Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

जैव प्रौद्योगिकीय संदर्भ में फ्यूकोसिलेटेड मानव दूध ट्राइसैकेराइड का विश्लेषण आनुवंशिक रूप से एनकोडेड Biotechnological का उपयोग

Published: April 13, 2019 doi: 10.3791/59253
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

Summary

हम यहां का वर्णन उच्च थ्रॉपुट का पता लगाने और fucosylated मानव दूध ओलिगोसैकेराइड (hmos) के एक पूरे सेल biosensor का उपयोग कर के परिमाणन । हम भी यहां प्रदर्शन, HMO उत्पादन उपभेदों के विश्लेषण की दिशा में इस मंच के अनुकूलन, शोर अनुपात को संकेत में सुधार पर ध्यान केंद्रित ।

Abstract

मानव दूध ओलिगोसैकेराइड (HMOs) मानव स्तन के दूध के जटिल कार्बोहाइड्रेट घटक है कि शिशु स्वास्थ्य पर बहुतायत लाभ दर्शाते हैं । तथापि, उनके जैव प्रौद्योगिकीय संश्लेषण का इष्टतम पता लगाना और मोनोसैकेराइड और लिंकेज का मात्रा का परिमाणन अपेक्षाकृत कम थ्रपुट द्वारा सीमित किया जाता है । ग्लाइकन विश्लेषण की पारंपरिक तकनीकों में क्रोमाग्राफिक/मास-स्पेक्ट्रोमेट्रिक पद्धतियां शामिल हैं, जो स्वचालन के बिना प्रतिदिन सैकड़ों नमूनों के आर्डर पर थ्रपुट के साथ होती हैं । हम यहां प्रदर्शित करता है, एक आनुवंशिक रूप से एंकोडेड बैक्टीरियल बायोसेंसर उच्च थ्र्यूपुट के लिए, लिंकेज-विशिष्ट का पता लगाने और फुकोसिलेटेड hmo संरचनाओं के परिमाणन, 2 '-fucosyllactose और 3-fucosyllactose, जो हम द्वारा प्राप्त की विषमजातीय फ्यूकोसाइडसेस की अभिव्यक्ति. के रूप में दूध में लैक्टोज की उपस्थिति या जैव प्रौद्योगिकीय प्रक्रियाओं झूठी सकारात्मक करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, हम भी लैक्टोज से संकेत की कमी प्रदर्शित विभिंन रणनीतियों का उपयोग । इस तकनीक के उच्च थ्रूपुट के कारण, कई प्रतिक्रिया शर्तों या बायोरिएक्टर मापदंडों समानांतर में घंटे के एक मामले में किया जा सकता है, hmo विनिर्माण के अनुकूलन के लिए अनुमति ।

Introduction

मानव दूध ओलिगोसैकेराइड (HMOs) लैक्टोज-व्युत्पंन ओलिगोसैकेराइड, आमतौर पर तीन से आठ चीनी मोनोमर शामिल हैं । वे एक लैक्टोज (gal-β1, 4-जीएलसी) अंत को कम करने और आगे ग्लाइकोसाइडिक लिंक (β-1, 3-या β-1, 6-) ग्लूकोज (glc), गैलेक्टोज (Gal), या एन acetylglucosamine (glcnac) द्वारा लम्बी हैं । इसके अलावा, फ्यूकोज़ (फक, α-1, 2-या α-1, 3-) या सियालिक अम्ल (Sia या NeuAc, α-2, 3-या α-2, 6-) अवशेष प्रायः1जोड़े जाते हैं ।

ओलिगोसैकेराइड और अन्य कार्बोहाइड्रेट्स का वर्तमान विश्लेषण क्रोमाग्राफिक/मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक (MS) प्रौद्योगिकी की आवश्यकता द्वारा थ्रपुट और स्कोप में सीमित है2,3,4,5, 6 , 7, जो लगभग एक घंटे के नमूने के प्रति ले जा सकते हैं, महंगा उपकरण, विशेष कॉलम और derivatizing एजेंटों, और इस उपकरण के संचालन पर विशेषज्ञता के लिए आवश्यकता का उल्लेख नहीं8। ओलिगोसैकेराइड लिंकेज विशेष रूप से निर्धारित करने के लिए मुश्किल है, उंनत MS9,10 या परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) तकनीकों की आवश्यकता11। इन ओलिगोसैकेराइड के संश्लेषण के तेजी से अनुकूलन इस तरह इस धीमी विश्लेषणात्मक कदम के थ्रूपुट द्वारा सीमित है ।

