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Genetics

का उपयोग निशानची-Cas9 का लक्ष्य कम करने के लिए crispr-Cas9 के नुकसान के बिना निर्देशित विकास के माध्यम से पर लक्ष्य गतिविधि की हानि के लिए

Published: February 26, 2019 doi: 10.3791/59202
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*1, *1, *1, 1
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* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए अनुकूलन crispr-Cas9 पर लक्ष्य गतिविधि के नुकसान के बिना एक उच्च विशिष्टता प्राप्त करने के लिए । हम वांछित विशेषताओं के साथ एक उत्परिवर्ती Cas9 खोजने के लिए स्नाइपर स्क्रीन कहा जाता है एक निर्देशित विकास दृष्टिकोण का उपयोग करें । स्निपर-Cas9 एक ribonucleopप्रोटीन प्रारूप में छोटा एकल गाइड rnas और प्रसव के साथ संगत है, उच्च विशेषज्ञता प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से ज्ञात रणनीतियों ।

Abstract

संकुल के विकास के नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता (crispr)-संबंधित प्रोटीन 9 (Cas9) चिकित्सीय रूपरेखा में अपने संभावित हानिकारक बंद लक्ष्य प्रभाव के परिहार की आवश्यकता है । ऐसे प्रभावों को कम करने के लिए कई तरीके ईजाद किए गए हैं । यहाँ, हम एक escherichiaकोलाई आधारित निर्देशित विकास विधि प्रस्तुत स्नाइपर-स्क्रीन अनुकूलित विशिष्टता के साथ एक Cas9 संस्करण प्राप्त करने के लिए और पर लक्षित गतिविधि बनाए रखा, स्निपर-Cas9 कहा जाता है. स्निपर-स्क्रीन, सकारात्मक और नकारात्मक चयन का उपयोग एक साथ किया जा सकता है । स्क्रीन भी सही सकारात्मक हिट के लिए समृद्ध करने के लिए अन्य एकल गाइड आरएनए (sgrna) दृश्यों के साथ दोहराया जा सकता है । Cas9 वेरिएंट व्यक्त करने के लिए cmv-PltetO1 दोहरी प्रवर्तक का उपयोग करके, परित लाइब्रेरी के प्रदर्शन जल्दी स्तनधारी कोशिकाओं में जाँच की जा सकती है. तरीके स्निपर-Cas9 की विशिष्टता बढ़ाने के लिए भी वर्णित हैं । सबसे पहले, छोटा sgrnas का उपयोग पहले Cas9 विशिष्टता को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है. अंय इंजीनियर Cas9s के विपरीत, स्नाइपर-Cas9 एक जंगली प्रकार (wt) पर लक्ष्य गतिविधि के स्तर को बरकरार रखती है जब काट sgrnas के साथ संयुक्त । दूसरा, स्नाइपर की डिलीवरी-एक ribonucleopप्रोटीन में Cas9 (rnp) प्रारूप के बजाय एक प्लाज्मिड प्रारूप अपनी पर लक्षित गतिविधि को प्रभावित किए बिना संभव है ।

Introduction

इस पत्र में, हम विभिंन रणनीतियों के संयोजन से Cas9 की विशिष्टता में सुधार करने का लक्ष्य है । crispr-Cas9 के ऑफ-टारगेट प्रभावों से बचने के विभिन्न तरीकों को विकसित किया गया है । उदाहरण के लिए, छोटा sgrnas उच्च विशिष्टता1प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । साथ ही, Cas9 वितरण की विधि प्लाज्मिड स्वरूप से एक rnp स्वरूप उच्च विशिष्टता2प्राप्त करने के लिए बदला जा सकता है । स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेनेस Cas9 (SpCas9) प्रोटीन के विशिष्ट एमिनो एसिड अवशेषों पहले वर्णित तर्कसंगत डिजाइन के अनुसार संशोधित किया गया है3,4,5. वैकल्पिक रूप से, एमिनो एसिड अवशेषों एक यादृच्छिक तरीके से बदल दिया गया है और उच्चतम विशिष्टता के साथ Cas9 वेरिएंट या तो एक खमीर6 या एक ई. कोली7,8 स्क्रीनिंग प्रणाली का उपयोग कर की पहचान की गई ।

हालांकि, कई समूहों ने बताया है कि Cas9 वेरिएंट डिजाइन का उपयोग कर Cas9 और सब्सट्रेट प्रदर्शन कम पर लक्ष्य गतिविधियों के बीच अविशिष्ट बातचीत दुर्बल करने के लिए इंजीनियर7,8,9, 10 , 11 , 12. हम एक ई.कोलाई आधारित विकास प्रणाली, स्नाइपर स्क्रीन, बेतरतीब ढंग से mutagenized Cas9 वेरिएंट स्क्रीन को विकसित किया । एक ई. कोलाई स्क्रीनिंग प्रणाली के कारण तेजी से दोगुना समय और ई.कोलाई की उच्च परिवर्तन क्षमता के एक खमीर प्रणाली पर लाभ है ।

दोनों नकारात्मक और सकारात्मक चयन, तीन अलग plasmids और ब्याज की एक जीन (भारत) ई. कोलाई जीनोम में एकीकृत के आधार पर, स्नाइपर स्क्रीन में उपयोग किया जाता है । Cas9 वेरिएंट को कम कॉपी नंबर प्लाज्मिड के सीएमवी-PltetO1 डुअल-प्रोमोटर सिस्टम के तहत व्यक्त किया जाता है ताकि ई. कोलाई में पहचाने गए उम्मीदवारों को सबक्लोनिंग की आवश्यकता के बिना स्तनधारी कोशिकाओं में परीक्षण किया जा सके । भारत सरकार ने Tn7 transposon प्रणाली का उपयोग कर ई. कोलाई जीनोम में पेश किया है । sgrna प्लाज्मिड, जिसमें प्रतिकृति का तापमान-संवेदी मूल शामिल है, भारत सरकारको लक्षित करने वाले sgrna को व्यक्त करता है; हालांकि, sgrna और भारत सरकार अनुक्रम पूरी तरह से मिलान नहीं कर रहे हैं । एक पूरी तरह से मिलान sgrna लक्ष्य साइट एक तिहाई ccdb जीन है, जो एक घातक उत्पाद है कि जहर gyrase encodes युक्त प्लाज्मिड पर मौजूद है । डबल-किनारा विराम (dsbs) जेनोमिक डीएनए में स्थित बेमेल साइट में प्रस्तुत हैं, क्योंकि इस सिस्टम में, उच्च ऑफ़-टारगेट गतिविधियों के साथ Cas9 भिन्न रूप व्यक्त कक्ष निकाल दिए जाते हैं । दूसरी ओर, कोशिकाओं को कम पर लक्ष्य गतिविधियों के साथ Cas9 वेरिएंट व्यक्त भी घातक ccdb जीन अभिव्यक्ति की वजह से हटा रहे हैं । एनहाइड्रोटेट्रासाइक्लिन (एटीसी) की एकाग्रता में फेरबदल करके Cas9 वेरिएंट के एक्सप्रेशन स्तर को बदला जा सकता है, जो चयन बल को समायोजित करता है ।

