Summary
Este protocolo describe métodos in vivo y ex vivo para visualizar y caracterizar completamente los vasos hialoide, un modelo de regresión vascular en los ojos del ratón, utilizando tomografía de coherencia óptica y angiografía de fundus fluoresceina para la imagen en vivo y ex vivo aislamiento y posterior montaje plano del hialoides para el análisis cuantitativo.
Abstract
En el ojo, los vasos hialoides embrionarios nutren la lente en desarrollo y la retina y retroceden cuando se desarrollan los vasos retinianos. La regresión persistente o fallida de los vasos hialoidese se puede ver en enfermedades como el vítreo primario hiperplásico persistente (PHPV), lo que conduce a una trayectoria de luz obstruida y a una función visual deteriorada. Comprender los mecanismos subyacentes a la regresión del vaso hialoide puede conducir a nuevas perspectivas moleculares sobre el proceso de regresión vascular y posibles nuevas formas de manejar enfermedades con vasos hialoides persistentes. Aquí describimos los procedimientos para la toma de imágenes de hialoide en ratones vivos con tomografía de coherencia óptica (OCT) y angiografía de fundus fluoresceína (FFA) y un protocolo técnico detallado de aislar y montar hialoide ex vivo para análisis cuantitativo. Los ratones noqueadores relacionados con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 5 (LRP5) se utilizaron como modelo experimental de vasos hialoide persistentes, para ilustrar las técnicas. Juntos, estas técnicas pueden facilitar una evaluación exhaustiva de los vasos hialoides como un modelo experimental de regresión vascular y estudios sobre el mecanismo de los vasos hiloide persistentes.
Introduction
El suministro de sangre en el ojo es esencial para asegurar el desarrollo normal de la retina y los tejidos oculares circundantes y para equipar una función visual adecuada. Hay tres camas vasculares en el ojo: la vasculatura de la retina, la coroides y una red circulatoria embrionaria transitoria de vasos hialoides. El desarrollo de la vasculatura ocular requiere coordinación espacial y temporal a lo largo de la embriogénesis y la maduración de tejidos. Entre las tres camas vasculares, la vasculatura hialoide es el primer sistema funcional de suministro de sangre que proporciona nutrición y oxígeno a la lente embrionaria recién formada y la retina en desarrollo. Los vasos hialoides retroceden al mismo tiempo que las vasculaturas de la retina se desarrollan y maduran1. La regresión de la vasculatura hialoide es fundamental para permitir una vía visual clara para el desarrollo de la función visual; por lo tanto, este proceso de regresión vascular es tan importante como el crecimiento de la vasculatura de la retina. La regresión hialide deteriorada puede conducir a enfermedades oculares. Además, la regresión de los vasos hialoides proporciona un sistema modelo para investigar los mecanismos celulares y moleculares involucrados en la regulación de la regresión vascular, que puede tener implicaciones para la regulación angiogénica en otros órganos también.
La vasculatura hialoide, derivada de la arteria hiloide (HA), se compone de vasa hyaloidea propria (VHP), tunica vasculosa lentis (TVL), y membrana pupilar (PM). Proporciona nutrición a la retina en desarrollo, el vítreoprimario y la lente durante el desarrollo embrionario 2. A partir de la HA, VHP se ramifica anteriormente a través del vítreo a la lente. El TVL copa la superficie posterior de la cápsula de la lente, y anastomosas a la PM, que se conecta a las arterias ciliares anteriores, cubriendo la superficie anterior de la lente2,3, lo que resulta en la formación de una red de vasos en el PM 3 , 4 , 5. Curiosamente, no hay venas en la vasculatura hialoides, y el sistema hace uso de venas coroidas para lograr el drenaje venoso.
En el embrión humano, la vasculatura hialoide está casi completa aproximadamente a la novena semana de gestación ycomienza a retroceder cuando aparecen los primeros vasos retinianos, durante el cuarto mes de gestación 2. Comenzando con la atrofia del VHP, regresión de las redes capilares dela TVL, el PM, y por último, la HA se produce posteriormente 2,3. Mientras tanto, el vítreo primario se retrae y el vítreo secundario comienza a formarse, compuesto por los componentes de la matriz extracelular, incluyendo fibras de colágeno. Para el sexto mes de gestación, el vítreo primario se reduce a un pequeño canal transparente que se extiende desde el disco nervioso óptico hasta la lente, llamado canal o canal hiloide del Cloquet, y el vítreo secundario se convierte en el componente principal del segmento posterior 2 , 3. La circulación hialoides desaparece sobre todo a 35 a 36 semanas de gestación, justo antes del nacimiento3.