इस अध्ययन में, हम एक आनुवंशिक रूप से एंकोडेड Escherichia कोली पूरे सेल का उपयोग करते हुए कि मानव दूध में सबसे प्रचुर मात्रा में hmos है, 2 ' fucosyllactose (2 '-FL) पर ध्यान केंद्रित, fucosylated trisaccharide लैक्टोज आधारित hmos के लिंकेज-विशिष्ट पता लगाने का प्रदर्शन 4 एमजी/एल पर पता लगाने की एक सीमा के साथ बायोसेंसर । इस जैव संवेदक की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि आइसोमेरिक ट्राइसैकेराइड के बीच अंतर करने की क्षमता है । डिजाइन सिद्धांत ई. कोलाई में विशिष्ट fucosidases की अभिव्यक्ति पर आधारित है कि hmos से मुक्त लैक्टोज, जो की उपस्थिति lac operon, जो बारी में एक फ्लोरोसेंट संकेत उत्पंन द्वारा पता चला है । हम एक दो plasmid प्रणाली के निर्माण के द्वारा इस लक्ष्य को प्राप्त करने, एक लिंकेज विशिष्ट fucosidase और अंय एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन शरण । इस बायोसेंसर मंच प्रवाह cytometry या माइक्रो प्लेट रीडर द्वारा उच्च थ्र्पुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है । हम भी एक इंजीनियर तनाव12द्वारा उत्पादित मात्रा बढ़ाता में बायोसेंसर के उपयोग का प्रदर्शन. इस अध्ययन के भीतर, हम भी लैक्टोज के चयनात्मक हटाने कि biosensor से झूठी सकारात्मक संकेत में परिणाम कर सकते हैं पर तीन रणनीतियों वर्तमान, यह देखते हुए कि इंजीनियर निर्माता तनाव लैक्टोज पर उगाया जाता है.

एक साथ लिया, आनुवंशिक रूप से एनकोडेड biosensors हमें का पता लगाने और एक लिंकेज विशिष्ट तरीके से, जो भी chromatographic, एमएस, या NMR तकनीकों के साथ मुश्किल है में HMOs की मात्रा की अनुमति देते हैं । अपनी उच्च थ्रॉपुट और उपयोग में आसानी के कारण, इस विधि के चयापचय इंजीनियरिंग और HMOs के संश्लेषण में व्यापक अनुप्रयोगों होना चाहिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल कल्चर और इंडक्शन कंडीशंस

नोट: निम्नलिखित प्रयोगों में, तीन उपभेदों का उपयोग किया जाता है: ई. कोलाई BL21 (DE3) एक खाली वेक्टर के साथ, ई. कोलाई BL21 (DE3) Plasmids pafca के साथ14 और pET28: ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (gfp), और ई. कोलाई BL21 (DE3) plasmids के साथ pAfcB14 और PET28: gfp । सभी उपभेदों Luria में बड़े हो रहे है-Bertani शोरबाट (पौंड) या उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ ंयूनतम मीडिया । 1, 000x कनमीसिन (५० मिलीग्राम/एमएल) और carbenicillin (१०० मिलीग्राम/एमएल) में विआयनीकृत (डीआई) पानी के शेयर समाधान तैयार करते हैं ।

  1. मीडिया की तैयारी
    1. पौंड पाउडर स्टॉक की 1 L DI पानी के 25 ग्राम जोड़कर LB मीडिया तैयार करें । आटोक्लेव 20 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर समाधान करने के लिए । जब तक निष्फल पौंड मीडिया तापमान के नीचे है ६० डिग्री सेल्सियस से पहले एंटीबायोटिक स्टॉक के 1 μL पौंड मीडिया के हर 1 मिलीलीटर के अलावा ।
    2. पौंड प्लेटें तैयार करने के लिए, नसबंदी से पहले पौंड मीडिया में 15 ग्राम आगार जोड़ें । निष्फल पौंड आगर तापमान एंटीबायोटिक के अलावा से पहले ६० डिग्री सेल्सियस नीचे है जब तक प्रतीक्षा करें ।
    3. 1.1.3 biosensing कोशिकाओं के लिए, मीडिया या दोहरी एंटीबायोटिक दवाओं, कनमीसिन और carbenicillin के साथ प्लेटें तैयार ।
  2. कार्बोहाइड्रेट प्रेरकों
    1. मोलर समकक्ष में कार्बोहाइड्रेट के लिए स्टॉक समाधान तैयार करना 20 ग्राम/L लैक्टोज से 29 ग्राम/l 2-FL और 3-FL ।
      नोट: प्रत्येक २०० μL कोशिकाओं की 20 μL 2 '-FL या 3-FL की आवश्यकता होगी ।
    2. 2-FL/3-FL के २.० ग्राम/L अंतिम सांद्रण के साथ २०० μL कोशिकाओं का विकास करना । लगातार मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते और संस्कृतियों रातोंरात बढ़ने देते हैं ।
  3. कोशिका संवर्ध
    1. प्रयोग बीज से पहले दिन पौंड मध्यम के 5 मिलीलीटर कनमीसिन और एक ताजा जीवाणु कॉलोनी से carbenicillin के साथ पूरक, तकनीक का उपयोग कर ।
    2. आंदोलन के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर सभी संस्कृतियों सेते और रातोंरात संस्कृतियों बढ़ने ।
    3. कानामाइसिन और कार्बेन्सिलिन के साथ ताजा पौंड/M9 मीडिया के 5 मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृति के ५० μL हस्तांतरण । ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते निरंतर मिलाते हुए और जब तक संस्कृति ६०० एनएम (ओडी६००) 0.5-0.7 के ऑप्टिकल घनत्व तक पहुंच गया है बढ़ने के साथ । इस मध्य लॉग चरण में, कोशिकाओं को प्रेरित किया जा सकता है ।

