Summary
Nous présentons des approches expérimentales pour étudier RNA-Interactiens de bicaténaire RNA binding protéine kinase activée par RNA (PKR) durant le cycle cellulaire chez les mammifères, à l’aide de cellules HeLa. Cette méthode utilise le formaldéhyde pour crosslink RNA-PKR complexes et immunoprécipitation pour enrichir PKR lié aux ARN. Ces ARN peut être davantage analysé par séquençage haut-débit ou qRT-PCR.
Abstract
Protéine kinase activée par RNA (PKR) est membre des réponse immunitaire innée de protéines et reconnaît la double-brin structure secondaire de l’ARN viral. Lorsqu’elle est liée à l’ARN double brin (dsRNA) viral, PKR subit une dimérisation et autophosphorylation ultérieure. PKR phosphorylée (pPKR) devenue active et induit la phosphorylation de la sous-unité alpha du facteur d’initiation eucaryote 2 (eIF2α) pour supprimer la traduction globale. Augmentant la preuve suggère que la PKR peut être activé dans des conditions physiologiques tels que durant le cycle cellulaire ou dans diverses conditions de stress sans infection. Cependant, nos connaissances sur les activateurs de RNA de PKR est limitée en raison de l’absence d’une méthode expérimentale normalisée pour capturer et analyser PKR-interaction ARN doubles brins. Nous présentons ici un expérimental protocole d’enrichir et de les analyser PKR spécifiquement lié RNAs durant le cycle cellulaire en utilisant des cellules HeLa. Nous utilisons l’activité efficace de réticulation du formaldéhyde pour fixer les complexes ARN-PKR et isoler par immunoprécipitation. PKR co-immunoprécipitée ARN peut ensuite être transformés pour générer une bibliothèque de séquençage haut-débit. Une classe importante de PKR-interaction cellulaire ARN doubles brins est ARN mitochondrial (mtRNAs), qui peut prendre la forme intermoléculaire ARN doubles brins par interaction complémentaire entre le lourds-strand et la lumière-brin ARN. Afin d’étudier la présence de ces mtRNAs duplex, nous présentons également un protocole pour le volet spécifique qRT-PCR. Notre protocole est optimisé pour l’analyse de PKR lié aux ARN, mais il peut facilement être modifié afin d’étudier l’Arndb cellulaire ou RNA-Interactiens d’autres protéines de liaison des Arndb.
Introduction
Protéine kinase activée par RNA (PKR), kinase d’également connu sous le nom eucaryotes initiation factor 2-alpha 2 (EIF2AK2), est une kinase bien caractérisés qui transmet les informations fournies par les ARN. Il appartient à l’alpha de sous-unité d’initiation 2 traduction eucaryote (eIF2α) famille kinase et phosphoryle eIF2α à sérine 51 en réponse à l’infection pour supprimer la traduction globale1. Dans ce contexte, PKR est activé par l’ARN bicaténaire viral (ARN doubles brins), qui fournissent une plate-forme pour PKR dimérisation et autophosphorylation2. En plus d’eIF2α, PKR peut également phosphoryler p53, substrat de récepteur de l’insuline 1, inhibiteur κB et c-Jun N-terminal kinase (JNK) pour réguler l’activité de nombreux signal transduction pathways3,4,5, 6.
PKR a été initialement identifiée comme une kinase qui phosphorylé eIF2α au cours de l’infection par le poliovirus en reconnaissant ARN doubles brins7,8 des poliovirus. PKR se trouve de plus en plus à jouer un rôle aux multiples facettes au-delà de réponse immunitaire, et son activation aberrante ou le mauvais fonctionnement est impliqué dans nombreuses maladies humaines. Activé/Phosphorylated PKR (pPKR) est fréquemment observée au cours de l’apoptose et est une caractéristique commune des patients atteints de maladies dégénératives, en particulier les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington, maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer9 ,10,11,12,13. En outre, PKR est activé dans diverses conditions de stress tels que le stress métabolique et chaleur choc14,15,16,17. En revanche, l’inhibition de la PKR entraîne la prolifération cellulaire accrue et une transformation maligne même18,19. Fonction PKR est également importante dans le fonctionnement normal du cerveau et durant le cycle cellulaire comme le niveau de pPKR est élevée au cours de la phase de M20,21,22. Dans ce contexte, pPKR supprime la traduction globale et fournit des repères pour des systèmes de signalisation mitotiques clés qui sont nécessaires à la division cellulaire appropriée20. En outre, l’activation prolongée de PKR a entraîné en phase G2/M, arrêt du cycle cellulaire dans les ovaires de hamster chinois cellules23. Par conséquent, la phosphorylation de PKR est réglementée par la boucle de rétroaction négative afin d’assurer une désactivation rapide pendant M/G1 transition21.
Malgré la fonction du large éventail de PKR, notre compréhension de l’activation de PKR est limitée en raison de l’absence d’une approche expérimentale normalisée de haut-débit pour capturer et identifier les ARN doubles brins qui peut activer la PKR. Des études antérieures ont montré que la PKR peut interagir avec ARN doubles brins formé par deux inversée Alu répétitions (IRAlus)20,24, mais la possibilité de l’existence d’autres ARN doubles brins cellulaire qui peut activer la PKR durant le cycle cellulaire ou sous conditions de stress dans les cellules humaines était encore inexplorés. L’approche classique en identifiant RNA-Interactiens d’une protéine de liaison du RNA (RBP) utilise la lumière UV pour crosslink RNA-RBP complexes25,26,27. Une récente étude a appliqué cette approche de réticulation UV dans un système de souris et identifié que les petits ARN nucléolaires peut réguler activation de PKR lors de stress métabolique16. En utilisant la réticulation haute efficacité de formaldéhyde, nous avons présenté une méthode alternative pour identifier PKR-interacting RNAs durant le cycle cellulaire de cellules HeLa28. Une approche similaire a été appliquée à l’étude des autres dsRBPs telles que Staufen et Drosha29,30,31. Nous avons trouvé que PKR peut interagir avec différents types d’ARN non codants tels que court interspersed nuclear élément (sinus), long intercalés nucléaire élément (ligne), élément de rétrovirus endogènes (ERV) et même alpha-satellite RNAs. En outre, nous avons montré que la PKR peut interagir avec ARN mitochondrial (mtRNAs), qui forme intermoléculaire ARN doubles brins par interaction complémentaire entre les brins lourds et la lumière chapelet RNAs28. Une publication récente a aussi appuyé nos données que certains mtRNAs existent sous une forme recto verso et peut activer les capteurs de dsRNA comme protéine associée à la différenciation par mélanome 5 pour induire des interférons32. Plus important encore, l’expression et la localisation subcellulaire des mtRNAs sont modulés au cours du cycle cellulaire et de différents facteurs de stress, qui peut être important dans leur capacité à réguler la PKR activation28.
Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé pour une réticulation formaldéhyde récemment mis au point et l’immunoprécipitation (fCLIP) méthode pour capturer et analyser PKR-interacting RNAs durant le cycle cellulaire. Nous démontrons la méthode pour préparer les échantillons d’arrestation cycle cellulaire à l’aide de la thymidine et la nocodazole. Puis, nous présentons le processus fCLIP pour isoler PKR lié aux ARN et une méthode pour préparer la bibliothèque de séquençage haut débit afin d’identifier ces ARN. En outre, nous définissent des procédures détaillées pour analyser PKR lié aux ARN par qRT-PCR. Plus précisément, nous présentons une procédure de transcription inverse brin spécifique pour analyser la présence de mtRNAs. Le protocole décrit est optimisé pour les cellules HeLa et PKR, mais des étapes clés tels que la préparation de l’échantillon du cycle cellulaire, fCLIP et analyse volet spécifique qRT-PCR peuvent être facilement modifiées pour étudier l’Arndb cellulaire ou d’identifier des Interactiens de RNA d’autres dsRBPs.
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Protocol
1. solution et cellule de préparation
- Préparation de la solution
- Pour le milieu de culture cellulaire, préparer milieu de culture cellulaire HeLa en ajoutant 50 mL de sérum fœtal (SVF) dans 500 mL du moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM).
Remarque : Les antibiotiques peuvent être ajoutés au milieu de culture cellulaire, mais nous n’utilisons pas d’antibiotiques. - Pour le 0,1 % de paraformaldéhyde, dissoudre paraformaldéhyde à 4 % (p/v) dans 1 x Phosphate-Buffered Saline (PBS) avec chauffage sur une plaque chauffante et diluer à faire 30 mL de paraformaldéhyde à 0,1 % (v/v) en ajoutant 1 x PBS.
Attention : Effectuez toutes les opérations sous une hotte et veillez à ne pas faire bouillir la solution de paraformaldéhyde. Protéger la solution à 0,1 % de la lumière et conserver à 4 ° C. Utiliser la solution dans le mois.
Nota : Le pH de la solution finale de paraformaldéhyde 0,1 % (v/v) devrait être autour de 7. - Préparer le tampon de lyse fCLIP : 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5 % (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1 % (v/v) X-100 Triton, 0,1 % (v/v) dodécylsulfate de sodium (SDS) et le désoxycholate de sodium 0,1 % (p/v). Ajouter l’eau distillée triple (TDW) à 40 mL. Conserver à 4 ° C.
- Préparer le tampon de lavage fCLIP : 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 % (v/v) NP-40, 0,1 % (v/v) X-100 Triton, 0,1 % (v/v) SDS et 0,1 % (p/v) désoxycholate de sodium. Ajouter TDW à 40 mL. Conserver à 4 ° C.
- Préparer 4 x tampon PK : 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, EDTA de 40 mM et le SDS de 4 % (v/v). Ajouter TDW à 40 mL. Conserver à température ambiante.
- Préparer fCLIP tampon d’élution : 20 mL 4 x tampon PK 21 g d’urée et 8,5 mL de TDW. Préparer les frais.
- Préparer le tampon d’élution RNA : 0,3 M NaOAc et SDS de 2 % (p/v). Conserver à température ambiante.
- Préparer 2 x teinture chargement RNA : bleu de bromophénol 0.025 % (p/v), 0.025 % (p/v) de xylène cyanol, 5 mM EDTA, SDS de 0,05 % (p/v) et 95 % (v/v) formamide. Conserver à-20 ° C.
- Préparer 1 x TBE tampon : 0,089 M Tris-Borate et 0,002 M EDTA. Préparer 500 mL de tampon TBE.
- Pour le milieu de culture cellulaire, préparer milieu de culture cellulaire HeLa en ajoutant 50 mL de sérum fœtal (SVF) dans 500 mL du moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM).
- Préparation de cellules de phase-arrêté S ou M
- Semence ~ 750 000 ou ~ 1 000 000 HeLa cellules pour les échantillons arrêté à la phase S ou M, respectivement. La croissance de cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
- Traiter les cellules avec la thymidine 2 mM et incuber pendant 18 heures à 37 ° C.
- Laver les cellules deux fois avec du PBS. Ajouter des supports neufs et incuber pendant 9 h à 37 ° C.
- Pour les cellules de phase-arrêté S, traiter des cellules avec de la thymidine 2 mM. Pour les cellules de phase-arrêté M, traiter les cellules avec 100 ng/mL nocodazole. Incuber pendant 15 h à 37 ° C et récolte des cellules.
Remarque : L’homogénéité des échantillons cycle cellulaire peut être vérifiée à l’aide de FACS.
2. formaldéhyde réticulation et immunoprécipitation
- Récolte de cellules
- Pour un échantillon de phase S, prélever des cellules avec un grattoir de cellules et les transférer dans un tube conique de 15 mL. Pour un échantillon de phase M, appuyez sur le côté de la boîte de Petri de cellule pour détacher des cellules de phase-arrêté de M et les transférer dans un tube conique de 15 mL.
Remarque : Pour augmenter l’homogénéité des cellules M phase-arrêté, ne pas utiliser un grattoir de cellules. - Centrifuger les cellules à 380 g à température ambiante pendant 3 min. retirer le surnageant et remettre en suspension avec 1 mL de PBS froid et le transfert dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
- Centrifuger les cellules à 10 000 x g à 4 ° C pendant 30 s. enlever le surnageant complètement.
- Pour un échantillon de phase S, prélever des cellules avec un grattoir de cellules et les transférer dans un tube conique de 15 mL. Pour un échantillon de phase M, appuyez sur le côté de la boîte de Petri de cellule pour détacher des cellules de phase-arrêté de M et les transférer dans un tube conique de 15 mL.
- Réticulation de formaldéhyde
- Ajouter 750 μL de paraformaldéhyde 0,1 % pendant 10 min à température ambiante pour fixer les cellules.
- Ajouter 250 μL de glycine de 1 M et incuber une supplémentaire de 10 min à température ambiante pour étancher la réaction. Centrifuger les cellules à 10 000 x g à 4 ° C pendant 30 s. enlever le surnageant complètement.
- Remettre en suspension avec 1 mL de PBS. Centrifuger les cellules à 10 000 x g à 4 ° C pendant 30 s et enlever le surnageant.
- Remettre en suspension avec 400 μl de tampon de lyse fCLIP additionné de 2 % (v/v) inhibiteur de RNase et de 0,2 % (v/v) inhibiteur de la protéase. Incuber sur glace pendant 10 min et laisser agir à l’aide d’un ultrasonicator.
- Ajouter 11 μL de 5 M de NaCl pour ajuster la concentration de NaCl à ~ 150 mM. Vortex brièvement et centrifuger à x 21 130 g à 4 ° C pendant 15 min. transférer le liquide surnageant dans un tube de microcentrifuge préalablement réfrigérées 1,5 mL.
NOTE : Conserver 40 μL de surnageant dans un tube à centrifuger de nouveau que l’échantillon d’entrée. Conserver l’échantillon d’entrée à 4 ° C.
- Immunoprécipitation
- Ajouter 20 μL de billes de protéine A dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
- Laver les billes avec 400 μl de tampon de lyse fCLIP. Centrifuger les perles à 1 000 x g à 4 ° C pendant 1 min. retirer le surnageant et ajouter 400 μL de tampon de lyse fCLIP soigneusement. Doucement remettre en suspension les perles en les retournant 3 ~ 4 fois.
- Répétez l’étape de lavage trois fois. Après le lavage final, retirez complètement le surnageant.
- Remettre en suspension les perles dans 300 μL de tampon de lyse fCLIP. Ajouter 8,3 μL de 5 M de NaCl pour ajuster la concentration de NaCl à ~ 150 mM. Ajouter 10 μL d’anticorps PKR et incuber pendant 3 h sur un rotateur à 4 ° C.
- Centrifuger les perles à 1 000 x g à 4 ° C pendant 1 min. retirer le surnageant et ajouter 400 μL de tampon de lavage fCLIP. Doucement remettre en suspension les perles en les retournant 3 ~ 4 fois.
- Répétez l’étape de lavage deux fois. Après le lavage final, retirez complètement le surnageant.
Remarque : N’utilisez jamais un vortex. Il faut inverser le tube doucement avec les mains. - Ajouter 300 μl de lysat et incuber pendant 3 h à 4 ° C sur un agitateur.
NOTE : Les temps d’incubation plus long peuvent entraîner liaison fond accrue. - Centrifuger les perles à 1 000 x g à 4 ° C pendant 1 min. retirer le surnageant et ajouter 400 μL de tampon de lavage fCLIP. Doucement remettre en suspension les perles en les retournant 3 ~ 4 fois.
- Répétez l’étape de lavage trois fois. Après le lavage final, retirez complètement le surnageant.
- Ajouter 300 μl de tampon d’élution fCLIP. Incuber dans un thermomixer pendant 3 h à 25 ° C pour éluer PKR depuis les perles.
NOTE : Préparez le frais de tampon d’élution fCLIP. - Centrifuger à 1 000 g à la température ambiante et transférer le surnageant dans un tube de mastic propre.
NOTE : Un tube de microcentrifuge est OK aussi, mais le tube de mastic est préférable pour éviter l’évaporation au cours de l’étape de-réticulation (étape 2.3.12). - Ajouter 300 μl de protéinase K (20 mg/mL) et incuber une nuit à 65 ° C.
Remarque : Utiliser un thermomixer avec couverture chauffée pour éviter l’évaporation.
- Extraction de l’ARN
- Ajoutez 580 μL d’acide-phénol chloroforme et vortex pendant 30 s. incuber à 37 ° C pendant 1 h.
- Vortexer pendant 30 s et centrifuger à 12 000 x g à température ambiante pendant 10 min.
- Transférer la couche supérieure dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 mL. Ajouter 1/10 volume de 3M NaOAc, 0,5 μL de coprecipitant (p. ex., Glycoblue) et un volume égal d’isopropanol. Incuber une nuit à-20 ° C.
- Précipiter les granulés par centrifugation à la vitesse maximale à 4 ° C pendant 1 h.
Remarque : Si granulés ARN/ADN n’ont pas été observés, ajouter un μL 0.5 supplémentaire de coprecipitant et centrifuger pendant une 1 h supplémentaire. continuer cette étape jusqu'à ce que les boulettes de l’ARN/ADN sont observées. - Retirez le surnageant et ajouter 1 mL d’alcool éthylique de 75 %. Centrifuger à 12 000 x g à 4 ° C pendant 5 min. Répétez l’étape de lavage une fois de plus. Retirez le surnageant complètement et sécher le culot à la température ambiante.
- Ajouter 42 μL de TDW, 5 μL de DNase I mettre en mémoire tampon, 1 μL d’inhibiteur de RNase et 2 μL de DNase I. incuber à 37 ° C pendant 1 h.
- Ajouter 150 μl de TDW et 200 μL d’acide-phénol chloroforme. Vortex pour 30 à s. centrifuger à 12 000 x g à température ambiante pendant 10 min.
- Transférer la couche supérieure dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 mL. Ajouter 20 μL de 3 M Acona, 0,5 μL de coprecipitant et 1 mL d’alcool éthylique à 100 %. Incuber une nuit à-80 ° C.
- Précipiter les boulettes et laver avec 75 % d’alcool éthylique comme décrit aux étapes 2.4.4 à 2.4.5.
- Remettre en suspension dans la quantité appropriée de TDW.
3. séquençage bibliothèque préparation
- suppression de l’ARNr
- Remettre en suspension les pellets de RNA de l’étape 2.4.10 avec 28 μL de TDW.
Remarque : Le montant maximal de l’ARN total doit être inférieur à 5 μg. - Suivre les procédures prévues par le guide de référence du kit de suppression de l’ARNr pour enlever les ARNr.
- Nettoyer les ARNr appauvri RNAs en ajoutant 160 μL de billes magnétiques.
- Mélanger en pipettant également, environ 15 fois et incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Fixer le tube sur un barreau magnétique et éliminer le surnageant.
- Ajouter 300 μL de 80 % d’alcool éthylique, tandis que les perles soient encore attachées sur la barre aimantée et incuber pendant 30 s.
- Remplacer l’alcool éthylique avec une solution fraîche de 300 μL. Sécher à l’air les perles sur le Barreau magnétique pendant 12 min à température ambiante.
- Remettre en suspension les perles dans 12 μL de TDW et mélanger en pipettant également 15 fois.
- Fixer les perles sur la barre aimantée et déplacer le surnageant dans un tube PCR propre.
- Appauvrissent la fragmenté RNAs ribosomal (ARNr) suivant les procédures fournies par ARNr appauvrissement Kit.
- Nettoyer l’ARN en ajoutant 110 μL de billes magnétiques et étapes répétant 3.1.3.1 à 3.1.3.6.
- Remettre en suspension les pellets de RNA de l’étape 2.4.10 avec 28 μL de TDW.
- Ligature d’étiquetage et de l’adaptateur de RNA
- Sur appauvri ARNr ARN, ajouter 2 μL de tampon de x CIAP 10, 1 μL d’inhibiteur de RNase et 2 μL de la phosphatase alcaline Antarctique. Incuber à 37 ° C pendant 1 h, puis à 65 ° C pendant 5 min inactiver la phosphatase.
- Ajouter 3 μL de tampon de x PNK 10, 1,5 μL d’inhibiteur de RNase, 1,5 μL d’enzyme T4 PNK, 0,8 μL de r-ATP et 1,7 μL de TDW. Incuber à 37 ° C pendant 50 min.
- Ajouter 1,5 μL d’ATP 10 mM et incuber à 37 ° C pendant plu 40 min.
- Arrêter la réaction en ajoutant 170 μL de tampon d’élution de la RNA.
- Ajouter 200 μL d’acide-phénol chloroforme et vortex pour 30 à s. centrifuger à 12 000 x g à température ambiante pendant 10 min.
- Transférer la couche supérieure dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 mL. Ajouter 20 μL de 3 M Acona, 0,5 μL de coprecipitant et 1 mL d’alcool éthylique à 100 %. Incuber une nuit à-80 ° C.
- Précipiter les pastilles de RNA et laver avec 75 % d’alcool éthylique comme décrit aux étapes 2.4.4 à 2.4.5. Remettre en suspension dans le 4,5 μL de TDW et ajouter 9 μL de 2 x colorant de chargement de RNA.
- Chauffer l’échantillon à 95 ° C pendant 5 min et charge sur un gel d’urée-PAGE 10 %.
- Exécutez le gel à 370 V pendant 40 min.
Remarque : Exécutez avant le gel à 370 V pendant 90 min avant le chargement de l’échantillon. - Coupez le gel à la région de nucléotides ~ 100 – 500, briser le gel.
- Ajouter 700 μL de 0,3 M de NaCl et incuber une nuit à 4 ° C sur un agitateur.
- Transvaser la solution dans une colonne et une centrifugeuse à vitesse maximum à température ambiante pendant 5 min.
- Transférer l’éluat dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 mL. Ajouter 1/10 volume de 3M NaOAc, 0,5 μL de coprecipitant et un volume égal d’isopropanol. Incuber une nuit à-20 ° C.
- 3' la ligature adaptateur
- Précipiter les pastilles de RNA et laver avec 75 % d’alcool éthylique comme décrit aux étapes 2.4.4 à 2.4.5.
- Remettre en suspension les pellets RNA dans 6,5 μL de TDW et ajouter 1 μL de 10 μM 3' adaptateur.
- Transvaser la solution dans un tube PCR et incuber à 70 ° C pendant 2 min.
- Ajouter 1 μL de tampon de ligature 10 x 0,5 μL d’inhibiteur de RNase et 1 μL de ligase d’ARN T4 2. Incuber à 28 ° C pendant 1 h, 25 ° C pendant 6 h et 22 ° C pendant 6 h.
- Ajouter 12 μL de 2 x colorant de chargement de RNA et de chaleur à 95 ° C pendant 5 min.
- Gel de purifier la 3' adaptateur ligaturé RNAs comme décrit dans 3.2.9 à 3.2.13.
- 5' la ligature adaptateur
- Précipiter les pastilles de RNA et laver avec 75 % d’alcool éthylique comme décrit aux étapes 2.4.4 à 2.4.5.
- Remettre en suspension les pellets RNA dans 4,2 μL de TDW et ajouter 1 μL de 5 μM 5' adaptateur.
- Transvaser la solution dans un tube PCR et incuber à 70 ° C pendant 2 min.
- Ajouter 0,8 μL de tampon de ligase 10 x, 0,4 μL d’inhibiteur de RNase, 0,8 μL d’ATP, 0,8 μL de ligase d’ARN T4 1 10 mM. Incuber à 28 ° C pendant 1 h, 25 ° C pendant 6 h et 22 ° C pendant 6 h.
- La transcription inverse et amplification par PCR
- Sur 5' adaptateur ligaturés RNAs, ajouter 1 μL d’apprêt de transcription inverse 4 μM. Incuber à 70 ° C pendant 2 minutes et les refroidir immédiatement à 4 ° C.
- Ajouter 4 μL de tampon de FS x 5, 4 μL de 2,5 mM dNTP, 1 μL de 0,1 M TNT, 1 μL d’inhibiteur de RNase et 1 μL de la transcriptase inverse. Incuber à 50 ° C pendant 1 h et 70 ° C pendant 15 min.
- Préparer l’amplification par PCR
- Mélanger 1 μL de produit de RT, 1 μL d’apprêt RPI 25 μM, 1 μL d’apprêt de RP1 25 μM, 10 μL de 5 x tampon HF, 4 μL de 2,5 mM dNTP, 32,5 μL de TDW et 0,5 μL de polymérase de haute fidélité.
- Exécutez le programme PCR pour 11 ~ 13 cycles.
NOTE : Le programme pour l’ACP est : 98 ° C pendant 30 s pour un démarrage à chaud, 98 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 45 s pour amplification et 72 ° C pendant 5 min. L’étape d’amplification est répétée pour les cycles de 11-13.
- Nettoyer les produits PCR utilisant 40 μL des billes magnétiques et étapes suivantes 3.1.3.1 à 3.1.3.6 mais 10 μL de TDW pour éluer l’ADN.
- Ajouter 2 μl de colorant de chargement 10 x ADN. Charger l’échantillon sur un gel de 6 % d’acrylamide et exécuter à 200 V pendant 30 min.
- Tache avec Sybr gold (0,01 % (v/v) dans 1 x TBE tampon) pendant 5 min à température ambiante.
- Se détachant dans 1 x TBE tampon pendant 5 min à température ambiante.
- Couper le gel à la région de nucléotides ~ 200-700 et briser le gel.
- Ajouter 700 μL de 0,3 M de NaCl et incuber une nuit à température ambiante pour éluer l’ADN.
- Charger le tout sur une colonne et une centrifugeuse à vitesse maximum à température ambiante pendant 5 min.
- Transférer l’éluat dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 mL. Ajouter 1/10 volume de 3M NaOAc, 0,5 μL de coprecipitant et un volume égal d’isopropanol. Incuber une nuit à-20 ° C.
- Précipiter l’ADN granulés et laver avec 75 % d’alcool éthylique comme décrit aux étapes 2.4.4 à 2.4.5. Remettre en suspension dans 20 μL de TDW.
- Analyser l’échantillon à l’aide d’un séquenceur.
4. analyse de PKR-interacting RNAs par qRT-PCR
- Méthode 1 : Hexamère aléatoire transcription inverse
- Remettre en suspension pastilles RNA de l’étape 2.4.10 avec 8,5 μl de TDW et transvaser la solution dans un tube de PCR.
- Ajouter 0,5 μL d’hexamères aléatoire de 100 μM et 4 μL de mélange dNTP 2,5 mM.
- Chaleur la solution à 65 ° C pendant 5 min et immédiatement incuber sur glace pendant au moins 1 minute.
- Faites la réaction de mélange : 4 μL de tampon de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM TNT, 1 μL d’inhibiteur de RNase et 1 μL de la transcriptase inverse (200 U/μl). Ajouter le mélange de la réaction à la solution RNA.
- Incuber le mélange à 23 ° C pendant 10 min, 50 ° C pendant 10 min et 80 ° C pendant 10 min.
- Analyser le cDNA utilisant un système PCR en temps réel.
NOTE : Le programme pour la PCR en temps réel est : 95 ° C pendant 3 min pour le démarrage à chaud, 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 10 s pour amplification et 95 ° C pendant 30 s, 65 ° C pendant 30 s et 95 ° C pendant 30 s pour faire fondre. L’étape d’amplification est répétée pendant 40 cycles.
- Méthode 2 : Volet spécifique transcription inverse
- Préparer un mélange maître d’amorces inverses : mélange de quantités égales d’amorces spécifiques de la transcription inverse de gène contenant la séquence promotrice CMV suivies de ~ 20 nucléotides des séquences spécifiques de gènes.
Remarque : La concentration et combinée de toutes les amorces spécifiques à gène RT est de 4 μM. - Remettre en suspension pastilles RNA de l’étape 2.4.10 avec 8,5 μl de TDW et transvaser la solution dans un tube de PCR.
- Ajouter 0,5 μL de mélange principal de 4 μM d’amorces de transcription inverse et 4 μL de mélange dNTP 2,5 mM.
- Chaleur la solution à 65 ° C pendant 5 min et immédiatement incuber sur glace pendant au moins 1 minute.
- Préparer la solution de réaction en mélangeant 4 μL de tampon de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM TNT, 1 μL d’inhibiteur de RNase et 1 μL de la transcriptase inverse (200 U/μl). Ajouter la solution de réaction à la préparation d’amorce d’ARN.
- Incuber la solution à 50 ° C pendant 10 min et 80 ° C pendant 10 min.
- Analyser le cDNA utilisant le système PCR en temps réel.
NOTE : Le programme pour la PCR en temps réel est la même que celle décrite dans la méthode 1.
- Préparer un mélange maître d’amorces inverses : mélange de quantités égales d’amorces spécifiques de la transcription inverse de gène contenant la séquence promotrice CMV suivies de ~ 20 nucléotides des séquences spécifiques de gènes.
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Representative Results
Un schéma pour le procédé à l’arrestation de cellules HeLa lors de la phase S ou M du cycle cellulaire est illustré à la Figure 1. Pour un échantillon de phase-arrêté M, nous pouvons visualiser clairement les ronds en forme cellules au microscope (Figure 2 a). Afin d’examiner l’efficacité de l’arrêt du cycle cellulaire, le contenu de la cellule en nucléaire peut être analysé à l’aide de FACS (Figure 2 b). La figure 3 montre les données représentatives pour l’immunoprécipitation essai d’efficacité, où les anticorps D7F7 montre une capacité supérieure d’immunoprécipitation PKR. Cette différence dans l’efficacité de l’immunoprécipitation peut avoir été reflétée dans l’écart dans la répartition des classes des bibliothèques du séquençage haut-débit, préparé à l’aide de deux types d’anticorps PKR (Figure 4). La spécificité de l’anticorps D7F7 est confirmée par toute tache occidentale en analysant l’immunoprécipitation PKR (Figure 5 a) et le lysat cellulaire total (Figure 5 b). La figure 6 montre le signal de radio-isotope avant et après le retrait des rRNA lors de la préparation de bibliothèque de séquençage haut-débit. La figure 7 illustre l’enrichissement de mtRNAs en ARN co-immunoprécipitée avec PKR, mais pas dans l’ARN co-immunoprécipitée avec lapin région chromosomique de IgG ou DiGeorge syndrome 8 (DGCR8). La figure 8 illustre le brin représentatif spécifiques analyse qRT-PCR de PKR lié aux mtRNAs en S ou M-phase arrêtée échantillons.
Figure 1 : schéma pour les échantillons d’arrêt du cycle cellulaire préparation. (A, B) Schéma de la préparation du S (A) ou M (B) phase-arrêté des cellules HeLa. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse du cycle cellulaire arrêté échantillons. (A) Phase images contrastées des échantillons de phase-arrêté S ou M. Les barres indiquent 250 μm. (B), FACS analyse indiquant la teneur en nucléaire des échantillons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : essai d’efficacité de l’immunoprécipitation des anticorps PKR. Pour l’enrichissement réussie de PKR lié aux ARN, un anticorps avec une efficacité d’immunoprécipitation définitif comme l’anticorps D7F7 doit être utilisé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : répartition des classes RNA des bibliothèques de séquençage préparé à l’aide de différents anticorps PKR. À l’aide de différents anticorps PKR pour fCLIP a abouti à une distribution de catégorie différente de séquençage mappé lectures. La différence est probablement due à des différences dans l’efficacité de l’immunoprécipitation. Ce chiffre a été modifié par Kim et al.,28. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : spécificité de l’anticorps D7F7 PKR. (A, B) L’analyse de toute tache occidentale de PKR immunoprécipitée (A) ou total HeLa lysat (B) ont montré qu’une forte bande correspondant à la taille de PKR, indiquant que l’anticorps D7F7 est hautement spécifique dans la reconnaissance de PKR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : signal de radio-isotopes pour PKR co-immunoprécipitée RNAs. (A) PKR co-immunoprécipitée RNAs pouvaient être détectés par leurs extrémités 5' avec r-ATP d’étiquetage. (B) radioistope signal diminution a été observée lors du retrait de rRNA réussie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Validation des interactions PKR-mtRNA. Connecter2 pli enrichissement de mtRNAs ARN co-immunoprécipitée avec des anticorps indiquées. Seul l’échantillon PKR co-immunoprécipitée RNA a montré fort enrichissement de mtRNAs. Les anticorps IgG de lapin et DGCR8 étaient utilisés comme témoins négatifs. Ce chiffre a été modifié par Kim et al.,28. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : analyse qRT-PCR Strand-spécifique de PKR lié mtRNAs. (A, B) Transcription inverse Strand spécifique a été utilisée pour analyser la présence des mtRNAs qui ont été co-immunoprécipitée avec PKR pour S (A) ou de cellules de phase-arrêté M (B). Ce chiffre a été modifié par Kim et al.,28. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le processus de préparation d’échantillons de phase-arrêté S ou M est illustré à la Figure 1. Pour arrêter les cellules en phase S, nous avons utilisé une méthode de double bloc de thymidine où nous avons traité des cellules avec de la thymidine deux fois avec une sortie de 9 h entre les deux pour assurer l’arrestation haute efficacité (Figure 1 a). Arrestation de phase M, nous avons traité les cellules une fois avec de la thymidine suivie d’une libération de 9 h et ensuite appliqué nocodazole bloc cellules à prométaphase (Figure 1 b). Une étape clé dans la préparation de l’échantillon du cycle cellulaire est l’étape de sortie après le premier bloc de la thymidine. Pour supprimer complètement la thymidine, il est essentiel de laver les cellules au moins deux fois avec du PBS frais. Lavage incorrect et thymidine résiduelle peut entraîner l’hétérogénéité accrue et la viabilité cellulaire réduite. Le succès de l’arrestation de phase M peut être confirmé visuellement basée sur l’augmentation du nombre de cellules de forme ronde (Figure 2 a). Toutefois, l’échantillon de phase M contient encore de nombreuses cellules interphasiques basés sur leur morphologie. Pour collecter uniquement la phase M arrêté les cellules, nous avons appliqué la force physique pour détacher les cellules en phase M de la surface. Le contenu nucléaire des cellules récoltées a été examiné à l’aide de FACS, qui a montré un pic large entre 2n et 4n pour la phase S et un pic à 4n pour l’échantillon de phase-arrêté M (Figure 2 b). Le protocole présenté est optimisé pour les cellules HeLa, qui ont un temps de doublement d’environ 24 heures. L’idée de double bloc thymidine et de la thymidine-la nocodazole peut être appliquée aux autres lignées de cellules, mais les durées de traitement et de la libération de drogue exact doivent être optimisées basé sur le temps de doublement des cellules cibles.
Pour identifier la PKR-interacting RNAs, nous réticulé PKR-RNA complexes avec le formaldéhyde et les enrichis par immunoprécipitation. Un facteur clé qui détermine la précision de l’analyse qui suit est l’efficacité d’immunoprécipitation. Nous avons testé de nombreux anticorps qui ciblent différents épitopes de la protéine PKR afin de déterminer les anticorps pour la préparation de bibliothèque de séquençage haut-débit. Comme illustré à la Figure 3, nous avons constaté que l’anticorps D7F7 qui reconnaît la région entre le domaine de liaison de dsRNA et le domaine catalytique a montré la capacité supérieure dans la capture de PKR. L’autre anticorps illustré à la Figure 3 (Milli) reconnaît la région N-terminale, mais présente une faible capacité en immunoprecipitating PKR. Par conséquent, la bibliothèque de séquençage haut débit préparée à l’aide de l’anticorps Milli contenait des nombreuses lectures de séquençage de fond qui sont dispersées dans tout le génome, en particulier dans les introns, sans accumulation distinctes à des régions spécifiques28 (Figure 4). Nous pensons que les divergences dans les deux bibliothèques de séquençage sont principalement en raison des différences dans les capacités des anticorps dans la capture de PKR pendant l’étape de l’immunoprécipitation. Nous avons étudié la spécificité de l’anticorps D7F7 PKR au moyen d’analyses occidentales toute tache d’immunoprécipitation (Figure 5 a) et totales lysats de HeLa (Figure 5 b). Dans les deux taches, nous avons observé seulement une bande forte qui correspond à la PKR. Cela indique que l’anticorps D7F7 est très spécifique et que les données de séquençage obtenues à l’aide de l’anticorps D7F7 susceptible de reflètent vrais Interactiens de RNA de PKR.
Une étape essentielle lors de la préparation de bibliothèque de séquençage haut-débit est la suppression des rRNA. Depuis que nous avons des complexes de RNA-RBP réticulé avec du formaldéhyde, nous avons utilisé un ultrasonicator complete lyse des cellules. Ce processus a abouti à la fragmentation des rRNA, qui réduit de façon significative l’efficacité de la suppression d’ARNr utilisant l’ARNr Kit de suppression. Pour résoudre ce problème, nous avons d’abord utilisé l’ARNr Kit suppression suivie de l’ARNr appauvrissement Kit (voir Table des matières), dont presque complètement supprimé rRNA et moins de 1 % du séquençage total se lit ont été cartographiés à rRNA. Nous avons utilisé ces deux trousses dans l’ordre car l’ARNr Kit de l’appauvrissement de la couche a une capacité maximale de seulement 1 μg tandis que les ARNr Kit de désinstallation a une capacité maximale de 5 μg. Nous avons connu que l’utilisation de plus que la quantité recommandée de l’ARN total se traduit par une quantité importante de séquençage lectures mappé à rRNA. La suppression réussie de l’ARNr peut être confirmée après marquage RNAs avec r-ATP grâce à la réaction du PNK. Tandis que les ARNr ARN appauvri a montré une bande distincte environ 150 nt, l’échantillon avant enlèvement de l’ARNr montre fort signal dans toute la région correspondant à la 50 ~ 300 nt (Figure 6).
Une des limites de la réticulation de formaldéhyde sont l’efficacité de l’immunoprécipitation de diminution. Autres applications de la réticulation de formaldéhyde par exemple immunocytochimie utilisent solution paraformaldéhyde à 4 % pour la fixation. Toutefois, une telle condition de fixation forte ne s’applique pour fCLIP expérience parce qu’il diminue de manière significative l’efficacité de l’immunoprécipitation, qui se traduit par un fond plus élevé. En outre, complexes de protéine-protéine crosslinks formaldéhyde fixation en plus des complexes protéine-ARN. Par conséquent, il faut payer la prudence dans l’interprétation des données fCLIP.
Comme indiqué précédemment, mtRNAs former intermoléculaire ARN doubles brins qui sont reconnus par PKR28. Tout d’abord, nous avons validé nos données de séquençage en examinant les interactions de PKR-mtRNA par qRT-PCR. Nous avons utilisé des IgG de lapin et DGCR8 anticorps comme témoins négatifs, qui n’a montré aucun enrichissement de mtRNAs (Figure 7). À noter, DGCR8 a été utilisé comme une protéine de liaison de dsRNA nucléaire qui est physiquement séparée de mtRNAs. Dans le même temps, PKR co-immunoprécipitée ARN a montré fort enrichissement de mtRNAs (Figure 7).
Pour poursuivre l’analyse des interactions de PKR-mtRNA, nous avons effectué transcription réverse brin spécifique pour distinguer les mtRNAs lourds-brin de le mtRNAs de la lumière-brin (Figure 8). Nous avons conçu la transcription inverse des amorces qui ont une séquence promotrice de CMV suivi d’une séquence de gène-spécifique et ensuite utilisé une séquence promotrice de CMV comme l’apprêt gauche et la droite amorces de gène-spécifiques pour l’analyse de qPCR. Nous avons également testé SP6 promoteur et séquences d’amorces de séquençage pGEX au lieu de la séquence du promoteur CMV. Nous avons constaté que tout en pGEX et promoteur de CMV séquençage des séquences d’amorces ont montré bon résultat, à l’aide de la séquence du promoteur SP6 n’a pas. La différence est due à sa faible teneur en GC de la séquence du promoteur SP6 (~ 33 %) par rapport à celles du promoteur CMV (environ 67 %) et l’amorce de séquençage de pGEX (~ 65 %) séquences. Le schéma proposé pour la transcription inverse brin spécifique peut être appliqué facilement sur autres ARN doubles brins intermoléculaire, mais lorsque vous concevez les amorces de transcriptase inverse, le contenu en GC doit être pris en considération.
Dans l’ensemble, nous avons démontré la préparation des échantillons de cycle cellulaire arrêté et l’enrichissement de PKR-interacting RNAs par réticulation de formaldéhyde et immunoprécipitation. À l’aide d’un anticorps D7F7 hautement efficace, nous avons avec succès isolé lié aux PKR RNAs et identifié ces ARN en générant et en analysant une bibliothèque de séquençage haut-débit. En outre, pour analyser la présence de mtRNAs lié à PKR, nous avons présenté une approche de la transcriptase inverse brin spécifiques. Nous espérons que le protocole présenté peut être facilement optimisé pour étudier des Interactiens de RNA d’autres dsRBPs et la présence d’ARN doubles brins intermoléculaires qui se forment via une interaction complémentaire entre le sens et les transcriptions.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la base Science Research Program grâce à la fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le gouvernement coréen, ministère de la Science et de la TIC (fro-2016R1C1B2009886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
- Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
- Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
- Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
- Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
- Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
- Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
- Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
- Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
- Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
- Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
- Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
- Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
- Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
- Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
- Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
- Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
- Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
- Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
- Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
- Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
- Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
- Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
- Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
- Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).
