Summary
Nós apresentamos abordagens experimentais para estudar RNA-interactianos de double-stranded RNA ligação proteína quinase RNA-ativado (PKR) durante o ciclo de pilha mamífero usando células HeLa. Este método utiliza o formaldeído para complexos de crosslink RNA-PKR e imunoprecipitação para enriquecer RNAs ligados a PKR. Estes RNAs podem ser analisados ainda mais através de sequenciamento de alto rendimento ou qRT-PCR.
Abstract
Proteína quinase RNA-ativado (PKR) é um membro das proteínas de resposta imune inata e reconhece a estrutura secundária de double-stranded do RNA viral. Quando vinculado a viral double-stranded RNA (dsRNAs), o PKR sofre de dimerização e autofosforilação subsequente. PKR fosforilada (pPKR) torna-se ativo e induz a fosforilação de subunidade alfa do fator de iniciação eucariótico 2 (eIF2α) para suprimir a tradução global. Aumentando a evidência sugere que a PKR pode ser ativada em condições fisiológicas, tais como durante o ciclo celular ou sob diferentes condições de estresse, sem infecção. No entanto, nosso entendimento sobre os ativadores de RNA de PKR é limitado devido à falta de um método experimental padronizado para capturar e analisar dsRNAs PKR-interagindo. Aqui, apresentamos um experimental protocolo especificamente enriquecer e analisar PKR limite RNAs durante o ciclo celular utilizando células HeLa. Nós utilizamos a atividade de reticulação eficiente de formaldeído para corrigir complexos PKR-RNA e isolá-los através da imunoprecipitação. Então, PKR co-immunoprecipitated RNAs podem ser processados para gerar uma biblioteca de sequenciamento de alto rendimento ainda mais. Uma classe importante de PKR-interagindo celular dsRNAs é RNAs mitocondriais (mtRNAs), que podem existir como intermoleculares dsRNAs através da interacção complementar entre os RNAs de luz-fio e pesados-strand. Para estudar o strandedness destes mtRNAs frente e verso, apresentamos também um protocolo para a vertente específica qRT-PCR. Nosso protocolo é otimizado para a análise de RNAs PKR-limite, mas ele pode ser facilmente modificado para estudar dsRNAs celular ou RNA-interactianos de outras proteínas com ligação dsRNA.
Introduction
Proteína quinase RNA-ativado (PKR), também conhecido como eucarióticas iniciação fator alfa-2 da quinase 2 (EIF2AK2), é uma bem caracterizadas proteína quinase que transmite informações fornecidas por RNAs. Pertence a alfa de subunidade de iniciação 2 Tradução eucariota (eIF2α) família quinase e fosforila eIF2α em serina 51 em resposta à infecção para suprimir a tradução global1. Neste contexto, o PKR é ativado por RNAs virais double-stranded (dsRNAs), que fornecem uma plataforma para PKR dimerização e autofosforilação2. Além de eIF2α, PKR pode também phosphorylate p53, substrato do receptor de insulina 1, inibidor κB e c-Jun N-terminal kinase (JNK) para regular a atividade de numerosos sinal transdução vias3,4,5, 6.
PKR foi originalmente identificada como uma quinase que fosforilado eIF2α durante a infecção de poliovírus através do reconhecimento dsRNAs7,8 dos poliovírus. PKR é encontrado cada vez mais a desempenhar papéis multifacetadas além da resposta imune, e sua ativação aberrante ou avaria está implícito em várias doenças humanas. Ativado/Phosphorylated PKR (pPKR) é frequentemente observada durante a apoptose e é uma característica comum dos pacientes do doenças degenerativas, particularmente doenças neurodegenerativas, como a doença de Huntington, Parkinson e a doença de Alzheimer9 ,10,11,12,13. Além disso, o PKR é ativado sob várias condições de estresse, tais como estresse metabólico e calor choque14,15,16,17. Por outro lado, a inibição da PKR resulta na proliferação celular aumentada e transformação maligna mesmo18,19. PKR função também é importante na função cerebral normal e durante o ciclo celular, como o nível de pPKR é elevada durante a fase de M20,21,22. Neste contexto, pPKR suprime tradução global e fornece dicas para sistemas de sinalização mitóticas chaves que são necessárias para a adequada divisão celular20. Além disso, a ativação prolongada de PKR resultou na fase G2/M detenção do ciclo celular em ovário de hamster chinês células23. Consequentemente, a fosforilação de PKR é regulada pelo ciclo de feedback negativo para garantir rápida desativação durante a transição de M/G121.