2. प्रतिदीप्ति और पता लगाने की सीमा की माप

  1. फ्लो साइटोमेट्री के लिए कोशिकाओं की तैयारी
    1. १.५ मिलीलीटर ट्यूबों और 1 मिनट के लिए १२,५०० एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करने के लिए रातोंरात संस्कृतियों स्थानांतरण ।
    2. एक एकल कोशिका निलंबन और एकल कोशिका का स्थानांतरण तैयार करने के लिए सुपरनैटंट छोड़ें और 1x फॉस्फेट-buffered खारा (PBS; 6 मिमी ना2hpo4, १.८ मिमी णः2PO4, १४५ मिमी nacl में पेलेट को पुन: निलंबित करें 5 मिलीलीटर प्रवाह cytometry ट्यूबों के लिए निलंबन ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में कोशिकाओं को एक प्रवाह cytometer पर नमूने चलाने तक रखें । श्रेष्ठ परिणामों के लिए, जितनी जल्दी हो सके कक्षों का विश्लेषण करें ।
    4. GFP उत्तेजित करने के लिए ४८८ एनएम लेजर का चयन करें । एक 525/50 एनएम बैंडपास फिल्टर के साथ, फ्लोरेसेइन आइसोथायोसिनेट (FITC) प्रतिदीप्ति स्तर (20000-40000 घटनाओं, अग्रवर्ती कोशिकाओं और मलबे से बचने के लिए आगे और साइड स्कैटर के लिए gated) लीजिए ।
  2. जैव संवेदक अंशांकन
    1. एक अंशांकन वक्र बनाने के लिए, 0-2500 मिलीग्राम/L रेंज में मानक 2 '-FL की 8-10 dilutions बनाने के लिए ।
    2. संस्कृति 2 '-FL biosensing कोशिकाओं (pAfcA और pET28 युक्त: GFP) और उंहें मानक dilutions के साथ प्रेरित, के रूप में पहले खंड १.३ में वर्णित है । प्रत्येक तनुकरण के लिए तीन जैविक प्रतिकृति ले ।

