Summary
Здесь мы демонстрируем магнитно-резонансную (MR) конвекцию повышенной доставки (CED) вирусных векторов в кору как эффективный и упрощенный подход для достижения оптогенетической экспрессии в больших корковых областях в мозге макаки.
Abstract
В оптогенетике нечеловеческих приматов (NHP) заражение крупных корковых участков вирусными переносчиками часто является трудной и трудоемкой задачей. Здесь мы демонстрируем использование магнитно-резонансной (MR) конвекции расширенной доставки (CED) оптогенетических вирусных векторов в первичные соматосенсорные (S1) и моторные (M1) кортики макаки для получения эффективного, широко распространенного коркового экспрессии светочувствительных ионных каналов. Адено-ассоциированные вирусные (AAV) векторы, кодирующие красно-сдвинутый опсин C1V1, слитый с желтым флуоресцентным белком (EYFP), были введены в кору резус-макак под MR-управляемым CED. Три месяца после вливания эпифлюоресцентная визуализация подтвердила большие областиоптогенетической экспрессии (130 мм 2) в М1 и С1 в двух макаках. Кроме того, мы смогли зафиксировать надежные световые реакции электрофизиологии из выражающихся областей с помощью микроэлектрокортикографических массивов. Позже гистологический анализ и иммуностоинирование в отношении репортера выявили широко распространенную и плотную оптогенетическую экспрессию в М1 и С1, соответствующую распределению, указанному эпифлуоресцентной визуализацией. Этот метод позволяет нам получить экспрессию на больших участках коры головного мозга в течение более короткого периода времени с минимальным ущербом по сравнению с традиционными методами и может быть оптимальным подходом для оптогенетических вирусных родов у крупных животных, таких как NHPs. Такой подход демонстрирует большой потенциал для сетевого уровня манипуляции нейронных цепей с клеточной типом специфичности в животных моделях эволюционно близко к человеку.
Introduction
Оптогенетика является мощным инструментом, который позволяет манипулировать нервной деятельностью и изучение сетевых связей в головном мозге. Внедрение этой методики в нечеловеческих приматах (NHPs) имеет потенциал для улучшения нашего понимания крупномасштабных нейронных вычислений, познания и поведения в мозге приматов. Хотя оптогенетика была успешно реализована вNHPs в последние годы 1,2,3,4,5,6,7, вызов, который Исследователи сталкиваются достигает высокого уровня экспрессии через большие области мозга у этих животных. Здесь мы обеспечиваем эффективный и упрощенный подход для достижения высокого уровня оптогенетической экспрессии на больших участках коры головного мозга у макак. Этот метод имеет большой потенциал для улучшения текущих оптогенетических исследованийу этих животных в сочетании с современной записи 8,9 и оптической стимуляции10 технологий.
Конвекция расширенные поставки (CED) является установленным методом доставки фармакологических агентов и других крупных молекул, в том числе вирусных векторов, в центральную нервную систему11,12,13. В то время как обычные методы доставки включают в себя несколько небольших вливаний, распределенных по небольшим областям мозга, CED может достичь более широкого и даже распределения агентов с меньшим количеством вливаний. Давление управляемых объемных потока жидкости (конвекция) во время инфузии позволяет более широко и равномерно распределенной трансдукции целевой ткани при доставке вирусных векторов с CED. В недавних исследованиях мы продемонстрировали трансдукцию и последующее оптогенетическое выражение больших участков первичного двигателя (M1) и соматосенсорных (S1) кортиков9 и таламуса14 с помощью магнитно-резонансного (MR) управляемого CED.
Здесь мы планируем использование CED для достижения оптогенетической экспрессии в больших корковых областях только с несколькими инъекциями корковых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Калифорнийским университетом, Сан-Франциско Институциональный комитет по уходу за животными и использованию (IACUC) и соответствуют Руководству по уходу и использованию лабораторных животных. Следующая процедура была проведена с использованием двух взрослых мужчин резус макак и 8 и 7 лет, весом 17,5 кг и 16,5 кг (обезьяна G и обезьяна J), соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стандартные асептические методы для всех хирургических процедур.