हम तर्क है कि एक प्लाज्मिड पर के बजाय जीनोमिक डीएनए में बेमेल sgrna लक्ष्य साइट का पता लगाने प्रणाली की संवेदनशीलता में वृद्धि होगी । इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि वहां केवल एक जीनोमिक साइट है, जबकि वहां कई plasmids, प्रत्येक एक लक्ष्य साइट युक्त, एक ई. कोलाई सेल के भीतर होगा ।

इस प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम एक Cas9 संस्करण, स्नाइपर-Cas9, जो wt के स्तर पर लक्ष्य गतिविधियों से पता चलता है और कम लक्ष्य की गतिविधियों की पहचान की है डब्ल्यूटी Cas9 की तुलना में । स्निपर-Cas9 कम sgrnas या rnp आधारित वितरण के बजाय plasmid आधारित डिलीवरी का उपयोग करके भी उच्च विशिष्टता अनुपात प्राप्त कर सकते हैं ।

Protocol

1. BW25141 ई. कोलाई तनाव में एक मानव सरकार के एकीकरण

  1. भारत सरकार की क्लोनिंग
    1. पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक मानव भारत सरकार की एक ५०० बीपी लंबाई बढ़ाना noti और xhoi प्रतिबंध एंजाइम साइटों युक्त प्राइमरों के साथ मानक पीसीआर तरीकों के माध्यम से विभिंन उंमीदवार लक्ष्य साइटों से युक्त ।
      नोट: इस प्रयोग में, भारत सरकार मानव EMX1 जीन था ।
    2. दोनों पीसीआर उत्पाद और pgrg3613 noti और xhoi प्रतिबंध एंजाइमों के साथ वेक्टर पचा ।
    3. जेल वांछित टुकड़े शुद्ध (५०० bp और 12 kb).
    4. टुकड़े को एक साथ आपस में मिलाकर टी-4 लिग्रेस का प्रयोग कर । ऐसा करने के लिए, 1 x ligase बफर और ०.५ U ligase एंजाइम युक्त 20 μl की एक प्रतिक्रिया मात्रा में ५० एनजी पचा pgrg36 और पीसीआर डालने के 6 एनजी मिक्स । रात भर कमरे के तापमान (आरटी) पर सेते हैं ।
    5. ligated प्लाज्मिड को DH5-α सक्षम कोशिकाओं में रूपांतरित करते हैं । luria शोरबा (पौंड) आगर (१०० μg/एमएल) में ३२ डिग्री सेल्सियस से युक्त प्लेटों पर परिणामी transformants बढ़ने और रात भर सेते हैं । एक कॉलोनी उठाओ और यह पौंड मीडिया में हो जाना एम्पिसिलीन रातोंरात युक्त. ई.कोलाई से प्लाज्मिड डीएनए को अलग, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध miniprep किट का उपयोग कर । मिनी-प्लाज्मिड तैयारी (मिनी-प्रेसिंग)13से प्राप्त प्लाज्मिड को सैमर अनुक्रमण द्वारा भारत सरकार के अंश की प्रविष्टि की पुष्टि करें ।
  2. BW25141-भारत सरकार की तैयारी
    1. BW25141 ई. कोलाई तनाव में प्राप्त pgrg36-GOI प्लाज्मिड को रूपांतरित करना । यह झूठी सकारात्मक कालोनियों की संख्या को कम करने के क्रम में एक BW25141 तनाव का उपयोग करने के लिए आवश्यक है ।
    2. ३२ डिग्री सेल्सियस पर पौंड बफर में रूपांतरित कोशिकाओं को रात भर बढ़ाएं । भारत सरकार BW25141 तनाव (BW25141-भारत) के जीनोमिक डीएनए में सम्मिलित है । मानक pgrg36 प्रोटोकॉल13का उपयोग करते हुए BW25141-भारत सरकार तनाव से pgrg36-goi प्लाज्मिड निकालें । संक्षेप में, एक कॉलोनी पतला (लगभग 107गुना) और यह ४२ डिग्री सेल्सियस पर एक पौंड थाली पर हो जाना रातोंरात । पौंड की थाली पर कालोनियों लकीर और उन्हें ४२ डिग्री सेल्सियस पर हो जाना रात भर ।
    3. कॉलोनी पीसीआर द्वारा सही भारत सरकार प्रविष्टि की पुष्टि करें, pgrg36 प्रोटोकॉल में सुझाए गए प्राइमरों का उपयोग: 5 '-gatgctggtggctgt-3 ' और 5 '-gatgacggtttgtcacatgga-3 ' । प्राइमरी जीनोमिक डीएनए प्रविष्टि साइट को प्रवर्त करता है, और परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पाद का आकार ९०४ बीपी प्लस (इस मामले में ५०० बीपी) के आकार का होगा ।
    4. तैयार electrocompetent BW25141-भारत की कोशिकाओं (एक विस्तृत प्रोटोकॉल कदम 3.2.6-3.2.10 में वर्णित है) ।

