Summary
Nous présentons ici une méthode reproductible pour le développement d’un modèle murin d’orthotopique du carcinome épidermoïde tête et du cou. Les tumeurs démontrent cliniquement pertinentes caractéristiques histopathologiques de la maladie, y compris nécrose, une différenciation pauvre, métastases nodales et infiltration immunitaire. Souris de tumeur-roulement développent des symptômes cliniquement pertinentes y compris la dysphagie, déplacement de la mâchoire et la perte de poids.
Abstract
Tête et cou carcinome épidermoïde (HNSCC) est une maladie débilitante et mortelle avec une prévalence élevée de récidive et d’échec du traitement. Pour développer des stratégies thérapeutiques mieux, compréhension tumeur micro-environnementales des facteurs qui contribuent à la résistance au traitement est important. Une entrave majeure à la compréhension des mécanismes de la maladie et améliorer la thérapie a été un manque de lignées de cellules murines qui ressemblent à la nature agressive et métastatique du HNSCCs humains. En outre, une majorité de modèles murins emploient des implantations sous-cutanées des tumeurs qui n’ont pas des caractéristiques physiologiques importantes de la région tête et cou, y compris haute densité vasculaire des vaisseaux lymphatique et flora muqueux résident. Le but de cette étude est d’élaborer et de caractériser un modèle orthotopique de HNSCC. Nous utilisons deux lignées cellulaires murins génétiquement distincts et tumeurs établies dans la muqueuse buccale de souris. Nous optimisons les méthodes de digestion de tumeur collagènase-basé pour la récupération optimale de cellules uniques de tumeurs établies. Les données présentées ici montrent que les souris développent des tumeurs fortement vascularisés qui métastaser dans les ganglions lymphatiques régionaux. Unicellulaire multiparamétriques cytometry masse analyse révèle la présence de diverses populations immunitaires avec des cellules myéloïdes, représentant la majorité de toutes les cellules immunitaires. Le modèle proposé dans la présente étude a des applications en biologie du cancer, immunologie tumorale et développement préclinique de nouveaux médicaments. La ressemblance du modèle orthotopique de caractéristiques cliniques de la maladie humaine fournira un outil de traduction accrue et améliorée des patients.
Introduction
HNSCC est la malignité cinquième plus courante dans le monde, avec plus 600 000 patients diagnostiqués chaque année1. Malgré un traitement agressif impliquant la chimiothérapie et la radiothérapie (RT), le taux global de survie (OS) pour HNSCC les patients sans infection par le virus du papillome humain (VPH) reste inférieure à 50 % après 5 ans2. Ceci est en grande partie attribué à un micro-environnement tumeur très complexes comme les tumeurs peuvent provenir de plusieurs sites anatomiques distinctes au sein de la région tête et cou, dont la muqueuse buccale, la langue, le plancher de la bouche, cavité buccale, cavité nasale, du pharynx, oropharynx et l’hypopharynx. En outre, la région de la tête et du cou est fortement vascularisée et contient près de la moitié de tous les ganglions lymphatiques dans le corps de3. Une majorité d’études portant sur la tête et du cou biologie tumorale s’appuient sur des modèles de tumeurs dans la région du flanc. Ces modèles peuvent offrir de mieux comprendre les mécanismes intrinsèques tumeur, mais le manque du microenvironnement natif de la tête et du cou peut avoir un impact significativement le potentiel translationnel de telles conclusions. Une méthode qui a été utilisée pour induire des tumeurs par voie orale est par l’exposition à la substance cancérogène 9,10-diméthyl-1, 2-benzanthracène (DMBA)4. Toutefois, cette méthode est associée à une longue procédure, induit des tumeurs chez les rats et les hamsters, mais pas chez les souris et les tumeurs qui en résulte ne possèdent pas beaucoup des caractéristiques histologiques différenciée frs5,6. Taux au sein et entre les lots d’abonnement de l’introduction de le carcinogen4-nitroquinoléine 1-oxyde (4-onq), un dérivé de la quinolone soluble dans l’eau, a donné lieu à des tumeurs par voie orale de souris lorsqu’il est appliqué par voie orale, mais a également souffert de longues durées d’exposition (16 semaines) et un nombre limité souris7,8,9. Afin de développer des modèles cliniquement pertinents, plusieurs groupes a utilisé des modèles issus du génie génétique impliquant la manipulation d’oncogènes de pilote ou de gènes suppresseurs de tumeur, dont TP53, TGFB, KRAS, HRAS et SMAD410. Ces modèles peuvent donnent un aperçu des tumeurs avec des gènes connus pilote mais ne pas récapituler l’hétérogénéité complexe de HNSCCs humaines.