1. Базовая визуализация
- Седативные и интубировать животное и поддерживать общую анестезию под изофлюран (концентрация изменилась от 0 до 5% по мере необходимости, в зависимости от жизненно важных признаков, таких как частота дыхания и частота сердечных приступов). Мониторинг температуры животного, частота сердечных приступов, насыщение кислородом, электрокардиографические реакции и конечноприливное частичное давление CO2 на протяжении всей процедуры.
- Поместите животное в MR-совместимую стереотаксию (см. таблицуматериалов), в которой оно останется на протяжении всей процедуры. Подключите животное к портативной Mr-совместимой изофрурановой машине и транспортите его на МРТ-сканер (3 T).
- Приобрести стандартный T1 (флип угол 9 ", время повторения / эхо время 668,6, размер матрицы 192 х 192 х 80 , толщина среза - 1 мм) и T2 (флип угол 130 ", время повторения / эхо время 52,5, размер матрицы 256 х 256 х 40 , толщина ломтика 1 мм) справки и для хирургического планирования.
- Восстановить животное от наркоза и транспортировать его в район проживания животных.
- Используйте приобретенные изображения T1 и T2 для определения размещения краниотомии. Расположение краниотомии можно точно определить путем сопоставления корковой области интереса от MR с макаки атлас мозга (Paxinos, Хуан, Петрид, Тога 2nd Edition). Кроме того, эти базовые изображения могут дать оценку местоположений вирусного вливания. Здесь продемонстрированы корковые области, представляющие интерес, - M1 и S1.
2. МР-совместимая камерная имплантация
- Успокойте и интубировать животное и поддерживать общую анестезию со стандартным анестезиологическим мониторингом, как в 1.1.
- Поместите животное в MR-совместимую стереотаксию рамку, в которой оно останется на протяжении всей камерной имплантации и вирусной переносоционной доставки. Подключите животное к портативному MR-совместимому изофрурановому аппарату.
- Создайте сагитальный разрез примерно на 2 см от средней линии длиной около 5 см скальпелем.
- Удалите основную мягкую ткань из черепа с помощью лифтов (см. Таблицаматериалов).
- Создайте круговую краниотомию (диаметр омички 2,5 см) для покрытия заранее спланированных траекторий для инъекций с помощью трефина (см. ТаблицуМатериалов).
- Нижняя точка центрирования трефина мимо края трефина. Создайте отступ в центре запланированной краниотомии достаточно глубоко в черепе, чтобы закрепить трефин с помощью регулируемой точки центрирования трефина. Упражнение осторожность, чтобы избежать полностью проникает через глубину черепа, как это может привести к повреждению основной нервной ткани.
- Периодически промыть области с физиологии по мере необходимости для поддержания влаги ткани всей краниотомии.
- После того, как центр был сделан, опустите трефин на череп и поверните трефин по часовой стрелке и против часовой стрелки при применении понижательное давление, пока костная крышка может быть удалена с помощью щипцов. Упражнение осторожность, чтобы избежать повреждения основной ткани с трефином.
- Нить тонкой шов (размер 6-0) через дюру в центре краниотомии и поднять дюру, осторожно потянув шов с поверхности мозга создания палатки в центре краниотомии.
- Далее, прокол дюра близко к центру палатки с помощью тонких офтальмологических ножниц, чтобы избежать повреждения мозга. Затем вырежьте дюру от центра до края краниотомии и продолжайте по краю мелкими оптальмичными ножницами.
- Смонтировать цилиндрический пользовательских CED MR-совместимой камеры(Рисунок 1; см. раздел 4 для производства инструкций) на череп на вершине краниотомии, чтобы обеспечить поддержку канюли во время вливания CED так, что кривизна камерного фланга выравнивается хорошо с кривизной черепа.
- Защищайте имплантаты черепа с помощью пластиковых винтов и акрила зубов или нескольких титановых винтов.
3. Доставка вирусного вектора
- Вскоре после имплантации MR-совместимой камеры и вставки сетки инъекций канюли(рисунок 1A-B, Дополнительная фигура 1) в камеру, заполните сетку сольником (0,9% NaCl) для визуализации мест инъекций с помощью анатомических изображений И заполнить камерные полости влажным стерильным поглощаемым желатином для поддержания влажности мозга(рисунок 1F).