A diferencia de los seres humanos, en los que la vasculatura hialoide está completamente regresiva al nacer, el sistema vascular hialoide del ratón comienza a retroceder después del nacimiento. A medida que la retina del ratón nace avascular y los vasos retinianos se desarrollan postnatalmente, los vasos hialoides retroceden simultáneamente desde el día postnatal (P) 4 y son en su mayoría completamente regresivos por P216 (Figura1). El PM desaparece primero entre P10 y P12, y el VHP desaparece entre P12 y P16, mientras que un pequeño número de células TVL yHA permanecen incluso en P16, y para P21 la regresión del sistema vascular hialoide es casi completa 6. Mientras tanto, la vasculatura de la retina comienza a desarrollarse después del nacimiento. La capa superficial del plexo vascular se extiende completamente a la retina periférica en P7–P8, la capa profunda (ubicada en la capa plexiforme externa) se desarrolla a partir de P7–P12, y finalmente, el plexo intermedio en la capa plexiforme interna se desarrolla entre P12 y P157 . A medida que se desarrolla la vasculatura de la retina, reemplaza gradualmente la función de retroceder concomitantemente los vasos hialoides, proporcionando nutrición y oxígeno al ojo en desarrollo. La ocurrencia postnatal de la regresión del vaso hialoide en ratones proporciona un modelo experimental de fácil acceso para observar y estudiar la vasculatura hialoides, así como la base molecular que rige los procesos de regresión vascular bajo la condiciones patológicas8.
El fracaso de la regresión hialoides se puede ver en enfermedades como el PHPV, que es una rara anomalía congénita del desarrollo del ojo resultante deuna regresión fallida o incompleta de la vasculatura embrionaria, vítrea primaria e hialoides 9. Los mecanismos que regulan el proceso de regresión de la vasculatura hialoides son complicados y ampliamente estudiados. Una vía molecular importante esencial para la regresión normal de los vasos hialoides es la vía de señalización Wnt10,yaque las mutaciones genéticas en esta vía que afectan tanto al ligando Wnt como a los receptores se han relacionado con el VPH en los seres humanos 9. Estudios experimentales identificaron un ligando Wnt, Wnt7b, que es producido por macrófagos alrededor de los vasos hialoides en el ojo en desarrollo para mediar este proceso de regresión. Wnt7b activa la señalización Wnt mediante la unión con los receptores frizzled4 (FZD4)/LRP5 en células endoteliales adyacentes para iniciar la apoptosis celular, lo que conduce a la regresión de los vasos hialoides10. Como resultado, los ratones Wnt7b-deficientes muestran una persistencia de los vasos hialoide10. Del mismo modo, un ligando Wnt no convencional, Norrin (codificado por el gen Ndp), también se une a FZD4/LRP5 para inducir la regresión del vaso hiloide durante el desarrollo. Los ratones Ndpy/-, Lrp5-/-y Fzd4-/- muestran regresión pospuesta del recipiente hiloide, apoyando un papel regulador crítico de la señalización Wnt11,12, 13,14,15,16. Por otra parte, otro coreceptor Wnt LRP6 se superpone con LRP5 en su función de modulación de la vía de señalización Wnt en células endoteliales vasculares hialoide17. Otros factores que también pueden contribuir a la regresión hialoide incluyen el factor hipoxia-inducible18,19, factor de crecimiento endotelial vascular20,21, colágeno-1822, 23, Arf24, angiopoietin-225, y proteína morfogenética ósea-426. En este artículo, utilizamos ratones Lrp5-/- como modelo de vasos hialoide persistentes para demostrar las técnicas de evaluación y caracterización de la vasculatura hialoides a través de métodos in vivo y ex vivo.
La visualización de la vasculatura hialoide in vivo y ex vivo es esencial para estudiar los mecanismos de regresión de los vasos hialoides. Los métodos actuales para observar la vasculatura hialoide se centran principalmente en visualizar y analizar el VHP y HA, a través de imágenes OCT y FFA, secciones transversales oculares y el montaje plano hialoide. OCT y FFA son potentes herramientas de imagen in vivo, que permiten la observación longitudinal en animales vivos después de que han abierto los ojos. Además, el montaje plano hialoide aislado proporciona la visualización de toda la vasculatura hialoide y un medio para lograr una cuantificación precisa del número de recipientes. Sin embargo, la naturaleza delicada y frágil de los vasos hialoidey y las dificultades técnicas resultantes de su aislamiento pueden haber limitado su uso en la investigación ocular un poco10,17,27. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado de la visualización de vasos hialoides, combinando imágenes retinianas en vivo in vivo y montaje plano hialoide aislado ex vivo para mejorar la viabilidad de estas técnicas. Este protocolo ha sido adaptado con la modificación y ampliación de publicaciones anteriores sobre el método in vivo de fondo en vivo y pTU imagen28 y el método ex vivo de montaje plano hialoide aislado11.