Dans ce travail, nous démontrons la possibilité d’effectuer une intramuqueuse inoculation de cellules de carcinome épidermoïde chez la souris. Cellules inoculées se développent dans les tumeurs agressives dans la semaine suivant l’injection. Semblable à HNSCCs humains, les tumeurs métastaser vers les ganglions lymphatiques régionaux. Nous caractériser les caractéristiques cliniques et histologiques de la maladie et permettent de mieux comprendre le microenvironnement immunitaire de la tumeur. Nous proposons que ce modèle orthotopique de HNSCC a des applications en biologie du cancer, immunologie tumorale et les études précliniques. Mécanismes d’évasion immunitaire, la progression tumorale, résistance au traitement et les métastases représentent les zones d’importance clinique qui peut être résolu en utilisant le modèle proposé.
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Protocol
Toutes les procédures d’animaux ont été effectuées conformément à un agréé animaux soin et l’utilisation Comité (IACUC) protocole institutionnel de l’Université du Colorado à Denver (protocole # 00250).
1. Culture de cellules de tumeur
Remarque : Les lignées de cellules B4B8 et LY2 ont servi à produire des tumeurs HNSCC orthotopique : cellules tumorales B4B8 provenaient de kératinocytes muqueuse cancérogène transformées (à partir de souris BALB/C)11. Cellules tumorales LY2 provenaient de métastases ganglionnaires d’un BALB/C spontanément transformé des kératinocytes ligne (Pam 212)12,13. Les deux lignées cellulaires ont été gracieusement fournies par Dr Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, é.-u.).
- Utiliser moyen (DMEM) F/12 de l’aigle modifié de Dulbecco additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et réactif aux antimicrobiens 1 % pour l’entretien de ligne de cellule. Maintenir ces lignées de cellules dans un incubateur stérile à 37 ° C et 5 % de CO2. Cellules devraient être utilisées pour l’inoculation avant dépassant 15 passages.
- Plaque de 2 x 106 à 4 x 106 cellules en flacons de culture cellulaire 175 cm2 .
Remarque : S’assurer que les cellules sont inférieures à 90 % anastomosé à éviter d’induire une réponse au stress. - Lorsque les cellules sont 70 % anastomosé (~ 48 h), enlever le ballon de l’incubateur et laver les cellules 3 x avec froide solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Détacher les cellules du flacon à l’aide de trypsine de 0,25 %, assez pour couvrir la surface de la plaque.
- Pour cela, diluer 4 mL de trypsine dans une fiole de2 175 cm contenant 70 % de cellules confluentes. Incuber les cellules avec la trypsine pendant 3 à 4 min dans l’incubateur de culture de cellules à 37 ° C et 5 % de CO2.
- Visualiser les cellules sous microscope pour s’assurer que le détachement de la cellule.
- Ajouter 12 mL de support de DMEM F/12 contenant FBS pour neutraliser l’activité de la trypsine.
- Aspirer la suspension cellulaire et le placer dans un tube conique de 50 mL.
- Agiter le tube contenant les cellules en inversant x-4 3 x.
- Vous pouvez également mélanger une quantité de 10 µL de suspension cellulaire à 10 µL de bleu de Trypan dans un tube de microcentrifuge et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Déterminer la viabilité cellulaire en soustrayant le nombre de cellules de bleu Trypan-positives du nombre total de cellules et diviser par le nombre total de cellules.
- Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Remettre en suspension les cellules en DMEM sans sérum et sans antibiotique à un volume approprié afin que 1 x 106 cellules sont présentes dans 50 µL de médias.
Remarque : Se fondant sur l’agressivité de ligne cellulaire in vivo (déterminée empiriquement), 1 x 106 cellules par site d’injection par souris a été jugée appropriée pour les cellules B4B8 et LY2. - Placez le flacon contenant la suspension cellulaire sur la glace.
- Placer la matrice préalablement décongelés membrane basale sur la glace.
Remarque : La matrice de la membrane basale a été décongelée pendant une nuit à 4 ° C.