3. एक उत्पादक विकृति में 2 '-FL का पता लगाने और परिमाणन

  1. उत्पादक विकृति की खेती
    1. न्यूनतम मीडिया बनाने के लिए, 1 M K2hpo4, फेसो4· 7h2O, सोडियम साइट्रेट, और 1 m thiamine-HCl के अलग समाधान तैयार करते हैं । एक ०.२२ Μm फिल्टर का उपयोग कर समाधान जीवाणुरहित । एमआइ पानी के 1 एल के साथ M9 मीडिया ब्रोथ पाउडर मिलाएं । ऑटोक्लेव 15 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर M9 समाधान. शांत समाधान ५० डिग्री सेल्सियस के लिए नीचे । MgSO4जोड़ें, cacl2, कश्मीर2hpo4, फेसो4· 7h2ओ, सोडियम साइट्रेट, और Thiamine के अंतिम सांद्रता करने के लिए 2 मिमी, ०.१ मिमी, 12 ग्राम/l, 11 मिलीग्राम/एल, ७५ मिलीग्राम/l, और ७.५ μg/l, क्रमशः.
    2. 2 के एक संस्कृति शुरू-FL उत्पादन तनाव, उदाहरण के लिए, JM109 gwBC-F2, पौंड मीडिया के 5 मिलीलीटर में और इसे ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ने, के रूप में बाऊंगगार्टनर एट अल.12में वर्णित है ।
    3. 1% पर उपसंस्कृति के रूप में पहले चरण में 1.3.3 २५० मिलीलीटर मिनिमल मीडिया के चरण 3.1.1 में तैयार की में वर्णित है । 10 ग्राम/L की अंतिम सांद्रता में ग्लिसरोल जोड़ें और संस्कृति को ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    4. जब संस्कृति एक ओडी६०० से 0.5 दृ 0.7 तक पहुंचती है, तो आइसोप्रोपिएल Β-D-1-थायोगालैक्टोपिरैनोसाइड (IPTG) को अंतिम सांद्रता में ०.५ मिमी और लैक्टोज को 2 ग्राम/L की अंतिम सांद्रता में जोड़ें ।
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर निरंतर मिलाते हुए और संस्कृतियों के 24 एच के लिए विकसित होने के साथ सेते ।
  2. 2 '-FL का निष्कर्षण
    1. 15 मिनट के लिए रातोंरात संस्कृतियों को बाँझ ५० मिलीलीटर ट्यूबों और सेंट्रीफ्यूज में ९०० x g पर स्थानांतरित करें ।
    2. 3.2.2 अधित्याग supernatant और DI पानी में गोली फिर से निलंबित । दोहराएं कदम तीन बार अवशिष्ट लैक्टोज हटाने के लिए और अंत में फिर से निलंबित DI पानी के 5 मिलीलीटर में ।
    3. सेल निलंबन को लाइसे करने के लिए 30% बिजली, 30 एस दालों में एक sonicator का उपयोग करें । कोशिकाओं को हर समय बर्फ पर रखें ।
    4. २,००० एक्स जीपर 25 मिनट के लिए लीजड ड कोशिकाओं सेंट्रीफ्यूज Supernatant निकालें, यह एक बाँझ (जैसे, ०.२२ μm) फिल्टर के माध्यम से पारित और विश्लेषण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  3. जैव संवेदक के साथ परिमाणन
    1. 2 '-FL biosensing कोशिकाओं की एक संस्कृति Inoculate और मध्य लॉग चरण में, खंड २.२ में वर्णित के रूप में अंशांकन वक्र बनाने के लिए प्रयोग किया जाता 2 '-FL के अनुमानित सांद्रता के लिए सेल लिस्ते के बराबर के साथ प्रेरित. एक ही परिवेश में अंशांकन का विश्लेषण करने के लिए नमूने के रूप में (जैसे, सेल lysate) 2 की dilutions जोड़कर '-FL को नियंत्रित करने के लिए (यानी, गैर-निर्माता) बायोसेंसर कोशिकाओं उत्प्रेरण से पहले सेल lysate फ़िल्टर ।
    2. एक प्रवाह cytometer पर नमूने चलाते हैं । ओलिगोसैकेराइड एकाग्रता के खिलाफ प्रतिदीप्ति उत्पादन की साजिश रचने से एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न. सेल lysate करने के लिए मानकों के जवाब की तुलना करें ।

4. लैक्टोज का चयनात्मक निष्कासन

नोट: biosensing कोशिकाओं लैक्टोज के प्रति संवेदनशील होते है और यह चुनिंदा रूप से लैक्टोज पर HMOs का पता लगाने के लिए biosensing के लिए वांछनीय है । एक कार्यनीति में अनुभाग ३.२ में वर्णित कक्षों की धुलाई शामिल होगी. तीन अंय रणनीतियों के नीचे वर्णित हैं ।

