Summary
In vivo בתרבית של מודלים של פגמים קריטיים בגודל העצם חיוניים עבור החוקרים ללמוד מנגנוני הריפוי וטיפולים אורתופדיים. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול עבור היצירה של פגמים לשחזור, סגמנטלי, הירך אצל חולדות מיוצב בעזרת קיבוע חיצוני.
Abstract
מחקר אורטופדי מסתמכת במידה רבה על מודלים בעלי חיים לימוד מנגנונים של עצם ריפוי ויוו , כמו גם לחקור את טכניקות טיפול חדש. בגודל קריטית פגמים סגמנטלי מאתגרת להתייחס קלינית, מאמצי המחקר יכול להפיק תועלת מודל בעל חיים קטן אמין, פעולות כירורגיות של פגם הירך סגמנטלי. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול כירורגי ממוטב עבור יצירה עקבית, לשחזור של פגם קריטי 5 מ מ diaphyseal עצם הירך עכברוש התייצב עם fixator חיצוניים. Ostectomy diaphyseal בוצעה באמצעות ג'יג מותאם אישית כדי למקם קירשנר 4 חוטים bicortically, אשר יוצבו התקן מותאם fixator חיצוניים. כותש העצמות נדנוד נעשה שימוש כדי ליצור את הפגם. ספוג קולגן לבד או ספוג קולגן טבולים rhBMP-2 היה מושתל לתוך הפגם, ריפוי עצם נוטרו מעל 12 שבועות באמצעות צילומי רנטגן. לאחר 12 שבועות, חולדות הוקרבו ולאחר ניתוח היסטולוגית בוצעה הפקד נכרת וטיפל עצמות הירך. פגמים עצם המכיל רק קולגן ספוג הביא והמעלית, בזמן הטיפול rhBMP הניבו את היווצרות עצם חדש וחסר חידוש שיפוץ. קיבוע טוב התאושש לאחר ההשתלה, וחיצוניים בעלי חיים הוכיחו מצליח לייצב את הליקויים הירך מעל 12 שבועות. מודל ניתוח יעיל זה יכול להיות מיושם בקלות ללמוד ריפוי עצם ואף מבחן biomaterials אורטופדי חדש ואת טיפולים משובי vivo בתוך.
Introduction
טראומה אורתופדיה הניתוח מתמקד בטיפול במגוון רחב של שברים מורכבים. קריטי עצם סגמנטלי diaphyseal פגמים הוכיחו קשה לטפל קלינית בשל היכולת משובי ירידה של השרירים המקיפים, קרום העצם, כמו גם על הכשל מקומי אנגיוגנזה1. טכניקות הטיפול מודרניים כוללים לקיבעון אופרטיביים עם בעזרת השתלת עצם, מתעכבת בעזרת השתלת עצם (Masquelet), עצם תחבורה, פיוז'ן, או קטיעה2,3,4. אצל רוב המטופלים שיש להם פונקציה אמבולטורי נשמר לאחר הטראומה שלהם, גפיים דיסטלי מתפקד היטב, להציל איבר ברור אפשרות טיפול טוב יותר5. טיפולים אלה הצלה לעיתים קרובות דורשים התערבויות כירורגיות בשלבים במהלך קורס טיפול ארוך. יש מחברים הראו שאת קיבוע חיצוני עדיפה לעומת שטח פנימי קיבוע ליישומים אלה עקב הרס הרקמה ירד במהלך ההשתלה, ירד מושתל, ו מוגברת לאחר הניתוח כוונון של fixator6. ניסוי מבוקר אקראי פרוספקטיבי זאת, כעת לדרך כדי לסייע להבהיר את המחלוקת פנימי לעומת קיבוע חיצוני בשברים פתוחים חמורה של שוקה7. למרבה הצער, עם הטיפול או שנבחר, סיבוך משמעותי וקצבי כשל נמשכות8,9. עם אחת מהשיטות הטיפול, לגבי אובדן עצם סגמנטלי, המנתח חייב להתמודד עם פגמים diaphyseal סגמנטלי שמציגים אתגרים משמעותיים. תיקונים של פגמים סגמנטלי חייב למקסם את ייצוב העצם ולשפר בו-זמנית את תהליך osteogenic10,11.