2. cellule Injection à des souris
- Préparer un mélange de 1:1 de matrice de membrane de cellules : sous-sol (50 µL).
- Ajouter des cellules d’abord ; puis, peu à peu pipetter la matrice de la membrane basale. Éviter d’introduire des bulles d’air. Veiller à ce que le mélange se fait immédiatement avant l’injection de l’animale. Ajoutant des cellules à membrane basale matrice pendant une période prolongée de temps peut entraîner dans la cellule de décantation dans le mélange de la matrice, ce qui rend le mélange difficile de serrer rigoureusement. Cela entraînera une variabilité considérable dans la taille de la tumeur entre les souris.
- Mélanger doucement. S’assurer que toutes les étapes impliquant la matrice sont effectuées sur la glace. Matrice de la membrane basale se polymérisent à température ambiante.
- Préparer les seringues pour l’inoculation.
- Charger des seringues à insuline 0,5 mL (23 G) avec 100 µL de la solution de matrice de membrane cellulaire/sous-sol.
- Garder les seringues sur la glace pour éviter la polymérisation de matrice de membrane basale.
- Anesthésier souris en les plaçant dans une chambre avec l’isoflurane et oxygène (2,5 %).
- S’assurer que les souris sont profondément anesthésiés avant d’effectuer l’injection (en assurant une absence de réponse à une pincée d’orteil).
- Introduire l’aiguille dans la région buccale droite ou gauche. Cela s’effectue par le biais de l’espace ouvert de chaque côté de la bouche.
- Veiller à ce que langue de la souris n’est pas de la manière.
Remarque : Il est facile de pousser la langue, qui se traduira dans les tumeurs de la langue. Remuer la langue vers le côté opposé si nécessaire. - Conserver la seringue parallèle à la région buccale à l’intérieur de la cavité buccale.
- Lorsque vous êtes prêt à injecter, retirer la seringue et introduire doucement la seringue à un angle de 10°.
- Injecter 100 µL de la suspension de matrice de membrane cellulaire/sous-sol sur une période de 5 s.
- Tenir la seringue en place pour une supplémentaire de 5 s pour s’assurer que tout le matériel est injecté.
Remarque : Pour souris retrouve contrôle, injecter un mélange de sérum et de la matrice (comme décrit ci-dessus) sans les cellules tumorales. - Retirer la seringue doucement.
- Continuer la procédure ci-dessus avec les souris restants.
- Prévoir 1 semaine jusqu'à ce que les tumeurs commencent à apparaître exagérément (50-200 mm3 pour les cellules B4B8 et LY2).
3. souris surveillance
- Effectuer la première mesure à l’aide d’étriers à 1 semaine après l’injection de cellules tumorales. Pour calculer le volume de la tumeur à l’aide d’étriers externes, déterminer le plus grand diamètre longitudinal (longueur) et le plus grand diamètre transverse (largeur) et utiliser la formule ellipsoïdal mis à jour le14,15.
- Continuer d’effectuer des mesures régulières étrier pour le volume des tumeurs (1 x x-2 par semaine à intervalles réguliers).
- Mesurer le poids de l’animal afin d’évaluer les effets de la croissance tumorale sur l’alimentation.
4. tumeurs de récolte
- Une fois atteint le point de terminaison expérimentale, euthanasier les animaux à l’aide de mesures appropriées (p. ex., CO2 asphyxie, décapitation ou dislocation cervicale).
Remarque : Dans cette étude, le point de terminaison a été atteint si les souris est devenu moribonds (avec une perte de poids de > 15 % de leur poids initial, un manque de toilettage, cachexie) et/ou si la taille de la tumeur a atteint 1 000 mm3. -
Commencer la dissection de l’animal en créant une longue incision par le biais de la ligne médiane dans la région du cou.
- Pince émoussée permet de saisir la peau et des ciseaux pour couper la peau.
- Insérer les ciseaux doucement sous la peau recouvrant la tumeur et créer des poches d’air en poussant les ciseaux dans l’ensemble et dans la peau.
- Une fois que la peau est suffisamment détachée de la tumeur, identifier les ganglions lymphatiques de drainage (DLNs) et d’accise eux afin d’éviter que le tissu tumoral confondu par la présence de ganglions lymphatiques.