2. Cas9 variant पुस्तकालय की तैयारी

  1. पुस्तकालय की तैयारी
    1. रूपांतरण Cas9 वेक्टर7 एक वाणिज्यिक ई. कोलाई mutator तनाव में (सामग्री की तालिका) और निर्माता के निर्देशों का पालन करने के लिए एक संस्करण पुस्तकालय (mutator पुस्तकालय) प्राप्त करते हैं ।
    2. त्रुटि-प्रवण पीसीआर किट (सामग्री तालिका) का उपयोग करते हुए Cas9 वेक्टर में पूरे wt Cas9 अनुक्रम पर त्रुटिपूर्ण पीसीआर निष्पादित करें ।
      नोट: कम त्रुटि दर प्रोटोकॉल में अपनाया गया था स्नाइपर-Cas9 मामले प्रोटीन के मूल समारोह में खलल न डालने से बचने के लिए ।
    3. उचित प्रतिबंध एंजाइमों के साथ Cas9 वेक्टर पचा । जेल पीसीआर उत्पाद को शुद्ध (2.1.2 कदम से) और पच रीढ़ की हड्डी ।
      नोट: SpCas9 जीन के आकार के बारे में ४.३ kb है । xhoi और kpni pblc-SpCas9 वेक्टर जो स्नाइपर-Cas9 मामले में इस्तेमाल किया गया था पचाने के लिए चुना गया ।
    4. रीढ़ टुकड़ा इकट्ठा (कदम 2.1.3 से) और सम्मिलित करें त्रुटि-प्रवण पीसीआर का उपयोग कर प्रवर्धित (कदम 2.1.3 से) इन विट्रो पुनर्संयोजन में समतापी के माध्यम से.
      नोट: (त्रुटि-प्रवण PCR [EP] लायब्रेरी) लायब्रेरी की एक उच्च सांद्रता प्राप्त करने के लिए ५०० से अधिक की रीढ़ की हड्डी एनजी की आवश्यकता है । दो अलग त्रुटि प्रवण पीसीआर किट स्निपर-Cas9 मामले (ईपी लाइब्रेरी मैं और द्वितीय) में ep पुस्तकालयों तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।
    5. (चरण 2.1.4 से) असेंबली से उत्पादों को शुद्ध एक डीएनए शोधन किट है कि कम मात्रा में रेफरेंस (सामग्री की तालिका) केलिए सक्षम बनाता है का उपयोग कर । 6 μl-न्यूक् स-नि: शुल्क पानी (nfw) के साथ elute और डीएनए की एकाग्रता को मापने ।
    6. अधिक से अधिक ५०० एनजी (तीन पुस्तकालयों में से प्रत्येक के लिए) Cas9 पुस्तकालय वेक्टर के ५० μl में electrocompetent ई. कोली कोशिकाओं (सामग्री की तालिका) । 3.2.1-3.2.4 चरणों में इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल देखें । इस पुस्तकालय की तैयारी के लिए, सक्षम कोशिकाओं के ५० μl प्रति २५० μl के बजाय soc मध्यम के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    7. बनाओ 1:100, 1:1000, और 1:10000 soc माध्यम से बरामद कोशिकाओं युक्त मिश्रण की dilutions । थाली पतला कोशिकाओं पर १०० मिमी पौंड आगर प्लेटों की पूरक के साथ क्लॉरॅंफेनिकोल (१२.५ μg/एमएल) । शेष कोशिकाओं को एक २४५ मिमी2 प्लेट पर प्लेट । ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते रातोंरात ।
  2. पुस्तकालय जटिलता की गणना
    1. फोटोग्राफ एक जेल प्रलेखन प्रणाली या एक साधारण डिजिटल कैमरा के माध्यम से कमजोर पड़ने प्लेट्स । भागो opencfu14 सॉफ्टवेयर और कमजोर पड़ने प्लेटों की तस्वीरें अपलोड करें । एक थाली के अंदर मतगणना क्षेत्र निर्धारित करें और झूठी कालोनियां हटाएं ।
    2. मैन्युअल रूप से कालोनियों की संख्या को तनुकरण कारक द्वारा transformants की मूल संख्या प्राप्त करने के लिए गुणा करें । इन संख्याओं को लॉगरिथ्मीय रूप (बेस 10) में कनवर्ट करें । लायब्रेरी की जटिलता निर्धारित करने के लिए औसत परिकलित करें ।
    3. जब वांछित जटिलता मान प्राप्त किया जाता है, तो सभी कालोनियों को इकट्ठा करें २४५ मिमी स्क्वायर प्लेट पर (चरण 2.1.7 से) एक स्प्रेडर का उपयोग करके और क्लॉरॅंफेनिकोल के साथ 20 मिलीलीटर पौंड का सप्लीमेंट । इकट्ठा कालोनियों बढ़ने और एक वाणिज्यिक midiprep किट का उपयोग प्लाज्मिड पुस्तकालय शुद्ध नहीं है ।
      नोट: उच्च पुस्तकालय जटिलता, बेहतर है । जब स्निपर-Cas9 की पहचान की गई थी, तो प्रत्येक लाइब्रेरी के लिए 3 x 106 की विविधता हासिल की गई थी ।