בשל החשיבות הקלינית, אך נפח נמוך, קריטי בגודל diaphyseal סגמנטלי פגמים, יעיל, לשחזור במודל חיה יש צורך לאפשר לצוותים מחקר לקדם את טכניקות הטיפול ולשפר בסופו של דבר את התוצאות הקליניות. החוקרים צריכים ללמוד ויוו הפיזיולוגיות מנגנוני הריפוי במודל בעלי חיים יונקים. בזמן כזה מודלים של קיבוע חיצוני כבר קיימים12,13,14,15, אנו מקווים לספק שיטה אמינה יותר עבור הלא-האיגודים ללא טיפול בבעלי החיים, הקטנת עלויות באמצעות הבחירה של חומרים fixator במחירים סבירים, מתאר פרוטוקול כירורגית פשוטה ליישום קל כדי מחקרים עתידיים. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא ליצור מודל לשחזור ואמין של פגם diaphyseal קריטי אצל חולדות. ההליך הוערך על-ידי הערכת פעולות הייצוב והשימור עצם לריפוי עצמות הירך עכבר מעל 12 שבועות. מטרות משניות כללו: ביצוע מודל סבירים כמו עלות יעילה ככל האפשר, לפשט את הגישה כירורגי, מייצב, ומבטיחה אתית על בעלי החיים. הסופרים ואנשי צוות המחקר ערכו ניסויים מוקדמים עם מגוון של biomaterials שונים וטיפולים משובי פוטנציאל לשיפור ריפוי פגם סגמנטלי זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
החולדות השתמשו במחקר זה קיבל טיפול יומי בהתאם להנחיות AVMA על המתת חסד של בעלי החיים: 2013 מהדורה16. אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון הערכה, אישור פרוטוקול נסיוני זה לפני תחילת הפרויקט.
1. בעלי חיים
- השתמש outbred ספראג-Dawley זכר לעכברושים במשקל של-350 גרם.
2. הכנה של עצם Morphogenetic חלבון-2 (rhBMP 2) ספוג ספוג פיגומים
הערה: הכנה לגרדום צריך להתרחש רק לפני ההשתלה של עצם הירך (ראה צעד 6.14).
- בצע את הוראות היצרן לשימוש של ערכת שתל עצם rhBMP-2 הוקמה המכיל של קולגן ספוג, rhBMP lyophilized-2, ובמים סטריליים שיחזור17. שמירה על עקרות, לשקם את rhBMP-2 עם המים סטרילי כדי ריכוז של 1.5 mg/mL.
- באמצעות מספריים סטרילי וסרגל סטרילי, לקצץ את הספוג קולגן רטובה rhBMP-2 כדי לשנות את צורתו להתאמה של 5 מ"מ x 3 מ"מ x 3 מ"מ פגם.
- באמצעות מזרק, פזר את הפתרון rhBMP-2 באופן שווה מעל הספוג קולגן כך זה נספג.
3. הכנת התקן מותאם אישית קיבוע חיצוני
הערה: ראה איור 1A לקבלת הפירוט המלא יותר של ממדים.
- לחתוך אלומיניום גיליון מניות (6061, סוג 0.088" עובי) לשתי חתיכות (1.4" x-6") באמצעות פאזל או כלי אחר המתאים.
- הר שלמה למכונת הטחינה ו... באמצעות 1/8" ב- 90°-נקודת קרביד התרגיל טחנה, ארבעה חריצים 'וי' (0.035" עמוק) לאורכו. להשאיר את השני ללא חתכים.
- לחתוך לוחות בודדים של 0.3" רוחב של השני החלקים (איור 1B). למדוד, לקדוח חורי עבור הליך משנה 4-40. הקש על צלחת עם חריצים 'וי' עם החוט 4-40. תרגיל את הצלחת ללא חריצים עבור תרגיל הגוף #4 הבורג.
- חול שני החלקים לעגל פינות ולהפחית את משקל (איור 1C).
- לעזאזל עם חתיכות יחד עם 4-40, 18-8 נירוסטה לחצן בראש כיפה ברגים (0.25") כך חריצים מיושרים נגד במשטח רגיל (איור 1D)
4. הרדמה הליך, שיכוך כאבים
- לגרום הרדמה על ידי הנחת החולדה בחדר אינדוקציה אספקת 4 L O /min2עם 4% איזופלוריין.
התראה: אנשי המחקר חייב למנוע שאיפת גז הרדמה, לשמור על המנוע תקין ואוורור במעבדות. - להסיר את החולדה מן החדר לאחר העכברוש מאבד שקמה בעצמה אחרי שמפילים רפלקס, לצרף קונוס האף ולמקם במינון תחזוקה של הרדמה דרך האף (O2 משלוח שיעור לאיזופלוריין 2-3 L/min ו- 0.8%).
- מקם את החולדה על כרית חימום או תחת אור התחממות כדור הארץ כדי למנוע היפותרמיה.
- לאשר את עומק נאותה של הרדמה על ידי צובט את הבוהן או בדיקה את רפלקס palpebral.
- שימון חלות על העיניים כדי למנוע ייבוש מתוך הקרנית.
- לספק זריקה תת עורית של הבופרנורפין המורחבת לשחרר (1 מ"ג/ק"ג) על המטען/dorsum של העכברוש, רחוק באתר כירורגית, לספק שיכוך כאבים עד 3 ימים לאחר הניתוח.