Remarque : Les grosses tumeurs peuvent atteindre ou couvrir le rad. Selon le type d’analyse effectuée, l’isolement des ganglions intactes est essentiel pour éviter tout débordement des cellules immunitaires dans la tumeur, qui se traduira par les résultats de titrage de l’inclinaison. - Couper à travers les frontières de la tumeur jusqu'à détache le volume entier.
5. tumeur de traitement pour les Applications en aval
- L’examen histologique en aval, placer les tumeurs dans du formol 10 % à la température ambiante. Pour éviter tout overfixation, remplacez le formol avec l’éthanol à 70 %. Pour l’analyse en cytométrie en flux, traiter les tumeurs comme décrit ci-dessous.
Remarque : Les tissus peuvent être conservés dans du formol pendant 72 h avant l’overfixation peut devenir problématique pour certains types de coloration. - Couper la tumeur en 1 à 2 mm-petits morceaux à l’aide d’une lame de rasoir stérile ou des ciseaux pointus.
- Placer les morceaux de tumeur coupés dans un tube conique de 50 mL avec la collagénase III (4 250 unités par exemple), DNase I (0,1 mg par exemple) et inhibiteur de la trypsine (1 mg par exemple).
- Incuber à 37 ° C pendant 30 min avec agitation toutes les 10 min.
Remarque : Les échantillons peuvent être placés dans un sac refermable, stérilisé à 90 % d’éthanol et placé dans un incubateur de culture cellulaire. - Après 30 min, ajouter 20 mL de Hank équilibré de solution saline (HBSS) et un essorage à 300 x g pendant 5 min.
Remarque : HBSS est composé de chlorure de potassium, chlorure de sodium, bicarbonate de sodium, phosphate dibasique de sodium, phosphate de sodium monobasique et le glucose. - Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 2 à 3 mL de tampon de lyse des globules rouges (gr). Pipetter rigoureusement.
Remarque : Tampon de lyse RBC est composé de chlorure d’ammonium, bicarbonate de sodium et disodique. - Incuber pendant 2 min à température ambiante.
Remarque : Une incubation plus longue peut être toxique pour les autres populations de cellules. - Ajouter 20 mL de HBSS pour neutraliser l’effet de tampon de lyse.
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
- Resuspendre le culot dans 10 mL de HBSS.
- Passer la solution à travers une drisse de nylon 70 µm et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
- Répétez les étapes 5,8 – 5,10 et passez la suspension cellulaire par une drisse nylon de 40 µm pour assurer que tous les débris supplémentaires sont supprimé à la suspension.
6. cellule de coloration et d’Acquisition de données
- Resuspendre le culot dans 1 mL de HBSS.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisées, comme indiqué au point 1.7
-
Déterminer le nombre total de cellules et la concentration appropriée pour la coloration.
Remarque : la concentration cellulaire idéal pour la coloration de cytométrie en flux est 1 million de cellules. Par exemple, si la coloration est effectuée dans une plaque à 96 puits et il y a 10 millions de cellules, remettre en suspension l’échantillon de 1 mL et plaque 100 µL pour 1 million de cellules par puits. -
Ajouter Fc bloc (CD16/CD32) à une concentration de 1/100 afin d’éviter la liaison nonantigen spécifique des immunoglobulines aux récepteurs FcγIII et FcγII. Incuber 5 min à température ambiante.
- Centrifuger et resuspendre le culot dans 100 µL de cellule d’écoulement cytometry coloration tampon (composé d’une solution saline contenant 5 % FBS, EDTA de 2 % et 1 % HEPES).
-
Effectuer la surface de la cellule de coloration selon les instructions fournies par le fournisseur (en ajoutant chaque anticorps à la dilution appropriée). Incuber pendant 60 min à température ambiante.
- Centrifuger et resuspendre le culot dans 100 µL de HBSS. Répéter 2 x pour se débarrasser de l’excès anticorps.
-
Exécutez des échantillons sur un cytomètre de flux approprié.
- Si l’analyse des marqueurs intracellulaires (par exemple, foxp3), effectuer perméabilisation de la cellule et de coloration selon les instructions du fournisseur.
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Representative Results
L’évaluation in vitro de la prolifération cellulaire LY2 et B4B8 ont montré que les deux lignées cellulaires ont fois doublement similaires (21 h et 23 h, respectivement). In vivo, les deux lignées cellulaires forment une masse unique, visible et palpable dans la semaine suivant l’inoculation (Figure 1 a). Dans des souris porteuses de tumeurs LY2, la mâchoire a été déplacée de 3 semaines en raison de la charge tumorale (Figure 1 a). Les souris témoins n’ayant pas reçu les cellules tumorales ne développaient pas de tumeurs comme prévu. Les tumeurs LY2 ont augmenté à un taux plus élevé par rapport aux tumeurs B4B8. Le volume tumoral moyen au jour 21 dans LY2 souris de tumeur-roulement a 632 ± 10 mm3 comparativement à 162 ± 4 mm3 B4B8 des tumeurs (Figure 1 b). Souris présentant le déplacement de la mâchoire rapidement mis au point la perte de poids à cause de la dysphagie (Figure 1). Souris présentant des poids perte définie comme > 15 % de leur poids initial et/ou ayant un volume de la tumeur de > 1 cm3 ont été euthanasiés dans 1 jour de l’observation remarquable. La médiane de survie chez les souris LY2 était de 22,5 jours, comparées à 52,0 jours chez des souris de tumeur-roulement B4B8 (Figure 1).
Imagerie de résonance magnétique (IRM) des souris de tumeur-roulement a montré des tumeurs bien délimitées qui s’étend dans la couche interne de la muqueuse buccale (Figure 2 a). Les tumeurs n’a pas été envahi dans la langue ou d’autres organes voisins (œsophage, bronches, thymus) comme le montre l’évaluation histologique. Hétérogénéité de signal sur des images de résonance a été représentant de la présence de régions hyperintense vascularisé (notées v) et hypointense nécrotiques (notées avec N) (Figure 2 a). Un examen pathologique brut a montré DLNs élargies (Figure 2 b). Nous avons évalué plus de volume de la tumeur avec la tomodensitométrie (TDM) pour déterminer la fiabilité des mesures étrier. Les tumeurs ont été définis à l’aide d’une imagerie numérique et la communication en médecine (DICOM) analyse de l’image logiciel16. Évaluation du volume tumoral LY2 par étriers et imagerie tomographique a montré une excellente corrélation entre les deux méthodes (R2 = 0.8493 ; La figure 2). Cela indique que la croissance tumorale est principalement exophytiques et mesure de calibre est une méthode fiable pour l’évaluation de la croissance tumorale. L’examen histologique a montré que toutes les souris de tumeur-roulement LY2 développés mal différencient carcinome épidermoïde (Figure 2D). Neuf des neuf LY2 avec tumeur souris ont développé des métastases dans les ganglions lymphatiques de première et de deuxième échelon. Nodales métastases ont été principalement sous-capsulaire (avec sept des neuf souris) et dans les sinus (avec cinq des neuf souris), avec deux des neuf souris démontrant l’invasion intracapsulaire. En revanche, souris porteuses de tumeurs B4B8 développés modérément différencient des carcinomes épidermoïdes (Figure 2E) et ne pas métastaser aux sites régionaux ou éloignés, y compris DLNs. nécrose ont été évaluée sur un trois-grade précédemment établi échelle : 0 ne = aucune nécrose visible, 1 = scant, 2 = modéré et 3 = sévère17. Toutes les souris de tumeur-roulement LY2 avaient confirmé histologiquement de nécrose avec la majorité (sept sur dix) démontrant modérée à sévère nécrose (Figure 2F). A observé aucun signe de nécrose des tumeurs B4B8.