  1. वाणिज्यिक शुद्ध β-गैलक्टोसिडेस के साथ उपचार
    1. भंग lyophilized β-galactosidase करने के लिए १,००० (FCC lactase) इकाइयों/एमएल, में 1 मिमी MgCl2 या वाणिज्यिक β-गैलेक्टोसिडेस का उपयोग समाधान में.
    2. आवश्यक एंजाइम के इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, 2 '-FL biosensing कोशिकाओं के एक संरोप बढ़ने और मिड लॉग चरण में 2 जी/एल लैक्टोज और २.९ g/l 2-FL के साथ प्रेरित ।
    3. करने के लिए १०० μL संस्कृतियों, के चर मात्रा में जोड़ें β-galactosidase, अप करने के लिए 12 इकाइयों, और दो संस्कृतियों लगातार मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ने.
    4. धारा २.१ में वर्णित प्रतिदीप्ति को मापने के लिए और संकेत के वांछित क्षीणन को प्राप्त करने के लिए न्यूनतम एंजाइम एकाग्रता निर्धारित करके आवश्यक एंजाइम की इष्टतम इकाइयों की गणना करें ।
    5. के लिए 2 '-FL उत्पादन कोशिकाओं 24 एच के लिए, β-galactosidase और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात इनसेबेट की इष्टतम इकाइयों में जोड़ें । खंड ३.३ में वर्णित के रूप में 2 '-FL टीटर का निर्धारण करने के लिए प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें ।
  2. LacZ + विकृति के साथ पूर्व उपचार
    1. 2 '-FL उत्पादन तनाव के एक 25 मिलीलीटर संस्कृति शुरू और एक बार मध्य लॉग चरण में प्रेरित, 24 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते ।
    2. एक ई. कोलाई BL21 (DE3) पौंड में संस्कृति का टीका, यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर मध्य लॉग चरण के लिए हो जाना और संस्कृति के ५० मिलीलीटर जोड़ें (2:1) 24 ज संस्कृति के लिए ।
    3. 3 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनसेबेट धारा ३.३ में वर्णित 2 '-FL टीटर का निर्धारण करने के लिए प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना ।
  3. इथेनॉल के साथ लैक्टोज वर्षण
    नोट: यह खंड Matsuki एट अल.12से अनुकूलित है ।
    1. 2 '-FL उत्पादन तनाव की एक 25 मिलीलीटर संस्कृति शुरू और एक बार मध्य लॉग चरण में प्रेरित, 24 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    2. संस्कृति के लिए १००% इथेनॉल के दो खंड जोड़ें, अच्छी तरह हिला, और 4 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    3. 15 मिनट के लिए ९०० x जी पर निलंबन सेंट्रीफ्यूज. 4 डिग्री सेल्सियस, जो लैक्टोज precipitates में रात भर supernatant और सेटे लीजिए ।
    4. एक फिल्टर पेपर (11 μm) के माध्यम से समाधान पारित करके उपजी लैक्टोज निकालें । छानना कि 2 '-FL युक्त सेल lysate है, जो धारा ३.३ का पालन करके मात्रा निर्धारित जा सकता है लीजिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम एक पूरी सेल 2 ' के लिए विशिष्ट बायोसेंसर-FL कि ओलिगोसैकेराइड के बायोसेंसर उत्पादन के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है डिजाइन । इस टर्मिनल को संशोधित करने के विशिष्ट एंजाइमी दरार पर निर्भर करता है शर्करा लैक्टोज पैदा करने और इस तरह के सक्रियण के लाख operon, एक रिपोर्टर फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी एक लैक्टोज inducible प्रमोटर के तहत, के अनुपात में 2 '-FL की मात्रा । इसकी लिंकेज विशिष्टता प्रदर्शित करने के लिए, एक समावयव, 3-फ्यूकोसिल्टोज (3-FL) का भी परीक्षण किया गया । आनुवंशिक परिपथ में दो भाग होते हैं: एक फ्यूकोसीडेस जीन, Afca या afca, एक संरक्षिका द्वारा संचालित एक संवैधानिक अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप एक वेक्टर पर क्लोन किया जाता है जो पेलब के सिग्नल अनुक्रम के साथ फ्यूकोसाइडेस जीन के अपस्ट्रीम को इनकोडिंग periplasmic निर्यात की सुविधा, साथ ही साथ एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर GFP की अभिव्यक्ति ड्राइविंग T7 promotion युक्त प्रणाली । पहला भाग प्लाज्मिड pAfcA पर और दूसरा रिपोर्टर सिस्टम पर प्लाज्मिड pET28: GFP पर व्यक्त किया जाता है । अंतिम निर्माण ई. कोलाई BL21 (DE3), एक व्यापक रूप से उपलब्ध तनाव है कि T7 rna पोलीमरेज़ लैक्टोज उत्तरदायी pLacUV5 प्रमोटर के नियंत्रण में जीनोम में एकीकृत है में तब्दील हो गया था । चित्रा 1a योजनाबद्ध डिजाइन से पता चलता है ताकि पाठक biosensor के कार्य सिद्धांत का पालन कर सकते हैं. चित्रा 1b प्रेरण की विभिंन शर्तों के तहत फ्लोरोसेंट संकेत के रूप में एक प्रवाह cytometer पर विश्लेषण दिखाता है । हमारी परिकल्पना के अनुरूप, प्रतिदीप्ति में १०० गुना वृद्धि से अधिक 2 '-fl बायोसेंसर के साथ मनाया गया वेक्टर केवल नियंत्रण या 3-fl के लिए बायोसेंसर के साथ तुलना में. यह जैव संवेदक के उच्च लिंकेज विशिष्टता को दर्शाता है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि संकेत वास्तव में डिफ्यूकोसिलेशन के कारण है, हम प्रेरण के दौरान संस्कृति के लिए वाणिज्यिक α-1, 2-फ्यूकोसाइडेस जोड़कर एक नियंत्रण चलाया, जो सही पर सलाखों के द्वारा दिखाए गए के रूप में पुष्टि की है । परख की संवेदनशीलता एक खुराक पैदा करने से निर्धारित किया जा सकता है-अलग कार्बोहाइड्रेट के स्तर के साथ प्रतिक्रिया वक्र (चित्रा 2A) । भूखंड से, 2 ' FL का पता लगाने के गतिशील रैखिक रेंज ४० और ४०० मिलीग्राम/एल के बीच है और पता लगाने की सीमा 4 मिलीग्राम/L है । इस परख बाहर एक काम के दिन के पाठ्यक्रम पर किया जा सकता है, के रूप में रिपोर्टर अभिव्यक्ति की गतिशीलता के स्नैपशॉट माप द्वारा दिखाया गया (चित्रा 2B) ।