5. aseptic והכנה המניעה לאנטיביוטיקה
- לגלח את האזור סביב hindleg באמצעות הצלעה 13, כף הרגל, האמצע הגבי האמצע הגחון כשוליים.
- סקראב גילח אזור בעזרת גזה סטרילית של 2 x 2, ספוגה povidone 10%-ואחריו 70% יוד EtOH (4 פעמים כל אחד, לסירוגין).
- לנהל זריקה תוך שרירית של צפאזולין (20 מ"ג/ק"ג) לתוך הארבע פעיל.
- לנהל enrofloxacin (0.25 mg/ml) במי שתייה במשך 7 ימים במשככי להגנה המשך באנטיביוטיקה.
- במקום חולדות על תרופות מזון (למשל, Uniprim) עבור משך המחקר כדי למנוע דלקות בדרכי pin.
- חלות אנטיביוטית זוגי הממשק העור פינים פעם אחת מדי יום במשך 3 ימים במשככי.
הערה: להימנע כל פין קיבוע חיצוני או להשתמש במלחציים התרופפות אשר יכולים לתרום להתפתחות של זיהום.
6. ניתוח
הערה: בצע מתואמת של מאמץ כדי לשמור על סביבת עבודה בעלת שדה סטרילי ופעל סטרילי טכניקה לאורך כל מכלול של התיק.
- להרחיב את הרגל מגולח דרך מאסו fenestrated, דביק ברור וספסל כירורגי מכסה במגבות סטרילי כדי ליצור שדה סטרילי.
- ימשש עצם הירך ולהשתמש להב #15 כדי ליצור חתך anterolateral דרך העור המשתרעת עצם הפיקה הירך-עצם הירך הפרוקסימלית.
- בזהירות פצעים וחתכים fascia לרוחב הרגל לאורך מחצה intermuscular להפריד את vastus lateralis שריר הירך הארבע-ראשי anteriorly מיתרי הברך posteriorly עד עצם הירך לרוחב חשוף. לשמר את ההכנסה גיד gluteal החוטף-הירך.
- לבצע ניתוח זהיר, רקמות רכות במבניו atraumatic ולחשוף את עצם הירך ב שלה diaphysis אמצע החל על פני לרוחב. כדי לעשות זאת, השתמש בלהב #15 לחתוך בעדינות את השריר מן העצם שמתחת על ידי שמירה על הלהב מקבילים נגד קווי המתאר של פני השטח של העצם. השתמש פריוסט כדי להרים את השריר מן העצם חשוף כמו זה הוא גזור והמשך סביב הירך עד 7-10 מ מ diaphysis המרכזית נוקתה של רקמות רכות מכל הצדדים כדי להתכונן ostectomy.
הערה: להימנע מפציעה על הצרור נוירו-וסקולריים הירך המדיאלי. - הוספת 4 חוטים קירשנר (k) 1.0 מ מ: 2 proximal וביים 2 דיסטלי של עצם הירך בניצב עצם הירך לרוחב, ישר לרוחב כדי המדיאלי. ודא שכל הפינים לעסוק בשני cortices (bicortical) ליציבות נאותה (איור 2 א).
- להתחיל עם ה-pin דיסטלי ביותר קודם, רק ברמה של העלי הרוחבית. המקום פאזל פלאש בעצם הירך לרוחב והכנס k-חוט 1.0 עצה משורשרות.
- שמירה על מיקומו של התוכנית על העצם, לזהות בו ה-pin מקורב ביותר יזין העצם מבוסס על החורים יג. אחרי המיקום בקפידה פצעים וחתכים במקביל סיבי הגיד gluteal כנדרש, כדי ליצור פער קטן בתוך הרקמה עבור ה-pin proximal לעבור, ובכך למזער את הפגיעה iatrogenic הגיד. תרגיל 1.0 מ מ ללא הליכי משנה k-חוט פער זה, שוב להבטיח שה-pin עוסקת בשני cortices (איור 2B).
- של ג ' יג שמרו על קשר עם העצם, תרגיל שני 1.0 מ מ מושחל k-חוטים, אחד משני צדי פגם עתידיים באתר. ודא סיכות לעסוק בשני cortices (איור 2C).
- מניחים את fixator חיצוני בר ברמה 1 ס מ מעל העור, לדפוק בחוזקה, נועל את המחסום במקום. קליפ את אורך pin עודף (איור דו-ממדי).
- להכין ostectomy (פגם הבריאה) על-ידי הצבת מפסק קטן, מעוקל סביב עצם הירך anterior ואת אחורי כדי להגן על הרקמות שמסביב, שריר, צרור נוירו-וסקולריים. ניצול הסאגיטלי ~ 5 מ"מ נדנוד ראתה להב, בזהירות רבה ליצור פגם סגמנטלי 5 מ מ דרך diaphysis מאמצע. החל אור, גם הלחץ עם המסור להימנע מיותר שבר (2E איור).
