकने के लिए । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    1. अपकेंद्रित्र और १०० μL प्रवाह कोशिका मिति सेल धुंधला बफर (5% FBS युक्त खारा समाधान के शामिल है, 2% EDTA, और 1% HEPES) में सेल गोली resuspend ।
  5. सेल की सतह का प्रदर्शन प्रदायक के अनुसार-प्रदान निर्देश (उपयुक्त कमजोर पड़ने पर प्रत्येक एंटीबॉडी जोड़ने) । कमरे के तापमान पर ६० मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    1. अपकेंद्रित्र और सेल गोली HBSS के १०० μL में पुनः स्थगित । दोहराएं 2x अतिरिक्त एंटीबॉडी से छुटकारा पाने के लिए ।
  6. एक उपयुक्त प्रवाह cytometer पर नमूने चलाएँ ।
    1. यदि intracellular मार्कर का विश्लेषण (जैसे, foxp3), सेल permeabilization प्रदर्शन और आपूर्तिकर्ता के निर्देशों के अनुसार धुंधला ।

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Representative Results

LY2 और B4B8 कोशिका प्रसार के इन विट्रो आकलन से पता चला है कि दोनों सेल लाइनों के समान दोहरीकरण बार (21 एच और 23 एच, क्रमशः) है । विवो में, दोनों कोशिका रेखाएँ टीका के 1 सप्ताह के भीतर एकल, दृश्यमान और स्पर्शनीय द्रव्यमान का निर्माण कर देती हैं (चित्र 1a) । चूहों LY2 ट्यूमर असर में, जबड़े 3 ट्यूमर बोझ (चित्र 1a) के कारण सप्ताह से विस्थापित किया गया था । नियंत्रण चूहों कि ट्यूमर कोशिकाओं को प्राप्त नहीं किया प्रत्याशित के रूप में ट्यूमर विकसित नहीं किया । LY2 ट्यूमर B4B8 ट्यूमर की तुलना में एक उच्च दर से बढ़ी । LY2 ट्यूमर असर चूहों में 21 दिन पर औसत ट्यूमर की मात्रा B4B8 ट्यूमर में १६२ ± 4 मिमी3 की तुलना में ६३२ ± 10 मिमी3 था (चित्र 1b) । जबड़े का प्रदर्शन करने वाले चूहों ने अपच के कारण वजन में तेजी से विकास किया (चित्र 1C) । चूहों अपने प्रारंभिक वजन के 15% के > के रूप में परिभाषित महत्वपूर्ण वजन घटाने का प्रदर्शन और/> 1 सेमी3 के एक ट्यूमर मात्रा होने नोट अवलोकन के 1 दिन के भीतर euthanized थे । LY2 चूहों में औसत अस्तित्व २२.५ दिन था, B4B8 ट्यूमर असर चूहों में ५२.० दिनों की तुलना में (चित्रा 1D).

ट्यूमर युक्त चूहों के चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) ने मुख म्यूकोसा की भीतरी परत में विस्तार करते हुए अच्छी तरह से सीमांकित ट्यूमर दिखाया (चित्र 2a). ट्यूमर जीभ या अन्य पास के अंगों (घेघा, ब्रोंकस, thymus) के रूप में ऊतकीय मूल्यांकन के साथ दिखाया में आक्रमण नहीं किया । श्री प्रतिबिंबों पर संकेत विविधता वैस्कुराइज्ड हाइपरइंटेंस क्षेत्रों (V के साथ चिह्नित) और परिगलित हाइप्टकाल क्षेत्रों (N के साथ चिह्नित) (चित्र 2a) की उपस्थिति का प्रतिनिधि था । एक सकल रोग परीक्षा बढ़े DLNs (चित्र 2b) दिखाया । हम आगे कैलिपर मापन की विश्वसनीयता का निर्धारण करने के लिए गणना टोमोग्राफी (सीटी) के साथ ट्यूमर की मात्रा का आकलन किया । ट्यूमर एक डिजिटल इमेजिंग और संचार में चिकित्सा (DICOM) छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर16का उपयोग चित्रित किया गया । कैलिपर्स द्वारा LY2 ट्यूमर मात्रा का आकलन और सीटी इमेजिंग दो तरीकों के बीच एक उत्कृष्ट सहसंबंध दिखाया (R2 = ०.८४९३; चित्र 2c) । यह इंगित करता है कि ट्यूमर के विकास के मुख्य रूप से बहिर्पादप और कैलिपर माप ट्यूमर के विकास के मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय तरीका है । Histologic परीक्षा से पता चला है कि सभी LY2 ट्यूमर असर चूहों के विकसित खराब अलग स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (चित्रा 2d) । नौ में से नौ LY2 ट्यूमर असर चूहों पहले और दूसरे सोपानक लिंफ नोड्स के लिए मेटास्टेसिस विकसित की है । नोडल मेटास्टेसिस मुख्य रूप से subcapsular थे (नौ चूहों में से सात के साथ) और साइनस के भीतर (नौ चूहों में से पांच के साथ), के साथ दो नौ चूहों के बाहर intracपुटी आक्रमण का प्रदर्शन । इसके विपरीत, B4B8 ट्यूमर असर चूहों मामूली विभेदक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा विकसित (चित्रा 2E) और क्षेत्रीय या दूर साइटों, dlns सहित करने के लिए metastasize नहीं किया था । परिगलन एक पहले से स्थापित तीन ग्रेड के आधार पर मूल्यांकन किया गया था स्केल: 0 = कोई दृश्यमान परिगलन, 1 = scant, 2 = मॉडरेट, और 3 = गंभीर17। सभी LY2 ट्यूमर असर चूहों histologically (दस में से सात) गंभीर परिगलन (चित्रा 2F) के लिए उदार प्रदर्शन बहुमत के साथ परिगलन की पुष्टि की थी । B4B8 ट्यूमर में परिगलन का कोई सबूत नहीं देखा गया ।