3. सकारात्मक और विकसित Cas9 के लिए नकारात्मक स्क्रीनिंग

  1. लक्ष्य चयन और प्लाज्मिड निर्माण
    1. भारतमें एक लक्ष्य sgrna स्पेसर अनुक्रम का चयन करें । यादृच्छिक न्यूक्लियोटाइड में एक या दो अवशेषों को एक बेमेल अनुक्रम बनाने के लिए स्थानापन्न करें ।
      नोट: मानव EMX1 लक्ष्य स्थल 3 (ggg PAM के साथ gagtccगगगआगाआ) स्नाइपर-Cas9 मामले में इस्तेमाल किया गया था । followings के बेमेल दृश्यों का इस्तेमाल कर रहे हैं: gagtccgagcagaaagagaa, gaacccगगगगागआगआ, gagtccgagagagaa, और gagcccगगगआगागआ.
    2. बेमेल अनुक्रम सम्मिलित करें (चरण 3.1.1 देखें) sgrna प्लाज्मिड में मानक oligonucleotide का उपयोग (oligo) क्लोनिंग कार्यविधियाँ7.
    3. p11 में 3 ' अंत में एक पाम के साथ बेमेल अनुक्रम डालें-lacy-wtx1 (सामग्री की तालिका) ccdb मानक oligo क्लोनिंग प्रक्रियाओं15का उपयोग कर प्लाज्मिड का निर्माण करने के लिए ।
  2. स्नाइपर की तैयारी-स्क्रीनिंग ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं
    1. thaw BW25141-भारत सरकार बर्फ पर electrocompetent कोशिकाओं ।
    2. जोड़ें 1 ccdb प्लाज्मिड के प्रत्येक एनजी और sgrna प्लाज्मिड डबल बेमेल के साथ ५० μl में गल BW25141-भारत की कोशिकाओं की । धीरे से पाइपटिंग द्वारा कोशिकाओं को मिलाएं और उन्हें एक prechilled ०.१ सेमी इलेक्ट्रोपोरेशन cuvette में ले जाएँ ।
    3. इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से दो plasmids के साथ ई. कोलाई रूपांतरण । सोक माध्यम के २५० μl को तुरंत इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद जोड़ें । सेल और मीडियम को मिक्स करने के लिए घोल को धीरे से पिपेट लें । मिश्रण एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
      नोट: अधिकतम दक्षता के लिए, १.८० केवी पर वोल्टेज सेट, और रनटाइम ४.८ ms और ५.० ms के बीच होना चाहिए.
    4. रूपांतरित कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें और कोमल झटकों के साथ 1 एच के लिए ३२ डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं ।
    5. एक एम्पीसिलीन (५० μg/एमएल)/kanamycin (25 μg/एमएल) पौंड आगर थाली (संस्कृति हालत) पर बरामद कोशिकाओं की थाली १२५ μl । प्लेट एक एम्पीसिलीन पर शेष कोशिकाओं/kanamycin/arabinose (१.५ मिलीग्राम/एमएल) पौंड आगर प्लेट (ccdb-व्यक्त हालत) । ३२ डिग्री सेल्सियस पर सेते रातोंरात ।
    6. ccdbपर जीवित कालोनियों के अभाव के लिए जांच-शर्त थाली व्यक्त । संस्कृति शर्त थाली से कालोनियों इकट्ठा एक स्प्रेडर का उपयोग कर और संस्कृति उन्हें सुपर इष्टतम शोरबा (sob) के ५० μg/एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक और ३२ डिग्री सेल्सियस, कोमल मिलाते हुए के साथ की 25 μg/एमएल की २५० मिलीलीटर में ।
    7. जब ६०० एनएम (ओडी६००) पर ऑप्टिकल घनत्व ०.४ तक पहुंचता है, तो बर्फ पर फ्लास्क को ठंडा करें । prechilled विआयनीकृत पानी और एक prechilled 10% ग्लिसरीन समाधान तैयार (उपयोग करने से पहले जीवाणुरहित) ।
    8. सेंट्रेसेज (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४,००० एक्स जी पर) कोशिकाओं और supernatant त्यागें । prechilled विआयनित पानी की २०० मिलीलीटर जोड़ें । 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को पुनर्जीवित करना । इस चरण को दोहराएं 3x ।
    9. prechilled 10% ग्लिसरीन समाधान के ५० मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४,००० एक्स जी पर) के रूप में पहले उंहें अपकेंद्रिर ।
    10. सतह पर तैरनेवाला छोड़ें और 10% ग्लिसरीन समाधान के ३०० μl में गोली resuspend । ५० μl aliquots बनाओ और उंहें तरल नाइट्रोजन में फ्रीज । कोशिकाओं को स्टोर (स्निपर-स्क्रीनिंग सेल) पर-८० ° c.
  3. स्निपर-स्क्रीनिंग
    1. (चरण 2.2.3 से) प्रत्येक पुस्तकालय से Cas9 संस्करण plasmids के १०० एनजी के साथ स्निपर-स्क्रीनिंग कोशिकाओं (चरण 3.2.10 से) रूपांतरण. 2.1.1 और 2.1.4 कदम देखें । चरण 3.2.1-3.2.3 में वर्णित इलेक्ट्रोपोरेशन चरणों का पालन करें ।
    2. एक ताजा १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए कोशिकाओं के २५० μl स्थानांतरण । 10 एनजी/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए एटीसी के २५० स्नातकोत्तर जोड़ें । दोनों atc-युक्त और atc-मुक्त कक्ष पुनर्प्राप्त करें (चरण 3.2.4 पुनर्प्राप्ति चरण के लिए देखें) ।
    3. प्लेट 25 μl की बरामद एटीसी-मुक्त कोशिकाओं एक chloramphenicol पर/kanamycin LB आगर प्लेट (nonचयनात्मक स्थिति). एक २४५ मिमी पौंड प्लेट पर १०० एनजी/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए बरामद एटीसी-युक्त कोशिकाओं को एटीसी जोड़ें । तुरंत एक क्लोरांफेनिकोल/kanamycin/अरेसिनोस पौंड आगर प्लेट (चुनिंदा हालत) पर कोशिकाओं को थाली । ३२ डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं ।
      नोट: आकार और पौंड प्लेट की संख्या स्क्रीनिंग कवर की विविधता के आकार से निर्धारित होते हैं । 20 मिलीलीटर पौंड के साथ १०० मिमी पेट्री डिश के मामले में, एटीसी का 2 μg जोड़ें ।
    4. फोटो प्लेट । व्यवहार्य opencfu सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कालोनियों की संख्या गिनती14। (2.2.1 कदम देखें) सुनिश्चित करें कि गैर-चयनात्मक प्लेट पर कालोनियों की संख्या सभी भिन्न रूप से कवर करने के लिए लाइब्रेरी की विविधता से कम 10x बड़ा है ।
    5. इस प्रकार के रूप में अस्तित्व आवृत्ति की गणना.
      उत्तरजीविता आवृति = एक चयनात्मक प्लेट पर कालोनियों की संख्या/(अचयनित प्लेट एक्स 10 पर कालोनियों की संख्या)
    6. सभी तीन पुस्तकालयों से चुनिंदा प्लेटों पर बच कालोनियों कि पूल । बचे हुए कालोनियों को २५० मिलीलीटर के पौंड मध्यम में सेते हुए १२.५ μg/ml क्लॉरॅंफेनिकोल के साथ ४२ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात । एक midiprep किट का उपयोग कर दिखलाई Cas9 लायब्रेरी डीएनए को अलग ।
      नोट: यह चरण sgrna प्लाज्मिड को साफ करता है ।
    7. कदम से स्क्रीनिंग प्रक्रिया को दोहराएं 3.3.1-3.3.6 जब तक अस्तित्व आवृत्ति एक पठार तक पहुँचता है. परिवर्तन के लिए चयनित Cas9 प्लाज्मिड और वसूली के दौरान एटीसी के 10 एनजी/एमएल के 10 एनजी का प्रयोग करें । चयनात्मक स्थिति के लिए १०० एनजी/एमएल में एटीसी एकाग्रता बनाए रखें ।
  4. फेरबदल और दूसरी स्क्रीनिंग
    1. निम्न डीएनए-फेरबदल प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए चयनित परित भिन्न रूप फेरबदल । पीसीआर सम्मिलित सीमाओं से अगल बगल प्राइमर्स, १५० न्यूक्लियोटाइड का उपयोग Cas9 प्लाज्मिड में Cas9 डालने बढ़ाना. 2 μg का प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद को डाइजेस्ट करने के लिए dnase I के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए ।
    2. टुकड़ों को शुद्ध 70 – 200 bp लंबाई में 2% agarose जेल वैद्यरसंचलन का उपयोग कर । पीसीआर शुद्ध टुकड़ों को बढ़ाना । पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में उत्पाद का उपयोग करें Cas9 डालने के लिए उपयुक्त प्राइमरों के साथ Cas9 अगल बगल. चरण 2.1.4 में वर्णित के रूप में एक Cas9 लायब्रेरी का निर्माण करने के लिए अंतिम PCR उत्पाद का उपयोग करें ।
    3. नए स्नाइपर स्क्रीनिंग सेल तैयार (देखें अनुभाग ३.२) के साथ एक और बेमेल sgrna प्लाज्मिड (कदम 3.1.1 देखें) । स्क्रीनिंग प्रक्रिया को फिर से करें (3.2-3.3 अनुभाग) जब तक जीवित रहने की दर एक पठार तक पहुंच जाती है । परिवर्तन के लिए चयनित Cas9 प्लाज्मिड और वसूली के दौरान 10 एनजी/एमएल एटीसी के 10 एनजी का प्रयोग करें । चयनात्मक स्थिति के लिए 10 एनजी/एमएल में एटीसी एकाग्रता बनाए रखें ।
  5. विकसित Cas9 उत्परिवर्ती plasmids का चयन
    1. पिछले स्क्रीनिंग कदम के बाद, बेतरतीब ढंग से चयनात्मक थाली से १०० कालोनियों उठाओ और उंहें chloramphenicol में संस्कृति-£ ४२ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ।
    2. एक miniprep प्रक्रिया का उपयोग कर plasmids को अलग और sanger-अनुक्रम Cas9 के भीतर अनुक्रमण प्राइमरों का उपयोग कर सम्मिलित करता है.
    3. मानव सेल लाइनों में उन्हें परीक्षण करने के लिए शीर्ष तीन सबसे अक्सर वेरिएंट का चयन करें ।