- להחיל כמויות קטנות של השקיה (בטמפרטורת החדר 0.9% סטרילי תמיסת מלח (NS)) לפי הצורך תוך יצירת פגם כדי להימנע תרמי ונמק של העצם.
- לרוקן את הפצע באמצעות 10 מ"ל של NS אחרי יצירת את הפגם.
- לנהל 0.1 מיליליטר 0.25% נמשך עם אפינפרין (1:200, 000) על הפצע שיכוך כאב, מצר את כלי הדם.
- הוספה לגרדום (5 מ מ x 3 מ מ x 3 מ מ) של קולגן ספוג או rhBMP-2 ספוג ספוג (מתוך שלב 2) לתוך הפגם. כל לגרדום צריך בגודל כראוי כדי להקיף את אורך ונפח של הפגם, עוזר השנורר להישאר בעמדה.
הערה: בשלב זה, מתחמי mRNA עשוי להיות מוכן והזריק כמתואר בצעדים 7.1-7.3 להלן אם ביצוע הדמיה ביולומינסנציה. - סגור את המטוס שריר באמצעות התבנית קטע פשוט בתפר שנספג 4-0. סגור את שכבת העור באמצעות תבנית subcuticular פועל בתפר שנספג 4-0, איך מתקדמת כדי לסגור פערים סביב הפינים בולטות.
- הסר את החולדה קונוס האף, שנותרו על כרית חימום, ונטר ברציפות עד העכברוש הוא מסוגל באופן עקבי לשמור על תנוחה זקופה. בשלב זה, מניחים בתוך כלוב נקי כדי להתאושש.
7. הכנת mRNA ומורכבת והדמיה ביולומינסנציה
הערה: תרביות תאים עם מתחמי mRNA צריכה להתבצע במהלך הניתוח יום אחד לפני הפריה חוץ גופית הדמיה. להשתמש בטכניקות סטריליות בעת טיפול mRNA.
- µL מיקס 10 של ה-mRNA קידוד עבור Gaussia לוציפראז (מניות ריכוז של µg 1/µL) עם 30 µL של סוכן transfecting lipidic.
- לאפשר מתחמי ה-mRNA-השומנים לטופס על-ידי המקננת לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסוכן transfecting lipidic לדחוס את מולקולות ה-mRNA, ייצוב אותם ושיפור יעילות תרביות תאים.
הערה: אם מתחמי לא משמשים באופן מיידי, לאחסן אותם בקרח לתקופה מקסימלית של 1 h נגד חשמל סטטי. - באמצעות פיפטה µL 20 מצוידים עם טיפים מסוננים, להזריק חצי נפח של mRNA מתחמי לקצה הדיסטלי, מקורב הפגם, בהתאמה.
- למחרת, 3 דקות לפני הדמיה, עזים ומתנגד העכברוש באמצעות איזופלוריין בשאיפה כפי שתואר קודם לכן ב- 4.1 שלב.
- מקם את החולדה ויוו הדמיה קאמרית מצויד קונוס האף אספקת איזופלוריין תחזוקה (0.8% איזופלוריין, O2 קצב משלוח של 2-3 L/min).
- מזריקים coelenterazine resuspended בתוך תמיסת מלח במינון של 4 מ"ג/ק"ג משקל גוף בקרבתו של הפגם.
- לרכוש תמונות ביולומינסנציה עם ה- ויוו מערכת (IVIS) על פי הוראות היצרן18הדמיה.
8. הדמיה פרוטוקול
- לאחר כיול המכשיר רדיוגרפי רגיל, מערכת צילום רנטגן19, עזים ומתנגד עכברים באמצעות איזופלוריין נשאפים כמו שתואר לעיל (ראה שלב 4.1) ומקם את החולדה בגביע האף עם איזופלוריין בשאיפה (0.8% איזופלוריין, O2 קצב משלוח של 2-3 L/min) עבור radiograph הירך anteroposterior (AP).
- כאשר העכבר נמצא recumbency בחזה ובצלעות, להתקדם קדימה, את hindlimb כירורגית כיפוף בירך, להחניק משותף. להגמיש את המפרק חנוק כ 90°. קלטת הצד plantar כפת, קרוב לקיר הגוף. מיקום עצם השוקה קדימה של עצם הירך כדי לשלול את האפשרות של superimposing את העצמות. כדי לספק החטיפה קלה של הירך, במקום ספוג שקוף (כ 15 מ מ עבה) באזור המפשעה. ואז להשיג תמונה (הגולגולת סימטרית) קדמי-את ישבנה של עצם הירך.
- חזור על תצוגה רדיוגרפי זו עצם הירך AP מיד לאחר הניתוח, 4 שבועות, ו- 12 שבועות. השתמש גאזה למצב כראוי את הגפיים של החיה איכות, הדמיה עקבית.