- Обложка кожи и цилиндра с стерильной противомикробной резки драпировки для поддержания стерильности цилиндров во время транспортировки и МР вливания. Поместите капсулу витамина Е, чтобы отметить верхнюю часть сетки инъекций для положительной идентификации.
- В то время как животное остается интубированным, отсоедините эндотрахеялую трубку от наркоза и прикрепите ее к переносной mr-совместимой изофрурановой машине и транспортировать животное к Магнитно-резонансному тому.
- Приобретите изображения T1 (угол флипа , 9 евро, время повторения/эхо-время 668,6, размер матрицы - 192 х 192, толщина среза 1 мм, 80 ломтиков) для расчета расстояния от верхней части впрыска сетки и корковой поверхности. Капсула витамина Е хорошо видна на изображениях T1 и должна использоваться в качестве маркера для верхней части сетки инъекций(рисунок 2A). Используйте инструмент линейки программного обеспечения MR для измерения расстояния между верхней частью сетки для впрыска и корковой поверхностью.
- Приобретите T2 изображения (флип угол 130 ", время повторения / эхо время 52,5, размер матрицы 256 х 256, толщина ломтика 1 мм, 45 ломтиков), чтобы определить оптимальные направляющие канюля для каждого сайта на основе целевого сайта инфузии (Рисунок 2B-C). Как упоминалось ранее, сетка cannula наполнена сольным раствором, который лучше всего виден на изображениях T2. Используя программное обеспечение для визуализации MR, прокрутите корональные и сагитальные плоскости, чтобы найти целевое место вливания.
- После оттаивания вирусного вектора в течение нескольких часов при комнатной температуре, смешайте вирусный вектор с контрастным агентом MR gadoteridol (коэффициент 250:1; 2mM Gd-DTPA, см. Таблица материалов) пипеткой или перемешиванием вихря.
ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный метод был протестирован на векторы AAV с моторикой CamKIIa вождения выражение C1V1 слиты с EYFP (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, титр: 2,5 х 1012 молекул вируса / мл; см. Таблица материалов). - Загрузите смешанный вирус в трубку высокого давления 0,2 мл (см. Таблицаматериалов).
- Установите стерильное поле за пределами сканера MR для подготовки линии вирусного инфузии.
- Используя трубки высокого давления IV, соедините длинную линию расширения (примерно 3-5 метров, в зависимости от расположения инфузионного насоса по отношению к скважине MR) к шприцу 3 мл, а также к сольному.
- Соедините дистальный конец длинной линии расширения к проксимальному концу 0,2 мл IV труб, загруженных вирусом, и прикрепите рефлюкс-резистентную канюлю с 1 мм ступенчатой наконечником (Рисунок 2D; см. раздел 5 для инструкций по производству канюли) к дистальному концу эта сборка с разъемом катетера в стиле зажима (см. Таблицаматериалов) (рисунок2E).
- Наконец, установите шприц в MR-совместимый насос (см. Таблицаматериалов). Поместите контроллер насоса в комнату управления сканером, поскольку он не совместим с MR-
- Используя базовые анатомические изображения MR, полученные ранее, выберите место расположения сетки инъекций cannula и глубину вставки, необходимую для достижения целевого места инфузии. Отметьте глубину вставки на канюле с помощью стерильной ленты.
- Начните настой со скоростью 1 л/мин и визуально проверить поток жидкости в линии инфузии, наблюдая выброс жидкости из кончика канюли.
- Вставьте канюль вручную через сетку инъекций на целевую глубину, сохраняя поток в линии инфузии, так как это предотвратит засорение канюли во время вставки.
- Приобретите быстрые (2 минуты) флэш-изображения T1 (угол флип-угол - 30 евро, время повторения/эхо- 3,05, размер матрицы - 128 х 128, толщина срезов - 1 мм, 64 ломтика) для онлайн-мониторинга вливания вирусного вектора.
- После вливание 10 qL переносчика так, что достаточно вирус вливается для обнаружения в сканере MR, получить МР изображения для проверки правильного размещения канюли, как видно по наблюдаемому распространению вируса. Если глубина вставленной канюли неверна, отрегулируйте глубину соответственно или медленно удалите канюль и повторно попытайте вставку как в 3.12.
- Мониторинг инфузии с помощью руководства онлайн МР-изображений (флэш T1 взвешенных) и увеличить скорость инфузии до 5 л / мин на 1 Л / мин шаги каждые несколько минут(рисунок 3A).
- После вливания примерно 40 л вирусного вектора, начните снижать скорость инфузии на 1 л/мин и остановите настой после введения 50 qL и оставьте канюлю на месте в течение 10 минут.
- Медленно удалите канюлу из мозга и перейдите к следующему месту. Повторите шаги от 3,9 до 3,19 для каждого местоположения.
- Накройте цилиндр стерильной драпировкой в конце инъекций, перед транспортировкой животных. Затем транспортировать животное обратно в операционную.
- Либо explant MR-совместимой камеры и закрыть хирургический разрез, заменив костной лоскут и надлежащую мышцу и зашивание кожи с помощью стандартных методов асептика или заменить камеру с титановым цилиндром и искусственным dura (см. Яздан-Шахморад и др.9 ) для нейронной записи и стимуляции.
4. МР-совместимое камерное производство
- Изготовить сетку инъекций нейлоновой канюли(рисунок 1A-B) путем обработки в соответствии с указанными размерами (Дополнительнаядиаграмма 1).
- 3D печать MR-совместимый цилиндр из акрилонитрила бутадиена стирола (ABS0 пластика(рисунок 1C-E) (см. Дополнительный файл 1-3; см. Таблица материалов для 3D принтера и материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Один дизайн поддерживает фиксированную сетку впрыска канюли в пределах MR-совместимого цилиндра(рисунок 1C),в то время как другой позволяет вращение сетки, расширяя область впрыска (рисунок1D-E). - Нить канюли инъекции сетки и нажмите соответствующую полость MR-совместимой камеры так, что обе части экспонат же резьбы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любой тип резьбы может быть использован при условии, что оба компонента имеют одинаковую резьбу. - Вставьте сетку инъекций нейлоновой канюлевы, завинчивая в прослушивание отверстия цилиндра, совместимого с MR.
5. Рефлюкс-устойчивой Cannula Производство13
- Вырезать 30 см длиной кремнезема труб с 0,32 мм ID и 0,43 мм OD для внутреннего кремнезема труб (см. Таблица материалов) с помощью лезвия бритвы.
- Вырезать 7,5 см длиной и 5 см длиной кремнезема труб с 0,45 мм ID и 0,76 мм OD для наружных труб кремнезема (см. Таблица материалов).
- Придерживайтесь 7,5 см наружной трубки 30 см внутренней трубки с цианоакрилат таким образом, что внутренняя трубка простирается на 1 мм за пределы внешней трубки, что делает рефлюкс-стойкий шаг(Рисунок 2D). Для обеспечения того, чтобы цианоакрилат не входит внутрь внутренней трубки, поместите цианоакрилат на внешней стороне внутренней трубки далеко от кончика канюли.
- Вставьте 5 см длиной силика труб на другой конец внутреннего труб для крепления к разъему катетера зажима (см. шаг 3.10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конвекция Улучшенная доставка (CED) под руководством МРТ
Распространение вирусного вектора отслеживалось во время вливания CED под руководством онлайн-изображений MR(рисунок 3A). В этом исследовании, S1 и M1 из двух обезьян были направлены(Рисунок 3B). Трехмерные объемы распределения были оценены в пост-специальном анализе изображений MR(рисунок 3C), описанномYazdan-Shahmorad et al. 2016 9, подтверждающим охват больших площадей коры головного мозга. Вливания M1 для обезьяны G были сделаны без руководства MR из-за временных ограничений.
Проверка вирусного выражения
Большое коркическое оптогенетическое выражение было подтверждено эпифлуоресцентной визуализацией, электрофизиологическими записями и гистологическим анализом, описанным Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Мы отслеживали оптогенетическое выражение поверхностной эпифлюоресценции изображения флуоресцентного репортера2,9 и оценили более 130 мм2 выражения вдоль корковой поверхности в M1 и S1 из двух макак из трех корковых инъекций9,15. Световая стимуляция (488 нм, мощность 20 мВт на кончике; см. ТаблицаМатериалов) дала надежные электрофизиологические реакции в выражающихся областях, измеряемых полупрозрачными микроэлектрокортикографическими массивами8,9 ,16 (рисунок4).
Анализ MR изображения дали оценкам 233 мм3 и 433 мм3 вектора распространения в M1 и S1 обезьяны J, соответственно, и 317 мм3 в S1 обезьяны G9. Мы провели гистологический анализ серийных корональных секций и наблюдали крупномасштабную оптогенетическую экспрессию вокруг инфузионных участков в M1 и S1(рисунок5C-I), при этом, по оценкам, 70-80% клеток выражали опсин. Выражение, наблюдаемое из гистологии, совпадает с предполагаемым распределением экспрессии от эпифлуоресцентной визуализации(рисунок 5A-D). Один из двух вливаний, выполненных за пределами сканера MR у обезьяны G, оказался неудачным, не выдав никакого выражения в соответствующем регионе(рисунок 5D). Распространение, оцениваемые с помощью Mr изображений, полностью в рамках как эпифлуоресцентных, так и гистологических показателей вирусного распространения(рисунок 5E-G). Расширение эпифлуоресцентной визуализации за пределы оценки MR можно объяснить распространением вирусных частиц за пределы области адвакции. Кроме того, гистологическая оценка выходит за рамки оценки эпифлюоресценции из-за отсутствия оптического доступа за пределы краниотомии. Подробная информация об этих методах включены в наш предыдущий документ9.
Рисунок 1: MR-совместимый цилиндр и канюля инъекций сетки. (A,B) специально разработанные нейлоновые инъекции сетки. (C) MR-совместимый фиксированный цилиндр. (D,E) Вращающийся цилиндр, совместимый с MR. (F) MR-совместимый инфузионный цилиндр с фиксированным положением сетки. Стрелки указывают на полости, которые предназначены для заполнения влажным стерильным абсорбируемым желатином, сохраняя поверхность мозга влажной в течение длительности инъекций. (G) Каннула вставляется в сетку. Эта цифра была изменена с Яздан-Шахморад и др. 20169. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Базовая мР-изображения и рефлюксустойчивые канюли. (A) T1-взвешенное изображение витамина Е, который был прикреплен к верхней части сетки инъекций, что позволяет нам измерить расстояние до поверхности мозга (белая стрелка). (B) T2-взвешенное изображение мозга помогает спланировать расположение инъекции из сетки канюли заполнены сольным раствором. (C) MR изображение инфузионной камеры и солевые заполненные канюли сетки. Ортогоналальные линии представляют сагитальные (желтые) и корональные (фиолетовые) плоскости. (D) Фото рефлюкс амфлюкс устойчивых инъекций канюли отзыв с рефлюксом устойчивый шаг (черная стрелка). (E) Линии инфузии. Эта цифра была изменена с Яздан-Шахморад и др. 20169. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Mr-изображение во время инфузии и предполагаемого распределения. (A) Распространение 50 зЛ вирусного вектора в корональных разделах Monkey G для одного места инъекции в S1 (показано со стрелой в B). (B) МРТ поверхности рендеринга корковой поверхности ниже цилиндра для обезьян G и J, соответственно. Места вливания S1 отображаются синим цветом, M1 - красным цветом. (C) MR Объем реконструкции распространения вирусного вектора после вливания CED. Мозг показан в светло-серый; Объемы вливания S1 и M1 показаны синим и красным цветом соответственно. Нет реконструкции объема MR доступна для m1 инфузий для обезьяны G, поскольку они не были сделаны в сканере MR. Эта цифра была изменена с Яздан-Шахморад и др. 20169. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Электрофизиологические записи свето-вызываемых активности. Записи микроэлектрокортикографии (ЗекоГ) происходили во время импульсной оптической стимуляции. Запись следов были от ближайшего электрода к месту стимуляции для примеров M1 (красный) и S1 (зеленый) местастимуляции. Затененные области вокруг следов представляют собой стандартную ошибку в 25 пробах. Синие квадраты на трассах показывают время стимуляции (1 мс). Полный набор стимулирующих волн для обеих пар образцов стимуляции и записывающих сайтов накладывается на средней волновой форме, как показано на левой стороне панели. Эта цифра была изменена с Яздан-Шахморад и др. 20169. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Гистологический анализ. (A) Базовое короналое изображение MR у обезьяны G. (B) Распространение контрастного агента после инфузии для того же мр коронарного ломтика, как в A. (C) Секция корональной ткани примерно из того же участка, что и в A и B; окрашивание перекисной корыт отражает выражение репортера EYFP. (D) Хорошее выравнивание наблюдается между областью экспрессии EYFP измеряется с эпифлоресценцией поверхности (темно-зеленые области) и с гистологическим окрашиванием (светло-зеленые линии). К ним относятся область распространения переносчиков, оцениваемых по изображениям MR (белая линия); белые точки указывают на места инъекций, и вся черная область представляет область, подверженную краниотомии. Два левых большинство инъекций сайты расположены в M1, и два правых большинство сайтов расположены в S1. (E) Низкое увеличение изображения коронального раздела окрашенных антителами анти-GFP показаны посредственно-боковой аспект выражения YFP в соматосенсорной коре обезьяны J (области 1, 2, 3). Черная наконечник стрелы указывает на расположение трассы канюли; смежной ткани (черный кадр) показан в F, при большем увеличении, чтобы показать ламинарное распределение YFP-положительных клеток. (F) Плотно заселенные области YFP-положительных клеток расположены преимущественно в слоях II-III и V-VI, а также показывают типичную пирамидальную морфологию (клетки в белых кадрах еще больше увеличиваются в панелях(G-I). Белые наконечники стрел на нижних панелях G-Iуказывают на типичные пирамидальные клетки в слоях II-III (G); слой V(H); и слойVI (I ). Шкала баров 2 мм (E); 200 мкм (F); 100 мкм (G-I). Эта цифра была изменена с Яздан-Шахморад и др. 20169 и Яздан-Шахморад и др. 201815. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная диаграмма 1: Сетка инъекций канюли до резьбы. Длина и диаметр впрыска сетки 15,00 мм и 12,00 мм соответственно. Рисунок впрыска сетки состоит из отверстий диаметром 0,8 мм, образующих три концентрических круга (диаметр: 1,6, 3,2 и 4,8 мм) вокруг центра сетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы намечаем осуществимую и эффективную технику для достижения крупномасштабной оптогенетической экспрессии в первичной соматосенсорной и моторной коре NHP с помощью MR-управляемого CED. Использование MR-управляемого CED представляет значительные преимущества по сравнению с традиционными методами вирусного вливания в мозг NHP. Одним из таких преимуществ является способность достичь экспрессии на больших участках с меньшим количеством необходимых вливаний. Например, с помощью обычных методов, несколько инъекций 1-2 л векторной доходности в области 2-3 мм диаметром1,2,5,17. В то время как предыдущие попытки достичь крупномасштабного векторного распространения дали объемы экспрессии примерно 10 мм3 с несколькими инъекциями18, здесь мы представляем метод для достижения экспрессии более 200 мм3 с только несколько вливаний . Один вливание 50 л cED может достичь переносного распространения до 10 мм от места инъекции для корковых CED9 и полного покрытия лобных корковых областей с таламическим CED14.