हम ट्यूमर-प्रतिरक्षा microenvironment के आगे लक्षण वर्णन के लिए LY2 ट्यूमर मॉडल पर ध्यान केंद्रित । ट्यूमर के बाद 3 सप्ताह में काटा ट्यूमर टीका और पचा collagenase III का उपयोग कर, कोशिका सतह और प्रवाह के लिए intracellular मार्कर के धुंधला द्वारा पीछा किया/ नमूने संसाधित किए गए, एक मास cytometer का उपयोग कर, कोलोराडो विश्वविद्यालय डेनवर प्रवाह कोशिका मिति साझा संसाधन में । गेटिंग और डेटा विश्लेषण प्रवाह कोशिका मिति वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । डेटा प्राप्त कई प्रतिरक्षा सेल आबादी की उपस्थिति डिग्री बदलती करने के लिए दिखाया । कुल प्रतिरक्षा कोशिकाओं (CD45+) कुल ट्यूमर का ७.३% का प्रतिनिधित्व किया (चित्रा 3 बी). पूर्ण संख्या में, हमने देखा, औसतन, 26 CD45+ कोशिकाओं (SD = ०.८१) प्रति मिलीग्राम ट्यूमर ऊतक (चित्रा 3b). Myeloid कोशिकाओं (CD11b+) सभी CD45+ कोशिकाओं का ३७.८% का प्रतिनिधित्व किया (चित्रा 3 सी). Myeloid कोशिकाओं मुख्यतः मैक्रोफेज (F4/80 +, ६३.०%), myeloid-व्युत्पंन दबानेवाला कोशिकाओं (MDSCs) (Gr1 +, ८.५१%) और न्यूट्रोफिल (Ly6G +, ५.८७%) । कुल टी कोशिकाओं CD45 के साथ शामिल १५.९%+ कोशिकाओं सीडी4 + टी सभी टी कोशिकाओं (७९.४%), जिनमें से ५३.४% के बहुमत से शामिल कोशिकाओं (tregs) (सीडी 4+FoxP3+) (चित्रा 3 डी) । प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं सभी CD45+ कोशिकाओं के १.७५% शामिल हैं । इन आंकड़ों LY2 orthotopic hnscc ट्यूमर जो संभावना ट्यूमर प्रगति और प्रतिरक्षा चोरी में मध्यस्थता में एक भूमिका निभा में विभिंन प्रतिरक्षा पैठ की उपस्थिति पर प्रकाश डाला ।