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Protocol
Todos los animales fueron tratados de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en La Investigación Oftálmica y de La Visión para experimentos con animales, siguiendo las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud ( NIH) con respecto al cuidado y uso de animales para procedimientos experimentales y las regulaciones establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Boston Children's Hospital. Lrp5-/- ratones (stock no 005823; Laboratorio Jackson) y sus ratones c57BL/6J de control de tipo salvaje (stock no 000664; Laboratorio Jackson) se utilizaron para este estudio.
1. Parte I: Imágenes in vivo de vasos hialoides utilizando un sistema de imágenes de retina de roedores
- Preparación de la anestesia de ratones y dilatación de la pupila
- Seleccione los ratones.
- Utilice ratones mayores que P12 (después de haber abierto los ojos) para la toma de imágenes de la retina; ambos sexos son adecuados.
- Como se desea, imágenes de ratones mutantes con regresión hialoides retardadas (y sus controles WT) a lo largo de la edad adulta. Los ratones WT de más de 3 semanas pueden no exhibir vasos hialoides restantes muy detectables, por lo tanto P12–P21 es ideal para obtener imágenes del hiloide WT visible restante.
- Preparar una mezcla de ketamina/xilazina para la anestesia.
- Tomar 2,3 ml de solución de ketamina (100 mg/ml) y 0,7 ml de solución de xilazina (20 mg/ml) y añadir 20 ml de solución salina estéril (cloruro de sodio 0,9%) para hacer una solución de trabajo de una mezcla de ketamina/xilazina (10 mg/ml de ketamina y 0,6 mg/ml de xilazina).
- Anestetizar a los ratones inyectando por vía intraperitoneal mezcla de ketamina/xilazina en un volumen de 8x el peso corporal del ratón (por ejemplo, un ratón de 20 g necesita 160 ml de mezcla de solución de trabajo de ketamina/xilazina para lograr una dosis de trabajo de ketamina [80 mg/kg de peso corporal] y xilazina [4,8 mg/kg de peso corporal] mezcla).
- Aplique una gota de solución de medicamentos dilatadores de pupilas (ver Tabla de materiales)a cada ojo para dilatar las pupilas del ratón inmediatamente después de la anestesia.
- Evaluar el nivel de anestesia por reflejo de pedal (pellizco firme del dedo del pizdo en la extremidad posterior). Espere hasta que el ratón esté suficientemente anestesiado (sin reflejo de pedal) y sus pupilas estén ampliamente dilatadas.
- Seleccione los ratones.
- Tomografía de coherencia óptica de vasos hialoides
- Hidratar las córneas del ratón con lágrimas artificiales, y luego, colocar el ratón en la etapa de posicionamiento.
- Contacte suavemente la córnea del ratón con la lente de la sonda OCT. Ajuste el ratón y la sonda para que la cabeza del nervio óptico esté en el centro del campo visual en la imagen del fondo, para guiar la imagen de OCT.
NOTA: Para obtener más detalles sobre la configuración general de un sistema de imágenes de retina de roedores (ver Tabla de materiales)y el ajuste de la posición del ratón, consulte Gong et al.28. - Ajuste el enfoque para lograr las imágenes óptimas de OCT.
- Ajuste el ángulo de la línea indicada en el software de imágenes OCT (consulte Tabla de materiales)para revelar recipientes hiloide persistentes y, a continuación, tomar imágenes.
- F undus f luoresceína a ngiografía imágenes de vasos hialoides
- Preparar una solución de fluoresceína: añadir 9 ml de solución salina estéril con fosfato (PBS) a 1 ml de solución de fluoresceína (concentración de stock: 100 mg/ml). La concentración de la solución de trabajo final es de 10 mg/ml.
- Inyecto intraperitonealmente la solución de trabajo con fluoresceína (5 l/g de peso corporal).
- Hidratar la córnea del ratón con lágrimas artificiales, y luego, colocar el ratón en la etapa de posicionamiento.
- Coloque la lente del microscopio de imágenes de retina Micron IV para establecer un contacto suave y directo con la córnea del ratón. Ajuste ligeramente la alineación para colocar la cabeza del nervio óptico en el centro del campo de vista.