अंत में, हम वर्तमान कैसे biosensing कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और 2 '-fl एक इंजीनियर से 2 '-FL उत्पादक तनाव मात्रा । चूंकि यह तनाव लैक्टोज को एक सब्सट्रेट के रूप में उपयोग करता है, हम बहिर्जात लैक्टोज से संकेत को कम करने के लिए रणनीति विकसित की है ताकि संकेत readout सीधे 2 '-FL एकाग्रता (चित्रा 3a) के अनुरूप होगा. एक रणनीति enzymatically लैक्टोज एक β-गैलेक्टोसिडेस कि संशोधित लैक्टोज पर कार्रवाई नहीं करता का उपयोग कर नीचा है । यह वाणिज्यिक β-galactosidase का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है कि लैक्टोज पर अधिमान्य कार्य करता है, लैक्टोज सिग्नल को कम करने के लिए 20% मूल (चित्रा 3B) या एक lacz + तनाव के साथ ऊष्मायन के माध्यम से, जंगली प्रकार BL21 (DE3), जो तीन घंटे में लैक्टोज बूंदें पृष्ठभूमि स्तर (चित्रा 3 सी) के लिए संकेत । पिछले रणनीति इथेनॉल है, जो न केवल चुनिंदा लैक्टोज precipitates लेकिन यह भी उत्पादक कोशिकाओं lyses, सेल lysis एक आवश्यक कदम डाउनस्ट्रीम जा रहा है (चित्रा 3 डी) का उपयोग करता है । यह एक सरल निष्कर्षण प्रक्रिया है, लेकिन देखभाल 2 ' के कम वसूली के कारण लिया जाना चाहिए-FL अन्य विधियों के साथ तुलना में, संभवतः 2 ' के कुछ क्रिस्टलीकरण के कारण घाटे से FL. इथेनॉल के अलावा के बावजूद, हम biosensing कोशिकाओं के विकास की महत्वपूर्ण निषेध का पालन नहीं किया, की संभावना है क्योंकि अंतिम इथेनॉल सांद्रता कम कर रहे है (< 2%, v/संस्कृतियों में । अंत में, सबसे प्रभावी लेकिन समय लेने वाली विधि हम प्रदर्शित करने के लिए गोली और सेल lysis से पहले कोशिकाओं को धोने के लिए intracellular 2 '-FL (चित्रा 3E) जारी है । हम सुझाव है कि दक्षता और समय और अभिकर्मकों की उपलब्धता के आधार पर लैक्टोज हटाने के लिए उपयुक्त विधि का चयन करने के लिए विवेक का उपयोग करने के लिए पाठक ।

चित्रा 3E भी जैव प्रौद्योगिकी के संदर्भ में मज़बूती से 2 '-FL मात्रा निर्धारित करने के लिए हमारी क्षमता को दर्शाता है । हम या तो एक इंजीनियर 2 '-FL-उत्पादन तनाव11 या एक fucosyltransferase नकारात्मक उत्परिवर्ती (नकारात्मक नियंत्रण) लैक्टोज के साथ सेल lysate में 2 ' FL के उत्पादन की निगरानी करने के लिए । कोशिकाओं की देखभाल के बाद, हम मांयता के लिए जैव संवेदक और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (hplc) दोनों का उपयोग कर एकाग्रता मापा (अनुपूरक चित्रा 1) । 2 '-FL के साथ नुकीला निर्माता lysate और नियंत्रण lysate के लिए खुराक प्रतिक्रिया घटता बहुत समान हैं, जो सेल lysate के संदर्भ में 2 '-FL की मात्रात्मक माप दर्शाता है ।