Кроме того, было показано, что использование CED может достичь более однородного распределения инъекционного агента12,19,20,21,22, что приводит к единообразным уровням выражения вокруг места вливания вирусного переносчика, по сравнению с традиционными микроинъекциями. В наших экспериментах с использованием CED, мы наблюдали равномерно высокий уровень экспрессии с примерно 70-80% нейронов, выражающих опсин8,9 (Рисунок5). В отличие от обычных инъекций на основе диффузии экспонат регионов высокой экспрессии сосредоточены вблизи инъекций сайтов окутан ослаблением уровня выражения4,5,17. Снижение потребности в нескольких инъекциях делает cED инфузию эффективным методом получения крупномасштабной, равномерной оптогенетической экспрессии. Благодаря меньшему количеству инъекций и более быстрым темпам инфузии, мы смогли спланировать и наполнить вирусный вектор под руководством МРТ. Использование онлайн-изображений MR позволяет точно нацеливаться на настои и мониторинг распространения вирусного вектора во время инфузии. Однако, если начальная глубина вставленной канюли неверна, это может дать экспрессию в нежелательных местах в результате первоначального проникнутого 10 злифика, необходимого для визуального обнаружения инфузии с помощью MR. Кроме того, коммерческие нейрохирургические навигационные системы использование фидуциальных маркеров также может быть использовано вместо руководства MR. Кроме того, затраты на онлайн-изображения могут быть обойдены путем маркировки желаемой глубины вставки на канюле до вставки и визуально подтверждающие полный вливание через линию инфузии, хотя точность размещения канюли будет Снижение. Однако, как видно из неудачной инъекции в M1 обезьяны G(Рисунок 5D), MR руководство может иметь решающее значение для обеспечения успешного вливания.
Предыдущие исследования продемонстрировали безопасность вливания CED как невирусных, так и вирусных частиц без наблюдаемых повреждений тканей за пределами канюли и без поведенческих дефицитов9,11,12,13 ,14,15,20. Здесь и в наших предыдущих публикациях9,14 мы сообщаем аналогичные результаты после вливания CED оптогенетических вирусных векторов. В дополнение к отсутствию наблюдаемых поведенческих дефицитов после вливания, NeuN и Nissl9,14,15 окрашивание показали гибель нейрональных клеток и глиоз был ограничен только канюльного тракта, как сообщалось с диффузионными методами5. Чтобы свести к минимуму ущерб от канюли трек, мы можем потенциально уменьшить диаметр канюли. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования для оценки влияния сокращения размера канюли на достижение больших площадей выражения. Кроме того, поскольку высокие показатели инфузии могут также привести к повреждению тканей13, рекомендуется поддерживать скорость инфузии на уровне или ниже 5 л/мин. Для получения более подробной информации о технике CED, пожалуйста, смотрите нашу предыдущую публикацию9.
Использование MR-управляемого CED для достижения широких областей целевой оптогенетической экспрессии в коре приматов может привести к дальнейшим исследованиям крупномасштабной динамики цепи, нервной пластичности и подключения к сети.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
PNS имеет финансовый интерес к Neuralink Corp., компании, которая разрабатывает клинические методы лечения с использованием стимуляции мозга.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Американской ассоциации сердца постдокторской стипендий (AY), обороны Расширенные исследовательские проекты агентства (DARPA) Реорганизация и пластичность для ускорения восстановления травматизма (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, и UCSF неврологии Imaging центр. Эта работа была также поддержана Национальным институтом здоровья детей и человеческого потенциала Национальных институтов здравоохранения имени Эунис Кеннеди-Шивер по премии K12HD073945, Вашингтонским национальным исследовательским центром приматов (WaNPCR, P51 OD010425) и Центр нейротехнологий (CNT, Научно-исследовательский центр Инженерного исследовательского центра Национального научного фонда при Гранте EEC-1028725). Мы благодарим Камило Диас-Ботия, Тима Хэнсона, Виктора Харазия, Даниэля Сильверсмита, Карен Маклеод, Джулиану Милани и Блейкли Эндрюса за помощь в проведении экспериментов и Нан Тянь, Цзивэй Хэ, Питера Ледоховича, Мишеля Махарбиза и Тони Хауна за техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3 cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
References
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Gerits, A., et al. Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates. Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates. Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).
- Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).
- Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates. Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).
- Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates. PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).
- Bankiewicz, K. S., et al. Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach. Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).
- Kells, A. P., et al. Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates. Elife. 7, (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates. SPIE BiOS. , (2015).
- Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain. Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), E7297-E7306 (2016).
- Bobo, R. H., et al.
- Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion. Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).
- Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord. Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).
- Szerlip, N. J., et al. Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).