4. एक rnp के रूप में कटा हुआ sgrna के साथ Cas9 के वितरण

  1. लक्ष्य जीन चयन का उपयोग कर Cas-offinder
    1. Cas-offinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) के साथ लक्षित साइटें चुनें. Cas9 के विशिष्ट प्रकार और लक्ष्य जीनोम (मानव, माउस, zebrafish, आदि) के लिए उपयुक्त पाम प्रकार का चयन करें । भरें क्वेरी अनुक्रम टैब में, बेमेल संख्याचुनें, और सबमिट करें बटन
    2. कुछ सेकंड के बाद, ऑन-टार्गेट (' 0 ' की बेमेल संख्या के साथ) और ऑफ़-टार्गेट साइट्स दिखाई देंगी । सामान्य तौर पर, एक से तीन बेमेल के साथ ऑफ-टार्गेट साइटें चुनें.
  2. sgrna टेंपलेट की तैयारी
    1. आदेश crrna और tracrrna ओलिगोस निम्नलिखित टेम्पलेट अनुक्रम के साथ, अर्थात् crrna अनुक्रम: 5 '-taatacgactcactataggnnnnn nnnnnn nnnngttttagctagaa-3 '; tracrrna अनुक्रम: 5 '-agcaccgactcggtgccactttcaagttgataacggactatcttacttgcतत्त्वात्कटैकटसीटाटाएएसी-3 ' । चरण 4.1.2 में प्राप्त लक्ष्य अनुक्रम के साथ crrna अनुक्रम में N20 भरें । छोटा sgrnas डिजाइन करने के लिए, 5 ' अंत से कुर्सियां निकालें N19, N18, या N17 sgrnas दृश्यों को प्राप्त करने के लिए ।
    2. sgrna-एंकोडिंग अनुक्रम के प्रवर्धन के लिए पीसीआर मिश्रण को इस प्रकार तैयार करें: 5x बफर के 10 μl, crrna ओलिगो के ०.५ μl (१०० pmol/μl), tracrrna ओलिगो के ०.५ μl (१०० pmol/μl), dntps के २.५ μl (10 मिमी प्रत्येक), डीएनए पोलीमरेज़ के ०.५ μl का मिश्रण , और nfw के ३६ μl (सामग्री की तालिका) ।
    3. निम्नलिखित शर्तों का उपयोग करके टेम्पलेट बढ़ाना, अर्थात्, प्रारंभिक विकृतन के लिए: ९८ डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट; विकृतन, अनीलन, और विस्तार के लिए: 10 एस पर ९८ ° c, 15 s पर ५४ ° c, 20 s पर ७२ ° c, के लिए 25 चक्र; अंतिम विस्तार के लिए: ७२ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट ।
    4. 2 μl के प्रवर्धित टेम्पलेट डीएनए (4.2.3 कदम से) पर एक 2% agarose जेल का विश्लेषण करें । एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर टेंपलेट शुद्ध ।
      नोट: टेंपलेट डीएनए का आकार १२५ bp है ।
  3. सगरना का संश्लेषण
    1. sgrna संश्लेषण के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण निम्नानुसार तैयार करें: टेम्पलेट डीएनए के ८.५ μl का मिश्रण (4.2.3 कदम से), utp के 1 μl (25 मिमी), ctp के 1 μl (25 मिमी), gtp के 1 μl (25 मिमी), एटीपी के 1 μl (25 मिमी), mgcl2 के ४.२ μl (१०० मिमी) , ४.५ μl of T7 rna पॉलीमरेज़ (५० u/μl), 3 μl of 10x T7 आरएनए पॉलीमरेज़ बफर, १.२ μl of पाइरोफॉस्फोटेज (०.५ u/μl), ०.७५ μl of rnase अवरोधक (४० u/μl), और nfw के ४.२ μl ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते (कम से 10 एच के लिए) । प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए dnase (2 U/μl) के ०.५ μl जोड़ें और 15 – 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं । एक आरएनए शोधन किट का उपयोग कर sgrna शुद्ध ।
    3. एक जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कारण विषाक्तता को कम करने के लिए 5 '-triphosphate पर sgrna16, निकालें 5 '-triphosphate से गाइड rnas के रूप में बछड़ा आंत्र alkaline फॉस्फेट (CIP) निम्नानुसार: का इलाज 10 μg इन विट्रो में- २५० यू ऑफ सीआईपी के साथ ट्रांसक्राइब आरएनए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 ज के लिए १०० यू के rnase अवरोधक की उपस्थिति में । एक आरएनए शोधन किट का उपयोग कर CIP-इलाज sgrna शुद्ध ।

