Summary
Este protocolo descreve um método simples para a aquisição das amostras de respiração dos filhos. Brevemente, amostras de ar misto pré-concentram-se em tubos de adsorvente antes da análise por cromatografia gasosa / espectrometria de massa. Biomarcadores de respiração de doenças infecciosas e não-infecciosa podem ser identificados usando este método de coleta de respiração.
Abstract
Análise e coleta de respiração podem ser usados para descobrir biomarcadores voláteis em um número de doenças infecciosas e não infecciosas, como malária, tuberculose, câncer de pulmão e doença hepática. Este protocolo descreve um método reprodutível para amostragem de respiração em crianças e depois estabilizar amostras de respiração para uma análise mais aprofundada com cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS). O objetivo desse método é estabelecer um protocolo padronizado para a aquisição de amostras de hálito para posterior análise química, de crianças com idades entre 4 a 15 anos. Primeiro, respiração é amostrada utilizando um papelão bocal conectado a uma válvula de 2 vias, que é conectada a uma bolsa de 3 L. Respiração analitos são então transferidos para um tubo de desorção térmica e armazenados a 4-5 ° C até análise. Esta técnica tem sido usada anteriormente para capturar o fôlego das crianças com malária para identificação de biomarcador de respiração bem sucedida. Posteriormente, nós tem aplicado com sucesso esta técnica de coortes pediátricas adicionais. A vantagem deste método é que ele exige cooperação mínima por parte do paciente (de determinado valor em populações pediátricas), tem um período curto da coleção, não requer pessoal treinado e pode ser realizado com equipamento portátil em configurações de campo de recursos limitados.
Introduction
Biomarcadores podem render informações valiosas sobre os processos biológicos normais e patológicos que podem contribuir para a doença clinicamente identificável. Recentemente, tem havido um interesse crescente na avaliação de compostos voláteis de respiração como biomarcadores para uma variedade de doenças, incluindo câncer 1, distúrbios metabólicos e infecção. Ar exalado contém níveis quantificáveis de compostos orgânicos voláteis (COV), compostos orgânicos semivoláteis e amostras com derivada material (por exemplo, os ácidos nucleicos de bactérias e vírus). O objetivo central de análise do ar exalado é obter conhecimento sobre o status de uma condição médica e/ou exposições ambientais não invasiva. Existem vários métodos de coleta e análise de ar exalado, dependendo dos componentes de interesse. Atualmente não há nenhum método de coleta de ar exalado padronizada, que dificulta a análise comparativa dos resultados através de estudos. Padronização de procedimentos de coleta de respiração é essencial, como o próprio procedimento de amostragem tem um efeito considerável sobre os resultados a jusante das análises de respiração.
Em muitos estudos, tarde amostragem respiratória respiração é empregada2,3. Esta amostragem envolve rejeitando a porção inicial do ar exalado ("dead space"), a fim de capturar preferencialmente o ar no final do ciclo de respiração. A vantagem desta estratégia é que minimiza os níveis de COV exógeno (por exemplo, VOCs ambientais), enquanto enriquece para VOCs endógenas, específicos do paciente. Este método exclui os primeiros segundos da expiração de um indivíduo antes de coletar a amostra de respiração. Outros pesquisadores têm utilizado um sensor de pressão para ativar a amostragem durante uma fase predefinida de expiração4,5. Sensores de pressão requer engenharia complexa, este método alternativo requer um dispositivo de amostragem relativamente caro e dedicado.
Amostragem de respiração pediátrica pode ser especialmente desafiador. Uma preocupação-chave é que as crianças podem ser incapazes de cooperar com protocolos para voluntária exalação de ar de "dead space". Por esta razão, é mais fácil obter a respiração respiratória mista de crianças. No entanto, uma ressalva importante com amostras de respiração respiratória mista é o risco de contaminação ambiental e material. Portanto, a viabilidade de coleta pediátrica é uma preocupação de condução no campo.
Além disso, métodos de coleta, armazenamento de amostras de hálito também pode influenciar a qualidade da amostra. A alta umidade no ar exhalate e as ultra baixas concentrações (partes por trilhão) de respiração orgânicos voláteis compostos fazer respiração amostras particularmente suscetível a problemas relacionados a armazenamento6,7. Apesar do grande potencial das técnicas em tempo real como espectrometria de massa-reação de transferência de próton (PTR-MS), GC-MS continua a ser o padrão-ouro para a análise de amostras de respiração. Desde que a análise por CG-em de amostras de respiração é uma técnica de off-line, está acoplada com métodos de pré-concentração tais como tubos de desorção térmica (TD), microextração de fase sólida e dispositivos de armadilha de agulha. Antes da pré-concentração, amostras de hálito precisam ser armazenados temporariamente em polímero sacos8. Sacos de polímero são populares por causa de seu preço moderado, relativamente boa durabilidade e capacidade de reutilização. Enquanto sacos podem ser reutilizados, tempo e esforço são necessários para garantir a eficiente limpeza7,8. Cada tipo de saco específico também requer procedimentos empiricamente determinados e padronizados para controle de qualidade, reutilização e recuperação.
Tubos de TD são amplamente utilizados para pré-concentração de respiração porque eles capturar um grande número de compostos voláteis e podem ser personalizados. Os materiais absorventes usados para embalar os tubos TD podem ser adaptados para aplicações particulares e voláteis de destino específico de interesse. Tubos de TD substancialmente melhorar a conveniência de estudos de biomarcador de respiração, especialmente em locais de campo remoto, porque TD tubos com segurança loja voláteis de respiração pelo menos duas semanas e são fáceis de transporte3.
Em um esforço para padronizar a coleção de respiração pediátrica para descoberta de biomarker, aqui nós descrevemos um método simples para coletar o hálito de crianças pequenas. Para ilustrar os resultados representativos dos protocolos implementados, dados de identificados são apresentados de uma coorte em curso das crianças (8-17 anos) submetidos à avaliação para doença hepática não-alcoólica de ácido graxo (NAFLD). Os resultados completos e a análise deste estudo serão relatados em uma publicação posterior. Neste trabalho, relatamos um subconjunto de dados que demonstrem a aplicação do nosso protocolo. Em breve, as crianças são instruídas a Expire normalmente através do bocal em um saco de polímero, como se "soprando um balão." O processo é repetido 2 - 4 vezes até 1 L de ar é coletada. A amostra é então transferida para um tubo de TD e armazenada a 5 ° C, antes da análise por GC-MS.
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Protocol
O estudo foi aprovado pelo institucional Review Board da Washington University School of Medicine (#201709030). Foi obtido o consentimento dos pais ou tutores legais antes da inclusão no estudo. Fotografias em Figura 2 reproduzida com o consentimento informado dos pais.
1. montagem de sampler respiração
- Usar luvas descartáveis, anexe um bocal de papelão para o sampler de respiração, como mostrado na Figura 1de suplementar. Anexe um comprimento curto de tubos de grande diâmetro para o outro extremo do amostrador a respiração, como mostrado na Figura suplementar 1. Use a tubulação nova para cada paciente.
- Ligue o conector de respiração para a válvula do saco através da tubulação. Veja a Figura 1 para foto do amostrador de respiração e saco ligado.
- Gire o parafuso recartilhado do lado de ajuste no sentido anti-horário para destravar a válvula de entrada de e empurre a haste da válvula do saco, para abrir a entrada da montagem para amostragem.
- Fechar a válvula aberta, girando o parafuso recartilhado do lado da entrada de ajuste no sentido horário.
- Confirme que a válvula azul no sampler respiração está aberta (em paralelo com o conector).
- Escreva o paciente ID, data e hora no rótulo do saco do polímero.
- Tubo adsorvente de condição TD antes da respiração coleção usando recomendado procedimentos (disponíveis a partir de fabricantes individuais). Cap e armazenar tubos de desorção térmica 4 – 5 ° c antes da coleção de respiração para minimizar artefatos.
2. coleção de respiração
- Realizar uma demonstração de exalação da respiração para a criança usando um amostrador de respiração (sem um saco). Explica à criança que eles devem expirar como eles seriam quando "soprando um balão" e continuar respirando para fora tanto quanto eles podem confortavelmente. Coloque o bocal de papelão entre seus lábios e expire o mais longe puder.
- Fornecer a criança com um novo amostrador de respiração anexado a um saco e pedir-lhes para exalar como a demonstração, conforme ilustrado na Figura 2.
- Feche a válvula azul no dispositivo de amostrador de ar assim que a criança tenha terminado expirando. Reabra a válvula conforme necessário antes de exalações adicionais.
- Repita a etapa 2.2 e 2.3, até pelo menos 1 L de ar tenha sido coletado. Para uma criança saudável pode levar 2 exalações e para um exalações de criança doente ou mais jovem 2 – 4. 1 L de ar é o requisito mínimo de analítico. Observe no rótulo do saco quantas respirações foram coletadas do paciente. Consulte Supplemental Figura 2 para uma foto do saco contendo diferentes volumes de ar.
- Antes de retirar o saco do amostrador de ar, certifique-se de soltar o parafuso recartilhado no lado de entrada do encaixe girando-a no sentido anti-horário e empurre a haste da válvula até fechar o encaixe da entrada. Ver suplementar Figura 3 para a foto do saco a válvula na posição aberta e fechada.
- Feche a válvula do saco fechada girando o parafuso recartilhado do lado da entrada de ajuste no sentido horário.
- Retire o saco do amostrador a respiração.
- Alienar o bocal e pôr de lado o amostrador de ar para limpeza antes da sua utilização com um paciente diferente.
3. transferência hálito para tubos de desorção térmica
- Retire o tubo de TD da geladeira. Remova as tampas de armazenamento a longo prazo do tubo adsorvente, usando a ferramenta de nivelamento/desoperculação tubo fornecido pelo fabricante.
- Fixe a extremidade ranhurada do tubo adsorvente TD saco de recolha utilizando tubos. Note que a orientação do tubo é importante, como TD tubos são projetados para ter o ar flui em uma direção apenas, a partir do final de ranhurados. Observe que a transferência de ar do saco de TD deve ser feita dentro de 1 hora de coleção de respiração.
- Introduza a outra extremidade do tubo TD a tubulação, que é ligada a uma bomba.
- Ligue a bomba e definido para ser executado em 100 mL/min por 10 min.
- Abra a válvula do saco rodando no sentido anti-horário o parafuso recartilhado no lado do encaixe da entrada e empurre a haste da válvula para baixo para abrir o encaixe da entrada. Isso é ilustrado no Supplemental Figura 4, que demonstra a transferência de ar num tubo adsorvente TD usando uma bomba.
- Ligue a bomba, que vai parar após 10min de coleção.
- Remover o tubo adsorvente TD e aperte as tampas em ambas as extremidades, usando a ferramenta de nivelamento/desoperculação tubo. Tampões de armazenamento a longo prazo devem ser firmemente apertados para garantir uma vedação estanque.
- Coloca um adesivo na extremidade de um tampão para indicar que o tubo foi usado. No adesivo, indica a data e número de identificação (ID) do paciente do estudo.
- Colocar o tubo em um pequeno saco de plástico re-selável. Tubo adsorvente de loja 4 e 5 ° c. Pressione o resto da respiração fora do saco e descartar o saco. Gravar o paciente estudo ID, TD tube número de série, dia de coleta, da coleção de respiração, tempo de transferência de respiração e ingestão de alimentos (tempo de ingestão de alimentos antes da coleção de respiração e as refeições consumidas).
4. coleção de ar ambiente
- Colete as amostras de ar ambiente no ambiente do paciente imediatamente após a colheita de respiração.
- Prenda o saco à porta de saída da bomba por meio de tubulação, conforme ilustrado na Figura suplementar 5.
- Empurre a haste da válvula do saco até abrir o encaixe da entrada para a amostragem.
- Trave a válvula aberta, girando no sentido horário o parafuso recartilhado no lado do encaixe da entrada.
- Ligue a bomba e definido para ser executado em 100 mL/min por 12 min. A bomba irá recolher 1.200 mL de ar ambiente.
- Depois que o volume solicitado foram coletado, afrouxe o parafuso recartilhado no lado de entrada do encaixe girando-a no sentido anti-horário e empurre a haste da válvula até fechar o encaixe da entrada.
- Feche a válvula do saco fechada girando no sentido horário o parafuso recartilhado no lado do encaixe da entrada.
- Retire o saco da bomba.
- Siga os mesmos passos como na seção 3. A única diferença é que ar ambiente que COV vai ser transferido, não aqueles de respiração.
5. a amostra e análise de dados
Nota: As condições para análise de amostras de ar e respiração foram descritos anteriormente9.
- Analisar dados coletados e detectar compostos nos cromatogramas. Use programas de software típico para encontrar e identificar todos os compostos detectados pelo instrumento (Figura 3A). Por exemplo, use um recurso de deconvolução para identificar compostos. Filtrar dados usando fator de tamanho de janela de retenção de 80, alturas em massa filtros ≥100 conta, e composto de área absoluta filtro ≥500 conta.
- Use padrões químicos para compostos de identidade em amostras de ar e respiração. Extrair a área do pico íon base de compostos de interesse, tais como isopreno e β-pineno (Figura 4) e comparar os níveis de compostos voláteis em respiração e ar.
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Representative Results
Em nosso estudo, respiração, as amostras foram coletadas de 10 crianças (8-17 anos) passando por avaliação no Hospital de crianças St. Louis. Amostras de hálito e amostras de ar ambiente (n = 10) foram coletadas conforme descrito acima. As amostras foram analisadas utilizando cromatografia gasosa quadrupolo tempo-de-voo espectrometria de massa (GC-MS QToF) e dessorção térmica, como descrito anteriormente9. Após a remoção de contaminantes de fundo, os protocolos implementados renderam uma média de 311 compostos orgânicos voláteis (COV) em cada uma das amostras de ar exalado misto. Em média, significativamente mais VOCs foram encontrados em amostras de hálito comparadas aos controles ambientais/ambiente (311 ± 11,5 versus 190 ± 12,6, p < 0,0001) (Figura 3A). O aumento do número de compostos orgânicos voláteis no hálito, em comparação com o ar ambiente, distinguem-se visivelmente comparando cromatogramas íon total representativa (TICs) (Figura 3B).
Como uma medida de controle de qualidade da coleção de respiração bem sucedida, os níveis de COV de respiração comum dois (isopreno e β-pineno) foram comparados aos controles de ar da sala (Figura 4). Isopreno, um dos COV mais abundantes no ar, é normalmente encontrado em níveis de partes por bilhão (ppb) (131 ppb) enquanto o β-pineno é encontrado em sub-ppb níveis (0,59 ppb)6. Ambos os compostos são bem estabelecidos para ser enriquecido no sopro de adultos saudáveis, em comparação com os baixos níveis presentes em ar ambiente, o qual indica processos fisiológicos normais como fonte primária destes analitos na respiração6. Isopreno (67 m/z) foi encontrado em retenção tempo 2,12 min e β-pineno (m/z 93) foi encontrado na retenção tempo min 14,4. Achamos que a abundância de isopreno foi 10-fold maior em amostras de hálito pediátrica do que em controles de ar do quarto (Figura 4; abundância média ± SEM é 4.2x105 ± 1.0x105 e 3.9x104 ± 0.9x104 para respiração e ar respectivamente, p = 0.0003) e β-pineno exibido 3 vezes maior abundância na respiração do que o ar (± abundância SEM são 3.0x104 ± 1.3x104 e 9.1x103 ± 1.6x103 para respiração e ar, respectivamente, p = 0,007), confirmando a coleção de respiração bem sucedida. Análise completa descritiva das conclusões de biomarcador descoberta deste estudo será relatado em uma futura publicação.
Figura 1: montado respiração sampler e saco para coleta de ar exalado. Amostrador de respiração (com válvula azul aberta, ou seja, em paralelo com o conector conforme indicado pela seta vermelha dupla face) e saco conectada com a tubulação, pronta para coleção de respiração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: criança expirar a respiração em um saco de amostragem de ar. Filho (A) detém amostrador de respiração, exala, e (B) fornece a amostra de ar dentro do saco. Fotografar com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: exalado BreathVolatiles. (A) número de compostos voláteis distintos em cada respiração da amostra de indivíduos pediátricos (n = 10) e controles de ar ambiente (n = 10). Exibido são os meios e o erro padrão da média (SEM). Cromatógrafo de íons Total de (B) (TIC) de amostras representativas de respiração pediátrica versus controle de ar, para visualização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: abundância de dois compostos voláteis do ar exalado. Abundância de isopreno e β-pineno em respiração amostras de indivíduos pediátricos (n = 10) e controles de ar da sala (n = 10). Abundância, quantificada pela área de pico íon base. Quer dizer e SEM são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 1: amostrador de ar. Esquerda: A) montado amostrador de ar: 1) adaptador macho + conector da válvula de esfera 2) duas vias + adaptador masculino 3) Teflon. B) bocal papelão. C) pequenas e tubos de grande diâmetro. Direito: sampler de respiração com bocal e tubos ligados. Clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar Figura 2: volumes de respiração diferente. Acima estão fotos de um saco de recolha preenchidas com diferentes volumes de ar (1 L, 2 L e 2,5 L), como uma representação visual dos volumes de respiração aproximada a ser recolhida. Clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar Figura 3: válvula do saco. Esquerda: haste da válvula é baixo (saco válvula está aberta). Feche a válvula do saco fechada girando no sentido horário o parafuso recartilhado no lado do encaixe da entrada. Está pronto para a coleção de respiração. Direito: é a haste da válvula (válvula de saco é fechada). Clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar Figura 4: transferência de respiração. Esquerda: tubo adsorvente (1) acoplado a uma extremidade do saco usando o tubo de diâmetro pequeno e grande porte e, do outro lado, para a bomba. Direito: fim sulcado de nota no tubo adsorvente; sulcado final aponta para o saco de recolha. Clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar Figura 5: coleção de ar ambiente. Esquerda: bomba com duas portas: entrada e saída. A abertura de saída é anexada ao saco de amostragem. A porta de entrada irá extrair o ar ambiente e transferi-lo para o saco. Direito: sistema de coleta de ar ambiente montado. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Apesar dos progressos consideráveis em pesquisa de fôlego na última década, práticas padronizadas para a amostragem e análise de compostos voláteis de gás de respiração permanecem indefinidos10. A principal razão para essa falta de padronização tem sido a diversidade de métodos de recolha de respiração, que têm impacto direto sobre a diversidade química resultante presente em qualquer amostra de determinado ar exalado. Respiração exhalate contém uma extensa gama de compostos orgânicos voláteis em concentrações altamente variado6. Portanto, mudar os métodos de coleção altera não só a abundância, mas também a diversidade de compostos que podem estar presentes numa determinada amostra.
Amostragem de gás de respiração é surpreendentemente complexa. Enquanto sujeitos só precisam exalar dentro do bocal de um colecionador de respiração ou em recipientes estanques ao gás antes da análise, amostragem de respiração deve considerar e controle para um número de variáveis possíveis. Neste trabalho, detalhamos um protocolo específico, validado para amostragem de gás de respiração em crianças. Anteriormente implementados com êxito este protocolo com febris crianças com 4 anos de idade, em um cenário de campo em um ambiente de recursos limitados (Malawi), demonstrando a viabilidade de nossos gasodutos de recolha e análise de respiração de biomarcador descoberta de9. Posteriormente, temos também implementado e avaliado os nossos protocolos para a coleta de amostras de respiração das crianças sob avaliação em uma clínica moderna subespecialidade pediátrica nos Estados Unidos. Nossos resultados sugerem que para descoberta de biomarcadores de respiração pediátrica, a coleção de ar misturado é fundamental, pois proporciona um verdadeiro "breathprint" de um determinado indivíduo. Além disso, a respiração expiratória mista é também o tipo mais simples de respiração que pode ser obtido, porque todas as fases do ar expirado (boca e nasal) são adquiridos3.
No campo, e especialmente quando os assuntos são agudamente doentes, pode ser difícil de controlar para confundidores comuns tais como a dieta, a temperatura do corpo, e/ou o uso de fragrância ou cremes por um determinado assunto. Estes fatores podem ter um profundo impacto sobre os níveis de respiração e a qualidade. Por este motivo, recomendamos que os investigadores não apenas registrar o tempo de respiração recolha e transferência para tubos de adsorvente, mas observe também fatores específicos do paciente adicionais tais como a dieta (por exemplo, 24 horas alimentar Lembre-se), uso de bochechos e uso de medicação, a fim de Avalie especificamente para os efeitos destes potenciais confundidores durante a descoberta de biomarker e análises a jusante.
Compostos de inalação do ar ambiente também podem influenciar a composição do ar exalado, que pode representar um desafio para os esforços de descoberta de biomarcador de respiração. Portanto, análise e coleta de ar ambiente é um controle crítico, produzindo importantes visões sobre a origem de voláteis do ar exalado. Por exemplo, perfis voláteis de ar ambiente tem sido usados para estabelecer se um determinado respiração volátil está em maior ou menor abundância em respiração comparada ao redor de ar11. Um composto de respiração especial é considerado para ser derivado de dentro do corpo (por exemplo, de origem endógena), se a concentração é maior no ar do que no ar ambiente, enquanto reduzida concentração na respiração indica que o composto foi derivado do ambiente (por exemplo, de origem exógena). Comparando a abundância voláteis no hálito contra ar ambiente também serve como um controle positivo importante para se a coleção de respiração é adequada. Como demonstrado em nossos dados representativos (Figura 4), o isopreno composto voláteis é de origem endógena e devem estar presente em amostras de ar em concentrações > 10 vezes o de ambiente de ar6.
Para descoberta de biomarker, perfis voláteis de indivíduos com condições de interesse devem ser comparados aos indivíduos controle saudável correspondente, tal que os padrões podem ser identificados usando técnicas estatísticas como aprendizagem de máquina e multivariada análises de12. O método de coleta de respiração descrito aqui pode ser aplicado a uma ampla gama de estados patológicos; a única exigência é que a criança é capaz de cooperar com respiração amostragem voluntariamente. Porque o teste de respiração é não-invasivo, facilmente repetidas e intimamente reflete as concentrações arteriais de substâncias biológicas, prende grande promessa para implementação em point-of-care testes para uso clínico.
Futuro trabalho incidirá sobre o desenvolvimento de novos métodos para coleta de respiração em lactentes jovens e crianças (< 4 anos de idade), que são mentalmente incapazes de exalar no comando.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Expressamos a nossa gratidão para as crianças e famílias de St. Louis Hospital das crianças que participaram neste estudo. Reconhecemos os esforços exclusivos da Sra. Stacy Postma e Sra. Janet Sokolich durante a coleta de respiração. Este trabalho é apoiado pela Fundação de Hospital de crianças St. Louis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
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