Summary
In vivo dos mamíferos modelos de defeitos ósseos tamanho crítico são essenciais para pesquisadores estudando mecanismos de curativas e terapias ortopédicas. Aqui, apresentamos um protocolo para a criação de defeitos reproduzíveis, segmentares, fêmur em ratos estabilizados utilizando fixação externa.
Abstract
Pesquisa ortopédica confia pesadamente em modelos animais para estudar mecanismos de consolidação óssea em vivo , bem como investigar as novas técnicas de tratamento. Tamanho crítico defeitos segmentares são desafiadores para tratar clinicamente, e os esforços de investigação poderiam beneficiar de um modelo animal pequeno confiável, ambulatório de defeitos segmentares femoral. Neste estudo, apresentamos um protocolo cirúrgico otimizado para a criação consistente e reproduzível de um defeito de diáfise crítica de 5 mm em um rato de fêmur estabilizado com fixador externo. A diáfise ostectomy foi realizada usando um gabarito personalizado para colocar 4 bicortically de fios de Kirschner, que foi estabilizada com um dispositivo adaptado de fixador externo. Uma serra de osso oscilante foi usada para criar o defeito. Ou uma esponja de colagénio sozinha ou uma esponja de colágeno embebida em rhBMP-2 foi implantada para o defeito, e a consolidação óssea foi monitorada durante 12 semanas usando radiografias. Após 12 semanas, ratos foram sacrificados e análise histológica foi executada no controle excisado e tratados fêmures. Defeitos ósseos contendo apenas esponja de colagénio resultaram na não-sindicalizados, tratamento de rhBMP-2 rendeu a formação de uma remodelação óssea periosteal de insensível e nova. Fixação de animais bem recuperada após o implante e externa for bem-sucedida na estabilização dos defeitos femorais durante 12 semanas. Este modelo cirúrgico simplificado poderia ser facilmente aplicado para estudar a consolidação óssea e testar novos biomateriais ortopédicos e terapias regenerativas em vivo.
Introduction
Cirurgia de trauma ortopédico centra-se no tratamento de uma ampla gama de fraturas complexas. Crítica óssea segmentar diafisária defeitos provaram-se difíceis de tratar clinicamente devido a diminuição da capacidade regenerativa da musculatura circundante e periósteo, bem como a falha de localizadas angiogênese1. Técnicas modernas de tratamento incluem fixação operativa com enxerto ósseo, atrasou o enxerto ósseo (Masquelet), transporte ósseo, fusão ou amputação2,3,4. Na maioria dos pacientes que têm a função ambulatorial preservada após o trauma, com bom funcionamento Membros distais, salvamento de membro é claramente a melhor opção de tratamento5. Estes tratamentos de salvamento muitas vezes exigem intervenções cirúrgicas encenadas um longo tempo de tratamento. Alguns autores têm sugerido que a fixação externa é superior em comparação com a área de superfície de fixação interna para estas aplicações devido aos danos do tecido diminuição durante o implante, diminuiu implantada e ajustabilidade pós-operatório aumentada de o fixador de6. No entanto, um prospectivo randomizado controlado está em andamento para ajudar a esclarecer esta controvérsia de interno versus fixação externa em graves fraturas expostas da tíbia7. Infelizmente, com qualquer tratamento selecionado, significativas taxas de complicação e falha persistirem8,9. Com qualquer método de tratamento, no que diz respeito a perda óssea segmentar, o cirurgião deve lidar com defeitos segmentares de diafisárias que apresentam desafios significativos. Correções de defeitos segmentares devem maximizar a estabilização óssea e simultaneamente reforçar o processo osteogênico10,11.
Devido a importância clínica e, no entanto, o menor volume de defeitos segmentares diafisárias tamanho crítico, um modelo animal eficaz, pode ser reproduzido é necessário para permitir que equipes de pesquisa para o avanço de técnicas de tratamento e, finalmente, melhorar os resultados clínicos. Os pesquisadores precisam estudar na vivo fisiológica mecanismos cura em um modelo animal mamífero. Embora tais modelos de fixação externa já existem12,13,14,15, esperamos fornecer um método mais confiável para não-uniões nos animais não tratados, diminuição de custos através da escolha de materiais acessíveis de fixador e contorno um protocolo cirúrgico simples, de fácil aplicação para estudos futuros. O objetivo principal do presente protocolo é estabelecer um modelo confiável e reprodutível de um defeito crítico diafisário em ratos. O procedimento foi avaliado pela estabilização e consolidação óssea em fêmures de ratos durante 12 semanas. Os objetivos secundários incluídos: fazendo um modelo acessível como um custo eficaz possível, simplificar a abordagem cirúrgica e a estabilização e assegurar a ética cuidar dos animais. Os autores e a equipe de pesquisa conduziram experimentos preliminares com uma gama de diferentes biomateriais e potenciais terapias regenerativas para melhorar a cicatrização nesse defeito segmentar.
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Protocol
Os ratos utilizados neste estudo receberam cuidados diários, em conformidade com as diretrizes de AVMA sobre a eutanásia dos animais: 2013 edição16. O Comité de uso na Universidade de Wisconsin-Madison e institucional Cuidado Animal avaliaram e aprovaram este protocolo experimental antes do início do projeto.
1. os animais
- Use os outbreds ratos machos Sprague-Dawley pesando aproximadamente 350 g.
2. preparação de Bone Morphogenetic proteína-2 (rhBMP-2) embebido esponja andaimes
Nota: A preparação do andaime deve ocorrer apenas antes da implantação no fêmur (ver passo 6.14).
- Siga as instruções do fabricante para o uso de um kit de enxerto de osso de rhBMP-2 estabelecida contendo uma esponja de colagénio, liofilizado de rhBMP-2 e água estéril para reconstituição17. Manter a esterilidade, reconstitua o rhBMP-2 com água estéril para uma concentração de 1,5 mg/mL.
- Usando uma tesoura esterilizada e uma régua estéril, apare a esponja de colagénio encharcado de rhBMP-2 para remodelar para caber uma 5 x 3 mm x defeito de 3 mm.
- Usando uma seringa, distribua a solução de rhBMP-2 uniformemente sobre a esponja de colágeno que é absorvida.
3. preparação do dispositivo de fixação externa personalizada
Nota: Ver figura 1A , para obter uma lista mais completa de dimensões.
- Cortar alumínio estoque folha (tipo 6061, 0,088" espessura) de duas peças (1,4" x 6") usando um quebra-cabeças ou outra ferramenta apropriada.
- Montar uma peça na máquina de trituração e, usando um 1/8" 90°-ponto carboneto broca moinho, corte quatro ranhuras de «V» (0,035" profunda) longitudinalmente. Deixe a outra parte livre de cortes.
- Cortar chapas individuais de 0,3" largura de duas peças (figura 1B). Medir e fazer furos de parafuso de rosca 4-40. Toque em placa com ranhuras 'V' com o segmento de 4-40. Perfure a placa sem ranhuras para um treino de corpo #4 parafuso.
- Areia de ambas as partes para arredondar cantos e reduzir o peso (Figura 1).
- Dane-se peças, juntamente com 4-40, de 18-8 botão cabeça tampa parafusos de aço inoxidável (0,25") para que os sulcos estão alinhados contra a placa simples (Figura 1)
4. analgesia e procedimento anestésico
- Induzi anestesia, colocando o rato na câmara de indução entregando L 4 O2/min com 4% de isoflurano.
Atenção: Pessoal de pesquisa deve evitar a inalação de gás anestésico e manter capa adequada e ventilação no laboratório. - Remover o rato da câmara depois do rato perde braço endireitante reflex, anexar um cone de nariz e coloque a dose de manutenção da anestesia através do nariz (taxa de entrega de2 O para 2-3 L/min e 0,8% de isoflurano).
- Coloque o rato sobre a almofada de aquecimento ou sob a luz de aquecimento para evitar a hipotermia.
- Confirme a profundidade adequada de anestesia por beliscar o dedo do pé ou teste do reflexo palpebral.
- Aplica lubrificação aos olhos para impedir a secagem da córnea.
- Entrega uma injeção subcutânea de liberação prolongada buprenorfina (1 mg/kg) no porta-malas/dorso do rato, longe do sítio cirúrgico, para proporcionar analgesia por até 3 dias após a cirurgia.
5. asséptica preparação e inibidores de antibióticos
- Raspe a área em torno do hindleg usando a 13th costela, o pé, da linha mediana dorsal e a linha média ventral como as margens.
- Área de matagal raspada usando gaze estéril de 2 x 2 embebido com 10% de iodo-povidona seguido por 70% EtOH (4 vezes cada, alternando).
- Administre uma injeção intramuscular de cefazolina (20 mg/kg) no quadríceps operativa.
- Administre enrofloxacina (0,25 mg/ml) em água potável por 7 dias no pós-operatório para protecção antibiótica contínua.
- Coloque ratos sobre alimentos com medicamentos (por exemplo, Uniprim) para a duração do estudo para evitar infecções do tracto de pino.
- Aplique pomada antibiótica dupla para a interface pele-pin uma vez diariamente por 3 dias no pós-operatório.
Nota: Evitar qualquer pino de fixação externa ou grampear afrouxamento que pode contribuir para o desenvolvimento de uma infecção.
6. ato cirúrgico
Nota: Certifique-se uma concertada ao esforço para manter um campo esterilizado e o espaço de trabalho e siga a técnica estéril durante a totalidade do caso.
- Estenda a perna depilada através de drape fenestrado, claro pegajoso e capa cirúrgica banco em toalhas estéreis para criar um campo estéril.
- Palpar o fêmur e use uma lâmina de 15 # para criar uma incisão ântero-lateral, através da pele, estendendo-se desde a patela para o grande trocanter no fêmur proximal.
- Incise cuidadosamente a fáscia da perna lateral ao longo do septo intermuscular para separar o músculo vasto lateral do quadríceps anteriormente os isquiotibiais posteriormente até o fêmur lateral é exposto. Preserve a inserção do tendão glúteo abdutor sobre o grande trocanter.
- Executar uma dissecção cuidadosa, de tecidos moles circunferencial de atraumática e expor o fêmur no seu meio da diáfise começando na superfície lateral. Para fazer isso, use uma lâmina #15 suavemente, cortar o músculo longe do osso subjacente, mantendo a lâmina paralela contra o contorno da superfície óssea. Use um elevador periosteal para levantar o músculo longe do osso exposto como ele é dissecado e proceder ao redor da diáfise femoral até 7-10 mm da diáfise central foi libertado de tecidos moles, por todos os lados para se preparar para ostectomy.
Nota: Evite lesões o vasculonervoso femoral medial. - Insira quatro fios de Kirschner (k) de 1.0 mm: 2 proximal e distal no fêmur perpendicular ao fêmur lateral, 2 dirigido em linha reta lateral para medial. Certifique-se de todos os pinos se envolver ambos os córtices (bicorticais) para estabilidade adequada (Figura 2A).
- Comece com o pino mais distal, apenas ao nível do epicôndilo lateral. Gabarito de lugar liberar para o fêmur distal lateral e introduza um fio de Kirschner 1,0 ponta roscada.
- Mantém a posição do gabarito no osso, identifica onde o pino mais proximal entrará o osso baseado os furos do gabarito. Uma vez que a posição é determinada, cuidadosamente incise paralelo às fibras do tendão glúteo conforme necessário para criar um pequeno espaço no tecido para o pino proximal a passagem, minimizando assim danos iatrogênicos ao tendão. Perfure um 1,0 mm não roscados fio de Kirschner esta lacuna, novamente, garantindo que o pino de encaixe ambos os córtices (Figura 2B).
- Manter a posição do gabarito em contacto com o osso e perfurar dois 1.0 mm roscada fios de Kirschner, um de cada lado do local do defeito do futuro. Certifique-se de pinos envolver ambos os córtices (Figura 2).
- Coloque o fixador externo bar nível 1 cm acima da pele e aparafuse firmemente, a barra de bloqueio. Clip os comprimentos de pino em excesso (Figura 2D).
- Prepare-se para o ostectomy (criação de defeito) colocando um afastador pequeno, curvado em torno do fêmur anterior e posterior para proteger os tecidos moles circundantes, músculo e feixe vasculonervoso. Utilizando uma oscilação sagital ~ 5 mm da lâmina da Serra, muito cautelosamente, criar um defeito segmentar 5mm através do meio da diáfise. Aplica uma luz, uma pressão uniforme com a serra para evitar desnecessária da fratura (Figura 2E).
- Aplica pequenas quantidades de irrigação (temperatura 0,9% solução salina normal estéril (NS)) conforme a necessidade, ao criar o defeito para evitar necrose térmica do osso.
- Lave a ferida com 10 mL de NS depois de criar o defeito.
- Administre 0,1 mL de bupivacaína a 0,25% com epinefrina (1: 200, 000) a ferida como um analgésico e um vasoconstritor.
- Inserir o andaime (5 x 3 x 3 mm) de esponja de colágeno ou de rhBMP-2 embebido esponja (da etapa 2) para o defeito. Cada andaime deve ser dimensionada adequadamente para abranger o comprimento e volume do defeito, ajudando a esponja fica em posição.
Nota: neste ponto, complexos mRNA podem ser preparados e injetados conforme descrito nas etapas abaixo de 7,1-7,3 se realizando imagens de bioluminescência. - Feche o avião muscular usando o padrão interrompido simples com uma sutura absorvível de 4-0. Fechar a camada de pele usando um padrão de execução subcuticular com sutura de 4-0 e cola para fechar as lacunas ao redor dos pinos protuberantes de pele.
- Retire o cone de nariz, permanecendo na rampa de aquecimento, o rato e monitorar continuamente até que o rato é capaz de manter sempre uma postura ereta. Neste ponto, coloque em uma gaiola limpa para se recuperar.
7. preparação de mRNA complexado e imagens de bioluminescência
Nota: Transfection com complexos mRNA deve ser realizada durante a cirurgia 1 dia antes da imagem latente de luminescência. Use técnicas estéreis ao manusear o mRNA.
- Mix 10 µ l de mRNA codificação para Gaussia luciferase (estoque concentração de 1 µ g / µ l) com 30 µ l do agente transfecting lipídico.
- Permitem os complexos mRNA-lipídios para formar incubando pelo menos 5 min à temperatura ambiente. O agente transfecting lipídico irá condensar as moléculas de mRNA, estabilizando-os e melhorando a eficiência do transfection.
Nota: Se os complexos não são usados imediatamente, armazená-los no gelo por um período máximo de 1 h. - Utilizando uma pipeta de µ l 20 equipados com pontas filtradas, injete metade do volume de complexos mRNA para as extremidades distais e proximais do defeito, respectivamente.
- No dia seguinte, 3 min antes de imagem, anestesia o rato utilizando isoflurano inalado como descrito anteriormente no passo 4.1.
- Posicione o rato em um na vivo de imagem câmara equipada com um cone de nariz entregando manutenção isoflurano (isoflurano 0,8%, taxa de entrega O2 de 2-3 L/min).
- Injete coelenterazine resuspended em soro fisiológico na dose de 4 mg/kg de peso corporal na proximidade do defeito.
- Adquirir imagens de bioluminescência com o na vivo de imagem de sistema (IVIS) de acordo com instruções18 as indicações do fabricante.
8. protocolo de imagem
- Depois de calibrar a máquina radiográfica simples, um sistema de raio x19, anestesiamos rato utilizando isoflurano inalado como descrito anteriormente (ver passo 4.1) e posicione o rato em um cone de nariz com isoflurano inalado (0,8% de isoflurano, O2 taxa de entrega de 2-3 L/min) para uma radiografia do fêmur ântero-posterior (AP).
- Enquanto o rato está em prostração esternal, avançar o cirúrgico membro posterior para frente, flexão no quadril e sufocar a articulação. Flexione a articulação de asfixiar a aproximadamente 90°. Fita do lado de plantar pata no chão, perto da parede do corpo. Posição da tíbia para a frente do fémur para eliminar a possibilidade de sobrepor os ossos. Para fornecer ligeira abdução do quadril, coloque uma esponja translúcida (cerca de 15 mm de espessura) na região da virilha. Em seguida, obter uma imagem (crânio-caudal) ântero-posterior do fêmur.
- Repita essa visão radiográfica do fêmur AP imediatamente após a cirurgia, semanas 4 e 12 semanas. Use fita e gaze para posicionar adequadamente a extremidade do animal para imagem consistente e de qualidade.
- Retire o cone de nariz o rato e monitorar continuamente até que o rato é capaz de manter sempre uma postura ereta. Em seguida, coloque de volta para a jaula.
9. histológico procedimento
- Eutanásia em ratos em uma câmara com inalado CO2 de acordo com padrões éticos de AVMA16.
- Após eutanásia, raspar o membro posterior, remover a pele da extremidade operativa e desarticular o fêmur no quadril. Retire todo tecido mole do fémur operativo (incluindo todos os músculos, tendões e ligamentos). Deixe apenas uma fina camada de músculo em torno do local do defeito para proteger danos inadvertidos durante a dissecção da região de cura.
- Coloque o fêmur em 10% neutro tamponado formalina em temperatura ambiente por 3-4 dias para permitir a fixação. Manter um formol de 15:1 a relação entre o volume de tecido. Altere a solução, uma vez que o processo de fixação no meio.
- Descalcificar o fêmur em uma solução de pH 6,5 15% ácido etilenodiaminotetracético ácido (EDTA) por 3-4 semanas. Colete seriais radiografias para determinar o ponto de extremidade de descalcificação.
- Bissetriz do fêmur longitudinalmente com um corte de anterior posterior no plano sagital médio. Submeta o tecido para incorporação de parafina padrão e hematoxilina e eosina (H & E) coloração.
- Envie H & E slides para uma patologista para avaliação histológica.
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Representative Results
Cirurgias foram realizadas em cerca de uma hora por um cirurgião com a ajuda de um assistente. Após a otimização cirúrgica, intrae complicações pós-operatórias foram grandemente minimizadas e usam de aparato jig assegurado tamanho consistente (5 x 3 x 3 mm) e localização de defeitos femorais. Ratos foram ambulatorial imediatamente após recuperação da anestesia e não pareceu ter qualquer padrões comportamentais alteradas; sua marcha não era antalgic, e eles não pareciam ser perturbado com o fixador externo.
Não roscados de Kirschner foram escolhidos para o pino mais proximal (Figura 2B), como o pino proximal tinha o mais alto risco de quebrar quando foram utilizados fios de rosca. Em alguns casos, particularmente no controle dos animais sem rhBMP-2 ou andaimes cujos defeitos não mostraram nenhuma evidência de formação de cura/osso, uma ou mais pontas de fio de Kirschner quebraram após cerca de 8 semanas, como pode ser visto na esponja só controlam radiografia do fêmur extirpado ( Figura 3).
Radiografias e histologia (coloração H & E) foram analisados para avaliar níveis de consolidação óssea. Controlo negativo defeitos que contém somente uma esponja de colagénio não mostrou nenhuma evidência de colmatar a osteogênese entre as extremidades proximal e distal do osso (Figura 3, Figura 4). Uma pequena quantidade de nova remodelação óssea pode ser vista diretamente adjacente à borda de corte do fêmur; o defeito em si mostra uma falta de material ósseo, a presença de cartilagem e algum hematoma residual (Figura 4). Defeitos contendo rhBMP-2 embebido esponja demonstrada significativa consolidação logo em 4 semanas após a cirurgia, como mostrado pelo insensível radiopaco ponte através do defeito na Figura 3. Por 12 semanas, deposição mineral nova significativa (Figura 4, NB: osso novo, PC: periosteal insensível) formou-se em todo o defeito. Significativa osso periosteal novo pode ser visto no insensível estendendo da borda de corte do fêmur, e espículas de osso lamelar e tecido desenvolveram-se durante todo o defeito. Deposição de cartilagem não é visto (Figura 4).
Histologia (coloração H & E) realizou-se, também, para um controle não infectado e um exemplo de um fêmur infectada (Figura 5). O fêmur infectado é significativamente ampliado, mostrando sinais de reacção endosteal infiltrando o córtex do osso. As setas indicam áreas de reabsorção óssea patológica osteoclast-mediada. O córtex de fêmur não infectados permanece compacto e com um córtex lamelar claramente delineado. Dosagem de antibiótico foi otimizado para incluir a cobertura máxima no pós-operatório. Enquanto a infecção em torno do local do defeito pode ocorrer, administração continuada de antibióticos topicamente ao redor do pino sites e em água e dieta for bem-sucedida em minimizar a infecção pós-operatória.
Mais de imagens usando o sistema de imagens In Vivo (IVIS) ilustra a capacidade das células bioluminescentes para ser visualizado dentro o defeito após a implantação do fixador externo (Figura 6). A placa externa pode ser facilmente removida para a imagem latente e substituída após a conclusão. Células na cavidade medular luminesce após transfecção com codificação de mRNA complexado por Gaussia luciferase. O nível mais alto de luminescência é focado no local do defeito femoral e o sinal não está obstruído pelos pinos do dispositivo de fixação. Isso é promissor para estudos futuros, contando com bioluminescência ou fluorescência para medir mudanças biológicas como uma expressão do gene ou a proteína durante o processo de cicatrização.
Figura 1: Fabricação de fixador externo. A: esquema de CAD do fixador externo montado com dimensões anotados para fabricação adequada. Cada fixador é composto por duas placas de alumínio, mantidas juntos por dois parafusos. B: placas são cortadas de 1,4 "x 6" folhas de alumínio com ranhuras 'V' cortadas a folha de baixo. C: furos de parafuso são perfurados em placas (roscadas na placa com ranhuras 'V') e todas as arestas e cantos são lixados para arredondar e reduzir o peso. D: fixador externo montado é apertado com parafusos (4-40 x 0,25", 18-8 aço inoxidável botão tampão principal) uma vez que os pinos estão em vigor nas ranhuras da 'V' no interior das placas de alumínio. O pino esquerdo é sem threads e mais proximal no fêmur. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema de colocação de pinos, colocação de fixador e criação do defeito. A: O pino distal (k-fio de 1,0 mm de rosca) é colocado na região metafisária epicôndilo, usando o gabarito (retângulo azul) para orientar a inserção do pino adequada. O gabarito é colocado sobre a superfície femoral ântero-lateral. B: O pino proximal (1,0 mm não roscados fio de Kirschner) é colocado usando o gabarito depois de fazer uma pequena incisão no tendão glúteo. C: os pinos médios (k-fio de 1,0 mm de rosca) são inseridos usando o gabarito. D: O gabarito é removido e as 2 placas são anexadas aos pinos com os 2 parafusos para fixar as placas. As placas estão apertadas 1 cm acima do nível da pele para evitar a pressão sobre a pele. E: uma serra oscilatória sagital é usada para criar um defeito de 5 mm entre os dois pinos do meio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representante radiografias de alta resolução mostram o osso de cura com tratamento de rhBMP-2. Imagens para a esponja de colagénio de controlo negativo e os grupos de esponja encharcada de rhBMP-2 são mostradas em 0, 4 e 12 semanas no pós-operatório. O grupo de tratamento de rhBMP-2 apresenta significativa cicatrização após 4 semanas com insensível abrangendo o defeito. As extremidades do fêmur de controle negativo não se curam com ponte óssea e o defeito continua a ser um não-sindicalizados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Significativa formação de osso novo é vista com tratamento de rhBMP-2. Representante 4 x ampliada H & E imagens histológicas para a esponja de colagénio de controlo negativo e o rhBMP-2 embebido esponja grupos tanto na borda de corte do fêmur e dentro o defeito. Novo osso formado em torno da borda de fêmur de controle, mas significativas extensões de novo osso trabecular, bem como o projeto periosteal insensível do fêmur Tratado. Nenhum material ósseo é visto dentro o defeito do controle, enquanto a formação óssea significativa pode ser observada em todo o defeito de tratados de rhBMP-2. NB: novo osso fêmur f:, c: cartilagem, h: hemorragia, PC: periosteal insensível. Barra de escala: 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Infected fêmur apresenta hipertrofia e marcadores de células inflamatórias. H & E imagens histológicas de um fêmur não infectado, comparado com um fêmur infectado, em plena vista e na ampliação de 4x de locais in a box. O córtex femoral não infectado continua a ser organizado e delineados, com poucos sinais de inflamação. O fêmur infectado aumenta consideravelmente, como pode ser visto em plena vista, e o córtex é dividido por áreas de reabsorção e necrose (clusters de célula roxo indicados por setas pretas). F: fêmur. Barra de escala: 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Sinal de luciferase Gaussia detectado o defeito. Luminescência de células transfectadas com Gaussia luciferase que mRNA é fotografada com IVIS após a retirada da placa externa. Vermelho indica a maior intensidade de luminescência no local do defeito femoral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Pequenos animais modelos de lesões ortopédicas, como fraturas ósseas completa habilitar pesquisa que explora os mecanismos de osteogênese e avaliar o potencial terapêutico de biomateriais20. Este estudo apresenta um rato defeito segmentar modelo estabilizado por um fixador externo personalizado que uma equipe do laboratório e a engenharia biomédica pode prontamente se reproduzem para novos estudos de reparação de osso de osteossíntese de carga.
Estudos anteriores usando tamanho crítico defeitos em modelos do rato geralmente dependem de fixação interna placas21,22,23,24. Apesar de qualquer método de fixação é clinicamente aceitável, fixação externa tem as vantagens distintas de causar menos interrupções de tecidos moles e perda de sangue, diminuindo a área de superfície total implantada para minimizar as oportunidades para a colonização bacteriana, e permitindo ajuste pós-operatório e intervenções cirúrgicas encenado6. Modelos anteriores do animal fratura fixação externa utilizaram materiais diferentes de placa, pino de fixação e/ou osso corte métodos12,13,14. Porque o fixador externo neste protocolo foi feito na oficina do laboratório com alumínio de baixo custo e pode facilmente ser remodelado, as despesas foram minimizadas. Isto fornece um fixador externo econômico permite que os pesquisadores a realizar experimentos com vários grupos de animais sem ser limitado financeiramente. Em comparação com um modelo de fixação interna, acreditamos que este sistema é tecnicamente mais simples e mais reprodutíveis em um modelo animal pequeno. Em nossa experiência com estes modelos, fixação interna é significativamente mais exigente tecnicamente e pode exigir personalizadas usinadas de implantes. Para o conhecimento dos autores, este protocolo geral é único em seu uso de um jig personalizados combinado com um fixador externo metal adaptado projeto15, bem como seu uso de um osso oscilante viu para melhor representar o cenário clínico comum de descascamento do periósteo realizada para preparar fratura sites para fixação. Uma observação final sobre o uso de uma serra oscilatória neste modelo é que o calor gerado e o rompimento do periósteo que ocorre fornece um elemento final de controle na formação de um modelo de não-União. Nossa experiência tem sido que com outros métodos, nestes modelos animais, os investigadores correm o risco dos controles de cura.
Para garantir o sucesso cirúrgico, deve ter cuidado em vários passos críticos: quando a incisão e realizando a dissecação circunferencial para expor o fêmur do entorno muscular, evitar perturbar o isquiático nervo caudalmente, os vasos femorais medialmente, e o tendão do glúteo proximalmente. Tome cuidado para posicionar o paralelo de aparelhos de gabarito e irrigue contra o plano, face ântero-lateral do fêmur, para que todos os pinos são precisamente perpendiculares ao osso. Isto irá confirmar o alinhamento adequado do fixador externo e reduzir a probabilidade de quebra do pino. A ordem de colocação de pino encontrado para ser mais simples era distal em primeiro lugar, seguido por proximal e então os dois pinos do meio. Isto permitiu menos interrupções do tendão glúteo pelo pino proximal. Finalmente, é importante que cada pino é colocado bicortically, ambos os córtices a penetração para que isso não acontece para fora do osso ou mudança na cavidade medular.
Uma máquina de raio-x capaz de radiografia de alta resolução foi usada para monitorar o status de consolidação óssea como alterações qualitativas podem ser visualizadas facilmente e de forma não-invasiva ao longo do tempo. No entanto, posicionamento da perna consistente é crucial para exata interpretação radiográfica como diferenças no posicionamento podem ser enganosas. Os resultados deste estudo estão de acordo com trabalhos anteriores, demonstrando que um defeito femoral 5mm impede a consolidação óssea espontânea em ratos normais25. Portanto, qualquer cura ou seja observado com terapias adicionadas como o rhBMP-2 embebido esponja pode definitivamente ser atribuída para o respectivo tratamento (Figura 3).
Possíveis preocupações para esta técnica incluem ruptura de pin, afrouxamento e infecção. Problemas com quebra de pinos proximais em testes preliminares solicitado um interruptor de rosca para não roscados fio de Kirschner. Os pinos não roscados são mecanicamente mais fortes, mas também representam mais risco de desistir do córtex. Particularmente em defeitos ósseo vazio, fios de Kirschner podem quebrar ou deslocados-se cerca de 8 semanas devido a carga de pino cíclico prolongado e a falta de cura (semelhante ao ciclismo/dobra um clipe de papel). Um regime estrito de antibióticos foi utilizado para incluir uma injeção imediata de cefazolina, aplicação diária de pomada antibiótica no local da incisão, 7 dias da enrofloxacina adicionado à água potável e alimentos com medicamentos. Este protocolo de antibiótico, juntamente com as técnicas cirúrgicas descritas acima, minimizado infecção (Figura 5).
Uma das vantagens adicionais do uso de fixador externo em um modelo animal é fácil remoção para uma visão desobstruída do defeito e substituição depois de imagem. Isso permite que mais eficaz na vivo por imagens técnicas depender de fluorescência ou luminescência para avaliar alterações como a expressão do gene ou a proteína. Por exemplo, mostramos que as células na cavidade medular transfectadas com codificação de mRNA complexado por luciferase Gaussia podem ser visualizadas com IVIS. A Figura 6 ilustra que a capacidade de detecção de sinal de luminescência não está obstruída por esta abordagem de fixação externa, como pode ser com placas internas, parafusos, ou haste intramedular pregos21,22,23 , 24. este custo-eficaz e reprodutível protocolo cirúrgico permite a criação consistente e estabilização de um defeito femoral tamanho crítico que imita o manejo clínico inicial dessas fraturas complexas. O estabelecimento de um modelo animal de confiança é fundamental para qualquer tratamentos experimentais destinados ao eventual uso clínico. Nosso modelo tem demonstrado resultados previsíveis e mínimas alterações comportamentais ou desconforto em nossos animais. Este modelo pode ser utilizado com uma variedade de andaimes baseados em biomateriais em conjunto com as técnicas de imagem utilizadas neste trabalho para fins de testes translacionais futuras. É nossa esperança que em trabalhar com este modelo, os pesquisadores será capazes de conceber novas formas para tratar defeitos ósseos críticos em pacientes de trauma. Isto pode ajudar a evitar a morbidade e custo em tratamentos longos atualmente empregados e possivelmente diminuir o número de amputações.
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Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou benefícios. Não houve nenhum benefício recebido diretamente ou indiretamente pelos autores do presente artigo.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma concessão de equipamentos de NIH 1S10OD023676-01 com suporte adicional, fornecida através de departamentos de Ortopedia e reabilitação da Universidade de Wisconsin e da faculdade de medicina e saúde pública. Queremos reconhecer o UW Carbone Cancer Center suporte Grant P30 CA014520 e uso de seu pequeno Animal Imaging Facility, bem como NIH Grant de formação 5T35OD011078-08 para suporte de H. Martin. Agradecemos também Michael e Mary Sue Shannon pelo apoio da parceria regeneração músculo-esqueléticas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, Ł, Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R.
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children's Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), Berlin. 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- Living lmage Software. , Perkin Elmer. (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