Apesar da função de ampla gama de PKR, nossa compreensão da ativação PKR é limitado devido à falta de uma abordagem experimental padronizada de alta produtividade para capturar e identificar dsRNAs que pode ativar PKR. Estudos anteriores mostraram que a PKR pode interagir com dsRNAs formado por dois invertido Alu repetições (IRAlus)20,24, mas a possibilidade da existência de dsRNAs celular adicional que pode ativar PKR durante o ciclo celular ou sob condições de estresse em células humanas era inexplorado. A abordagem convencional na identificação de RNA-interactianos de uma proteína de ligação de RNA (RBP) usa a luz UV para crosslink RNA-RBP complexos25,26,27. Um estudo recente aplicado esta abordagem de reticulação UV em um sistema de rato e identificou que pequenos RNAs nucleolares podem regular a ativação PKR durante o estresse metabólico16. Utilizando a reticulação de alta eficiência de formaldeído, apresentamos um método alternativo para identificar RNAs PKR-interagindo durante o ciclo celular em células de HeLa28. Uma abordagem similar foi aplicada para estudar outros dsRBPs como Staufen e Drosha29,30,31. Nós achamos que a PKR pode interagir com vários tipos de RNA não-codificante tais como curto interspersed nuclear elemento (SINE), longo intercaladas elemento nuclear (linha), elemento de retrovírus endógenos (ERV) e alfa-satélite nem RNAs. Além disso, mostramos que a PKR pode interagir com RNAs mitocondriais (mtRNAs), que forma intermoleculares dsRNAs através da interacção complementar entre a luz e pesados-strand strand RNAs28. Uma recente publicação mais suporte para nossos dados que algumas mtRNAs existe em um formulário frente e verso e pode ativar sensores dsRNA como melanoma diferenciação-proteína associada 5 para induzir os interferões32. Mais importante, a expressão e Localização subcellular das mtRNAs são modulados durante o ciclo celular e por vários factores de stress, que pode ser importante na sua capacidade de regular a ativação de PKR28.
Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para uma reticulação de formaldeído recentemente desenvolvidos e imunoprecipitação (fCLIP) método para capturar e analisar RNAs PKR-interagindo durante o ciclo celular. Demonstramos o método para preparar amostras de detenção do ciclo celular utilizando timidina e nocodazole. Em seguida apresentamos o processo de fCLIP para isolar RNAs ligados a PKR e um método para preparar a biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para identificar estes RNAs. Além disso, podemos delinear procedimentos detalhados para analisar ligados a PKR RNAs usando qRT-PCR. Especificamente, apresentamos um procedimento de transcrição reversa vertente específica para analisar o strandedness de mtRNAs. O protocolo descrito é otimizado para as células HeLa e PKR, mas etapas-chave tais como a preparação da amostra de ciclo celular, fCLIP e análise da vertente específica qRT-PCR podem ser facilmente modificadas para estudar celular dsRNAs ou identificar interactianos de RNA de outros dsRBPs.
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Protocol
1. solução e célula preparação
- Preparação da solução
- Para o meio de cultura celular, prepare-se meio para cultura de células HeLa, adicionando 50 mL de soro fetal bovino (FBS) para 500 mL de meio modificado águia de Dulbecco (DMEM).
Nota: Os antibióticos podem ser adicionados ao meio de cultura celular, mas não usamos antibióticos. - Para o 0,1% paraformaldeído, dissolver paraformaldeído 4% (p/v) em 1 x Phosphate-Buffered salino (PBS) com aquecimento em uma chapa quente e diluir para fazer 30 mL de 0,1% (v/v) paraformaldeído adicionando 1X PBS.
Atenção: Executar todas as etapas em uma coifa e tenha cuidado para não ferver a solução de paraformaldeído. Proteger a solução 0,1% de luz e armazenar a 4 ° C. Utilize a solução dentro de um mês.
Nota: O pH da solução de paraformaldeído final de 0,1% (v/v) deve ser em torno de 7. - Preparar o tampão de Lise fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 10 mM de EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) sulfato dodecyl de sódio (SDS) e Deoxycholate do sódio de 0,1% (p/v). Adicione água destilada tripla (TDW) para 40 mL. Loja a 4 ° C.
- Preparar fCLIP tampão de lavagem: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM de EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) SDS e 0,1% (p/v) Deoxycholate do sódio. Adicione 40 mL TDW. Loja a 4 ° C.
- Preparar 4 x buffer de PK: 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 40 mM de EDTA e SDS de 4% (v/v). Adicione 40 mL TDW. Armazenar em temperatura ambiente.
- Preparar o tampão de eluição de fCLIP: 20 mL de 4 x 8,5 mL de TDW, 21 g de ureia e buffer de PK. Prepare-se fresco.
- Preparar o tampão de eluição do RNA: 0,3 M de NaOAc e SDS 2% (p/v). Armazenar em temperatura ambiente.
- Prepare 2 x tintura de carregamento do RNA: 0.025% (p/v) de azul de bromofenol, xileno cianol de 0.025% (p/v), 5 mM EDTA, SDS de 0,05% (p/v) e formamida 95% (v/v). Loja a-20 ° C.
- Preparar 1 buffer de x TBE: 0.089 M Tris-borato e 0,002 M EDTA. Prepare 500 mL de tampão TBE.