Figure 1
चित्रा 1: orthotopic HNSCC ट्यूमर असर चूहों की निगरानी. (क) ट्यूमर युक्त चूहों की प्रतिनिधि छवियां । टीका के 1 सप्ताह के भीतर एक ट्यूमर विकसित करता है । 3 सप्ताह में, जबड़े के विस्थापन मनाया जाता है । (ख) B4B8 में ट्यूमर की वृद्धि दर और कैलिपर मापन द्वारा निर्धारित ट्यूमर-धारी चूहों LY2 । (ग) B4B8 या LY2 ट्यूमर असर चूहों के शरीर के वजन में परिवर्तन. (घ) B4B8 और LY2 ट्यूमर वाले चूहों के अस्तित्व । सलाखों के प्रति समूह 7 के माध्य (SEM) की मानक त्रुटि-10 चूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: इमेजिंग और murine HNSCC ट्यूमर के histologic सुविधाएँ. (क) एक LY2 ट्यूमर-असर चूहे के प्रतिनिधि किरीटी श्री छवि । Anपरमाणुक साइटों लेबल कर रहे हैं । संकेत की अतितीव्रता के क्षेत्र वाहिकाप्रकृत क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं । संकेत हाइपॉइंट के क्षेत्र परिगलित क्षेत्रों (निरूपित N) का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ख) विच्छेदयुक्त ट्यूमर वाले क्षेत्र का प्रतिनिधिक सकल प्रतिबिंब । सफेद तीर बढ़े हुए draining लिम्फ नोड्स (DLNs) के लिए बिंदु । (ग) कैलिपर मापन बनाम कम्प्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) आधारित मूल्यांकन द्वारा आकलित ट्यूमर की मात्रा का सहसंबंध । ढलान, सहसंबंध गुणांक (R2), और सबसे अच्छा फिट की रेखा दिखाई जाती हैं । (घ) प्रतिनिधि हेमेटोक्सिलिन और इओसिन (एच & ई) की छवि LY2 ट्यूमर की है । (अ) प्रतिनिधि भ् & ड चित्र B4B8 ट्यूमर । (च) एच & ई चार गे्रड स्कोरिंग प्रणाली पर आधारित LY2 ट्यूमर में परिगलन का परिमाणीकरण । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: बेसलाइन इंट्रायूमोरल प्रतिरक्षा आबादी का विश्लेषण समय की उड़ान (cytometry) द्वारा cytometry का उपयोग कर । ट्यूमर एक एकल कोशिका निलंबन collagenase आधारित एंजाइमी पाचन और, फिर, कोशिका की सतह और intracellular मार्कर के साथ दाग का उपयोग कर में संसाधित किया गया । (क) Cytometry मंच का उपयोग करके जन कोशिका मिति का प्रदर्शन किया गया । (ख) कुल प्रतिरक्षा कोशिकाओं (CD45+) का निरपेक्ष और सापेक्ष मात्रात्मक मूल्यांकन । (ग) माइलॉयड-प्रतिरक्षा उपआबादी का परिमाणीकरण । (घ) लिम्फोइड इम्यून सबबादियों का परिमाणीकरण । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

कठोर विश्लेषण और ट्यूमर microenvironment के लक्षण वर्णन ट्यूमर के विकास, प्रगति के तंत्र को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण रणनीति का प्रतिनिधित्व करते हैं, और मेटास्टेसिस और प्रभावी उपचार के विकास के लिए । सिर और गर्दन के कैंसर एक जटिल रोग है कि सिर और गर्दन क्षेत्र के भीतर कई संरचनात्मक साइटों से उत्पंन कर सकते है । रोग तंत्र को समझने और चिकित्सा में सुधार करने के लिए एक प्रमुख बाधा murine माउस कोशिका लाइनों है कि मानव HNSCCs की आक्रामक और मेटास्टेटिक प्रकृति के समान की कमी रही है । इसके अलावा, कई murine मॉडल ट्यूमर के एक चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण जो सिर और गर्दन क्षेत्र, एक उच्च संवहनी घनत्व, एक व्यापक लसीका वाहिकान्यास, और निवासी श्लैष्मिक वनस्पति सहित की महत्वपूर्ण शारीरिक सुविधाओं की कमी को रोजगार ।

इस अध्ययन में, हम murine HNSCC के एक orthotopic मॉडल विशेषता । हम छवि मार्गदर्शन के लिए आवश्यकता के बिना इस क्षेत्र के लिए आसान पहुँच सहित कारणों की एक संख्या के लिए ट्यूमर टीका की साइट के रूप में बुक्कल म्यूकोसा चुना, कैलिपर्स का उपयोग ट्यूमर के विकास का आकलन करने की क्षमता, श्लैष्मिक वनस्पति के भीतर ट्यूमर की उपस्थिति, आसपास के लसीकों की उपस्थिति, और reproducibility की आसानी. हालांकि बुक्कल म्यूकोसा में कोशिकाओं के इंजेक्शन सीधा है, सुई की स्थिति और प्रवेश की गहराई त्वचा के माध्यम से पंचर को रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैं और यह सुनिश्चित कोशिकाओं subcuत्वं इंजेक्शन नहीं कर रहे हैं । हम सुई अंतरा-मौखिक रूप से डालने की सिफारिश करते समय यह पूरी तरह से बुक्कल क्षेत्र के लिए समानांतर है और एक कोण पर झुकने से अधिक नहीं 10 ° जब सुई लगाने के लिए तैयार है ।