- הסר את החולדה קונוס האף ונטר ברציפות עד העכברוש הוא מסוגל באופן עקבי לשמור על תנוחה זקופה. אז, המקום בחזרה לתוך הכלוב.
9. הליך היסטולוגית
- המתת חסד חולדות בחדר עם CO בשאיפה2 על פי סטנדרטים אתיים AVMA16.
- לאחר המתת חסד, לגלח את hindlimb, להסיר את העור מן החמורים פעיל, disarticulate הירך בירך. הסר בזהירות את כל רקמות רכות של עצם הירך פעיל (כולל כל השרירים, הגידים והרצועות). להשאיר רק שכבה דקה של השרירים המקיפים את אתר פגם כדי להגן על האזור הריפוי מנזק בהיסח הדעת במהלך ניתוח.
- למקם את עצם הירך 10% נייטרלי Buffered פורמלין בטמפרטורת החדר במשך 3-4 ימים כדי לאפשר את הקיבעון. לשמור על פורמלין 15:1 יחס נפח הרקמה. לשנות את הפתרון ברגע באמצע תהליך קיבוע.
- Decalcify עצם הירך ב- 15% Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) pH 6.5 פתרון עבור 3-4 שבועות. לאסוף צילומי טורי כדי לקבוע נקודת קצה decalcification.
- קטיעות עצם הירך longitudinally עם חתך ממכסה והשתרשה עמוק בלבה את ישבנה במטוס מאמצע-הווריד. להגיש רקמות פרפין סטנדרטי הטבעה hematoxylin ואת אאוזין (H & E) מכתים.
- לשלוח שקופיות H & E פתולוג עבור הערכה היסטולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הניתוחים בוצעו בעוד שעה בקירוב על ידי מנתח אחד עם העזרה של עוזר אחד. לאחר ניתוח אופטימיזציה, אינטרה - וסיבוכים לאחר הניתוח היו במידה רבה ממוזער, שימוש המנגנון ג'יג הבטיחו גודל עקבית (5 x 3 x 3 מ מ), לוקליזציה של פגמים הירך. חולדות היו פעולות כירורגיות הבאות מיד ההתאוששות מן ההרדמה, לא נראה לי כל דפוסי התנהגות שונה; ההליכה שלהם הייתה לא antalgic, הם לא הופיעו כדי להיות מוטרד על ידי fixator חיצוניים.
הליכי משנה שאינם k-חוטים נבחרו עבור ה-pin מקורב ביותר (איור 2B), כמו ה-pin proximal לסיכון הגבוה ביותר של שובר כאשר החוטים משורשרות שימשו. במקרים מסוימים, בעיקר בשליטה חיות ללא rhBMP-2 או פיגומים פגמים אשר הראה שום ראיה ריפוי/עצם היווצרות, טיפים k-חוט אחד או יותר פרצו לאחר כ 8 שבועות כפי שניתן לראות את הספוג רק לשלוט radiograph של עצם הירך נכרת ( איור 3).
צילומי רנטגן והיסטולוגיה (צביעת המטוקסילין -אאוזין) נותחו כדי להעריך את רמות של ריפוי עצם. בקרה שלילית פגמים המכיל רק ספוג קולגן הראה שום הוכחה פרכת בין קצות העצם לקרע, (איור 3, איור 4) גישור. כמות קטנה של איחוי העצם החדשה ניתן לראות ישירות סמוך לקצה לחתוך עצם הירך; הפגם עצמו מראה חוסר חומר העצם, הנוכחות של הסחוס, יש שטף דם שיורית (איור 4). פגמים המכיל rhBMP-2 ספוג ספוג הפגינו עצם משמעותית ריפוי מוקדם ככל 4 שבועות לאחר הניתוח, כפי שמוצג על ידי גישור קשוח בלייזר על פני הפגם באיור3. על ידי 12 שבועות, משמעותי התצהיר מינרל חדש (איור 4, NB: עצם חדשה, PC: חידוש קשוח) הקימה לאורך כל הפגם. עצם חידוש משמעותי חדש ניתן לראות את הרחבת קשוח מהקצה לחתוך עצם הירך, spicules של עצם ארוגים, מחליפי פיתחו לאורך כל הפגם. הסחוס התצהיר הוא לא ראיתי (איור 4).
היסטולוגיה (צביעת המטוקסילין -אאוזין) בוצעה גם עבור פקד נגוע והן דוגמה עצם הירך הנגוע (איור 5). עצם הירך הנגוע הוא מוגדל באופן משמעותי, מראה סימנים של תגובה endosteal שחדר קליפת העצם. חיצים מציינים אזורים של ספיגת עצם פיפטות בתיווך אוסטאוקלסט. קליפת עצם הירך נגוע נשאר קומפקטית, עם קליפה מחליפי לחדיה. מינון אנטיביוטיקה אופטימלי כדי לכלול כיסוי מקסימלי במשככי. בזמן זיהום סביב האתר הפגם יכול להתרחש, המשך ניהול של אנטיביוטיקה topically סביב ה-pin אתרים, מים, תזונה עלתה בצמצום זיהום לאחר הניתוח.
הדמיה נוספות באמצעות מערכת הדמיה Vivo ב (IVIS) מדגים את היכולת של תאים זוהרים ניתן לאבחן בתוך הפגם לאחר השרשת fixator חיצוני (איור 6). הצלחת חיצוני יכול להיות בקלות להסיר עבור הדמיה והחליפו עם סיומו. תאים בחלל מדולרי luminesce לאחר תרביות תאים עם ה-mRNA ומורכבת קידוד עבור לוציפראז Gaussia. הרמה הגבוהה ביותר של הפריה חוץ גופית הוא מרוכז באתר של הפגם הירך, האות לא נחסמת על-ידי הסיכות מכשיר קיבעון. זה מבטיח עבור מחקרים עתידיים להסתמך על ביולומינסנציה או קרינה פלואורסצנטית למדוד שינויים ביולוגיים כגון ביטוי גנים או חלבון במהלך תהליך ההחלמה.
איור 1: ייצור חיצוניים fixator. A: CAD סכמטית fixator חיצוניים מורכבים עם ממדים המבואר עבור ייצור תקין. כל fixator מורכב שתי פלטות אלומיניום מחוזק ע י שני הברגים. B: צלחות לחתוך אלומיניום גליונות 1.4 "x-6" עם חריצים 'V' חותכים את הסדין התחתון. C: חורי הברגים הם תרגלנו את הצלחות (משורשרות בצלחת עם חריצים 'V') ואת כל בקצוות ובפינות ״הכל לעגל ולהפחית את משקל. D: שהורכב fixator חיצוני הוא הידק עם ברגים (4-40 x 0.25", 18-8 נירוסטה לחצן ראש cap) לאחר סיכות במקום החריצים 'וי' על הקרביים של הלוחות אלומיניום. ה-pin השמאלי הוא שאינם הליכי משנה והוא מקורב ביותר על עצם הירך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סכמטי של pin השמה, השמה fixator פגם הבריאה. א: ה-pin הדיסטלי (1.0 מ מ מושחל תיל-k) ממוקם אזור metaphyseal epicondyle באמצעות ג ' יג (מלבן כחול) כדי להדריך את הכניסה ה-pin הנכון. ג ' יג מונחת על גבי המשטח הירך anterolateral. B: ה-pin (1.0 מ מ ללא הליכי משנה k-תיל) צינתור מושם באמצעות התוכנית לאחר ביצוע חתך קטן הגיד העכוז. C: סיכות האמצעי (1.0 מ מ מושחל תיל-k) מוכנסים באמצעות ג ' יג. D: רוסמ יוסר ולא הלוחות 2 מחוברים הפינים באמצעות 2 הברגים כדי לאבטח את הצלחות. הלוחות הם הידקו 1 ס מ מעל פני העור כדי למנוע לחץ על העור. E: מסור נדנוד הסאגיטלי משמש ליצירת פגם 5 מ מ בין שני הפינים האמצעי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נציג צילומי ברזולוציה גבוהה להראות עצם ריפוי עם טיפול rhBMP-2- תמונות עבור השנורר קולגן שליטה שלילי ואת הקבוצות ספוג רטוב rhBMP-2 מוצגים במשככי 0, 4, ו 12 שבועות. קבוצת טיפול rhBMP-2 תערוכות ריפוי משמעותי לאחר 4 שבועות עם קשוח פורש את הפגם. הקצוות של עצם הירך שליטה שלילי לא לרפא עם גישור העצם ונשאר הפגם והמעלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: צורה עצם חדשה משמעותית נתפסת עם טיפול rhBMP-2- נציג 4 x בהגדלה תמונות היסטולוגית H & E השנורר קולגן שליטה שלילי, ה-rhBMP-2 ספוג ספוג קבוצות בקצה עצם הירך לחתוך והן בתוך את הפגם. עצם חדשה שהוקמה סביב קצה עצם הירך שליטה, אבל הרחבות משמעותיות הן עצם trabecular חדש, כמו גם בפרויקט קשוח חידוש עצם הירך שטופלו. שום חומר גרמי נתפסת בתוך הפגם שליטה, בזמן היווצרות העצם משמעותי יכול להיות שנצפו ברחבי הפגם שטופלו rhBMP-2. נ. ב: עצם חדשה, f: עצם הירך, c: סחוס, ח': דימום, PC: חידוש לאמיתו. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: הירך נגועים תערוכות היפרטרופיה סמנים דלקתיים תא. H & E תמונות היסטולוגית של הירך נגוע בהשוואה של עצם הירך נגוע, בתצוגה מלאה ו- 4 x הגדלה של מיקומים מסגרת. קליפת הירך נגוע נשאר מאורגן, מוגדרים היטב, עם שלט קטן של דלקת. עצם הירך נגוע מגדיל במידה רבה, כפי שניתן לראות בתצוגה מלאה, קליפת שבורים מאת תחומי resorption נמק (תא סגול אשכולות המסומנים על ידי חצים שחורים). F: עצם הירך. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: Gaussia לוציפראז אות זוהה הפגם. הפריה חוץ גופית של תאים transfected עם Gaussia לוציפראז ש-mrna הוא תמונה עם IVIS לאחר הסרת לוחית חיצוניים. אדום מציין את עוצמת הארה הגבוהה ביותר באתר של הפגם הירך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים בעלי חיים קטנים של פציעות אורטופדיות כגון שברים בעצמות מלאה לאפשר מחקר זה בוחן את המנגנונים של הפוטנציאל הטיפולי biomaterials20פרכת והערכה. מחקר זה מציג חולדה פגם סגמנטלי דגם מיוצב על ידי fixator חיצוני מותאם אישית זה צוות המעבדה, הנדסה ביו-רפואית ניתן להפיק בקלות עבור מחקרים נוספים של תומך osteosynthetic עצם תיקון.
מחקרים קודמים באמצעות פגמים קריטיים בגודל חולדה דגמים בדרך כלל להסתמך על קיבוע פנימי צלחות21,22,23,24. אף אחת מהשיטות קיבוע קבילה מבחינה רפואית, קיבוע חיצוני יש יתרונות ברורים גרימת הפרעה רקמות רכות פחות ואובדן דם, הפחתת שטח משטח מושתל כדי למזער את ההזדמנויות עבור מושבת חיידקים, ומאפשר יכולת כוונון לאחר הניתוח וכן התערבויות כירורגיות בשלבים6. דגמים קודמים של בעלי חיים שבר קיבוע חיצוני השתמשו בחומרים שונים צלחת, pin securement, ו/או עצם חיתוך שיטות12,13,14. כי fixator חיצוני ב פרוטוקול זה בוצע בסדנה של המעבדה עם אלומיניום בעלות נמוכה יכול להיות בקלות, אשר שופץ וחודש ההוצאות היו מזעריות. זה מספק ש-fixator חיצוני חסכוני מאפשר לחוקרים לבצע ניסויים עם מספר קבוצות בעלי חיים ללא מוגבלים פיננסית. לעומת מודל פנימי, אנו מאמינים כי מערכת זו היא טכנית פשוטה יותר לשחזור במודל בעלי חיים קטנים. הניסיון שלנו עם מודלים אלה, קיבוע פנימי הוא תובעני יותר משמעותית מבחינה טכנית, ניתן לדרוש שתלים במכונה-מותאם אישית. לידע של המחברים, פרוטוקול הכולל זה הוא ייחודי בזכות השימוש ג'יג אישית מעוצבת בשילוב של עיצוב מותאם fixator חיצוני מתכת15, כמו גם את השימוש עצם נדנוד ראו טוב יותר מייצגים התרחיש הנפוץ קליני של בנוכחות אחר חידוש לבצע כדי להתכונן קיבוע שבר אתרים. הערה סופית על השימוש המסור נדנוד במודל זה הוא החום שנוצר ובהפסקות חידוש המתרחשת מספקת אלמנט סופי של שליטה ביצירת מודל והמעלית. הניסיון שלנו כבר כי עם שיטות אחרות, במודלים של בעלי חיים אלה, חוקרים מפעיל את הסיכון של הפקדים ריפוי.
כדי להבטיח הצלחה כירורגי, כדאי לשים לב-מספר שלבים קריטיים: כאשר אם וביצוע את הקרע במבניו לחשוף את עצם הירך שבסביבה שריר, להימנע מטרידה פציעה עצבים. הקליפה, כלי הירך medially, ו הגיד gluteal הציר הקרוב. לטפל כדי למקם המקבילה המנגנון ג'יג ותורידי נגד לדירה, anterolateral הפנים של עצם הירך כך כל הפינים הם בדיוק בניצב לעצם. זה לאשר את היישור הנכון של fixator חיצוני, המקטינות את הסבירות pin שבירה. הסדר של מיקום ה-pin נמצא הברור ביותר היה דיסטלי ראשון, ולאחריו צינתור, ואז שניהם המזרח התיכון סיכות. פעולה זו מותרת עבור פחות הפרעה של הגיד gluteal בניצרה הפרוקסימלית. לבסוף, חשוב כי כל סיכה ממוקמת bicortically, חודר בשני cortices כך הוא אינו לבטל העצם או משמרת לתוך חלל מדולרי.
מכונת רנטגן מסוגל רדיוגרפיה ברזולוציה גבוהה שימש כדי לנטר את מצב העצם-הילינג כמו שינויים איכותי, ניתן לאבחן בקלות, לא פולשני לאורך זמן. עם זאת, הרגל עקבי מיצוב חיונית לפירוש רדיוגרפי מדויק כמו הבדלים במיקום עלולה להטעות. תוצאות המחקר הם מסכים עם העבודות הקודמות הוכחת כי פגם הירך 5 מ מ מונעת עצם ספונטני ריפוי חולדות רגילה25. לכן, כל ריפוי זה ציין עם טיפולים נוסף כגון ה-rhBMP-2 ספוג ספוג ניתן בהחלט לייחס את הטיפול המתאים (איור 3).
לגבי אפשרות של טכניקה זו כוללים pin שבירה, התרופפות זיהום. בעיות עם שבירה צינתור הצמד בבדיקות ראשוניות בקשה מתג מ k תילים משורשרות כדי שאינם הליכי משנה. הליכי משנה ללא סיכות מכנית חזקה אבל גם להוות הסיכון יותר. נסוג של קליפת המוח. במיוחד באזור עצם ריק פגמים, k-חוטים עשוי לשבור או שנעקרו בסביבות 8 שבועות בשל ממושך pin מחזורי טעינה וחוסר ריפוי (בדומה לרכיבה על אופניים/כיפוף המהדק). ממשטר לאנטיביוטיקה היה מנוצל כדי לכלול הזרקת צפאזולין מיידית, יישום יומי אנטיביוטית באתר החתך, 7 ימים של enrofloxacin הוסיף במים לשתייה וכן הזנה תרופות. פרוטוקול זה לאנטיביוטיקה, יחד עם טכניקות כירורגיות נכונה המתוארים לעיל, ממוזער זיהום (איור 5).
אחד היתרונות נוספים בעזרת קיבוע חיצוני במודל חיה הוא קל להסרת יפה וממקלחות של פגם, החלפת לאחר דימות. דבר זה מאפשר יותר יעיל ויוו הדמיה טכניקות להסתמך על זריחה או הפריה חוץ גופית כדי להעריך שינויים כגון הביטוי גן או חלבון. למשל, אנחנו הראו כי תאים בחלל מדולרי transfected עם ה-mRNA ומורכבת קידוד עבור לוציפראז Gaussia יכול להיות דמיינו IVIS. איור 6 ממחיש כי יכולת איתור אות הפריה חוץ גופית לא כל כך הפריע על ידי גישה זו קיבוע חיצוני כמו זה יכול להיות עם לוחות פנימיים, ברגים, או מסמרים אורתופדיים21,22,23 , 24. פרוטוקול כירורגי זה חסכוני וגם לשחזור מאפשר יצירה עקבית וייצוב של פגם הירך קריטי בגודל המחקה ניהול קליני הראשונית של שברים מורכבים אלה. הקמת מודל בעלי חיים אמין הוא קריטי עבור כל ניסיוני טיפולים מיועד לשימוש קליני בסופו של דבר. המודל שלנו הוכיחה לתוצאות צפויות מראש, שינויים התנהגותיים מינימלי או חוסר נוחות בבעלי חיים שלנו. מודל זה עשוי לשמש עם מגוון של פיגומים מבוססי biomaterial בשילוב עם טכניקות הדמיה מנוצל בעיתון הזה למטרות בדיקה translational בעתיד. . זוהי תקוותנו כי בעבודה עם מודל זה, חוקרים יוכלו לגבש דרכים חדשניים לטיפול פגמים גרמית קריטי אצל חולי טראומה . זה יכול לעזור למנוע את התחלואה ואת עלות טיפולים ארוך מועסקים כיום יכול להקטין את מספר כריתות
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים ללא אינטרסים כלכליים מתחרים או הטבות. היו בלי הטבות קיבל ישירות או בעקיפין על ידי מחברי מאמר זה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק ציוד-NIH 1S10OD023676-01 עם תמיכה נוספים הניתנים על-ידי מחלקות של אורטופדיה באוניברסיטת ויסקונסין, שיקום, בית הספר לרפואה ובריאות הציבור. ברצוננו להודות קרבון סרטן מרכז תמיכה גרנט P30 CA014520 ושימוש של UW של מתקן הדמיה חיה קטנה שלהם, כמו גם מענק הכשרה-NIH 5T35OD011078-08 לתמיכה של מרטין ה'. אנו מודים גם ומייקל שאנון מרי סו על תמיכתם של השותפות התחדשות השלד והשרירים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, Ł, Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R.
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children's Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), Berlin. 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- Living lmage Software. , Perkin Elmer. (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