5. wt-और स्निपर-Cas9 प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि

  1. ई. कोलाई में प्रोटीन अभिव्यक्ति
    1. बदलना पालतू plasmids18 कूटबंधन अपने-टैग wt-और स्निपर-Cas9 BL21 (DE3) ई. कोलाई तनाव में ।
    2. एक ताजा कॉलोनी में पीईटी-Cas9 एक्सप्रेशन प्लाज्मिड के साथ ५० μg/एमएल कनमाइसिन युक्त पौंड मध्यम की ५० मिलीलीटर और इसे रातोंरात (२०० आरपीएम) ३७ डिग्री सेल्सियस (preculture) में मिलाते हैं ।
    3. ताजा LB मध्यम के ५०० मिलीलीटर के लिए रातोंरात संस्कृति के 10 मिलीलीटर का स्थानांतरण ५० μg/एमएल कनमीसिन । 2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए (२०० rpm) के साथ संस्कृति सेते हैं ।
    4. जब तक संस्कृति के मध्य लॉग चरण वृद्धि (आयुध डिपो६०० ≈ 0.6-0.7) तक पहुंच ओडी६०० मॉनिटर ।
    5. isopropyl β-D-1 के साथ wt-या स्निपर-Cas9 प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रेरित (iptg, ०.२५ एनएम की एक अंतिम एकाग्रता पर)..... 18 ° c रातोंरात पर संस्कृति सेते ।
  2. प्रोटीन शुद्धि
    1. ५,००० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रेगेशन द्वारा कोशिकाओं को फसल ।
    2. lysis बफर में गोली resuspend (५० मिमी NaH2पीओ4, ३०० मिमी nacl, 10 मिमी imidazole, 4 मिमी dithiothreitol [डीटीटी], 5 मिमी benzamidine, १०० मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड [pmsf], पीएच 8) प्रति ग्राम गीला वजन 20 मिलीलीटर में ।
    3. 1 मिलीग्राम/एमएल प्रत्येक के अंतिम एकाग्रता के लिए pmsf, डीटीटी, और लाइसोजाइम जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं ।
    4. बर्फ पर कोशिकाओं sonicate । प्रत्येक नाड़ी के बीच एक 10 शीतलन अवधि के साथ 200-300 डब्ल्यू पर 10 एस के लिए बार ही नाड़ी, 20 मिनट की कुल समय के लिए ।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ६,००० एक्स जी पर lysate अपकेंद्रिका ।
    6. एक ताजा ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला निकालें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए साफ lysate के 5 मिलीलीटर और धीरे शेक के लिए अपने बाँध agarose राल के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    7. एक छाया हुआ नीचे आउटलेट के साथ एक कॉलम पर lysate/अपने बांध agarose राल मिश्रण लोड ।
    8. निचला कैप निकालें और स्तंभ प्रवाह-थ्रू एकत्र करें.
    9. वॉश बफर के साथ कॉलम 2x धो लें (५० मिमी NaH2पीओ4, ३०० मिमी nacl, 20 मिमी imidazole, पीएच 8); सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीऐक्रिलेमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस-पेज) द्वारा विश्लेषण के लिए वॉश अंश लीजिए ।
    10. एलूटा प्रोटीन 10x 1 मिलीलीटर के साथ रेफरेंस बफर (५० मिमी नाह2पीओ4, ३०० मिमी nacl, २५० मिमी इमिडाजोल, पीएच 8), एसडीएस-पेज के लिए नमूनों का संग्रह ।
    11. एक १०० केडीए कॉलम फिल्टर का उपयोग कर eluted wt-या स्निपर-Cas9 प्रोटीन ध्यान लगाओ । नमूनों को 10 मिमी Tris-HCl, १५० मिमी nacl के समाधान में स्टोर करें, और ५०% ग्लिसरीन पर-८० डिग्री सेल्सियस ।

6. rnp डिलिवरी

  1. परिवहन और rnp डिलीवरी के लिए कोशिकाओं की तैयारी
    1. HEK293T में 5% सह2के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs) और 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (dmem) में कोशिकाओं को बनाए रखें ।
    2. मिश्रण wt-या स्निपर-Cas9 प्रोटीन (2 μg) sgrna (2 μg) के साथ और आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते rnp परिसरों बनाने के लिए ।
    3. trypsinize और कोशिकाओं की गणना । 2 x 104 कोशिकाओं प्रति एक प्रतिक्रिया तैयार करते हैं । फॉस्फेट-buffered खारा (pbs) और अपकेंद्री के साथ कोशिकाओं को धो लें । महाप्राण और पेलेट को इलेक्ट्रोपोरेशन बफर के साथ पुनर्जीवित करें ।
    4. निम्नलिखित सेटिंग्स, अर्थात् १,३०० V, 30 ms, और एक पल्स का उपयोग कर कोशिकाओं में इलेक्ट्रोपोरेट rnp परिसरों । प्लेट एक ४८-अच्छी तरह से fbs और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक dmem के ५०० μl से भरा थाली पर कोशिकाओं (के रूप में चरण 6.1.1 में वर्णित है) सही इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद । 5% सह2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    5. एक gdna तैयारी किट के साथ जीनोमिक डीएनए को अलग, ४८ एच transfection के बाद.

7. plasmids एंकोडिंग स्निपर-Cas9 और sgrna के transfection

  1. एक sgrna प्लाज्मिड का निर्माण
    1. आगे आदेश और निंनलिखित टेंपलेट अनुक्रम, अर्थात् आगे के साथ ओलिगोस्पर्मिया रिवर्स: 5 '-caccgnnnnnnn '-3 ' के लिए, और रिवर्स: 5 '-aaacnnnnnnnn-3 '...... N20 चरण 4.1.2 में प्राप्त लक्ष्य अनुक्रम के साथ प्रतिस्थापित करें । N19, N18, या N17 की लंबाई करने के लिए छोटा sgrna संश्लेषणआकार करने के लिए लक्ष्य अनुक्रम छोटा करें ।
    2. 1x T4 डीएनए ligase बफर में anneal दोनों ओलिगोस्पर्मिया.
    3. बसाई प्रतिबंध एंजाइम के साथ pRG2 वेक्टर पचा ।
    4. जेल पच सदिश शुद्ध (३,३०० bp) का उपयोग कर एक ०.८% agarose gel.
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर T4 ligate का उपयोग करते हुए annealed ओलिगो और शुद्ध टुकड़ा को लिकेट करें: मिक्स ५० के एनजी पचा pRG2 और 1 एनजी की एक प्रतिक्रिया मात्रा में oligo के 20 μl । 15 मिनट के लिए आरटी में सेते हैं ।
    6. लिगेशन मिश्रण को DH5 अल्फा तनाव में बदलना और पौंड आगर प्लेटों पर ट्रांसफॉर्मंट्स को विकसित करना, जिसमें एम्पीसिलीन (१०० μg/एमएल) ३७ डिग्री सेल्सियस पर है । मानक sequencing द्वारा वेक्टर में oligo की प्रविष्टि की पुष्टि करें ।
  2. plasmids एन्कोडिंग स्निपर-Cas9 और sgrna का ट्रांसफेक्शन
    1. dmem में HEK293T कोशिकाओं को बनाए रखने के 10% fbs और 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2के साथ पूरक । transfection पहले दिन, trypsinize और कोशिकाओं की गणना । जब एक ४८-ठीक पैमाने पर काम कर रहे हैं, थाली 1 x 105 कोशिकाओं को पूर्ण विकास माध्यम के २५० μl में अच्छी तरह से प्रति । कोशिकाओं को 50%-80% transfection के दिन पर संगामी होना चाहिए ।
    2. ४८-वेल स्केल पर, p3s-Cas9 प्लाज्मिड और २५० एनजी के ट्रांसफेक्शन के लिए स्गरना प्लाज्मिड के २५० एनजी तैयार करें, एक लिपिड-आधारित ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक का उपयोग करते हुए । सीरम फ्री-मेम के 25 μl में plasmids मिलाएं ।
    3. सीरम मुक्त मेम के 25 μl के साथ ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक के 1 μl को पतला करें । 5 मिनट के लिए आरटी में मिश्रण सेते. दो मिश्रण का मिश्रण है और 20 मिनट के लिए आरटी पर परिणामी समाधान सेते करने के लिए plasmid lipofectamine परिसरों फार्म ।
    4. 20 मिनट की ऊष्मायन के बाद, एक अच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं के लिए सीधे प्लाज्मिड-ट्रांसफक्शन अभिकर्मक परिसरों वाले समाधान के ५० μl जोड़ें, और थाली को पीछे की और आगे की और धीरे से मिलाएं । transgene अभिव्यक्ति के लिए परख से पहले 48 – 72 एच पोस्ट ट्रांसफेक्शन के लिए एक सह2 इनकोबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते ।