सेल लाइनों हम इस्तेमाल किया murine कोशिका वे से व्युत्पंन थे तनाव के असुरक्षित चूहों में उनके रोपण की अनुमति लाइनों थे । वहां रहे है पर ३९ HNSCC मानव कोशिका लाइनों है कि साहित्य में अध्ययन किया गया है, लेकिन एक देशी microenvironment18की उपस्थिति में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । हाल के घटनाक्रम humanized माउस मॉडल है जो मानव अस्थि मज्जा-सिर की इशारा scid गामा चूहों (भी एनएसजी चूहों के रूप में जाना जाता है), एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली है कि एक में मानव ट्यूमर के साथ बातचीत कर सकते है के विकास की अनुमति को एकीकृत के डिजाइन के लिए अनुमति इम्यूनो माउस मॉडल19. हालांकि, इस तरह के मॉडल महंगा कर रहे हैं, श्रमसाध्य प्रजनन विधियों की आवश्यकता होती है, और endothelial कोशिकाओं, fibroblasts, और लसीकाविज्ञान सहित ट्यूमर microenvironment के सभी घटकों को पुनः पूंजीकरण नहीं. Murine माउस मॉडल हम इस अध्ययन में कार्यरत मानव hnsccs के महत्वपूर्ण घटकों संक्षेप, विभिन्न प्रतिरक्षा पैठ की उपस्थिति सहित. ट्यूमर से व्यवहार्य एकल कोशिकाओं की अधिकतम पुनर्प्राप्ति सुनिश्चित करने के लिए, पाचन एंजाइमों का उपयोग आवश्यक है । Collagenase आधारित पाचन एंजाइमों कोशिकाओं पर कठोर हो सकता है और एकाग्रता और collagenase के प्रकार के अनुकूलन अलग ट्यूमर प्रकार के लिए आवश्यक हो सकता है । हम पांच पाचन एंजाइमों कि collagenase III, जो इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था निर्धारित करने से पहले की तुलना में, स्क्वैमस सेल ट्यूमर के पाचन के लिए इष्टतम विधि है ।

इस अध्ययन में प्रयुक्त ट्यूमर मॉडल HNSCC प्रतिरक्षा चोरी और विभिन्न उपचारों के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं । हम पहले प्रदर्शन किया है कि दोनों B4B8 और LY2 ट्यूमर प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधक विरोधी-पीडी-L120के लिए radioresistant और दुर्दम्य हैं । यह मानव HNSCCs के बहुमत के अनुरूप है । हाल ही में नैदानिक परीक्षणों से पता चला है कि कम hnscc रोगियों के 15% विरोधी के लिए उत्तरदाई-पीडी-1/ इसके अलावा, यह अच्छी तरह से स्थापित है कि hnsccs26,27radioresistant हैं । HNSCC में radioresistance के लिए जिंमेदार मार्ग लक्ष्यीकरण उपचार प्रतिक्रिया बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । मील का पत्थर bonner एट अल. अध्ययन सेटुक्सीमब के अलावा के साथ समग्र अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण लाभ दिखाया अकेले आरटी की तुलना में स्थानीय रूप से उंनत hnscc रोगियों में28। हाल के डेटा का प्रदर्शन है कि EphB4 के निषेध-ephrin-बी 2 orthotopic hnsccs में संकेतन और आर टी या cetuximab के जवाब में सुधार कर सकते है-आर टी ट्यूमर apoptosis को बढ़ावा देने और ट्यूमर प्रसार29,30बाधा । इसके अलावा, तर्कसंगत प्रतिरक्षा उपचार के साथ आरटी संयोजन एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने और दोनों स्थानीय ट्यूमर नियंत्रण और दूर मेटास्टेसिस के नियंत्रण को बढ़ाने कर सकते हैं31. हम हाल ही में प्रदर्शन किया है कि प्रतिरक्षा चेकपॉइंट नाकाबंदी और आर टी परिणाम में ट्यूमर उंमूलन और immunologic मेमोरी३२के साथ संयोजन में tregs लक्ष्यीकरण । भविष्य HNSCC के orthotopic मॉडल को रोजगार के अध्ययन बेहतर नैदानिक परीक्षणों के डिजाइन को सूचित करेंगे और ट्यूमर प्रतिरक्षा चोरी और उपचार प्रतिरोध के तंत्र की समझ में सुधार होगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कोई नहीं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase III Worthington Biochemical Corp. LS004183
DNase I Worthington Biochemical Corp. LS006328
Fc Block (CD16/32) BD Biosciences 553141  Clone 2.4G2 
Flow Cytometry Staining Buffer eBioscience 00-4222-26
HBSS ThermoFisher Scientific 14175079 no calcium, no magnesium, no pheno red
Helois mass cytometer Fluidigm NA
Matrigel membrane matrix Corning  CB-40234B
MRI Scanner Bruker NA 7.4 Tesla
RBC lysis buffer BioLegend 420301
Trypsin inhibitor Worthington Biochemical Corp. LS002830

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Oweida, A. J., Bhatia, S., Van Court, B., Darragh, L., Serkova, N., Karam, S. D. Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment. J. Vis. Exp. (146), e59195, doi:10.3791/59195 (2019).

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