- Cambie el filtro del microscopio a un canal fluorescente verde.
- Concéntrese en los vasos hialoide persistentes para tomar imágenes.
- Tome varias imágenes después de 1 min, 3 min, 5 min y 10 min (no más de 10 min) después de la inyección para determinar el mejor punto de tiempo (relación señal-fondo) para observar vasos hiloide. Complete el procedimiento FFA dentro de los 10 minutos, después de lo cual la fluoresceína puede volverse demasiado difusa y hacer invisibles los vasos.
- Recuperación de los ratones de la anestesia
- Después de los procedimientos, mantenga a los ratones en una almohadilla de calentamiento caliente.
- Espere hasta que los ratones vuelvan a ser móviles para devolverlos a la jaula del ratón.
2. Parte II: Visualización ex vivo de vasos hialoides
- Preparación de ojos fijos de ratón
- Seleccione ratones de la edad correcta.
NOTA: Los ratones neonatales suelen sacrificarse en P8 por disección hialoide. Ambos sexos son adecuados. Los ratones mutantes con una regresión hialoides retardada (y sus respectivos controles WT) pueden ser diseccionados y analizados a lo largo de la edad adulta. - Eutanasia a los ratones por exposición al CO2.
- Enuclea restar los ojos del ratón por disección contundente.
- Abra los párpados de par en par con fórceps de microcirugía para permitir el acceso al globo ocular. Coloque fórceps de microcirugía curvado debajo del globo en la órbita para agarrar el nervio óptico sin apretar el globo ocular. Tire suavemente y retire el globo ocular con los fórceps.
- Alternativamente, diseccione el globo ocular usando tijeras de microcirugía para cortar cuidadosamente paralelo al globo desde los cuatro lados hacia la parte posterior de la órbita y separando el globo de los tejidos conectivos circundantes.
- Sumerja los ojos en un 4% de paraformaldehído en el tampón PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente para la fijación.
- Transfiera los globos oculares fijos al amortiguador PBS helado.
NOTA: Los globos oculares pueden almacenarse en PBS a 4 oC durante un máximo de 1 semana.
- Seleccione ratones de la edad correcta.
- Incorporación de vasos hialoides con inyección de gelatina
- Preparar una solución de gelatina del 5% (p/v).
- Pesar 50 mg de gelatina.
- Disolver la gelatina en 1 ml de agua destilada.
- Incubar la solución de gelatina en un baño de agua a 37 oC hasta que se disuelva por completo. Conservar la solución en agua a 37oC hasta su uso.
NOTA: Se puede preparar y almacenar un lote más grande de solución a 4 oC como alícuotas. Cada vez antes de su uso, la solución necesita ser calentada en un baño de agua de 37 oC para lograr una consistencia clara.
- Bajo un microscopio de disección, inyectar 50 ml de solución de gelatina en el cuerpo vítreo en el limbo; repetir la inyección 3x en diferentes sitios para hacer un total de cuatro inyecciones, espaciados uniformemente alrededor del limbo (Figura2A).
- Incubar los globos oculares en un refrigerador de 4oC o en hielo durante 30 minutos para solidificar la gelatina inyectada en el espacio vítreo.
- Preparar una solución de gelatina del 5% (p/v).
- Disección y aislamiento de los vasos hialoide
NOTA: Véase la Figura 2B-E.- Coloque los globos oculares en un plato de Petri que contenga PBS para evitar que el tejido se seque. Haga una incisión con tijeras de microcirugía en el limbo y retire la córnea.
- Recorte y retire el nervio óptico.
- Bajo un microscopio de disección, usa dos pares de fórceps para despegar y desechar las capas de epinefrina, coroides y epitelio pigmentario de la retina (RPE) y eliminar el iris.
- Con el lado óptico-nervio de la retina hacia arriba y la lente hacia abajo, inyectar 50 éL de PBS justo debajo de la copa de la retina para permitir la acumulación del tampón PBS entre el cuerpo vítreo gelatinizado y la retina.
- Retire suavemente y retire la copa de la retina y el cuerpo ciliar del cuerpo vítreo con fórceps de microcirugía.
- Con una pipeta de transferencia, transfiera la copa de gelatina que contiene el tejido hialoide sumergido en PBS a una diapositiva del microscopio
- Gire el resto del tejido (lente/hialoides) hacia arriba, para que el lado de la lente esté mirando hacia arriba.
- Levante la lente y afloje suavemente la conexión entre la lente/TVL y el VHP, y luego, corte la HA con tijeras de microcirugía para quitar la lente-TVL. Mantenga la parte VHP de la copa hialoides para el montaje plano.