8. पर लक्ष्य और बंद लक्ष्य गतिविधियों का निर्धारण करने के लिए indel आवृत्तियों की गणना

  1. लक्ष्य और संभावित बंद लक्ष्य साइटों के विश्लेषण के लिए लक्षित गहरी अनुक्रमण
    1. एक gdna तैयारी किट के साथ कदम 6.1.5 या 7.2.4 से जीनोमिक डीएनए को अलग. पर लक्ष्य और बंद लक्ष्य लक्ष्यीकरण प्राइमरों के साथ gdna के पीसीआर प्रवर्धन द्वारा गहरी अनुक्रमण पुस्तकालयों उत्पंन करते हैं ।
    2. प्रत्येक नमूने को लेबल करने के लिए अनुक्रमणिका प्राइमर्स का उपयोग करें । एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मशीन का उपयोग कर युग्मित अंत अनुक्रमण करने के लिए पुस्तकालय परित विषय ।
  2. कैस-विश्लेषक का उपयोग करते हुए डीप अनुक्रमण विश्लेषण
    1. गहरी अनुक्रमण Cas-विश्लेषक मूल्यांकन उपकरण का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण17।
    2. पढ़ें 1 और पढ़ें 2 टैब के तहत fastq फ़ाइलें चुनें (1 पढ़ें = XX_SXX_L001_R1_001. fastq, 2 पढ़ें = XX_SXX_L001_R2_001. fastq).
    3. मूल जानकारी टैब भरें और विश्लेषण पैरामीटर्स टैब सबमिट बटन क्लिक करें ।

Representative Results

स्नाइपर स्क्रीन के बाद किया जाता है, अस्तित्व कालोनियों का प्रतिशत पौंड प्लेट में कालोनियों की संख्या से chloramphenicol, कनमीसिन, arabinose, और एटीसी (ckaa) युक्त एलबी की थाली पर कॉलोनियों के नंबर विभाजित करके गणना की जा सकती है क्लोरांफेनिकोल और कनमीसिन केवल (CK) । यह प्रतिशत आमतौर पर बहुत कम था जब स्नाइपर स्क्रीन SpCas9 के पुस्तकालयों के साथ प्रदर्शन किया गया था । सच-सकारात्मक हिट जीवित पूल के साथ स्क्रीन दोहरा द्वारा समृद्ध किया जा सकता है । इस प्रतिनिधि स्निपर स्क्रीन में, उदाहरण के लिए, एक १००% उत्तरजीविता दर तीसरी स्क्रीन (चित्रा 1) के बाद प्राप्त किया गया था । rnps या plasmid-एनकोडेड स्निपर-Cas9 का उपयोग कर transfections विभिन्न लक्ष्यों और लक्षित amplicon अनुक्रमण (चित्रा 2) द्वारा मापा पर लक्षित और बंद लक्ष्य गतिविधियों के परिणामस्वरूप किया जा सकता है । सबसे लक्ष्य पर, स्निपर-Cas9 wt की तुलना में पर लक्ष्य गतिविधियों और उच्च विशिष्टता अनुपात के एक ही स्तर से पता चलता है. छोटा sgrnas भी आगे विशिष्टता में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 3). हालांकि, उनके उपयोग केवल कुछ लक्ष्यों तक ही सीमित है क्योंकि वे कम पर लक्ष्य गतिविधियों पूर्ण लंबाई sgrnas की तुलना में, ज्यादातर मामलों में परिणाम है । इसलिए, अलग लंबाई के साथ sgrnas (से 17-करने के लिए 20-mers) का परीक्षण किया जाना चाहिए और दोनों पर लक्ष्य और बंद लक्ष्य गतिविधियों विशिष्टता ऑप्टिमाइज़ करने के लिए मापा जाना चाहिए.

Figure 1
चित्र 1: प्रतिनिधि स्निपर-स्क्रीन यादृच्छिक Cas9 वेरिएंट के विभिन्न पुस्तकालयों के साथ प्रदर्शन किया । mutator पुस्तकालय, ईपी पुस्तकालय मैं, और ईपी लाइब्रेरी द्वितीय विभिन्न वाणिज्यिक किट का उपयोग कर बनाया पुस्तकालयों का संकेत. पहले, दूसरे, और अंतिम बार संवर्धन स्क्रीन7प्रदर्शन किया गया था की संख्या से संकेत मिलता है । यह आंकड़ा ली एट अल.7से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पर लक्ष्य और wt-Cas9 या स्निपर-Cas9 एक 20-मेर गाइड प्लाज्मिड या rnp के माध्यम से दिया अनुक्रम के साथ युग्मित की बंद लक्ष्य गतिविधियों । विशिष्टता अनुपात ऑफ़-टार्गेट गतिविधि द्वारा ऑन-टार्गेट गतिविधि को विभाजित करके निर्धारित किया गया था । त्रुटि पट्टियां SEM (n = 3)7इंगित करते हैं । यह आंकड़ा ली एट अल.7से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: पर लक्ष्य और निशानची-Cas9 के बंद लक्ष्य गतिविधियों wt-Cas9 चर लंबाई FANCF01 और aavs साइटों को लक्षित करने के साथ sgrnas का उपयोग कर प्राप्त की तुलना में । विशिष्टता अनुपात उन पर लक्षित साइटों पर indel आवृत्तियों विभाजित द्वारा निर्धारित किए गए थे संबंधित बंद लक्ष्य साइटों पर । 5 ' टर्मिनस (GX18 या GX19) पर एक मिलान ग्वानिन के साथ sgrnas और एक बेमेल ग्वानिन (gX17, GX18, GX19, या gX20) के साथ उन संकेत दिया जाता है । जब सामांयीकृत ऑन-टार्गेट गतिविधियां 70%7< थीं तब विशिष्टता अनुपात की गणना नहीं की गई थी । यह आंकड़ा ली एट अल.7से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Discussion

जो लोग बोझिल स्क्रीनिंग प्रक्रियाओं स्निपर-Cas9 प्राप्त करने के लिए से बचना चाहते हैं के लिए, स्निपर-Cas9 प्रोटीन और एन्कोडिंग प्लाज्मिड उपलब्ध हैं । इन सामग्रियों का उपयोग करना, sgrna की इष्टतम लंबाई, कि उच्चतम विशिष्टता अनुपात प्रदान, निर्धारित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, एक rnp प्रारूप में स्निपर-Cas9 और sgrna के वितरण की सिफारिश की है, क्योंकि यह आमतौर पर एक उच्च विशिष्टता अनुपात में एक प्लाज्मिड प्रारूप में प्रसव से परिणाम है । स्निपर-Cas9 के विपरीत, अन्य इंजीनियर Cas9 वेरिएंट छोटा sgrnas6,7 या rnp फार्म8 में वितरण के साथ संगत नहीं कर रहे हैं (hifi के अपवाद के साथ-Cas9).

