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Neuroscience

एक मानव रक्त मस्तिष्क इंटरफेस मॉडल रोगजनकों या दवाओं और मस्तिष्क के साथ उनकी बातचीत द्वारा बैरियर क्रॉसिंग का अध्ययन करने के लिए

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59220
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 3, 1
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम एक cellulo bbb (रक्त मस्तिष्क बाधा) में एक की स्थापना का वर्णन प्रोटोकॉल वर्तमान-minibrain पॉलिएस्टर झरवाला झिल्ली संस्कृति डालने प्रणाली आदेश में जैव अणुओं या एक मानव bbb भर में संक्रामक एजेंटों के परिवहन का मूल्यांकन करने के लिए और उनके पड़ोसी मस्तिष्क कोशिकाओं पर शारीरिक प्रभाव ।

Abstract

एक प्रासंगिक और cellulo bbb मॉडल में उनकी पैठ और बाधा और मस्तिष्क पैरेन्काइमा के साथ उनकी बातचीत के लिए एक उचित और विश्वसनीय पर तंत्रिका तंत्र दवाओं की जल्दी स्क्रीनिंग अभी भी एक अपूरित की जरूरत है । इस अंतर को भरने के लिए, हम cellulo मॉडल में एक 2D डिजाइन, BBB-Minibrain, एक पॉलिएस्टर झरनी झिल्ली संस्कृति एक त्रिकोणीय मानव मस्तिष्क कोशिकाओं (ंयूरॉंस, astrocytes और microglial कोशिकाओं की संस्कृति द्वारा गठित Minibrain के साथ मानव BBB मॉडल डालने के संयोजन के द्वारा) । Bbb-minibrain हमें एक न्यूरोप्रोटेक्टिव दवा उंमीदवार (जैसे, neurovita) के परिवहन का परीक्षण करने की अनुमति दी, bbb के माध्यम से, न्यूरॉन्स के लिए इस अणु के विशिष्ट लक्ष्यीकरण निर्धारित करने के लिए और दिखाने के लिए कि दवा की न्यूरोप्रोटेक्टिव संपत्ति के बाद संरक्षित किया गया था दवा बीबीबी को पार कर गई थी । हम यह भी दिखा दिया है कि BBB-Minibrain एक दिलचस्प मॉडल endothelial कोशिकाओं बाधा भर में वायरस के कणों के पारित होने का पता लगाने और न्यूरोइनवेसिव वायरस कणों द्वारा Minibrain के संक्रमण की निगरानी करने के लिए गठन किया है । BBB-Minibrain एक विश्वसनीय प्रणाली, सेल संस्कृति प्रौद्योगिकी और उपचार या अपमान के बाद मस्तिष्क कोशिकाओं phenotypes के भविष्य कहनेवाला में प्रशिक्षित शोधकर्ता के लिए संभालना आसान है । इस तरह के cellulo परीक्षण में ब्याज twofold होगा: एक हाथ पर दवा के विकास में जल्दी कदम derisking शुरू करने और दूसरी ओर पशु परीक्षण के उपयोग को कम करने ।

Introduction

मस्तिष्क एक गैर पारगम्य संरचना है कि मस्तिष्क पैरेन्काइमा और रक्त, रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) कहा जाता है के बीच आदान प्रदान प्रतिबंधित द्वारा प्रणालीगत संचलन से अलग है । ज्यादातर मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं से बना है, BBB गतिशील astrocytes, परिसंवहनी microglia और पड़ोसी मस्तिष्क पैरेन्काइमा के ंयूरॉंस के साथ सूचना का आदान प्रदान । Bbb के तीन प्रमुख कार्यों के निर्माण और न्यूरोनल कार्यों के लिए आयनिक homeostasis के रखरखाव, पोषक तत्वों के साथ मस्तिष्क की आपूर्ति कर रहे हैं, और विषाक्त चोटों या रोगजनकों1,2के प्रवेश से सुरक्षा, जो योगदान करने के लिए मस्तिष्क होमियोस्टैसिस और उसके कार्यों के रखरखाव3। इस बाधा इतना कुशल है कि केवल कुछ दवाओं bbb4,5को पार कर सकते हैं । वर्तमान में, उपलब्ध तरीकों की भविष्यवाणी करने के लिए कि क्या एक अणु BBB पास होगा और मस्तिष्क में फैलाना पूर्व vivo अध्ययन से मिलकर बनता है ऑटोप्सी सामग्री, एमआरआई द्वारा मानव स्वयंसेवकों के मस्तिष्क में छवि ट्रैकिंग (चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग) या पीईटी (positon उत्सर्जन tomography) या फार्माकोडाइनेमिक्स और पशुओं में फार्माकोकाइनेटिक पूर्व नैदानिक अध्ययन6,7,8. इन तकनीकों और मॉडलों जैसे पीईटी के सीमित संकल्प और एमआरआई6,8की कम संवेदनशीलता के रूप में कुछ सीमाएं हैं, कठिनाई अणुओं यों तो करने के लिए (यानी, उदाहरण के लिए एंटीबॉडी आधारित अणुओं) कि खराब 7मस्तिष्क घुसना, और पूर्व नैदानिक अध्ययन उनके उच्च लागत और पशु परीक्षण के रिसॉर्ट के लिए ।

अंतिम बिंदु महत्वपूर्ण है क्योंकि, है 3R's नियमों के अनुसार, (प्रतिस्थापन, कमी और शोधन के पशु परीक्षण) विनियामक प्रशासन कहा है कि शोधकर्ताओं ने तुरंत वैज्ञानिक पशु के लिए सही विकल्प विकसित प्रयोग9,10,11,12,13,14,15.

पिछले दशकों में, bbb के विट्रो मॉडलों में कई का प्रस्ताव किया गया है16,17,18 फिल्टर झिल्ली पर खेती द्वारा ऐसी माउस, चूहा, गोजातीय और सुअर के रूप में विभिंन प्रजातियों से endothelial कोशिकाओं को संमिलित करता है । जहां तक मानव प्रजाति का संबंध है, प्राथमिक कोशिकाओं की दुर्लभ और कठिन उपलब्धता ने शोधकर्ताओं को मानव मॉडल को अमर मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं या मानव व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के आधार पर विकसित करने के लिए प्रेरित किया19,20, 21. इन बाधाओं के विट्रो में उचित bbb के surrogates है बशर्ते कि वे endothelial सेल मार्करों, तंग जंक्शन मार्करों, बहि: स्राव ट्रांसपोर्टरों, घुला वाहक, रिसेप्टर्स, और endothelial उत्तेजनाओं 20का जवाब व्यक्त करते हैं । कुछ bbb मॉडल endothelial कोशिकाओं और अंय सेल प्रकार (यानी, astrocytes, ंयूरॉंस या pericytes22,23,24) के साथ लेपित फिल्टर झिल्ली आवेषण का उपयोग कर रहे थे assayed । इन सह संस्कृतियों का लक्ष्य astrocytes/ंयूरॉंस या pericytes द्वारा घुलनशील कारकों के स्राव का लाभ लेने के द्वारा BBB शारीरिक विशेषताओं को बढ़ाने के लिए किया गया था ।

फिर भी, इन मॉडलों में से कोई भी शामिल है मस्तिष्क पैरेन्काइमा का अध्ययन करने के लिए और एक दवा उंमीदवार के भाग्य की भविष्यवाणी एक बार यह बाधा पारित कर दिया है । इसलिए, हमारे लक्ष्य के लिए एक एक किट में एक BBB मॉडल और मिश्रित मस्तिष्क कोशिकाओं की एक संस्कृति के संयोजन से cellulo रक्त/मस्तिष्क अंतरफलक, BBB-Minibrain में एक का निर्माण किया गया था । BBB-Minibrain एक संस्कृति एक multiwell सेल संस्कृति प्लेट की एक अच्छी तरह से डाला फिल्टर से मिलकर प्रणाली का उपयोग करता है । फिल्टर hcmec/D3 कोशिकाओं, एक मानव मस्तिष्क endothelial कोशिका लाइन है कि bbb दवा परीक्षण25,26,27के लिए अत्यधिक विश्वसनीय साबित कर दिया गया है के साथ लेपित है, bbb के रूप में । मिनिब्रेन, जो मानव ंयूरॉंस और astrocytes की एक सह-विभेदित संस्कृति ntera/ब्स2. D1 सेल लाइन28,29 के साथ मिश्रित मानव माइक्रोग्लाइकल सेल लाइन के साथ मिला है chme/Cl530 के अनुरूप अनुपात में माइक्रोग्लिया बनाम ंयूरून-31मस्तिष्क के astrocytes अनुपात, थाली के तल में अच्छी तरह से खेती की जाती है ।

BBB भर में दवाओं के पारित होने के अलावा और उनके भाग्य में पैरेन्काइमा, रक्त मस्तिष्क अंतरफलक cellulo मॉडल में मस्तिष्क में रोगजनकों के प्रवेश का पता करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है (neuroinvasiveness), मस्तिष्क में फैलाव (neurotropism) और विषाक्तता (neurovirulence) वे मस्तिष्क पैरेन्काइमा कोशिकाओं पर डालती कर सकते हैं । Neurovirulence और neurovirulence अध्ययन cellulo मॉडल में एक कुशल के विकास से लाभ और पशु मॉडल की जगह लाभप्रद होगा । Bbb-minibrain किट३२का उपयोग कर, हम दुर्लभ वायरल म्यूटेंट कि पीले बुखार वायरस (यानी, fnv-yfv३३,३४) के फ्रेंच न्यूरोट्रॉपिक वायरस तनाव में जमा की neuroinvasive phenotype का प्रदर्शन एक तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया बंद रहते yfv वैक्सीन और एक neuroregenerative और न्यूरोप्रोटेक्टिव biomolecule बुलाया neurovita के पारित होने (NV के रूप में पांडुलिपि में अब से कहा जाता है)३५। क्योंकि NV न तो स्वाभाविक रूप से कोशिका झिल्ली को पार करता है और न ही BBB, NV एक एकल श्रृंखला Llama कि BBB और एक कोशिका मर्मज्ञ अणु (सीपीएम)३६के रूप में कार्य सहित जैविक झिल्ली को पार की एंटीबॉडी के चर भाग (vhh) के साथ जुड़े हुए थे । Vhh के सीपीएम संपत्ति समविभव बिंदु और vhh३७की लंबाई पर निर्भर लगता है ।

यह cellulo परीक्षण में यह संभव है कि अणुओं को बाहर ले जाने से पहले संभावित BBB को पार कर सकता है, और एक ही समय में आदर्श के लिए अपने व्यवहार की भविष्यवाणी करने में सक्षम होने के लिए कर सकते है पैरेन्काइमा. इस प्रणाली को जैविक रूप से प्रासंगिक है और आसानी से स्थापित और सेल संस्कृति26,29,30,३८में प्रशिक्षित पेशेवरों द्वारा संभाल आसान है । ऐसे cellulo परीक्षण में ब्याज दो गुना होगा: एक हाथ पर पूर्व नैदानिक परीक्षणों की लागत को कम करने और दूसरी ओर पशु परीक्षण के उपयोग को कम करने ।

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Protocol

1. Ntera के सेल संस्कृति काम/ब्स2 । डी 1 के बाद मिटिक hNeurons और hAstrocytes के एक सह संस्कृति तैयार करने के लिए (NT2-N/

नोट: यह Minibrain के घटक है (चित्रा 1).

  1. Ntera/ब्स2. D1
    1. तरल नाइट्रोजन टैंक से जमे हुए कोशिकाओं की एक शीशी निकालें । बर्फ पर रखें ।
    2. एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में तेजी से कोशिकाओं गल ।
    3. एक 15 मिलीलीटर पूर्ण DMEM F12 मध्यम के 10 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण (Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम: पोषक तत्व मिश्रण F-12 मध्यम) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, 2 मिमी ग्लूटामाइन, १०० IU पेनिसिलिन और १०० μg स्ट्रेप्टोमाइसिन (यानी, पूरा DMEM F12 मध्यम) ।
    4. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए २०० x g पर सेंट्रीफ्यूज । पूर्ण DMEM F12 माध्यम के 2 मिलीलीटर में गोली को अलग करना ।
    5. एक T75 ऊतक संस्कृति कुप्पी में polystyrene में विशेष उपचार के साथ संवेदनशील आसंन कोशिकाओं (T75Cell+) पूरा dmem F12 माध्यम के 13 मिलीलीटर युक्त स्थानांतरण ।
    6. एक मशीन में संस्कृति कोशिकाओं ३७ डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा, 5% सह2 और ९५% नमी तक ९०% संगम (यानी, लगभग 5 दिन) । मध्यम हर 2-3 दिन में बदलें ।
  2. Ntera/ब्स2. D1 और प्रवर्धन Subculturing
    1. कुप्पी से मध्यम निकालें ।
    2. सेल monolayer फॉस्फेट बफर खारा (PBS) के 10 मिलीलीटर के साथ Ca2 + और मिलीग्राम2 +के साथ पूरक कुल्ला ।
    3. EDTA समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ सेल monolayer कुल्ला (आरटी में रखा) ।
    4. Trypsin के 3 मिलीलीटर जोड़ें-EDTA समाधान (०.०५% trypsin, ०.०२% EDTA) और आर टी पर 2 मिनट सेते ।
    5. कुप्पी हिला और सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं प्लास्टिक की सतह से अलग कर रहे हैं ।
    6. Trypsin को निष्क्रिय करने के लिए पूर्ण DMEM F12 माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज २०० x जी पर RT.
    7. पूर्ण माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ गोली को अलग करना और एक मिलीलीटर पूरा dmem F12 माध्यम के 14 मिलीलीटर युक्त प्रत्येक नए फ्लास्क संरोपण करने के लिए 1 एमएल का उपयोग करें ।
      नोट: तीस T75 सेल+ बोतल प्रत्येक भेदभाव के लिए आवश्यक हैं ।
    8. ३७ डिग्री सेल्सियस पर बोतल है, 5% सह2 और ९५% नमी तक ९०% संगम ।
  3. NTera/ब्स2. D1 के मानव ंयूरॉन-astrocyte सह संस्कृति में भेदभाव
    नोट: यह Minibrain का मुख्य घटक है ।
    1. 0 दिन में, trypsin के साथ कोशिकाओं को अलग करना-edta कदम १.२ में वर्णित के रूप में और पूरा dmem F12 माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक कुप्पी के सेल गोली अलग करना ।
    2. सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें (5 x 106 कोशिकाओं को इसी) ८५ मिमी व्यास के ६० प्लास्टिक पेट्री व्यंजन में पूरा Dmem F12 मध्यम के 11 मिलीलीटर युक्त ।
      नोट: कोशिकाओं प्लास्टिक के लिए संलग्न नहीं है और छद्म neurospheres बनाने के लिए कुल होगा ( चित्रा 1के निचले पैनल में तस्वीर देखें) । ३७ डिग्री सेल्सियस पर ६० पेट्री व्यंजन, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता एक दिन के लिए इनसेबेट करें ।
    3. 1 दिन में, पूरा DMEM F12 मध्यम के 1 मिलीलीटर सभी ट्रांस Retinoic एसिड (ATRA) प्रति पेट्री डिश (अंतिम एकाग्रता अतरा 10 μM) के १३० μM के साथ पूरक और ३७ डिग्री सेल्सियस पर व्यंजन वापस, 5% सह2 और ९५% नमी 24 एच के लिए जोड़ें ।
    4. 2 दिन में, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब और ५० x जी और आरटी में 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज में प्रत्येक पेट्री डिश के सेल क्षेत्रों से युक्त मध्यम बहुत सावधानी से स्थानांतरण । वियोजित करना ध्यान से ढीला गोली के साथ 13 मिलीलीटर पूरा Dmem F12 मध्यम 10 ΜM ATRA के साथ पूरक और गु जोड़ें एक नया ८५ मिमी व्यास पेट्री डिश में ई 13 एमएल ।
      नोट: अलग मार्ग पर, यह अत्यंत के रूप में उच्च के रूप में 2 दिन (यानी, ७०% की सघनता के आसपास) में प्राप्त घनत्व के रूप में क्षेत्रों घनत्व बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । इसलिए, यदि गोले का घनत्व कम हो रहा है, तो कोशिकाओं की संख्या के अनुसार पेट्री व्यंजन की कुल संख्या कम हो जाती है ।
    5. ऊपर की प्रक्रिया को दोहराएं (चरण 1.3.4) 4, 6 और 8 दिनों में ।
    6. 10 दिन में, ऊपर की प्रक्रिया को दोहराने लेकिन T75 सेल के लिए क्षेत्रों को जोड़ने+ पेट्री व्यंजन के बजाय बोतल है । एक पेट्री डिश से एक T75 सेल+ flask करने के लिए कोशिकाओं को जोड़ें ।
    7. दिन में 11, 13, 15 और 17, पूरा DMEM के 14 मिलीलीटर के साथ इस्तेमाल किया मध्यम बदलें F12 पूरक 10 μM ATRA के साथ ।
    8. 19 दिन में, पूर्ण DMEM F12 माध्यम के 14 मिलीलीटर के साथ परिवर्तन मध्यम अतरा प्रति फ्लास्क के बिना ।
    9. 20 दिन में, धीरे से ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं को अलग करना/
      1. प्रत्येक T75 सेल+ Flask के लिए, Ca2 + और मिलीग्राम2 +के साथ पूरक pbs के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला; आरटी में 5 मिनट के लिए EDTA के 4 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेटे ।
      2. सावधानी edta निकालें और trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें-edta और 7 मिनट के लिए आर टी पर. शेक बहुत धीरे कुप्पी और ध्यान से पूरा dmem F12 मध्यम के 8 मिलीलीटर जोड़ें ।
      3. 10 सेंट्रीफ्यूज १६० पर मिनट के लिए एक्स जी और आरटी. को पूरा Dmem F12 मध्यम और एक T75 सेल+ flask में हस्तांतरण के 13 मिलीलीटर में सेल गोली को अलग करना ।
        नोट: trypsin के साथ बहुत कोमल वियोजन-edta मूल teratocarcinoma कोशिकाओं, जो दृढ़ता से प्लास्टिक के बर्तन से जुड़ी है से अतरा विभेदित कोशिकाओं को ठीक करने की अनुमति देगा ।
    10. 21 दिन में, मध्यम और मृत कोशिकाओं को हटा दें । 5% FBS, 2 मिमी glutamine, १०० IU पेनिसिलिन, १०० μg streptomycin और AraC के ०.५ μM (Cytosine β-D-अरेबिनोफोरिनोसाइड) (पूरा 5% FBS DMEM F12-AraC) के साथ पूरक पूरा DMEM F12 मध्यम के 14 मिलीलीटर जोड़ें ।
    11. दिन में 23, 25 और 28, की जगह इस्तेमाल किया मध्यम के साथ 14 एमएल 5% FBS DMEM F12-AraC.
    12. दिन में 29 अप करने के लिए ४९ (हर दो दिन), 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी ग्लूटामाइन, १०० IU पेनिसिलिन, १०० μg स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 μM फुडृ (5-फ्लुओरो-2' डीऑक्सीयूरिडीन) और 10 μM Urd (यूरिडीन) के साथ पूरक पूरा DMEM F12 मध्यम के साथ इस्तेमाल किया मध्यम बदलें (पूरा 5 FBS DMEM F12-फुडृ-Urd).
    13. दिन ५० में, पूरा DMEM F12 मध्यम 5% FBS, 2 मिमी glutamine, १०० IU पेनिसिलिन, १०० μg streptomycin और 10 μM Urd (पूरा 5% FBS DMEM F12-Urd) के साथ पूरक के 14 मिलीलीटर के साथ इस्तेमाल किया बदलें ।
    14. दिनों में ५१ अप करने के लिए ९५ (सप्ताह में दो बार), 14 मिलीलीटर पूरा 5% FBS DMEM F12 के साथ उपयोग किया-Urd बदलें ।
      नोट: कक्ष प्रयोग के लिए दिन ५१ से नहीं बल्कि बाद में दिन ९५ से उपयोग किया जा सकता है । बँटवारा निरोधक के साथ धारावाहिक उपचार के उपयोग के बाद के सह संस्कृति की शुद्ध जनसंख्या उबरने की अनुमति देता है-मिटोटिक hNeuron और hAstrocytes (NT2-N/
    15. कोशिकाओं को बीज करने के लिए, 20 दिन के लिए वर्णित के रूप में कोमल trypsinization के साथ आगे बढ़ें ।

2. कोशिका संस्कृति मानव माइक्रोग्लाइफियल कोशिकाओं के काम CHME/Cl5

नोट: यह Minibrain के microglial घटक है (चित्रा 1).

  1. मानव माइक्रोग्लाइकल कोशिकाओं को Culturing/Cl5
    1. तरल नाइट्रोजन टैंक से जमे हुए कोशिकाओं की एक शीशी निकालें । बर्फ पर रखें ।
    2. एक ३७ ° c पानी स्नान में तेजी से गल ।
    3. एक 15 मिलीलीटर पूर्ण DMEM F12 मध्यम 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी glutamine, १०० IU पेनिसिलिन और १०० μg streptomycin (यानी, पूरा 5% FBS DMEM F12 माध्यम) के साथ पूरक के 10 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में कोशिकाओं का स्थानांतरण ।
    4. आर टी में 5 मिनट के लिए २०० x g पर सेंट्रीफ्यूज पूर्ण 5% FBS Dmem F12 माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ गोली Dissociate ।
    5. पूर्ण 5% fbs dmem F12 माध्यम के 13 मिलीलीटर युक्त एक T75 सेल+ कुप्पी में स्थानांतरण ।
    6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता ९०% संगम तक । मध्यम हर 2-3 दिन में बदलें ।
  2. मानव microglial कोशिकाओं को Subculturing चमे/Cl5
    1. Flask से मध्यम निकालें ।
    2. सेल monolayer PBS के 10 मिलीलीटर के साथ Ca2 + और मिलीग्राम2 +के साथ पूरक कुल्ला ।
    3. EDTA समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ सेल monolayer कुल्ला (आरटी में रखा) ।
    4. Trypsin के 3 मिलीलीटर जोड़ें-EDTA समाधान और 2 मिनट के लिए आर टी पर सेते ।
    5. कुप्पी हिला और सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं प्लास्टिक की सतह से अलग कर रहे हैं ।
    6. पूर्ण 5% FBS के 10 मिलीलीटर जोड़ें DMEM F12 मध्यम trypsin को निष्क्रिय करने के लिए, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज २०० एक्स जी और आरटी में ।
    7. पूर्ण माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ गोली को अलग करना और 1 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए प्रत्येक नए फ्लास्क पूर्ण 5% fbs dmem F12 मध्यम के 14 मिलीलीटर युक्त संरोपण ।
    8. ३७ डिग्री सेल्सियस पर बोतल है, 5% सह2 और ९५% नमी तक ९०% संगम ।

3. hCMEC के साथ संस्कृति काम/कोट झरझू संमिलित करता है और BBB तैयार

  1. मानव endothelial कोशिकाओं की Culturing hCMEC/डी 3 (चित्रा 2)
    1. पतला प्रकार मैं शुद्ध बाँझ पानी (सेल संस्कृति ग्रेड) के साथ 1:30 के लिए कोलाजेन चूहा ।
    2. एक T75 सेल में 10 मिलीलीटर स्थानांतरण+ कुप्पी और एक ३७ डिग्री सेल्सियस में 2 एच, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता इनसेबटर ।
    3. कोलेजन समाधान निकालें और यह endothelial सेल मध्यम के 10 मिमी के साथ पूरक के 15 मिलीलीटर के साथ की जगह (पूरा endothelial कोशिका माध्यम के रूप में संदर्भित) ।
    4. तरल नाइट्रोजन टैंक से कोशिकाओं के एक क्रायो शीशी निकालें । बर्फ पर रखें ।
      नोट: कोशिकाओं को बड़े हो गए थे, और एक बीज बहुत निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में किया गया था । सेल लाइन एक जैविक सामग्री हस्तांतरण समझौते के द्वारा कवर किया जाता है । यह कोशिकाएं गद्यांश संख्या 25 पर प्राप्त की जाती हैं और इन्हें ३५ से आगे उपयोग नहीं किया जाना चाहिए ।
    5. एक ३७ ° c पानी स्नान में तेजी से गल ।
    6. T75 सेल+ कुप्पी में कोशिकाओं को हस्तांतरण और 2 से 4 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता पर कुप्पी वापस ।
    7. कक्षों को खोए या निकालने के बिना मध्यम को सावधानीपूर्वक निकालें । कोशिकाओं को पूरा endothelial सेल मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ एक बार कुल्ला ।
    8. पूर्ण endothelial सेल मध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़ें ।
    9. ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता जब तक १००% संगम (नहीं से कम 4 दिन) माध्यम बदलने के बिना ।
  2. BBB का संमिलन तैयार करने के लिए hCMEC/D3 को घटाना
    1. कोट एक नया T75 सेल+ कुप्पी या प्रकार मैं चूहा कोलेजन के रूप में ऊपर वर्णित (कदम ३.१) के साथ संमिलित करता है ।
    2. कुप्पी से मध्यम निकालें । सेल monolayer PBS के 10 मिलीलीटर के साथ Ca2 + और मिलीग्राम2 +के साथ पूरक कुल्ला ।
    3. Trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें-EDTA समाधान और 5 मिनट ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    4. कुप्पी हिला और सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को पूरी तरह से प्लास्टिक की सतह से अलग कर रहे हैं ।
    5. Trypsin को निष्क्रिय करने के लिए पूरा endothelial सेल माध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें ।
    6. एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक पिपेट के साथ, यंत्रवत् एस्प्राएटिंग और निस्तब्धता सेल निलंबन से कोशिकाओं को अलग करना है, जबकि 5 मिलीलीटर पिपेट कुप्पी के नीचे करने के लिए ंयूनतम 5 बार बनाए रखने ।
    7. कक्षों की गणना करें और एक 12 अच्छी तरह से पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति सम्मिलित करता है और एक T75 सेल+ flask के लिए 2 x 106 कोशिकाओं डालने के लिए 5 x 104 कोशिकाओं/ भी पीईLy के लिए कोशिकाओं के बिना तीन फिल्टर तैयार (यानी, endothelial कोशिकाओं Lucifer पीला पैराग्राफ ४.२ के नीचे देखने के लिए पारगम्यता) पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति आवेषण के साथ प्रयोगों ।
    8. ३७ डिग्री सेल्सियस पर बोतल है या सम्मिलित करता है, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता जब तक १००% संगम ।
    9. एक नया पारित होने तक T75 सेल+ फ्लास्क के लिए मध्यम परिवर्तन न करें । पर BBB के लिए इसके विपरीत पर पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति आवेषण: 2 और 4 दिनों में मध्यम बदलें, 6 दिन में प्रयोगों के लिए BBB का उपयोग करें ।

4. निर्माण और BBB के गुणवत्ता नियंत्रण-Minibrain (चित्रा 2)

  1. एक BBB-Minibrain पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति डालने डिवाइस की स्थापना (चित्रा 2B)
    1. 12 अच्छी तरह से पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति पर hCMEC/D3 कोशिकाओं को विकसित करने के प्रयोग के लिए उन्हें उपयोग करने से पहले endothelial सेल माध्यम पर 6 दिनों के लिए फिल्टर डालें ।
    2. कोट एक 12 अच्छी तरह से पाली के साथ थाली डी-lysine (1 मिलीलीटर/ठीक है, 10 μg/मिलीलीटर, आरटी में 4 एच) और फिर laminin (1 मिलीलीटर/ठीक है, 1 μg/एमएल, आरटी में रातोंरात) ।
    3. Laminin निकालें और endothelial सेल मध्यम 5% FBS (5% endothelial सेल मध्यम) के साथ पूरक के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए सेते, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता ।
    5. धीरे NT2-N/(के रूप में 1.3.9 कदम में वर्णित) और CHME/Cl5 (के रूप में कदम २.२ में वर्णित) और पूर्ण endothelial कोशिका माध्यम के साथ सेल छर्रों को अलग करना ।
    6. कक्षों की गणना करें, मिश्रण ३.६ x 105 NT2-N/A और ०.४ x 105 chme/Cl5 कोशिकाओं/अच्छी तरह से और 12 कूप थाली बीज ।
    7. T पर = 24 h (बोने के बाद 24 h): ताजा पूरा endothelial सेल मध्यम (Minibrain कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं) के साथ इस्तेमाल किया मध्यम बदलें और Minibrain कोशिकाओं के शीर्ष पर hCMEC/D3 पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति डालने फिल्टर हस्तांतरण । ३७ डिग्री सेल्सियस पर BBB-Minibrain, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता इनसेबेट ।
      ध्यान दें: BBB-Minibrain तो के एक परत से मिलकर बना होगा मानव endothelial कोशिकाओं hCMEC/D3 के एक मिश्रित संस्कृति के लुमिनल डिब्बे (या "रक्त" डिब्बे) और मानव कोशिकाओं hNT2-N/A और hCHME/Cl5 के तल पर (Minibrain) की एक मिली-अच्छी तरह से परिभाषित abluminal डिब्बे (या "मस्तिष्क" डिब्बे) (चित्रा 2B) ।
  2. BBB के endothelial पारगम्यता का सत्यापन-Minibrain (गुणवत्ता नियंत्रण) (चित्र 2c)
    1. परिवहन बफर (टीबी) है, जो HBSS (हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान) बफर Ca 2 के साथ तैयार+ और मिलीग्राम2 + 10 मिमी hepes और 1 मिमी सोडियम pyruvate के साथ पूरक ।
    2. अच्छी तरह से प्रति परिवहन बफर के १.५ मिलीलीटर के साथ 12 अच्छी तरह से प्लेट्स तैयार करें ।
    3. T = 0 पर, ताजा परिवहन बफर ५० μM लूसिफ़ेर पीला (LY-टीबी) के साथ पूरक बनाते हैं ।
    4. Endothelial सेल बाधा को प्रभावित किए बिना ध्यान से मध्यम हटाने के लिए उल्टा प्रत्येक फिल्टर रिवर्स ।
    5. भरे 12 वेल प्लेट पर फिल्टर लगाएं और इसमें ०.५ मिलीलीटर की LY-TB डालें ।
    6. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता में इनसेबटर करें ।
    7. पर टी = 10 मिनट नई टीबी भर 12 अच्छी तरह से प्लेट पर फिल्टर हस्तांतरण और आयुध डिपो पढ़ने के लिए पहली थाली के abluminal डिब्बे रखने के लिए ।
    8. T = 25 मिनट पर, चरण 4.2.7 दोहराएं ।
    9. टी = ४५ मिनट पर, प्लेटों से फिल्टर हटा कर परिवहन बंद करो । आयुध डिपो के उपायों के लिए एबल्यूमिनल और ल्युमिनल कंपार्टमेंट रखें ।
    10. एक अंधेरे में स्थानांतरण ९६ अच्छी तरह से नमूने प्लेटें: 10 μL के लिए १९० μL टीबी LY-टीबी और luminal डिब्बों, abluminal डिब्बों के लिए नमूना के २०० μL.
    11. विभिन्न नमूनों में विद्यमान LY-टीबी के प्रतिदीप्ति को क्रमश λ ४२८ दउ λ ५३५ दउ (उत्तेजन और उत्सर्जन लंबाई तरंगों) में मापना ।
    12. Siflinger के अनुसार-टीबी (पीईly) की ओर endothelial पारगम्यता (पीई) की गणना-Birnboim, एक एट अल (१९८७)३९ और डीए कोस्टा, एक एट अल. (२०१८)३४ सूत्र का उपयोग करके:
      1/PSe = (1/PSt) – (1/पीएसएफ) और पीईLY= pse/
      नोट: PSf कोशिकाओं के बिना फिल्टर की पारगम्यता है, पीएसटी कोशिकाओं के साथ फिल्टर की पारगम्यता है, सार्वजनिक उपक्रम endothelial मोनोलेयर समय monolayer की सतह की पारगम्यता है, एस monolayer की सतह है (एक 12 अच्छी तरह से फिल्टर के लिए = 1.12 cm2 ), पीईLY में व्यक्त किया है cm/ HCMEC/D3 के लिए पीईLY प्रयोगों में इस्तेमाल किया fbs के मुख्य आधार पर ०.७ और १.२ x 10-3 सेमी/मिनट के बीच होना चाहिए । महत्वपूर्ण: एक पीईLY १.२ से अधिक का मतलब है कि bbb काफी तंग नहीं है और कुछ रिसाव मनाया जा सकता है । इन अवरोधों को त्यागें ।

5. BBB-Minibrain का उपयोग एक पीले बुखार वायरस वैक्सीन के नमूने में न्यूरो इनवेसिव वायरल कणों की उपस्थिति को उजागर करने के लिए, फ्रांसीसी न्यूरोट्रॉपिक वायरस, YFV-FNV ३४ (चित्रा 3)

  1. BBB पार और Minibrain में पीले बुखार वायरस के गुणा
    1. BBB-Minibrain वायरस के अलावा से पहले कदम 4.1.7 24 एच में वर्णित के रूप में तैयार का प्रयोग करें; 2% FBS endothelial सेल माध्यम से मध्यम बदलें ।
      नोट: वायरस को जोड़ने से पहले मीडियम को बदलने से बचने के लिए बेहद जरूरी है । मध्यम बदलने के मानव endothelial कोशिकाओं को सक्रिय करने और सकर्मतापूर्वक बाधा है जो वायरस के पारित होने की अनुमति देगा खुला कर सकते हैं । यहां मध्यम प्रयोग शुरू करने से पहले 24 h बदल जाता है ।
    2. टी = 0 पर, जोड़ें ३५०० पट्टिका बनाने इकाइयों (PFU) YFV-FNV के ५० μL में 2% FBS endothelial सेल मध्यम बहुत ध्यान से luminal डिब्बे के शीर्ष पर पतला । नियंत्रण BBB-Minibrain वायरस के बिना 2% FBS endothelial सेल माध्यम के ५० μL के साथ inoculated है । साथी पर पीईLY अच्छी तरह से निर्धारित करें ।
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में BBB-Minibrain, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता इनसेबेट ।
    4. 24 h के बाद, पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति सम्मिलित करता है फिल्टर डिवाइस को हटाने और पीईLYका निर्धारण, नमूना 1 एमएल abluminal डिब्बे से और एक. da कोस्टा एट अल (२०१८)३४द्वारा वर्णित के रूप में वायरस titrate. नए 2% FBS endothelial सेल माध्यम के साथ मध्यम बदलें ।
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर BBB-Minibrain, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता इनसेबेट ।
    6. ७२ h के बाद, नमूना abluminal डिब्बे से माध्यम और वायरस, और/या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए Minibrain कोशिकाओं से RNA निकालने के रूप में एक. da कोस्टा एट अल (२०१८)३४द्वारा वर्णित है ।
  2. धारावाहिक मार्ग द्वारा Minibrain कोशिकाओं पर YFV-FNV के न्यूरोट्रॉपिक वेरिएंट का प्रवर्धन
    1. का प्रयोग करें Minibrain कोशिकाओं लेपित 12 अच्छी तरह से प्लेट्स (यानी, कदम 4.1.6 और 4.1.7) ।
    2. समय बिंदु 0 एच में, जोड़ें ३,५०० पट्टिका YFV-FNV की इकाइयों के गठन 2% FBS endothelial सेल मध्यम की ५० μL में बहुत ध्यान से कोशिकाओं के शीर्ष पर (luminal डिब्बे) पतला ।
    3. 1 ज के बाद, वायरस संरोप के साथ मध्यम निकालें और ताजा 2% fbs endothelial सेल मध्यम के साथ बदलें ।
    4. ४८ h के बाद, संस्कृति मध्यम और संक्रमित ताजा Minibrain कोशिकाओं का नमूना ५०० μL
    5. के बाद १२० एच, संस्कृति मध्यम और संक्रमित ताजा Minibrain कोशिकाओं के ५०० μL नमूना ।
    6. १९२ के बाद, संस्कृति मध्यम सहेजें (= वायरस स्टॉक समृद्ध) और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए Minibrain कोशिकाओं से एक. da कोस्टा एट अल (२०१८)३४द्वारा वर्णित के रूप में rna निकालें ।

6. BBB-Minibrain का उपयोग एक biomolecule के BBB पार और मस्तिष्क कोशिका लक्ष्यीकरण का अध्ययन करने के लिए

  1. एक ंयूरोन के BBB भर में परिवहन biomolecule लक्ष्यीकरण
    1. Minibrain-BBB का प्रयोग करें वर्णित कदम 4.1.7 के रूप में तैयार किया ।
    2. समय बिंदु 0 ज में, biomolecule जोड़ें (परिणाम खंड में प्रदान की उदाहरण में, ५८.७५ एनजी/BBB के सेल permeant NeuroTag-NV अणुओं प्रति BBB जोड़ा गया-Minibrain डालने ।
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर BBB-Minibrain, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता इनसेबेट ।
    4. 24 ज के बाद, पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति सम्मिलित करता है फिल्टर डिवाइस को हटाने और पीईLYका निर्धारण, तो hNeurons Neurofilament Nf200 के लिए minibrain कोशिकाओं दाग और minibrain में biomolecule की उपस्थिति का पता लगाने (परिणाम में प्रदान की उदाहरण में अनुभाग, न्यूरोटैग-NV strep के खिलाफ निर्देशित एक एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया गया था-टैग यह शामिल हैं३५,४०).
  2. बायोमोलेक्यूल BBB को पार कर गया है के बाद एक न्यूरोमेनेटिव biomolecule के BBB और Minibrain में बाद में न्यूरोपॉलिथीन परख भर में परिवहन
    1. चरण 4.1.7 में वर्णित के रूप में तैयार Minibrain-BBB का उपयोग करें ।
      नोट: केवल ंयूरॉंस को लक्षित अणुओं के लिए, Minibrain कोशिकाओं ंयूरॉंस कोशिकाओं (NT2-N) केवल३८द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।
    2. समय बिंदु पर 0 एच, ५८.७५ एनजी/BBB-Minibrain अच्छी तरह से सेल permeant NV अणुओं (सक्रिय रूप सीपीएम-NeuroTag-NV, गैर सक्रिय रूप सीपीएम-NeuroTag-NVΔ) के द्वारा वर्णित के सी. प्रेहौड एट अल. (२०१४)३५जोड़ें ।
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में BBB-Minibrain, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता इनसेबेट ।
    4. 4 ज के बाद, Minibrain कोशिकाओं पर एक इंजेक्शन सुई (26GX1/2, 12-4.5, Terumo, बेल्जियम) के साथ व्यक्तिगत घाव बनाते हैं । प्रत्येक व्यक्ति पर अच्छी तरह से कम से 10 खरोंच बनाओ । साथी पर पीईLY अच्छी तरह से निर्धारित करें ।
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में BBB-Minibrain, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता इनसेबेट ।
    6. 8 ज के बाद, नए सिरे से पूरा endothelial सेल माध्यम से abluminal डिब्बे में मध्यम बदलें ।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है इस कदम पर मध्यम की जगह के बाद से minibrain कोशिकाओं के घाव के कारण कोशिका मृत्यु और फिर साइटोटोक्सिक यौगिकों की रिहाई के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
    7. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में BBB-Minibrain, 5% सह2 और ९५% आर्द्रता इनसेबेट ।
    8. ४८ ज के बाद, दाग के रूप में C. Prehaud एट अल (२०१३)४०द्वारा वर्णित के रूप में hNeurons के axon उत्थान के लिए कोशिकाओं ।

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Representative Results

BBB-Minibrain रक्त मस्तिष्क अंतरफलक के cellulo प्रयोगात्मक मॉडल में एक है ।

BBB-Minibrain पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति डालने प्रणाली पर ऊपरी स्तर पर एक रक्त डिब्बे और रक्त मस्तिष्क अंतरफलक के निचले स्तर पर एक मस्तिष्क के डिब्बे की नकल करने के लिए स्थापित किया गया है (चित्रा 2A, बी). यह मस्तिष्क कोशिकाओं (ंयूरॉंस, astrocytes और microglial कोशिकाओं) के Minibrain मानव त्रि-संस्कृति शामिल है जो BBB और एक abluminal डिब्बे, बनाने फिल्टर पर hCMEC/D3 endothelial कोशिकाओं के साथ एक luminal डिब्बे के होते हैं । Minibrain कोशिकाओं एक शास्त्रीय त्रि संस्कृति मिश्रित जनसंख्या phenotype प्रदर्शन (चित्रा 1, कम सही पैनल) और सेल के प्रत्येक प्रकार के विशिष्ट मार्कर व्यक्त के रूप में डीए कोस्टा ए एट अल., २०१८३४द्वारा दिखाया गया है ।

BBB-Minibrain में hCMEC/D3 परत के उपयोग की अनुमति देता है एक मजबूत बाधा प्राप्त करने के लिए एक मतलब पीई के साथ 0.95 e-03 सेमी/मिनट और एक मतलब ट्रांस Endothelial विद्युत प्रतिरोध (TEER) के ५१.८९ Ω/सेमी2। इन मूल्यों को कभी एक मानव endothelial सेल लाइन27,४१ ऐसे पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति डालने प्रणाली (चित्र 2cमें) के लिए वर्णित सबसे अच्छा मूल्यों की सीमा में हैं । इन कोशिकाओं को तंग जंक्शन इस तरह के ZO-1 और cadherin के रूप में प्रोटीन मार्करों एक्सप्रेस पारगम्यता परिमाणन (नहीं दिखाया गया डेटा) से अपेक्षा के रूप में । उंहोंने यह भी रिसेप्टर्स, बहि: स्राव ट्रांसपोर्टरों या ट्रांसपोर्टरों के सभी सबसेट एक्सप्रेस [रिसेप्टर्स: ldlr, कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर; LRP1, कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर संबंधित प्रोटीन 1; INSR, इंसुलिन रिसेप्टर; LEPR, लेप्टिन रिसेप्टर; लू, बेसल कोशिका आसंजन अणु; TFRC, CD71 antigen; आगर, उन्नत ग्लाइकोसिलेशन एंड प्रोडक्ट रिसेप्टर । Efflux ट्रांसपोर्टरों: ABCB1 (पी जीपी); ABCG2 (BCRP); ABCC1 (MRP1); ABCC2 (MRP2); ABCC4, ABCC4 प्रोटीन; ABCC5, ABCC5 प्रोटीन. ट्रांसपोर्टरों: STRA6, retinoic एसिड जीन द्वारा उत्तेजित 6 प्रोटीन; SLC2A1, ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर प्रकार 1; SLC7A5, बड़े तटस्थ अमीनो एसिड ट्रांसपोर्टर 1; SLC1A1, विलेय वाहक परिवार 1 प्रोटीन; SLC38A5, विलेय वाहक परिवार ३८ सदस्य 5 प्रोटीन; SLC16A1, monocarboxylate परिवहन प्रोटीन 1], जो उनके जैविक कार्यों के लिए महत्वपूर्ण प्रासंगिक प्रोटीन हैं (चित्र 2 डी)21.

BBB-Minibrain का चयन, प्रवर्ध और एक जीवित वायरस वैक्सीन की तैयारी से दुर्लभ न्यूरोइनवेसिव वायरल वेरिएंट की विशेषता की अनुमति देता है ।

BBB-Minibrain संस्कृति डिवाइस एक cellulo परीक्षण में अलगाव और दुर्लभ न्यूरोइनवेसिव के प्रवर्धन की अनुमति के रूप में इस्तेमाल किया गया था/संभावित रूप से पीले बुखार वायरस (YFV) वायरल लाइव टीके४२में मौजूद. YFV एक viscerotropic जिगर है कि कुशलता से BBB पार नहीं करता है लक्ष्यीकरण वायरस है । फ्रांसीसी तंत्रिकानुवर्ती वायरस, fnv, 1980 के दशक३३,४३तक एक जीवित yfv टीके के रूप में इस्तेमाल किया गया था । Fnv के बाद बच्चों में (०.३ के लिए ०.४% vaccogenas) में vaccinal neuropathogenesis कारण पाया गया था और इस प्रकार १९८२३३,४३में बंद कर दिया गया था । हम यहां fnv yf वायरस के एक प्रोटोटाइप के रूप में इस्तेमाल किया जो न्यूरोइनवेसिव के एक उच्च अनुपात में शामिल होसकते हैं/ एक FNV वायरस तैयारी (यानी, ३५०० PFU/एमएल) एक BBB-Minibrain के luminal डिब्बे में जोड़ा गया था, नियंत्रण एक BBB-Minibrain कि नकली था संक्रमित था । लकड़ी के डिब्बे में वायरस के कणों की उपस्थिति बाधा पारगम्यता के रूप में मापा 24घंटे बाद में बदल नहीं करता है के बाद से वायरल कुओं में पीई ly नियंत्रण कुओं के पीईly से अलग नहीं था (०.८० ± ०.०९ x 10-3 सेमी/ और ०.८६ ± ०.०९ x 10-3 सेमी/मिनट पीईLY के लिए नियंत्रण और YFV-fnv कुओं में क्रमशः) । Abluminal डिब्बे की सामग्री, 24 एच पोस्ट संक्रमण पर पट्टिका परख द्वारा वायरस की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन किया गया था । Minibrain कोशिकाओं दो दिन और मस्तिष्क कोशिकाओं में न्यूरोइनवेसिव वेरिएंट के प्रवर्धन का मूल्यांकन करने के लिए और चित्रा 3Aपर दिखाया कार्टून पर वर्णित के रूप में जीन अभिव्यक्ति की निगरानी करने के लिए इनयूबटेड थे.

हम कुछ YFV-FNV वायरस है, जो 24 एच में BBB पार कर सकते है (मतलब ४३ PFU/ वायरस मस्तिष्क की कोशिकाओं के अंदर वायरस के गुणा द्वारा अगले दो दिनों के लिए प्रवर्धित किया गया (४.६९ x 104 pfu/एमएल), (चित्रा 3b) के अनुमापांक मतलब । नोट, एक वैक्सीन तनाव तैयारी जो पोस्ट के कारण नहीं है-vaccinal neuropathogenesis कुशलता से इस प्रणाली में BBB पार नहीं होगा के रूप में यह दा कोस्टा ए एट अल द्वारा प्रदर्शन किया गया है (२०१८)३४। हम वायरस के गुणन के दो biomarkers की पहचान: इंटरफेरऑन उत्तेजित जीन 15 (ISG15) और इंटरफे्रन नियामक फैक्टर 7 (IRF7). इन दो biomarkers के भाव उत्तेजित थे जब इस न्यूरोइनवेसिव वायरल जनसंख्या Minibrain कोशिकाओं पर प्रश्नपत्र passaged था (चित्रा 3C). क्यू-आरटी-पीसीआर द्वारा मापी गई ये उपगुल्तियां कड़ाई से वायरल लोड (पीयरसन पी वैल्यू ०.००१६ के लिए ISG15 और ०.०२६० के लिए IRF7) से सहसंबद्ध थीं ।

Bbb-Minibrain की अनुमति देता है दोनों एक biomolecule की क्षमता बाधा पास करने के लिए और एक ही समय में परीक्षण कि क्या biomolecule समारोह BBB पार करने के बाद संरक्षित किया गया था ।

NV एक biomolecule रेबीज वायरस है जो neuroprotection और neuroregeneration४०के आश्चर्यजनक गुणों के पास से व्युत्पंन है । इस छोटे से पॉलीपेप्टाइड है कि न तो स्वाभाविक रूप से कोशिका झिल्ली को पार और न ही bbb एक सीपीएम के साथ जुड़े थे ंयूरॉंस को लक्षित करने में सक्षम । हमारी पसंद के चर भाग (vhh) का उपयोग करने के लिए किया गया था एक एकल श्रृंखला के एंटीबॉडी कि bbb३६,४५ और एक neurotag लक्ष्यीकरण ंयूरॉंस विशेष रूप से सहित जैविक झिल्ली पार । NV VHH और एक NeuroTag से जुड़ा हुआ था, एक सीपीएम के निर्माण के लिए-ंयूरोटैग-NV (चित्र 4a) और vhh केवल एक सीपीएम का निर्माण करने के लिए-NeuroTagΔ-Nv विशिष्ट Neurotag ंयूरॉंस के लक्ष्यीकरण की अनुमति कमी (चित्रा 4b) । बाद luminal डिब्बे को जोड़ा जा रहा है, सीपीएम-NeuroTag नमन (ग्रीन डॉट्स) BBB पार और मानव ंयूरॉंस (लाल रंग में) को लक्षित करने में सक्षम था (चित्रा 4C, डी) । सीपीएम-NeuroTagΔ नमन endothelial सेल बैरियर (हरी डॉट्स) पार लेकिन लक्ष्य कम कुशलता से मानव ंयूरॉंस (हरी डॉट्स के बहुमत ंयूरॉंस के बाहर स्थित हैं) (चित्रा 4D) ।

के रूप में ऊपर वर्णित है, NV एक VHH और एक NeuroTag के लिए एक सीपीएम-NeuroTag-NV निर्माण से जुड़ा हुआ था । हम NVΔ NV के सक्रिय भाग (सीपीएम-NeuroTag-NVΔ) (चित्रा 5A) की कमी के एक निष्क्रिय रूप के लिए ही किया था । बाद Luminal डिब्बे को जोड़ा जा रहा है, सीपीएम-NeuroTag-NV BBB पार और घायल (चित्रा 5B, सही पैनल) के बाद मानव ंयूरॉंस के axons पुनर्जीवित करने में सक्षम था, सीपीएम के विपरीत-NEUROTAG-NV Δ नमन के निष्क्रिय रूप (चित्रा 5b, वाम पैनल)४०. ये गुण दो प्रकार के प्रोटोकॉल्स में असाए गए; या तो पूर्व – एक्सपोज़र (चित्र 5C) या पोस्ट एक्सपोज़र प्रोटोकॉल (चित्र 5d) में । जब axon scratching (4 एच, H4), सीपीएम-ंयूरोटैग-NV से पहले लागू नकली इलाज कोशिकाओं के विपरीत पर घायल ंयूरॉंस और axon उत्थान के neurotag ट्रिगर (यानी, नियंत्रण) या कोशिकाओं सीपीएम के साथ इलाज किया-NeuroTag-NVΔ (मतलब पुनर्जनन ९१% और 12%-10% क्रमशः, चित्रा 5C) । जब biomolecule axonal घावों के बाद लागू किया गया था (1 घंटा, H1, चित्रा 5d) आदेश में एक चिकित्सा के बाद जोखिम प्रोटोकॉल की नकल करने के लिए, सीपीएम-NEUROTAG-nv अभी भी सीपीएम के विकलांग फार्म के विपरीत पर axonal पुनर्जीवित करने में सक्षम है-NEUROTAG-nv Δ, ( मतलब उत्थान ८५% और ५.१% क्रमशः) (चित्र 5d) ।

Figure 1
चित्रा 1: Minibrain मॉडल । NT2-N/A और CHME/Cl5 संस्कृतियों (ऊपरी पैनल) की समय सारणी । मूल कोशिका रेखा के फोटोग्राफ (लोअर पैनल) (Ntera/ब्स2. D1) बाएँ फलक में, छद्म neurospheres मध्य ऊपरी पैनल में ATRA उपचार के बाद प्राप्त की, मध्य निचले पैनल में CHME/Cl5, और Minibrain (Cristal बैंगनी धुंधला), सही पैनल में, NT2-N/A और CHME के मिश्रण के परिणामस्वरूप/ CL5 संस्कृतियों । स्केल बार १०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: BBB-Minibrain मॉडल । HCMEC/d3 संस्कृतियों और BBB-Minibrain डिवाइस की तस्वीर की एक समय अनुसूची: एक पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति आवेषण-फिल्टर hCMEC के साथ/3 endothelial बाधा एक forcep के साथ आयोजित करने से पहले एक 12 वेल्स सेल संस्कृति थाली के एक अच्छी तरह से डाला जा रहा है । B. कार्टून (रक्त) endothelial कोशिका बाधा और Abluminal (मस्तिष्क) minibrain कोशिकाओं युक्त डिब्बे (मानव ंयूरॉंस, astrocytes और microglial कोशिकाओं) युक्त डिब्बे के साथ डिवाइस का वर्णन । C. बीबीबी के प्रतिनिधि उपाय-तीर (अर्थात, पांच फिल्टर पर पीईly) के लिए तीन उपकरणों या पारगम्यता पर Transendothelial विद्युत प्रतिरोध) द्वारा (यानी,. D. एंडोथेलीयल कोशिकाओं पर रिसेप्टर्स, बहि: स्राव ट्रांसपोर्टरों और ट्रांसपोर्टरों की क्यू-आरटी-पीसीआर द्वारा अभिव्यक्ति विश्लेषण hcmec/ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: BBB-Minibrain मॉडल लाइव YFV वैक्सीन तैयारी के बीच न्यूरोइनवेसिव वेरिएंट की पहचान की अनुमति देता है । A. प्रयोग की अनुसूची । B. वायरस का परिमाणन जो लाइव वायरस (प्रत्येक बिंदु एक पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति आवेषण प्रयोग) का प्रतिनिधित्व करता है पट्टिका बनाने इकाई (pfu) द्वारा bbb पार कर दिया है । C. ISG15 और IRF7 जीन अभिव्यक्ति की साजिश वायरल भार में वायरल कणों की संख्या के एक समारोह के रूप में क्यू-आरटी-पीसीआर द्वारा मापा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: bbb-minibrain न्यूरोरोजेनेरेटिव biomolecule गुण के परीक्षण की अनुमति देता है: विशिष्ट को लक्षित ंयूरॉंस जब NV को neurotag के लिए संगलित है । A. सीपीएम के एक कार्टून nv आधारित (यानी, सीपीएम-neurotag-nv) एक विशिष्ट neurotag युक्त करने के लिए विशेष रूप से ंयूरॉन लक्ष्य । B. सीपीएम के कार्टून आधारित Nv न्यूरोटैग (यानी, सीपीएम-NeuroTagΔ-nv) के नष्ट कर दिया । C. मानव ंयूरॉंस के प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस तस्वीरें । स्केल बार ५० μm. NF २०० लाल, सीपीएम में-NeuroTag-NV/सीपीएम-NeuroTagΔ-नीले रंग में ग्रीन, नाभिक में नमन. D. Cpm-न्यूरोटैग-NV अणुओं bbb और लक्ष्य मानव ंयूरॉंस सीपीएम से अधिक कुशलता से पार-NeuroTagΔ-nv कर सकते हैं । संक्रमित ंयूरॉंस और ंयूरॉंस की कुल जनसंख्या immunolabeling के बाद तपसिल स्लाइड पर गिना गया । कुल ंयूरॉंस NF200 सकारात्मक कोशिकाओं के अनुरूप (लाल रंग में) । एक या अधिक हरे डॉट (सीपीएम-NV) के साथ जुड़े किसी भी लाल कोशिकाओं को एक सकारात्मक ंयूरोन के रूप में गिना जाता है । अयुग्मित छात्र का t-test दो पुच्छ * * *p = 0.0002. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: bbb-Minibrain न्यूरोरेजेरेटिव biomolecule गुणों के परीक्षण की अनुमति देता है: bbb पार नमन के neuroregenerative गुणों को बदल नहीं करता है । सीपीएम के एक कार्टून nv आधारित (यानी, सीपीएम-nv) और उसके विकलांग समकक्ष (यानी, सीपीएम-NVΔ) । बीसीपीएम द्वारा axon उत्थान-एक में cellulo खरोंच परख (सही पैनल) में NV । सीपीएम-NVΔ axon उत्थान (बाएं पैनल) ट्रिगर नहीं कर सकते, स्केल बार १०० μm. C। सीपीएम-NV endothelial सेल पार और BBB के ंयूरॉंस पर axons पुनर्जीवित-Minibrain जब घाव से पहले 4 एच लागू कर सकते हैं: (ऊपरी पैनल) प्रयोग की योजना; (लोअर पैनल) उत्थान का परिमाणन । D. सीपीएम-NV भी एक चिकित्सा प्रोटोकॉल में सक्रिय है जब यह लागू किया जाता है 1 ज घाव के बाद: (ऊपरी पैनल) प्रयोग की योजना; (लोअर पैनल) उत्थान का परिमाणन । अयुग्मित छात्र का t-test दो पुच्छ * * * *p < 0.0001. उत्थान तपसिल प्रयोगों से गणना की थी (> 800 ंयूरॉंस गिना) ंयूरॉंस कोशिकाओं के धुंधला के बाद । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस अनुच्छेद में हम कैसे cellulo रक्त में एक बनाने के लिए प्रदर्शन/मस्तिष्क अंतरफलक, BBB-Minibrain, एक BBB मॉडल और मिश्रित मस्तिष्क मस्तिष्क कोशिकाओं (Minibrain) की एक संस्कृति के संयोजन से एक किट में । इस प्रणाली को जैविक रूप से प्रासंगिक है, आसान स्थापित करने और प्रयोग के लिए संभाल अच्छी तरह से सेल संस्कृति में प्रशिक्षित किया ।

BBB के विट्रो मॉडल में किसी भी अंय के लिए के रूप में, विश्वसनीय परिणाम यदि बाधा की तंगी के कठोर नियंत्रण लागू किया जाता है प्राप्त होगा । आवेषण सावधानी पारगम्यता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए और अपर्याप्त पारगम्यता मूल्यों के साथ किसी भी सम्मिलित (यानी, एक पीई अधिक से अधिक १.२) छोड़ दिया जाना चाहिए.

FBS के नमूने ध्यान से BBB की विशेषताओं को निष्क्रिय नहीं करता है कि एक बैच की पहचान करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए । एक ही सलाह वाहन माध्यम है जिसमें वायरस कणों या जैव अणुओं पतला कर रहे हैं के बारे में किया जा सकता है । यह भी करने के लिए संभव के रूप में छोटे के रूप में biomolecule या वायरस निलंबन की मात्रा रखने के लिए सिफारिश की है, क्रम में luminal डिब्बे की मध्यम संरचना को बदलने के लिए नहीं. Ntera/ब्स2 से मानव सह संस्कृति ंयूरॉन/astrocytes संस्कृति का भेदभाव । D1 एक सिद्ध तकनीक है । मानव ंयूरॉंस के विपरीत जो समसूत्री के बाद कर रहे हैं, astrocytes अभी भी कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं । एस्ट्रोसाइटीस कोशिकाओं का उच्च प्रसार कभी-कभार मनाया जाता है । यदि ऐसा होता है तो मिनिब्रेन कल्चर को छोड़ दिया जाए । हम अपनी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया CHME/Cl5 कोशिकाओं को साबित करना है कि वे मानव मूल (होमो sapiens CCNT1 phenotyped) के थे phenotyped थे. वहां एक जोखिम है कि कुछ प्रयोगशालाओं में कुछ CHME बहुत इस्तेमाल किया चूहा (Rattus norvegicus) मूल के रूप में गार्सिया-Mesa Y. et अल. (२०१७)४६द्वारा दावा किया जा सकता है । इसलिए, यह CHME/Cl5 सेल लाइन के मूल के लिए जांच करने के लिए सिफारिश की है ।

मिनिब्रेन ह्यूमन त्रि-संस्कृति प्रणाली जिसमें पोस्ट मिटिक न्यूरॉन्स (मुख्य रूप से डोप्नेरिजिक), एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लाइकल कोशिका रेखा शामिल हैं, एक सरलीकृत मस्तिष्क वातावरण की नकल करती हैं । इस प्रणाली में अभी भी सुधार किया जा सकता है । एक के लिए myelinated axons या प्राथमिक microglial कोशिकाओं को प्राप्त लक्ष्य के साथ संस्कृति को ओलिगोडेन्रोसाइट्स जोड़ने की कल्पना कर सकते हैं । Minibrain भी मानव व्युत्पंन स्टेम सेल19,20,21की एक मिश्रित संस्कृति के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है । फिर भी, विभिंन कोशिकाओं के बहुत सारे के बीच परिवर्तनशीलता को ध्यान में महारत हासिल करना होगा । BBB-Minibrain जटिलता भी23pericytes जोड़कर बढ़ाया जा सकता है । हमारे हाथों में, यह सुधार मुश्किल से मानव मूल के pericytes के लिए विश्वसनीय पहुंच के लिए बाधित किया गया था ।

हम व्यवहार्यता और इस रक्त मस्तिष्क अंतरफलक नकल किट की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है, मैं) एक पीले बुखार वैक्सीन नमूना है कि BBB के माध्यम से मस्तिष्क में प्रवेश करने के लिए संपत्ति विकसित किया है से दुर्लभ न्यूरोइनवेसिव वायरस कणों को अलग, और द्वितीय) एक सरलीकृत मस्तिष्क पैरेन्काइमा की नकल उतार Minibrain त्रि-संस्कृति में इन न्यूरोइनवेसिव उप-आबादी बढ़ाना. भविष्य के आवेदन ऐसे कण्ठमाला वैक्सीन के रूप में अंय जीवित टीकों की गुणवत्ता नियंत्रण का विस्तार करने के लिए और एक मतलब के रूप में bbb-minibrain को बढ़ावा देने के लिए विट्रो में neurovirulence सुविधाओं का अध्ययन हो सकता है ।

दूसरा प्रायोगिक अध्ययन यह दिखाना था कि एक दवा अभ्यर्थी बीबीबी के माध्यम से गुजरता है और अपने न्यूरो-पुनर्योजी गुणों को खोने के बिना, Minibrain तक पहुंचता है । हम दृढ़ता से आश्वस्त है कि bbb-minibrain पूर्व में प्रमुख अग्रिमों की अनुमति कर सकते है उंहें पूर्व नैदानिक परीक्षणों को जारी करने से पहले अणुओं की छंटाई । BBB-Minibrain का उपयोग दोनों reglementary assays और प्रायोगिक अनुसंधान के लिए पशु परीक्षण के उपयोग को कम करने के उद्देश्य से 3Rs उपायों के कार्यांवयन की सुविधा होनी चाहिए ।

सिल्को दृष्टिकोण (कंप्यूटर मॉडल ) के अगले विकास के साथ पूरी तरह से, हम जल्द ही bbb पार करने की एक उच्च संभावना के साथ दवा उंमीदवारों की पहचान करने में सक्षम हो जाएगा, सेल्युलो में एक 3d मॉडल के विकास तंत्रिका पैरेन्काइमा रक्त नकल उतार इंटरफेस बहुत मदद की होगी ।

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Disclosures

इस प्रणाली की बौद्धिक संपदा ३२, ३५ और ३८में संदर्भित पेटेंट था ।

Acknowledgments

इस अध्ययन Institut Pasteur से आंतरिक अनुदान द्वारा एक Incitative अनुदान (PTR ४३५) और एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था "Contrat de सौटीन à ला Recherche" Sanofi Pasteur द्वारा प्रदान करने के लिए Institut Pasteur । ए दा कोस्टा Sanofi द्वारा समर्थित-पाश्चर अनुदान और फ्लोरियन Bakoa एक पीएचडी ANRT द्वारा प्रदान की अनुदान के प्राप्तकर्ता है (एसोसिएशन Nationale डे ला Recherche एट डे ला Technologie) । हम उपयोगी चर्चाओं के लिए पीआर पियरे-ओलिवियर कौराउड और डॉ फ्लोरेंस मिलर के ऋणी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well plates Corning 3336
5-fluoro-2’deoxyuridine Merck-Sigma Aldrich F0503
85mm Petri Dish Sarstedt 83-3902-500
Anti-Nf200 Merck-Sigma Aldrich N4142
β-mercapto-ethanol Merck-Sigma Aldrich M3148
CHME/Cl5 Unité de Neuroimmunologie Virale On request to Dr Lafon
CMC Calbiochem 217274
Cytosine β-D-arabinofuranoside Merck-Sigma Aldrich C1768
Dark 96 well plates Corning 3915
DMEM F12 Thermofisher Scientific 31330-038
DMSO Merck-Sigma Aldrich D2650
Endogro IV Millipore SCME004 endothelial cell medium
Ethanol Carlo Erba 529121
FBS Hyclone SV30015-04
Formaldehyde Merck-Sigma Aldrich 252549
GIEMSA RAL Diagnostic 320310
Goat-Anti Mouse Jackson Immuno Research 115-545-003
Goat-Anti Rabbit Thermofisher Scientific R37117
HBSS with Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14025-100
hCMEC/D3 Cedarlane CLU512
Hepes 1M Thermofisher Scientific 15630-070
Hoescht 33342 Merck-Sigma Aldrich 33263
Laminine Merck-Sigma Aldrich L6274
L-glutamin Thermofisher Scientific 25030-024
Lucifer Yellow Merck-Sigma Aldrich L0259
MEM 10X Thermofisher Scientific 21430
MEM 1X Thermofisher Scientific 42360
Ntera/Cl2D.1 ATCC CRL-1973
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714
PBS without Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14190
PBS-Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14040-091
Pen/Strep Eurobio CXXPES00-07
Poly-d-Lysine Merck-Sigma Aldrich P1149
Prolong Gold Thermofisher Scientific P36930
Qiashredder QIAGEN 79656
Rat Collagen I Cultrex 3443-100-01
Retinoic Acid All-Trans Merck-Sigma Aldrich R2625
RNA purification kit QIAGEN 74104
SDS Merck-Sigma Aldrich L4509
Sodium bicarbonate 5.6% Eurobio CXXBIC00-07
Sodium Pyruvate Thermofisher Scientific 11360
T75 Cell+ Flask Sarstedt 83-1813-302 Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells
Transwell Corning 3460 polyester porous membrane culture inserts
Trypsin-EDTA Merck-Sigma Aldrich T3924
Ultra Pure Water Thermofisher Scientific 10977-035
Uridine Merck-Sigma Aldrich U3750
Versene Thermofisher Scientific 15040-033 EDTA
YFV-FNV IP Dakar Vaccine vial

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४६ BBB-Minibrain सेल्युलो मॉडल में मानव endothelial कोशिकाओं hCMEC/D3 Ntera/Cl2D. 1 मानव ंयूरॉन मानव astrocyte मानव microglial कोशिकाओं CHME/Cl5
एक मानव रक्त मस्तिष्क इंटरफेस मॉडल रोगजनकों या दवाओं और मस्तिष्क के साथ उनकी बातचीत द्वारा बैरियर क्रॉसिंग का अध्ययन करने के लिए
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da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa, F., Afonso, P., Ceccaldi, P. E., Lafaye, P., Lafon, M. A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain. J. Vis. Exp. (146), e59220, doi:10.3791/59220 (2019).

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