- Montaje plano y tinción de recipientes hialoides
- Enjuague suavemente la copa hialoides con PBS en la diapositiva para eliminar todos los restos de disección.
- Asegúrese de que la copa hialoide está flotando en la corredera en una solución PBS adecuada.
- Colocar y ajustar suavemente la posición de la copa hialoides gelatinizada con fórceps microcirugía, con el borde de la copa hacia abajo en el portaobjetos, para lograr un aspecto óptimo después de la fusión.
- Coloque el tobogán con la copa hialoides sumergida en PBS en un calentador de diapositivas a 37 oC, espere hasta que la gelatina se derrita y el hialoides se aplana, y retire el portaobjetos cuando esté apenas seco (no se seque demasiado).
- (Opcional) Inmunostaína de los vasos hialoide
- Hacer tampón de bloqueo y penetración (por ejemplo, albúmina sérica bovina al5% [BSA] y 0.1% Triton X-100 en el buffer PBS). Añadir 50 s de tampón de bloqueo a un aislamiento hialoide plano e incubarlo a temperatura ambiente durante 30 min.
- Aplicar 50 ml de anticuerpo primario (p. ej., CD31) (1:100 dilución en tampón de bloqueo) sobre un montaje plano de aislamiento hialoide, y luego, incubarlo en una caja húmeda a 4 oC durante la noche.
- Enjuague suavemente 3x, durante 5 min cada vez, con PBS.
- Aplicar 50 éL de anticuerpo secundario (p. ej., anticuerpo secundario anticonejo de cabra-Alexa 488, dilución 1:100) sobre el soporte plano hialoide e incubarlo a temperatura ambiente durante 1 h.
- Enjuague suavemente 3x, durante 5 min cada vez, con PBS.
- Añadir una gota de medio de montaje anti-fade con DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) para manchar los núcleos en los vasos hiloide.
- Coloque suavemente un cubreobjetos en el hialoides para completar el soporte plano.
- Imágenes y cuantificación de vasos hialoide de montaje plano
- Imagen de la tinción DAPI de vasos hialoides con un microscopio fluorescente y asegúrese de que la HA central sea visible (excluya las muestras sin la HA).
- Identificar las ramas de los buques directamente derivadas de la HA y contar manualmente el número de ramas de los buques para la cuantificación.
- Visualización de vasos hialoides en la sección transversal de los ojos
- Incruste los globos oculares fijos en un compuesto de temperatura de corte óptimo en un molde de tejido adecuado y, a continuación, congele los ojos incrustados en hielo seco o guárdelos en un congelador de -20 oC.
- Utilice un microtomo de criostato para hacer una sección transversal de los ojos incrustados en secciones de 12 m de espesor a -20 oC.
- Recoja las secciones transversales del ojo en la temperatura de la sala de diapositivas del microscopio tocando suavemente las secciones de tejido, que se adhieren a la diapositiva.
- Secar al aire para deshidratar las secciones de tejido durante 30 minutos, que luego se pueden almacenar en un congelador de -20 oC hasta que esté listo para la tinción.
- Enjuague la diapositiva 1x con PBS para eliminar el compuesto de temperatura de corte óptimo restante en la diapositiva.
- (Opcional) Sumerja la corredera en un búfer fijador adecuado (por ejemplo, un 4% de paraformaldehído en PBS) durante 15 minutos a temperatura ambiente para una fijación adicional, si es necesario.
- Permeabilizar el tejido con 0.1% Triton X-100 en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
- Preparar tampón de tinción de isolctina-IB4 para la tinción de los vasos sanguíneos.
- Disolver y reconstituir el polvo de isolectina-IB4 (500 g) con 50 ml de PBS en un tubo centrífugo de 50 ml.
- Añadir lentamente 50 ml de 1 M de caCl2 solución, gota a gota, en los 50 ml de la mezcla PBS/isolectin-IB4. Este paso debe realizarse lentamente para evitar precipitaciones. La concentración final de CaCl2 es de 1 m. Se requiere la presencia de Ca2+ para la tinción de isolctina-IB4.
- Aplicar 30 s de tampón de tinción de isolctina-IB4 en las secciones transversales del ojo en la diapositiva e incubarlo en una caja húmeda a 4 oC durante la noche.
- Enjuague 3x, durante 5 min cada vez, con PBS.
- Agregue una gota de medio de montaje anti-fade con DAPI para manchar los núcleos en las secciones.
- Coloque suavemente un cubreobjetos en las secciones de tejido para completar el soporte plano.
- Revise el tejido bajo un microscopio para visualizar la presencia de vasos hialoides dentro del ocular.
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Representative Results
Imágenes in vivo de vasos hialoide en ratones vivos
Figura 3 A revela vistas transversales de imágenes de PTU para la retina y los tejidos hialoides en ratones WT y Lrp5-/-de 3 meses de edad, un modelo animal con hiloide persistente. El ojo WT muestra la ausencia de tejido hialoide, mientras que el ojo Lrp5-/-muestra dos vasos hialoide persistentes derivados de la cabeza del nervio óptico. Figura 3 B muestra imágenes FFA de vasos hialoide persistentes (verdes) en el campo fluorescente en ratones Lrp5-/- de 6 semanas de edad. El ratón WT no muestra ningún remanente de vasos hialoide, y el ratón Lrp5-/-muestra ocho ramas de vasos hialoide en el cuerpo vítreo.
Visualización ex vivo de vasos hialoide
Figura 4 A,B demuestra vasos hialoideaislados aislados visualizados en soportes planos, donde las células vasculares y los macrófagos asociados fueron manchados por sus núcleos con la tinción DAPI (azul). La HA está en el centro de cada imagen, y los vasos hialoide son revelados por las líneas discontinuas derivadas de DAPI. Cada línea representa un buque de VHP. En ratones Lrp5-/-,se observó un mayor número de vasos hialoide restantes en P8 en montajes planos (Figura4A). Los ratones WT tenían un promedio de 12 ramas de vasos hialoide en P8, mientras que los cachorros Lrp5-/- coincidentes con la edad mostraron alrededor de 25 ramas de vasos hialoide, lo que demuestra una regresión significativamente deteriorada de la vasculatura hialoides (Figura4 B). Además, el desarrollo vascular de la retina retardada e incompleto, otra característica a menudo asociada con los vasos hialoide persistentes, también se observó en los cachorros Lrp5-/- (Figura4C,D). La Figura 5 muestra los vasos hialoide restantes en secciones transversales de Lrp5-/-ojos en P8, mientras que los ojos WT no muestran vasos hialoides.
Figura 1 : Diagrama esquemático que representa la regresión del desarrollo de la vasculatura hialoides en los ojos del ratón. Los vasos y ramas hialoide, incluyendo VHP, TVL y PM, se derivan de la HA, y ocupan gran parte del espacio entre la lente y la retina inmadura al nacer (P0). La involución hialoides en ratones comienza con la regresión de los capilares PM ya en cuanto p4. En P8, PM, VHP y TVL las capas están retrocediendo continuamente, coincidiendo con la formación completa de la capa superficial de los vasos retinianos. Para P12, la involución de la capa PM es completa, mientras que la atrofia de VHP y TVL todavía está en curso. Mientras tanto, una capa profunda de vasos retinianos comienza a formarse durante P7–P12. Para P16, la regresión del sistema hialoide se completa parcialmente (con los vasos TVL restantes y la IZQUIERDA), y la capa intermedia del plexo vascular retiniano continúa desarrollándose. La vasculatura retiniana está completamente madura por P21 y asume el papel de nutrir los tejidos de la retina de los vasos hialoide, que ahora son en su mayoría regresivos. En P21, el vítreo, en ausencia de vasos hialoides, muestra una vía visual clara. Las líneas rojas discontinuas representan los vasos regresivos. VHP á vasa hyaloidea propria; TVL - tunica vasculosa lentis; PM - membrana pupilar; HA - arteria hiloide. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Diagrama esquemático que representa el procedimiento secuencial del aislamiento del vaso hialoide para ex vivo montaje plano visualización. (A) Inyección de gelatina en el ojo enucleado a través de cuatro puntos de inyección (puntos rojos) en el limbo, para solidificar el cuerpo vítreo. (B) Extirpación de la córnea y el nervio óptico, disección cuidadosa del iris y descamación del complejo esclerótica-choroides-RPE. (C) Voltear el vasos de retina restantecon la lente para hacer que el lado de la retina se enfrente; luego, inyectando PBS entre la retina y el cuerpo vítreo para separarlos, seguido de despegar la capa de retina. (D) Volteando boca abajo de nuevo el resto del tejido, que contiene la lente con el hialoides circundante. Levantar ligeramente la lente para aflojar la conexión de TVL y VHP. (E) Corte en la HA entre el TVL y el VHP, y la extracción de la lente y TVL. Capa VHP de montaje plano. VHP á vasa hyaloidea propria; TVL - tunica vasculosa lentis; PM - membrana pupilar; HA - arteria hiloide. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Imágenes in vivo de vasos hialoide con tomografía de coherencia óptica (OCT) y angiografía por fluorescencia del fondo (FFA). R: Imágenes representativas de OCT de WT y Lrp5-/-ratones a 3 meses de edad que muestran vasos hialoide persistentes en el espacio vítreo en los ojos Lrp5-/-. B: Imágenes representativas de ffA de ratones WT y Lrp5-/-a las 6 semanas de edad. Los ratones se inyectaron con 1mg de fluoresceína sódica en 0,1 ml de solución salina por ratón después de la anestesia, y se tomaron imágenes 5 minutos después de la inyección, centradas en vasos hialoide en ratones Lrp5-/-en ratones o cuerpo vítreo en WT (en ausencia de vasos hialoide). Los vasos hialoide persistentes se visualizaron en los ojos Lrp5-/-pero no WT. Las flechas rojas indican vasos hialoide. Ambas barras de escala: 100 m(A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Visualización de la regresión tardía del vaso hialoide y el desarrollo retardado de vasculatura de la retina en ratones Lrp5-/-. (A) Imágenes representativas de recipientes hialoides de montaje plano teñidos con DAPI (azul) en WT y Lrp5-/-ojos en P8. Las flechas (blancas) indican la arteria hialoide. (B) Cuantificación del número de vasos hialoides que se ramifican desde la arteria hiloide en los ojos WT y Lrp5-/-. (C) Retinas representativas de montaje plano teñidas con isolctina-IB4 (rojo) para la vasculatura en WT y Lrp5-/-ojos en P8. Las líneas discontinuas blancas indican el borde de la retina. Las líneas amarillas indican el borde del área vascularizada. (D) Cuantificación de la cobertura vascular del plexo vascular superficial de la retina en los ojos WT y Lrp5-/-. n 8–12/grupo. Las barras de escala en los paneles A y C a 1 mm. Los datos se muestran como medias - SEM. Prueba tdel estudiante de dos colas se utilizó para el análisis estadístico. **P < 0.01. Esta figura se modifica con el permiso de Wang et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Visualización de vasos hialoides en secciones transversales de Lrp5-/-ojos. Imágenes representativas de secciones transversales de los ojos aisladas de los ratones WT y Lrp5-/-en P8. Los ojos estaban enucleados e incrustados a una temperatura de corte óptima, y las secciones se cortaban con criostato. Las secciones transversales se teñieron con DAPI (azul) para mostrar los núcleos y la isolctina-IB4 (rojo) para mostrar los vasos sanguíneos. Las flechas blancas indican vasos hialoide. La barra de la báscula es de 500 m. Esta figura está adaptada con el permiso de Chen et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las técnicas para evaluar y caracterizar los vasos hialoides son procedimientos intuitivos y necesarios para observar la regresión del vaso hialoide en modelos animales, para permitir estudios sobre los mecanismos subyacentes a la regresión vascular durante el desarrollo. Si bien la imagen retiniana in vivo permite la observación longitudinal de la regresión hialoides en el mismo animal, el acceso a un sistema de imágenes de fondos para roedores para LA OCT y la FFA puede ser un factor limitante. Además, la toma de imágenes in vivo en ratones vivos no es factible antes de abrir los ojos. Por lo tanto, esta metodología no es aplicable durante el desarrollo ocular en la etapa neonatal. Por otro lado, mientras que las imágenes secciones transversales de ojos aislados se pueden utilizar para cualquier edad del ratón y tiene una barrera técnica baja, no es cuantitativa cuando sólo hay unos pocos vasos hialoidevisibles visibles, y la posibilidad de obtener una imagen ideal depende en gran medida de la ángulo de seccionamiento (Figura5). En comparación, el aislamiento de los recipientes hialoide para la visualización de montaje plano permite la toma de imágenes completas de todo el recipiente hialoide y la cuantificación precisa, sin embargo, pueden existir desafíos técnicos debido a la naturaleza delicada y frágil de los vasos hialoides. Esperamos que el protocolo detallado en este documento ayude a superar estos desafíos.
Varios pasos críticos en el protocolo de aislamiento hialoide incluyen la inyección de la solución de gelatina, la eliminación de la retina y el montaje plano final. La dificultad técnica de manejar la vasculatura hialoide radica en su naturaleza delicada, el estado casi líquido del vítreo donde residen los vasos hialoide, y su estrecha conexión con la lente adyacente y la retina. Inyectar solución de gelatina intravitrealmente es clave para solidificar el cuerpo vítreo que contiene vasos hialoidey y, por lo que, hacer su textura más firme para facilitar la disección y el manejo. La gelatina es un agente gelificante que forma geles termoreversibles elásticos transparentes. Inyectando la forma líquida de gelatina (a temperatura ambiente o a 37oC) en el espacio vítreo y enfriándola a una temperatura más baja (4oC), el cuerpo vítreo se transforma en una copa de gel más firme. La realización de múltiples inyecciones de gelatina en el ojo permite la dispersión completa de una cantidad suficiente de gelatina en el espacio vítreo, para formar una copa de tejido hialoides gelatinizado uniforme y redonda. Otra dificultad técnica radica en la eliminación de la retina sin dañar el tejido hialoide. A diferencia de la coroides, que es relativamente fácil de diseccionar, el cuerpo vítreo gelatinizado que contiene vasos hialoides es difícil separarse de la retina cercana sin dañar el hialoide. Encontramos que inyectar PBS en el espacio entre el cuerpo vítreo y la retina generó una capa de tampón líquido, por lo que es mucho más fácil separar estos dos tejidos. Esto es algo similar a la técnica de hidrodisección utilizada en la cirugía de cataratas para separar la cápsula y la corteza de cataratas. El montaje plano final es el último paso técnicamente difícil del protocolo. Calentar el tejido hialoides gelatinizado en una gota de PBS en un calentador de diapositivas lo convierte de nuevo en una forma más líquida para permitir un montaje plano más fácil. La disposición adecuada y la orientación de la copa de gel hialoide sigue siendo esencial para garantizar su incluso aplanamiento después de la fusión y el secado.
El protocolo de aislar los vasos hialoides puede modificarse de varias maneras. La concentración de solución de gelatina que utilizamos es del 5%, pero las concentraciones más altas o más bajas también pueden funcionar, dependiendo de la preferencia del investigador para lograr una textura más firme o más suave para el manejo. La tinción DAPI de los núcleos celulares también se puede modificar con isolctina-IB4 u otros marcadores de células endoteliales o macrófagos, para distinguir mejor las células endoteliales vasculares de los macrófagos. Una palabra de precaución: los recipientes hialoides de montaje plano son muy delicados y sólo se adhieren libremente al portaobjetos; por lo tanto, las correderas hialoides deben manipularse con mucha cuidado y cuidado si se necesita un enrrecido durante la tinción. Este protocolo de aislamiento también tiene sus limitaciones, incluyendo la complejidad de realizar la disección fina y la dificultad de la preservación a largo plazo de las muestras debido a la naturaleza del tejido frágil. Sin embargo, aislar y montar vasos hialoides de montaje plano sigue siendo la forma más completa e intuitiva de estudiar la vasculatura hialoide, para promover estudios oculares y de angiogénesis10,17,27, 29,30,31.
La vasculatura hialoide proporciona un excelente modelo experimental de estudio del crecimiento y la regresión de los vasos de desarrollo, relevante para los campos de investigación en oftalmología, angiogénesis y muerte celular programada, con el que este artículo tiene como objetivo ayudar. Las modificaciones futuras del protocolo de aislamiento pueden estar dirigidas a mejorar la viabilidad de un procedimiento de disección técnica. En general, la imagen in vivo combinada y el aislamiento ex vivo de los vasos hialoides es un método ventajoso para permitir la evaluación completa y caracterización de los vasos hialoide en ratones como un modelo útil de regresión vascular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las becas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (R01 EY024963 y EY028100) a J.C. Z.W. contó con el apoyo de una beca de iniciación profesional de la Knights Templar Eye Foundation. El procedimiento de aislamiento hialoide descrito en este estudio fue adaptado con la modificación de protocolos generosamente compartidos por los doctores Richard Lang, Toshihide Kurihara y Lois Smith, a quienes los autores están agradecidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor (fluorescein injection, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | Stock NO: 000664 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Cyclopentolate hydrochloride and phenylephrine hydrochloride eyedrop | Cyclomydril | N/A | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Heating board | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| Ketamine hydrochloride injection | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- mice | The Jackson Laboratory | Stock NO. 005823 | Developed by Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV and OCT | Phoenix Research Labs | N/A | Imaging software: InSight |
| Microscope | Zeiss | discovery v8 | |
| Microsurgery forceps | Scanlan International | 4004-05 | |
| Microsurgery scissors | Scanlan International | 6006-44 | |
| Optimal cutting temperature compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Optimal cutting temperature compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds (tissue molds) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (10X) | Teknova | P0496 | |
| Slide cover glass | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Xylazine sterile solution | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
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