Nous nous sommes concentrés sur le modèle de tumeur LY2 pour davantage de caractérisation du microenvironnement tumoral-immunitaire. Les tumeurs ont été récoltés à 3 semaines après l’inoculation de la tumeur et digéré à l’aide de collagénase III, suivie par la coloration de la surface cellulaire et marqueurs intracellulaire pour débit/masse cytometry (Figure 3 a). Échantillons ont été traités, à l’aide d’un cytomètre en masse, à l’Université du Colorado Denver Flow Cytometry ressource partagée. Gating et analyse de données effectuées en utilisant des logiciels commerciaux de cytométrie de flux. Les données obtenues ont montré la présence de nombreuses populations de cellules immunitaires à des degrés divers. Total des cellules immunitaires (CD45+) représenté 7,3 % de la tumeur totale (Figure 3 b). En chiffres absolus, nous avons observé, en moyenne, 26 CD45+ cellules (SD = 0,81) par milligramme de tissu tumoral (Figure 3 b). Cellules myéloïdes (CD11b+) représentait 37,8 % de CD45 toutes les cellules de+ (Figure 3). Cellules myéloïdes sont composaient principalement des macrophages (F4 / 80 +, 63,0 %), suivis des cellules myéloïdes dérivés suppresseur (MDSCs) (Gr1 +, 8,51 %) et les neutrophiles (Ly6G +, 5,87 %). Les lymphocytes T totales comptent de 15,9 % de CD45 cellules CD4+ + T des cellules contenant la majorité de tous les lymphocytes T (79,4 %), dont 53,4 % étaient réglementaires les cellules T (Tregs) (CD4+FoxP3+) (Figure 3D). Cellules tueuses naturelles (NK) comptent de 1,75 % de CD45 tous+ cellules. Ces données en évidence la présence de divers immunitaire s’infiltre dans LY2 orthotopique tumeurs HNSCC qui probablement jouent un rôle dans la médiation de la progression tumorale et l’évasion immunitaire.
Figure 1 : surveillance des souris porteuses orthotopique tumeurs HNSCC. (A) les images représentant des souris de tumeur-roulement. L’inoculation buccale développe une tumeur dans la semaine suivant l’inoculation. Après 3 semaines, on observe le déplacement de la mâchoire. (B) taux de croissance tumorale chez des souris de tumeur-roulement B4B8 et LY2 telle que déterminée par des mesures de l’étrier. (C) les changements dans le poids corporel des souris porteuses de tumeurs B4B8 ou LY2. Souris de tumeur-roulement (D) la survie des B4B8 et LY2. Les barres représentent l’écart-type de la moyenne (SEM) de 7 à 10 souris par groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : caractéristiques d’imagerie et histologiques des tumeurs murines de HNSCC. Image à (A) de Monsieur et coronale représentative d’une souris de tumeur-roulement LY2. Sites anatomiques sont étiquetés. Zones d’hypersignal signal représentent les régions vascularisées (notée V). Les régions de signal hypointensity représentent des zones nécrotiques (désigner N). (B) image brute représentative d’une région de tumeur contenant disséquée. Flèches blanches pointent vers les ganglions lymphatiques de drainage élargies (DLNs). (C) corrélation du volume de la tumeur telle qu’évaluée par la mesure de calibre par rapport à la tomodensitométrie (TDM)-base d’évaluation. Pente, coefficient de corrélation (R2) et ligne de régression apparaissent. (D) l’hématoxyline et éosine (H & E) image représentative de la tumeur LY2. Image (E) représentant H & E de tumeur B4B8. (F) Quantification de nécrose des tumeurs LY2, basé sur un H & E qualité quatre système de notation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyse de base intratumorale populations immunitaire à l’aide de cytométrie en flux par temps de vol (CyTOF). Tumeurs ont été transformées en une suspension de cellules individuelles par digestion enzymatique collagènase-basée et, ensuite, colorées avec des marqueurs de surface et intracellulaires de cellules. (A) masse cytometry a été effectuée à l’aide de la plateforme CyTOF. (B) une évaluation quantitative absolues et relative des cellules immunitaires totales (CD45+). (C) Quantification des sous-populations myéloïde-immunitaire. (D) Quantification des sous-populations immunitaires lymphoïdes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Une analyse rigoureuse et la caractérisation du microenvironnement tumoral représentent une stratégie importante pour la compréhension des mécanismes de développement de tumeurs, de progression et de métastases et pour le développement de thérapies efficaces. Cancer de la tête et du cou est une maladie complexe qui peut provenir de plusieurs sites anatomiques dans la région de la tête et du cou. Un obstacle majeur à la compréhension des mécanismes de la maladie et améliorer la thérapie a eu un manque de lignées de cellules de souris murin qui ressemblent à la nature agressive et métastatique du HNSCCs humains. En outre, les nombreux modèles murins emploient une implantation sous-cutanée des tumeurs qui n’ont pas des caractéristiques physiologiques importantes de la région tête et cou, dont une forte densité vasculaire, une grande vascularisation lymphatique et flora muqueux résident.
Dans cette étude, nous avons caractérisé un modèle orthotopique de HNSCC murin. Nous avons choisi la muqueuse buccale comme site d’inoculation de la tumeur pour un certain nombre de raisons, y compris un accès facile à la région sans la nécessité pour le guidage par l’image, la capacité d’évaluer la croissance de la tumeur à l’aide d’étriers, la présence de la tumeur au sein de la flore muqueuse, la présence de vaisseaux lymphatiques environnants et la facilité de reproductibilité. Bien que l’injection de cellules dans la muqueuse buccale est simple, le positionnement de l’aiguille et la profondeur de pénétration sont essentiels pour prévenir la ponction à travers la peau et s’assurer que les cellules ne sont pas injectées par voie sous-cutanée. Nous vous recommandons d’insertion de l’aiguille intra oralement bien qu’il soit parfaitement parallèle à la région buccale et en inclinant à un angle ne dépassant pas 10 ° lorsqu’il est prêt à injecter.
Nous avons utilisé les lignées de cellules ont été des lignées de cellules murines permettant leur implantation chez les souris immunocompétentes de la souche qu’ils provenaient. Il y a plus de 39 lignées cellulaires humaines de HNSCC qui ont été étudiées dans la littérature, mais ne peuvent être utilisées en présence d’un microenvironnement native18. Développements récents a permis pour la conception de modèles de souris humanisée qui intègrent des chimères d’OS-moelle osseuse humaines chez les souris NOD scid gamma (également connu sous le nom des souris NSG), permettant le développement d’un système immunitaire qui peuvent interagir avec les tumeurs humaines dans un modèle de souris immunodéficientes19. Cependant, ces modèles sont coûteuses, exigent des méthodes de reproduction laborieux et ne pas récapituler tous les composants du microenvironnement tumoral, y compris les vaisseaux lymphatiques, les fibroblastes et les cellules endothéliales. Les modèles murins souris, que nous avons utilisé dans cette étude récapitulent des composantes essentielles de la HNSCCs humaines, y compris la présence d’infiltrats immunitaires divers. Afin de garantir une récupération maximale de cellules viables de tumeurs, l’utilisation d’enzymes de digestion est nécessaire. Enzymes de digestion de collagénase-basés peuvent être rudes sur les cellules et l’optimisation de la concentration et le type de collagénase peut être nécessaire pour les types de tumeurs différentes. Nous avons comparé cinq enzymes de la digestion avant de déterminer cette collagénase III, qui a été utilisé dans cette étude, est la méthode optimale pour la digestion des tumeurs à cellules squameuses.
Les modèles de tumeur utilisés dans cette étude sont particulièrement utiles pour étudier des mécanismes évasion immunitaire HNSCC et évaluation préclinique de diverses thérapies. Nous avons démontré précédemment que les tumeurs B4B8 tant LY2 sont radiorésistantes et réfractaire à la point de contrôle immunitaire inhibiteur anti-PD-L120. Cela est compatible avec la majorité des HNSCCs humaines. Des essais cliniques récents ont montré que moins de 15 % des patients HNSCC répondent à la thérapie anti-PD-1/PD-L121,22,23,24,25. En outre, il est bien établi que les HNSCCs sont radiorésistantes26,27. Ciblant les voies responsables de radiorésistance dans HNSCC est une étape importante pour renforcer la réponse au traitement. Le point de repère Bonner et coll. étude a démontré un avantage significatif en survie globale avec l’ajout de cetuximab jusqu'à la RT par rapport à la RT seule à localement avancé HNSCC patients28. Des données récentes démontrent que l’inhibition de la EphB4-Ephrin-B2 signalisation dans orthotopique HNSCCs peut améliorer la réponse à la RT ou cetuximab-RT en promouvant tumeur apoptose et en inhibant la prolifération de tumeurs29,30. En outre, combinant RT avec rational thérapies immunisées peut augmenter les réponses immunitaire antitumorales et améliorer tant contrôle tumoral local et le contrôle des métastases à distance,31. Nous avons récemment démontré que ciblage Tregs en combinaison avec le blocus de point de contrôle immunitaire et RT se traduit par l’éradication de la tumeur et une mémoire immunologique32. Futures études utilisant des modèles orthotopiques de HNSCC seront mieux informer la conception des essais cliniques et améliorer la compréhension des mécanismes d’évasion immunitaire de tumeur et résistance au traitement.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Aucun
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
References
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