Figure 1
चित्रा 1:2 के योजनाबद्ध-FL बायोसेंसर डिजाइन और प्रतिनिधि डेटा. (ं) 2 '-फ्यूकोसिल्लैक्टोज (2 '-FL) जीवाणु परिप्लावी में प्रवेश करता है और विषमयुग्मकी द्वारा व्यक्त किए गए फ्यूकोसाइडेस द्वारा लैक्टोज में परिवर्तित हो जाता है । लैक्टोज को कोशिकाद्रव्य में ले जाया जाता है और एल्लैक्टोज में परिवर्तित कर दिया जाता है । यह ई. कोलाई BL21 (DE3) में देशी LacUV5 प्रमोटर सक्रिय करता है, T7 rnap, जो T7 प्रमोटर के तहत gfp transcribes, फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी उत्पादन । (ख) 2-fl और 3-fl का पता लगाना । PET28 युक्त कोशिकाओं: gfp और या तो pAfcA (ग्रीन), Pafca (magenta), या एक खाली वेक्टर नियंत्रण (नीला) कोई चीनी, 2 '-fl, 2 '-fl exogenously जोड़ा α-1, 2-fucosidase, 3-fl, या लैक्टोज के साथ रातोंरात प्रेरित किया गया । सभी डेटा तीन जैविक प्रतिकृति के एक औसत है प्रत्येक triplicate में विश्लेषण किया, जहां त्रुटि सलाखों मतलब से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । सांख्यिकीय महत्व Tukey के एकाधिक तुलना परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था और * * p < ०.०१ का संकेत है ।  यह आंकड़ा पहले Enam और Mansell14 में दिखाई दिया और अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
2 '-FL का पता लगाने के लिए बायोसेंसर के लक्षण वर्णन: चित्रा 2. (क) जैवसंवेदकों के संसूचन और अंतरण कार्यों की सीमाएं । प्रतिक्रिया वक्र pAfcA/2 ' FL (ग्रीन सर्कल) के लिए मतलब प्रतिदीप्ति या खाली नियंत्रण वेक्टर (नीला हीरा) 2 की अलग मात्रा में-FL सभ्य चित्रित । (ख) रिपोर्टर अभिव्यक्ति का समय-पाठ्यक्रम । विकृति pAfcA 2 '-FL (ग्रीन स्क्वायर) और प्रतिदीप्ति के साथ इनसेबटेड था प्रेरण के 8 ज पर नजर रखी थी । विकृति pAfcA लैक्टोज के साथ इनसेबटेड एक नियंत्रण के रूप में शामिल है । सभी डेटा तीन जैविक प्रतिकृति के एक औसत है प्रत्येक triplicate में विश्लेषण किया, जहां त्रुटि सलाखों मतलब से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा पहले Enam और Mansell14 में दिखाई दिया और अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक उत्पादक तनाव से 2 '-FL का पता लगाने और परिमाणन । (क) कार्यप्रवाह अवशिष्ट लैक्टोज से शोर को हटाने पर मुख्य ध्यान के साथ एक सरल प्रोटोकॉल में बायोसेंसर के उपयोग का प्रदर्शन. (ख) लैक्टोज को β-गैलेक्टोसिडेस एन्जाइमैटिक पाचन द्वारा हटाना । ०.३% 2 '-FL (ग्रीन स्क्वायर) या ०.२% लैक्टोज (नीला चक्र) वाली संस्कृतियों को इंक्यूबेशन के बाद इनक्युबिटेनस की मात्रा में शामिल समय के साथ बायोसेंसर संस्कृतियों से युक्त किया गया था, जो कि ऊष्मायन के बाद प्रतिदीप्ति के लिए दी गई थी । (ग) उष्मायन द्वारा लैक्टोज को वन्य-प्रकार की lacz + विकृति से हटाना । LB जिसमें ०.३% 2 '-fl (हरा वृत्त), ०.२% लैक्टोज (नीला वर्ग), या 1:1 मिश्रण (०.२% लैक्टोज समतुल्य, अर्थात, ०.१% लैक्टोज + ०.१५% 2 '-FL, मैजेंटा त्रिभुज) BL21 (DE3) कोशिकाओं के साथ विभिन्न समय के लिए इनसेबटेड था, और फिर बायोसेंसर संस्कृतियों के लिए जोड़ा ऊष्मायन के बाद प्रतिदीप्ति मापन रातोंरात । (घ) एथेनोल के पूर्व उपचार द्वारा लैक्टोज और सेल लाइसिस का अवक्षेपण । JM109 gwbc-f2 (magenta सर्कल) या JM109 gwbc (नीला त्रिकोण) के fermentations कोशिकाओं को इथेनॉल के 2 संस्करणों और फ्लोरोसेंट बायोसेंसर कोशिकाओं के साथ ऊष्मायन से पहले फ़िल्टर और अनुपचारित JM109 gwbc-F2 संस्कृति से प्रतिदीप्ति के साथ की तुलना के साथ इनक्यूबेटेड थे ( ग्रीन स्क्वायर) । (ङ) सेल लिस्ते में 2-FL का परिमाणन । बायोसेंसर एक metabolically इंजीनियर निर्माता तनाव से 2 '-FL का पता लगाने की क्षमता के लिए मूल्यांकन किया गया था. JM109 gwBC-F2 (मैजेंटा सर्कल, 2 '-FL "के रूप में LC-MS) द्वारा निर्धारित मात्रा में, 2 '-FL के साथ या तो क्रूड lysate के प्रतिदीप्ति मापन के साथ-साथ gwBC सेल lysate (ग्रीन स्क्वायर), या JM109 gwBC तनाव के कच्चे lysate (नीला हीरा) । उत्पादक विकृति में एचपीएलसी परिमाणन द्वारा 2-एफएल के परिणामों का सत्यापन किया गया । सभी डेटा तीन जैविक प्रतिकृति के एक औसत रहे है प्रत्येक triplicate में विश्लेषण, जहां ऊर्ध्वाधर त्रुटि सलाखों के माध्य प्रतिदीप्ति और क्षैतिज त्रुटि सलाखों से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व 2 ' में मानक विचलन का प्रतिनिधित्व-FL hplc द्वारा मापा triplicates. यह आंकड़ा पहले Enam और Mansell14 में दिखाई दिया और अनुमति के साथ पुन: उपयोग किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1: HPLC-2 ' के एमएस विश्लेषण-FL । (क) 2-FL (m/z ५११) का निकाले जाने वाला आयन क्रोमैटोग्राम । एक वाणिज्यिक मानक का वर्णलेख शीर्ष पर दिखाया गया है । JM109gwBC-F2 विकृति (10-गुना कमजोर पड़ने) से 2 '-FL का वर्णलेख नीचे दिखाया गया है । ५११ एम/जेड में चोटी पर सोडियम योयोटी है । (ख) सामूहिक स्पेक्ट्रम की 300 − 800 से वृद्धि, जहां सर्वाधिक प्रचुर सिग्नल केन्द्रित थे, को उत्पादक विकृति (नीचे) से वाणिज्यिक मानक (ऊपर) और 2-FL के लिए दर्शाया गया है । (ग) वाणिज्यिक 2-एफएल के विभिन्न स्तरों के साथ नियंत्रण रेखा-एमएस विश्लेषण द्वारा एक मानक वक्र का सृजन किया गया था । त्रुटि पट्टियां, तपसिल माप से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम फुकोसिलेटेड मानव दूध ओलिगोसैकेराइड के लिंकेज विशेष पहचान के लिए एक उच्च थ्रौपुट रणनीति प्रस्तुत करते हैं । यह आनुवंशिक रूप से इंजीनियरिंग ई. कोलाई जो विशिष्ट glycans के साथ प्रेरण पर एक फ्लोरोसेंट संकेत के साथ प्रतिक्रिया द्वारा पूरे सेल biosensors के निर्माण से पूरा किया गया था । प्रोटोकॉल भी कैसे बायोसेंसर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक metabolically इंजीनियर जीवाणु तनाव में hmos यों तो पर विवरण.