- Para o meio de cultura celular, prepare-se meio para cultura de células HeLa, adicionando 50 mL de soro fetal bovino (FBS) para 500 mL de meio modificado águia de Dulbecco (DMEM).
- Preparação de células de fase-preso S ou M
- Semente de 750.000 ~ ou ~ 1.000.000 HeLa células para amostras preso a fase S ou M, respectivamente. Desenvolvem-se células em 37 ° C e 5% CO2 por 24 h.
- Tratar as células com timidina 2mm e incubar por 18 h a 37 ° C.
- Lave as células duas vezes com PBS. Adicionar mídia fresca e incubar durante 9 h a 37 ° C.
- Para S células fase-preso, tratar as células com timidina 2mm. Para células de fase-preso M, trate as células com 100 ng/mL nocodazole. Incube por 15 h a 37 ° C e a colheita de células.
Nota: A homogeneidade das amostras de ciclo celular pode ser verificada usando FACS.
2. formaldeído cross-linking e imunoprecipitação
- Colheita da pilha
- Para uma amostra da fase S, colete as células com um raspador de célula e transferência em um tubo cônico de 15 mL. Para uma amostra da fase M, bata com o lado do prato cultura celular para destacar células fase-preso M e transferi-los para um tubo cônico de 15 mL.
Nota: Para aumentar a homogeneidade das células M fase-preso, não use um raspador de célula. - Centrifugar as células a 380 x g em temperatura ambiente por 3 min. Retire o sobrenadante e ressuspender com 1 mL de frio PBS e transferir para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Centrifugar as células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. remover o sobrenadante completamente.
- Para uma amostra da fase S, colete as células com um raspador de célula e transferência em um tubo cônico de 15 mL. Para uma amostra da fase M, bata com o lado do prato cultura celular para destacar células fase-preso M e transferi-los para um tubo cônico de 15 mL.
- Reticulação de formaldeído
- Adicione 750 μL de paraformaldeído 0,1% por 10 min à temperatura ambiente para consertar as células.
- Adicionar 250 μL de glicina 1 M e incubar um adicional 10 min à temperatura ambiente para saciar a reação. Centrifugar as células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. remover o sobrenadante completamente.
- Re-suspenda com 1 mL de PBS. Centrifugar as células em 10.000 x g a 4 ° C por 30 s e remover o sobrenadante.
- Re-suspenda com 400 μL de tampão de Lise fCLIP suplementado com inibidor de protease de 0,2% (v/v) e 2% (v/v) inibidor de RNase. Incubar no gelo por 10 min e proceda à sonicação usando um ultrasonicator.
- Adicione 11 μL de 5 M NaCl, ajustar a concentração de NaCl ~ 150 mm. Vórtice brevemente e centrifugar 21.130 x g a 4 ° C por 15 min. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora pre-refrigerados 1,5 mL.
Nota: Manter 40 μL do sobrenadante em um novo tubo de centrifugação, como o exemplo de entrada. Armazenar o exemplo de entrada a 4 ° C.
- Imunoprecipitação
- Adicione 20 μL de grânulos de proteína A um tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
- Lave os grânulos com 400 μL de tampão de Lise fCLIP. Centrifugue os grânulos a 1.000 x g a 4 ° C, durante 1 min. Retire o sobrenadante e adicionar 400 μL de tampão de Lise fCLIP cuidadosamente. Delicadamente, re-suspender os grânulos invertendo-se 3 ~ 4 vezes.
- Repeti a etapa de lavagem três vezes. Após a lavagem final, remova o sobrenadante completamente.
- Re-suspenda as contas em 300 μL de tampão de Lise fCLIP. Adicione 8.3 μL de 5 M NaCl, ajustar a concentração de NaCl ~ 150 mm. Adicionar 10 μL do anticorpo PKR e incubar durante 3 h em rotacao a 4 ° C.
- Centrifugue os grânulos a 1.000 x g a 4 ° C, durante 1 min. Retire o sobrenadante e adicionar 400 μL de tampão de lavagem fCLIP. Delicadamente, re-suspender os grânulos invertendo-se 3 ~ 4 vezes.
- Repita a etapa de lavagem duas vezes. Após a lavagem final, remova o sobrenadante completamente.
Nota: Nunca use um misturador do vortex. Inverta o tubo delicadamente com as mãos. - Adicionar 300 μL de lisado e incubar durante 3 h a 4 ° C em rotacao.
Nota: O tempo de incubação pode resultar em vinculação do aumento do fundo. - Centrifugue os grânulos a 1.000 x g a 4 ° C, durante 1 min. Retire o sobrenadante e adicionar 400 μL de tampão de lavagem fCLIP. Delicadamente, re-suspender os grânulos invertendo-se 3 ~ 4 vezes.
- Repeti a etapa de lavagem três vezes. Após a lavagem final, remova o sobrenadante completamente.
- Adicione 300 μL de tampão de eluição de fCLIP. Incube em uma thermomixer por 3 h a 25 ° C para eluir PKR de grânulos.
Nota: Prepare o fresco de tampão de eluição fCLIP. - Centrifugar a 1.000 x g , à temperatura ambiente e transferir o sobrenadante para um tubo siliconizado limpo.
Nota: Um tubo de microcentrifugadora também é okey, mas tubo siliconizado é a preferida para evitar a evaporação durante a etapa de reticulação (etapa 2.3.12). - Adicionar 300 μL de proteinase K (20 mg/mL) e incubar durante uma noite a 65 ° C.
Nota: Utilize um thermomixer com tampa aquecida para evitar a evaporação.
- Extração de RNA
- Adicione 580 μL de ácido fenol clorofórmio e vórtice por 30 s. Incubar a 37 ° C por 1h.
- Vórtex durante 30 segundos e centrifugar a 12.000 x g em temperatura ambiente por 10 min.
- Transferi a camada superior para um tubo de microcentrifugadora limpa 1,5 mL. Adicione o volume de 1/10 de 3M NaOAc, 0,5 µ l de coprecipitant (por exemplo, Glycoblue) e um volume igual de isopropanol. Incubar durante uma noite a-20 ° C.
- Precipitar pelotas por centrifugação a velocidade máxima a 4 ° C, durante 1 h.
Nota: Se não foram observados aglomerados de RNA/DNA, adicione um adicional 0,5 μL de coprecipitant e centrífuga para um adicional 1 h. continuar esta etapa até pelotas de RNA/DNA são observadas. - Remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de álcool etílico de 75%. Centrifugar a 12.000 x g a 4 ° C por 5 min. repetir a etapa de lavagem mais uma vez. Remover o sobrenadante completamente e seque a pelota à temperatura ambiente.
- Adicione 42 μL de TDW, 5 μL de DNase eu de buffer, 1 μL de inibidor de RNase e 2 μL de DNase I. Incubar a 37 ° C por 1h.
- Adicione 150 μL de TDW e 200 µ l de ácido fenol clorofórmio. Vórtice de 30 s. centrifugar a 12.000 x g em temperatura ambiente por 10 min.
- Transferi a camada superior para um tubo de microcentrifugadora limpa 1,5 mL. Adicione 20 μL de 3 M NaOAc, 0,5 µ l de coprecipitant e 1 mL de álcool etílico de 100%. Incubar durante uma noite a-80 ° C.
- Precipitar pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5.
- Ressuspender em quantidade adequada de TDW.
3. sequenciamento biblioteca preparação
- remoção de rRNA
- Re-suspenda as pelotas de RNA da etapa 2.4.10 com 28 μL de TDW.
Nota: A quantidade máxima de RNA total deve ser inferior a 5 μg. - Siga os procedimentos fornecidos pelo guia de referência do kit rRNA remoção para remover o rRNA.
- Limpar o rRNA empobrecido RNAs adicionando 160 μL de grânulos magnéticos.
- Misture pipetando ~ 15 vezes e incubar a temperatura ambiente por 15 min.
- Prenda o tubo em uma barra magnética e remover o sobrenadante.
- Adicionar 300 μL de álcool etílico a 80%, enquanto as contas ainda estão anexadas na Barra magnética e incubam por 30 s.
- Substitua o álcool etílico com uma solução de 300 μL a fresco. Ar seco os grânulos na Barra magnética para 12 min à temperatura ambiente.
- Re-suspenda as contas em 12 μL de TDW e misture pipetando 15 vezes.
- Anexar os grânulos na Barra magnética e mover o sobrenadante para um tubo limpo do PCR.
- Empobrecem as fragmentada RNAs ribossomal (rRNAs) seguindo os procedimentos fornecidos pelo rRNA Kit de depleção.
- Limpe os RNAs adicionando 110 μL de grânulos magnéticos e repetindo as etapas 3.1.3.1 para 3.1.3.6.
- Re-suspenda as pelotas de RNA da etapa 2.4.10 com 28 μL de TDW.
- Ligadura de rotulagem e adaptador de RNA
- Em RNAs empobrecido rRNA, adicione 2 μL de tampão, x CIAP 10, 1 μL de inibidor de RNase e 2 μL de fosfatase alcalina da Antártica. Incube a 37 ° C por 1h e depois a 65 ° C por 5 min inactivar a fosfatase.
- Adicione 3 μL de tampão, x PNK 10, 1,5 μL de inibidor de RNase, 1,5 μL de T4 PNK enzima 0,8 μL de r-ATP e 1,7 μL de TDW. Incube a 37 ° C, durante 50 min.
- Adicionar 1,5 μL de 10mm ATP e incubar a 37 ° C por mais 40 min.
- Pare a reação adicionando 170 μL de tampão de eluição do RNA.
- Adicione 200 μL de clorofórmio fenol-ácido e vórtice por 30 s. centrifugar a 12.000 x g em temperatura ambiente por 10 min.
- Transferi a camada superior para um tubo de microcentrifugadora limpa 1,5 mL. Adicione 20 μL de 3 M NaOAc, 0,5 µ l de coprecipitant e 1 mL de álcool etílico de 100%. Incubar durante uma noite a-80 ° C.
- Precipitar o RNA pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5. Ressuspender em 4,5 μL de TDW e adicionar 9 μL de 2 x tintura do carregamento de RNA.
- Aquece a amostra a 95 ° C por 5 min e carga em um gel de ureia-página 10%.
- Funcione o gel a 370 V por 40 min.
Nota: Pré-funcione o gel a 370 V para 90 min antes de carregar a amostra. - Corte o gel na região de nucleotídeo ~ 100-500 e quebrar o gel.
- Adicione 700 μL de 0,3 M NaCl e incubar durante uma noite a 4 ° C em rotacao.
- Transferi a solução para uma coluna e centrifugar a velocidade máxima à temperatura ambiente por 5 min.
- Transferi o eluato num tubo microcentrifuga limpa 1,5 mL. Adicione o volume de 1/10 de 3M NaOAc 0,5 μL de coprecipitant e um volume igual de isopropanol. Incubar durante uma noite a-20 ° C.
- Ligadura de adaptador 3'
- Precipitar o RNA pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5.
- Re-suspender as pelotas de RNA em 6,5 μL de TDW e adicionar 1 μL de 10 μM 3' adaptador.
- Transferir a solução para um tubo PCR e incubar a 70 ° C por 2 min.
- Adicione 1 μL de tampão, ligadura 10 x 0,5 μL de inibidor de RNase e 1 μL de RNA T4 ligase do 2. Incube a 28 ° C, durante 1 h, 6 h 25 ° C e 22 ° C, durante 6 h.
- Adicione 12 μL de 2 x tintura do carregamento de RNA e calor a 95 ° C por 5 min.
- Gel de purificar a 3' adaptador ligado RNAs, conforme descrito em 3.2.9 para 3.2.13.
- Ligadura de adaptador 5'
- Precipitar o RNA pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5.
- Re-suspender as pelotas de RNA em 4.2 μL de TDW e adicionar 1 μL de 5 μM 5' adaptador.
- Transferir a solução para um tubo PCR e incubar a 70 ° C por 2 min.
- Adicione 0,8 μL de tampão, ligase 10 x, 0,4 μL de inibidor de RNase, 0,8 μL de 10mm ATP, 0,8 μL de RNA T4 ligase do 1. Incube a 28 ° C, durante 1 h, 6 h 25 ° C e 22 ° C, durante 6 h.
- A transcrição reversa e amplificação por PCR
- No 5' adaptador RNAs ligados, adicionar 1 μL de primer de transcrição reversa 4 μM. Incubar a 70 ° C por 2 min e arrefecer imediatamente a 4 ° C.
- Adicione 4 μL de tampão, FS x 5, 4 μL de 2.5 mM dNTP, 1 μL de 0,1 M DTT 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa. Incube a 50 ° C por 1 h e 70 ° C durante 15 min.
- Preparar a amplificação por PCR
- Misturar 1 μL do produto da RT, 1 μL de primer RPI 25 μM, 1 μL de primer de RP1 25 μM, 10 μL de 5x buffer de HF, 4 μL de 2.5 mM dNTP, 32,5 μL de TDW e 0,5 μL de polymerase de alta-fidelidade.
- Executar programa PCR para 11 ~ 13 ciclos.
Nota: O programa para o PCR é: 98 ° C por 30 s para um começo quente, 98 ° C, durante 10 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 45 s para amplificação e 72 ° C por 5 min. A etapa de amplificação é repetida em ciclos de 11-13.
- Limpe os produtos PCR usando 40 μL dos grânulos magnéticos e passos seguintes 3.1.3.1 para 3.1.3.6 mas usando 10 μL de TDW para Eluir o DNA.
- Adicione 2 μL de tintura de carregamento 10 x DNA. Carregar a amostra em um gel do acrilamido 6% e executar a 200 V por 30 min.
- Mancha com Sybr gold (0,01% (v/v) em 1 x TBE buffer) durante 5 min à temperatura ambiente.
- A mancha em 1 x TBE buffer durante 5 min à temperatura ambiente.
- Corte o gel na região de nucleotídeo ~ 200 – 700 e quebrar o gel.
- Adicione 700 μL de 0,3 M NaCl e incubar durante uma noite em temperatura ambiente para Eluir o DNA.
- Coloque tudo em uma coluna e centrifugar a velocidade máxima à temperatura ambiente por 5 min.
- Transferi o eluato num tubo microcentrifuga limpa 1,5 mL. Adicione o volume de 1/10 de 3M NaOAc 0,5 μL de coprecipitant e um volume igual de isopropanol. Incubar durante uma noite a-20 ° C.
- Precipitar o DNA pelotas e lavar com álcool etílico de 75%, conforme descrito nas etapas 2.4.4 para 2.4.5. Ressuspender em 20 μL de TDW.
- Analise a amostra com um sequenciador.
4. análise da PKR-interagindo RNAs usando qRT-PCR
- Método 1: A transcrição reversa do hexâmero aleatória
- Re-suspender pelotas RNA da etapa 2.4.10 com 8,5 μL de TDW e transferir a solução para um tubo PCR.
- Adicione 0,5 μL de hexâmeros aleatória de 100 μM e 4 μL de mistura de 2.5 mM dNTP.
- Calor a solução a 65 ° C por 5 min e imediatamente incubar no gelo pelo menos 1 min.
- Fazer com que a reação mix: 4 μL de tampão de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa (200 U/μL). Adicione a mistura de reação para a solução de RNA.
- Incubar a mistura a 23 ° C por 10 min, 50 ° C por 10 min e 80 ° C por 10 min.
- Analise o cDNA usando um sistema PCR em tempo real.
Nota: O programa para o PCR em tempo real é: 95 ° C por 3 min para arranque a quente, 95 ° C por 5 s e 60 ° C durante 10 s para amplificação e 95 ° C por 30 s, 65 ° C por 30 s e 95 ° C por 30 s para derreter. A etapa de amplificação é repetida para 40 ciclos.
- Método 2: Transcrição reversa Strand-específicos
- Preparar uma mistura de mestre de primers inversa: mistura de quantidades iguais de primers específicos de transcrição reversa de gene que contém a sequência de promotor CMV seguidas de ~ 20 nucleotídeos de sequências de genes específicos.
Nota: A concentração combinada de todos os genes específicos RT primeiras demão é de 4 μM. - Re-suspender pelotas RNA da etapa 2.4.10 com 8,5 μL de TDW e transferir a solução para um tubo PCR.
- Adicione 0,5 μL da mistura mestre da 4 μM de primers de transcrição reversa e 4 μL de mistura de 2.5 mM dNTP.
- Calor a solução a 65 ° C por 5 min e imediatamente incubar no gelo pelo menos 1 min.
- Prepare a solução de reação misturando 4 μL de tampão de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inibidor de RNase e 1 μL de transcriptase reversa (200 U/μL). Adicione a solução de reação à mistura do RNA-primer.
- Incube a solução a 50 ° C por 10 min e 80 ° C por 10 min.
- Analise o cDNA usando o sistema PCR em tempo real.
Nota: O programa para o PCR em tempo real é o mesmo que aquele descrito no método 1.
- Preparar uma mistura de mestre de primers inversa: mistura de quantidades iguais de primers específicos de transcrição reversa de gene que contém a sequência de promotor CMV seguidas de ~ 20 nucleotídeos de sequências de genes específicos.
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Representative Results
Um esquema para o processo de prender HeLa células em fase S ou M do ciclo celular é mostrado na Figura 1. Para uma amostra da fase-preso M, podemos Visualizar claramente redondo em forma de células sob o microscópio (Figura 2A). Para examinar a eficácia da detenção do ciclo celular, o conteúdo nuclear da célula pode ser analisado usando FACS (Figura 2B). A Figura 3 mostra dados representativos para teste de eficiência de imunoprecipitação, onde o anticorpo D7F7 mostra uma capacidade superior de immunoprecipitate PKR. Esta diferença na eficiência da imunoprecipitação pode foram refletida na discrepância na distribuição classe das bibliotecas do elevado-throughput sequenciamento preparado usando dois anticorpos diferentes PKR (Figura 4). A especificidade do anticorpo D7F7 é confirmada usando análise ocidental de toda mancha de immunoprecipitate o PKR (Figura 5A) e o total lisado celular (Figura 5B). A Figura 6 mostra o sinal de radioisótopo antes e após a remoção dos rRNAs durante a preparação da biblioteca de sequenciamento de alto rendimento. A Figura 7 mostra o enriquecimento da mtRNAs em RNAs co-immunoprecipitated com PKR, mas não em RNAs co-immunoprecipitated com coelho IgG ou DiGeorge síndrome cromossômica região 8 (DGCR8). A Figura 8 mostra a vertente representativa específicas análise de qRT-PCR de PKR-limite mtRNAs em S ou M-fase preso amostras.
Figura 1: esquemático para as amostras de detenção do ciclo celular preparação. (A, B) Esquemas da preparação de S (A) ou M (B) fase-preso as células HeLa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: análise de ciclo celular preso amostras. (A) fase imagens de contraste de amostras de fase-preso S ou M. As barras indicam 250 μm. (B), FACS análise mostrando o conteúdo nuclear das amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: teste de eficiência da imunoprecipitação para anticorpos PKR. Para enriquecimento bem sucedido de RNAs PKR-limite, um anticorpo com uma eficiência de imunoprecipitação definitivo como o anticorpo D7F7 deve ser usado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: distribuição de classe de RNA das bibliotecas de sequenciamento preparado usando anticorpos diferentes PKR. Usar anticorpos diferentes PKR para fCLIP resultou em uma distribuição de classe diferentes de leituras de sequenciamento mapeada. A discrepância é provavelmente devido as diferenças na eficiência da imunoprecipitação. Esta figura foi modificada de Kim et al.28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: a especificidade do anticorpo PKR D7F7. (A, B) A análise de toda mancha ocidental de PKR immunoprecipitated (A) ou total HeLa lisado (B) mostrou que apenas uma banda forte correspondente ao tamanho da PKR, indicando que o anticorpo D7F7 é altamente específico em reconhecer PKR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: sinal de radioisótopos para PKR RNAs de co-immunoprecipitated. (A) PKR co-immunoprecipitated RNAs poderiam ser detectadas através da marcação de suas extremidades 5' com r-ATP. (B) diminuição do sinal de radioistope foi observada após a remoção bem sucedida do rRNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: validação de PKR-mtRNA interações. Log2 dobra enriquecimento de mtRNAs em RNAs co-immunoprecipitated com anticorpos indicados. Apenas a amostra de RNA de co-immunoprecipitated PKR mostrou forte enriquecimento de mtRNAs. Anticorpos IgG de coelho e DGCR8 foram usados como controles negativos. Esta figura foi modificada de Kim et al.28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: análise de qRT-PCR Strand-específico de PKR-limite mtRNAs. (A, B) Strand-específicos transcrição reversa foi usada para analisar o strandedness de mtRNAs que foram co-immunoprecipitated com PKR para S (A) ou M (B) células de fase foi preso. Esta figura foi modificada de Kim et al.28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O processo para preparar amostras de fase-preso S ou M é ilustrado na Figura 1. Para prender as células na fase S, usamos um método de bloqueio duplo de timidina onde tratamos as células com timidina duas vezes com um lançamento de 9h entre elas para assegurar a prisão de alta eficiência (figura 1A). Para a detenção de fase M, tratamos as células uma vez com timidina seguido por um lançamento de 9 h e então aplicado nocodazole ao bloco de células em prometafase (figura 1B). Um passo fundamental na preparação da amostra de ciclo celular é a etapa de lançamento após o primeiro bloco de timidina. Para remover completamente a timidina, é fundamental lavar as células pelo menos duas vezes com PBS fresco. Lavagem impróprio e timidina residual podem resultar em aumento da heterogeneidade e viabilidade celular diminuída. O sucesso da detenção de fase M pode ser confirmado visualmente baseado no aumento do número de células redondas (Figura 2A). No entanto, a amostra de fase M ainda contém muitas células de interfase com base na sua morfologia. Para coletar somente a fase M preso células, aplicamos força física para desanexar células em fase M da superfície. O conteúdo nuclear das células colhidos foi analisado usando FACS, que mostrou um grande pico entre 2n e 4n para a fase S e um pico afiado em 4n M fase-preso no exemplo (Figura 2B). O protocolo apresentado é otimizado para as células HeLa, que têm um tempo de duplicação de cerca de 24 h. A ideia de bloco duplo de timidina e timidina-nocodazole pode ser aplicada a outras linhas de células, mas as durações de tratamento e lançamento de droga exata precisam ser otimizado baseado no tempo de duplicação das células alvo.
Para identificar os RNAs PKR-interagindo, nos complexos de quitosana PKR-RNA com formaldeído e enriquecido-los através da imunoprecipitação. Um fator chave que determina a precisão da análise subsequente é a eficiência da imunoprecipitação. Nós testamos inúmeros anticorpos que se destinam a diferentes epitopos da proteína PKR para determinar o anticorpo para a preparação de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento. Como mostrado na Figura 3, descobrimos que o anticorpo D7F7 que reconhece a região de vinculador entre os domínios de ligação do dsRNA e o domínio catalítico mostrou superior habilidade na captura de PKR. O outro anticorpo mostrado na Figura 3 (Milli) reconhece a região N-terminal, mas mostra uma habilidade pobre em immunoprecipitating PKR. Consequentemente, a biblioteca de arranjar em sequência do elevado-throughput preparada usando o anticorpo Milli continha muitas leituras de sequenciamento de fundo que estão dispersas por todo o genoma, particularmente em intrões, sem acumulações distintas em regiões específicas28 (Figura 4). Acreditamos que as discrepâncias nas duas bibliotecas sequenciamento são principalmente devido às diferenças nas habilidades dos anticorpos na captura de PKR durante a etapa de imunoprecipitação. Ainda mais, nós examinamos a especificidade do anticorpo D7F7 PKR através de análises ocidentais de toda mancha de immunoprecipitate (Figura 5A) e total HeLa lysates (Figura 5B). Em ambos os borrões, observamos apenas uma banda forte que corresponde a PKR. Isso indica que o anticorpo D7F7 é altamente específico e que os dados de sequenciamento obtidos utilizando o anticorpo D7F7 provavelmente refletem verdadeiros interactianos de RNA de PKR.
Um passo crítico durante a preparação de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento é a remoção de rRNAs. Desde que nós complexos de RNA-RBP quitosana com formaldeído, usamos um ultrasonicator para lise completa das células. Esse processo resultou na fragmentação de rRNAs, que reduziu significativamente a eficiência de remoção de rRNA usando o rRNA Kit remoção. Para resolver este problema, primeiro usamos o rRNA remoção Kit seguido o rRNA depleção Kit (veja a Tabela de materiais), que quase completamente removido rRNAs e menos de 1% de leituras o sequenciamento total foram mapeados para rRNAs. Usamos estes dois kits sequencialmente porque o rRNA depleção Kit tem uma capacidade máxima de apenas 1 μg enquanto o rRNA remoção Kit tem uma capacidade máxima de 5 μg. Nós experimentamos isso usando mais do que a quantidade recomendada do RNA total resulta em uma quantidade significativa de sequenciamento leituras mapeado para rRNAs. A remoção bem sucedida do rRNA pode ser confirmada depois de rotular os RNAs com r-ATP através da reação de PNK. Enquanto o rRNA RNAs empobrecidos mostraram uma banda distinta em 150 nt, a amostra antes de remoção de rRNA mostra forte sinal em toda a região correspondente a 50 ~ 300 nt (Figura 6).
Uma limitação de reticulação de formaldeído é a diminuição da imunoprecipitação eficiência. Outras aplicações de reticulação de formaldeído como imunocitoquímica, normalmente, usar solução de paraformaldeído 4% para fixação. No entanto, tal condição fixação forte não pode ser aplicada para o experimento de fCLIP porque ele diminui significativamente a eficiência de imunoprecipitação, que resulta em um plano mais elevado. Além disso, complexos de proteína-proteína de ligações cruzadas de fixação de formol além de complexos de RNA-proteína. Portanto, um precisa prestar atenção na interpretação dos dados fCLIP.
Conforme relatado anteriormente, mtRNAs forma dsRNAs intermoleculares que são reconhecidos por PKR28. Nós primeiro validado nossos dados de sequenciamento, examinando PKR-mtRNA interações por qRT-PCR. Usamos o IgG de coelho e anticorpos DGCR8 como controles negativos, que não mostrou qualquer enriquecimento de mtRNAs (Figura 7). De nota, o DGCR8 foi usado como uma proteína nuclear dsRNA que é fisicamente separadoda do mtRNAs. Ao mesmo tempo, o PKR co-immunoprecipitated RNAs mostraram forte enriquecimento de mtRNAs (Figura 7).
Para analisar mais interações PKR-mtRNA, realizamos a transcrição reversa de vertente específica para distinguir o mtRNAs pesado-vertente de mtRNAs o fio de luz (Figura 8). Nós projetamos a transcrição reversa primers que tem uma sequência de promotor CMV seguiram por uma sequência do gene-específico e servirão uma sequência do promotor CMV o primer esquerdo e primeiras demão certa gene-específico para a análise de qPCR. Nós também testamos o promotor SP6 e sequências da primeira demão do pGEX sequenciamento ao invés da sequência do promotor CMV. Achamos que ao mesmo tempo do pGEX e promotor CMV sequências da primeira demão de sequenciamento mostrou bom resultado, usando a sequência de promotor SP6 fez não. A diferença é devido ao baixo teor de GC da sequência de promotor SP6 (~ 33%) comparadas com as do promotor CMV (~ 67%) e o primer de sequenciamento do pGEX (~ 65%) sequências. O esquema proposto por transcrição reversa vertente específica facilmente pode ser aplicado a outros dsRNAs intermoleculares, mas ao projetar os primers de transcrição reversa, o conteúdo GC precisa ser levado em consideração.
Em geral, temos demonstrado a preparação de amostras de ciclo celular preso e o enriquecimento de RNAs PKR-interagindo através de reticulação de formaldeído e imunoprecipitação. Usando um anticorpo D7F7 altamente eficiente, temos com sucesso isolado RNAs ligados a PKR e identificados esses RNAs gerando e analisando uma biblioteca de sequenciamento de alto rendimento. Além disso, para analisar o strandedness de mtRNAs limite a PKR, apresentamos uma abordagem de vertente específica de transcrição reversa. Esperamos que o protocolo apresentado pode ser facilmente otimizado para estudar RNA interactianos de outras dsRBPs e strandedness de dsRNAs intermoleculares que são formados através de uma interacção complementar entre sentido e antisentidas transcrições.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo governo coreano, Ministério da ciência e TIC (NRF-2016R1C1B2009886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
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