स्नाइपर स्क्रीन के लिए, बेमेल अनुक्रम का चयन सबसे महत्वपूर्ण कदम है । एक बेमेल sgrna का चयन जो भारत सरकार के अनुक्रम की ओर कम दरार गतिविधि के साथ जुड़ा हुआ है से बचना चाहिए । यदि नहीं, विशिष्टता के एक wt स्तर के साथ Cas9 वेरिएंट बेमेल लक्ष्य साइट के साथ ई. कोलाई जीनोमिक डीएनए सट नहीं होगा । इस आशय की पृष्ठभूमि कालोनियों की एक बड़ी संख्या में परिणाम होगा, पूरी स्क्रीनिंग प्रक्रिया jeopardizing ।

क्योंकि ई. कोलाई एक तेजी से दोगुना समय और उच्च परिवर्तन दक्षता खमीर की तुलना में है, स्नाइपर स्क्रीन खमीर आधारित स्क्रीनिंग तरीकों की तुलना में लाभप्रद है । इसके अतिरिक्त, स्निपर-स्क्रीन अन्य ई.कोलाई आधारित प्रणालियों की तुलना में अधिक संवेदनशील होना चाहिए जिसमें बेमेल साइट एक प्लाज्मिड पर किया जाता है: जीनोमिक डीएनए की एक प्रति है और इस प्रकार हमारे सिस्टम में बेमेल साइट की केवल एक प्रतिलिपि है, लेकिन बड़ी संख्या में एक एकल ई. कोलाई सेल के भीतर plasmids ।

dsbs, जैसे SaCas9 या Cpf1s, को प्रेरित करने वाले अन्य डीएनए endonucleases की विशिष्टताओं को भी स्नाइपर स्क्रीन का उपयोग करके सुधारा जा सकता है. दुर्भाग्य से, स्नाइपर स्क्रीन आधार संपादकों की विशिष्टता को सीधे बढ़ाने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, क्योंकि आधार संपादकों ई.कोलाई के जीनोमिक डीएनए में dsbs प्रेरित नहीं करते । आधार संपादकों के रूप में अपने सिस्टम के कोर में Cas9 के nickase या मृत संस्करण का उपयोग करें, आधार संपादकों की विशेषज्ञता स्नाइपर स्क्रीन से प्राप्त हिट का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है.

Disclosures

toolgen एक पेटेंट आवेदन दायर की है (पीसीटी/KR2017/006212) को कवर स्निपर-स्क्रीन (स्थिति: लंबित, आविष्कर: jungjoon कश्मीर ली) । jungjoon कश्मीर ली, joonsun ली, minhee जंग, और euihwan jeong toolgen, इंक के कर्मचारी है

Acknowledgments

इस अनुसंधान विज्ञान और कोरिया के आईसीटी (2017m3a9b4061406) और कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (nrf) द्वारा वित्त पोषित मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया कोरियाई सरकार (msit) (अनुदान संख्या 2017m3a9b4061406 और 2018m3a9h3020844) jungjoon K. ली. प्लाज्मिड एंकोडिंग pGRG36 नैंसी क्रेग (addgene प्लाज्मिड #16666) और p11 से एक उपहार-लैस था-wtx1 huimin zhao से एक उपहार था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) NEB M0290L
Ampicillin Sodium Salt Fisher Chemical BP1760-25
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma Aldrich 37919 or 94664
Antibiotic Antimycotic solution Welgene LS203-01 Media component
BamHI Enzynomics R003L
Chloramphenicol Sigma Aldrich R4408
Diversify PCR Random Mutagenesis Clontech 630703 Error-prone PCR kit
DNA-Shuffling Kit Jena Bioscience PP-103
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM001-17 Culture media
Endura Electrocompetent Cells (DUO) Lucigen 60242-2 E. coli electrocompetent cells for library preparation
Fetal Bovine Serum (FBS) Welgene S101-01 Media component
Gene Pulser II Bio-Rad E. coli electroporation equipment
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit Agilent 200550 Error-prone PCR kit
genomic DNA prep kit GenAll 106-152 gDNA-prep kit
Glycerol BioShop GLY001.1
GP/MP Cuvette, 0.1cm Bio-Rad BR165-2089 E. coli electroporation equipment
HEK293T cell ATCC CRL-11268 Human cell line
Kanamycin sulfate Acros Organics 450810500
L-(+)-Arabinose Sigma Aldrich A3256-25G
LaboPass PCR Purification Kit Cosmogenetech CMR0112
LaboPass Plasmid Mini Cosmogenetech CMP0112 Mini-prep kit
LB Agar Miller Formedium LMM0202
LB Broth Miller Formedium LMM0102
Lipofectamine Invitrogen 11668019 Transfection reagent
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix NEB E2621L Gibson assembly (isothermal in vitro recombination) mixture
Neon Transfection System Thermo MPK5000 RNP Electroporation equipment
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo MPK1096 RNP Electroporation equipment
NucleoBond Xtra Midi EF Macherey-Nagel 740420.50 Midi-prep kit
Oligo Clean & Concentrator Zymo Research D4061 DNA purification kit that enables low-volume elution
Opti-MEM Gibco LS31985070 Transfection media
p11-lacY-wtx1 Addgene #123945
pgrg36 Addgene #16666 E. coli mutator strain
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530L
Pyrophophatase NEB M2403L
Ribonucleotide Solution Set NEB N0450L
RNase inhibitor NEB M0314L
T7 RNA polymerase NEB M0251L
Turbo Dnase Ambion AM2238
XbaI Enzynomics R013L
XL1-Red Competent Cells Agilent 200129

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References

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आनुवंशिकी मुद्दा १४४ निशानची बंद लक्ष्य पर लक्ष्य crispr Cas9 rnp प्लाज्मिड
का उपयोग निशानची-Cas9 का लक्ष्य कम करने के लिए crispr-Cas9 के नुकसान के बिना निर्देशित विकास के माध्यम से पर लक्ष्य गतिविधि की हानि के लिए
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Lee, J., Jung, M. h., Jeong, E., Lee, J. K. Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution. J. Vis. Exp. (144), e59202, doi:10.3791/59202 (2019).

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