हमारे प्रोटोकॉल को chromatographic/MS विधियों की तुलना में इसके लिंकेज विशिष्टता के अलावा अपने उच्च थ्रपुट के कारण वैकल्पिक विधियों पर लाभ प्रदान करता है । पता लगाने और व्यापक गतिशील रेंज की कम सीमा HMOs के प्रत्यक्ष माप के लिए अनुमति देता है ।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम निर्माता उपभेदों के सेल lysate की तैयारी में होते हैं । 2-FL की अधिकतम अनुमापांक सुनिश्चित करने के लिए, यह इष्टतम शर्तों प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है । बैचों में Variabilities sonication मापदंडों या प्रेरण समय के कारण उत्पन्न हो सकता है. देखभाल biosensor के लक्षण वर्णन के दौरान लिया जाना चाहिए. यह भी निरंतर परिणाम सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग में सभी चरणों के लिए उचित नियंत्रण चलाने के लिए सिफारिश की है ।

हमारे प्रोटोकॉल की एक सीमा प्रेरण के लिए लैक्टोज पर अपनी निर्भरता है, जो एक अड़चन बन जाता है जब लैक्टोज स्वाभाविक रूप से मौजूद है, के रूप में स्तन के दूध में, या hmos के जैव प्रौद्योगिकीय उत्पादन में सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया । हम चार अलग रणनीति के साथ इस बात को संबोधित किया है शोर अनुपात को संकेत इतना है कि बायोसेंसर चुनिंदा लैक्टोज पर hmos का पता लगा सकते हैं ।

आनुवंशिक रूप से एनकोडिंग पूरे सेल बायोसेंसर यहां प्रस्तुत hmos के निर्माण के लिए अनुकूलन की अनुमति होगी, के रूप में कई प्रतिक्रिया शर्तों या बायोरिएक्टर मापदंडों समानांतर में घंटे के एक मामले में किया जा सकता है । जब ९६-या ३८४-well प्लेटों में प्रदर्शन किया, विधि प्रति दिन नमूनों की हजारों स्क्रीन करने के लिए क्षमता से पता चलता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी स्टार्टअप फंड्स ने सपोर्ट किया था । F.E. आंशिक रूप से NSF Trinect फैलोशिप और Manley Hoppe प्रोफेसरशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया । T.J.M. आंशिक रूप से करेन और डेनी Vaughn संकाय फैलोशिप द्वारा समर्थित था । लेखक आयोवा राज्य विश्वविद्यालय फ्लो Cytometry सुविधा और प्रतिदीप्ति और नियंत्रण रेखा-एमएस अध्ययन के साथ सहायता के लिए आलमआरा Keck Metabolomics अनुसंधान प्रयोगशाला धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).

Tags

जैव रसायन अंक १४६ कार्बोहाइड्रेट रसायन विज्ञान मानव दूध ओलिगोसैकेराइड biochemistry सिंथेटिक जीव विज्ञान चयापचय इंजीनियरिंग उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग चयनात्मक लैक्टोज हटाने
जैव प्रौद्योगिकीय संदर्भ में फ्यूकोसिलेटेड मानव दूध ट्राइसैकेराइड का विश्लेषण आनुवंशिक रूप से एनकोडेड Biotechnological का उपयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of … More

Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter