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Biochemistry

Analyse des Trisaccharides lait Fucosylées homme dans contexte biotechnologique génétiquement encodé biocapteurs

Published: April 13, 2019 doi: 10.3791/59253
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

Summary

Nous décrivons ici la détection haut débit et la quantification des oligosaccharides de lait humain fucosylées (HMO) à l’aide d’un biocapteur à germes entiers. Nous démontrons ici, l’adaptation de cette plate-forme vers l’analyse des souches de production HMO, mettant l’accent sur l’amélioration du rapport signal sur bruit.

Abstract

Le lait humain oligosaccharides (HMO) sont les composants de hydrate de carbone complexe du lait maternel humain qui présentent de nombreux avantages sur la santé infantile. Cependant, l’optimisation de leur synthèse biotechnologique est limitée par le débit relativement faible de détection et de quantification des monosaccharides et des liens. Les techniques classiques d’analyse glycane comprennent des méthodes chromatographiques /-spectrométrie de masse avec le débit de l’ordre de plusieurs centaines d’échantillons par jour sans automation. Nous démontrons ici, un biocapteur bactérien génétiquement codé de haut-débit, assemblage spécifique de détection et de quantification des structures fucosylées HMO, 2'-fucosyllactose et 3-fucosyllactose, qui nous atteint via hétérologue expression de fucosidases. Comme la présence de lactose dans le lait ou dans les procédés biotechnologiques pourrait conduire à de faux positifs, nous démontrons également la réduction du signal du lactose en utilisant des stratégies différentes. En raison du débit élevé de cette technique, beaucoup de conditions de réaction ou de paramètres de bioréacteur pourraient être dosés en parallèle en quelques heures, ce qui permet l’optimisation de la fabrication de HMO.

Introduction

Oligosaccharides de lait maternel (HMO) sont des oligosaccharides dérivé de lactose, généralement composée de trois à huit monomères de sucre. Ils ont une réduction de lactose (Gal-β1, 4-Glc) fin et sont plus allongées par des liaisons glycosidiques (β-1, 3 - ou β-1, 6-) de glucose (Glc), galactose (Gal) ou le N-acétylglucosamine (GlcNAc). En outre, fucose (Fuc, α-1, 2 - ou α-1, 3-) ou l’acide sialique (Sia ou NeuAc, α-2,3 - ou α-2, 6-) résidus sont souvent ajoutés1.

Analyse actuelle des oligosaccharides et des autres glucides est limité en débit et en portée par la nécessité d’une chromatographie/spectrométrie de masse (MS) technologie2,3,4,5, 6 , 7, qui peut prendre environ une heure par exemple, pour ne pas mentionner la nécessité d’équipements coûteux, colonnes spécialisées et agents de dérivatisation et expertise sur le fonctionnement de cet équipement8. Liens d’oligosaccharides sont particulièrement difficiles à déterminer, nécessitant des avancées MS9,10 ou de techniques de résonance magnétique nucléaire (RMN)11. Optimisation rapide de la synthèse de ces oligosaccharides est donc limitée par le débit de cette étape analytique lente.

Dans cette étude, nous démontrons la liaison spécifique détection fucosylées trisaccharide ossi à base de lactose, en se concentrant sur la 2'-fucosyllactose (2'-FL) qui est le plus abondant HMO dans le lait maternel, en utilisant un génétiquement encodé Escherichia coli cellules entières biocapteur avec une limite de détection à 4 mg/L. Une caractéristique importante de ce biocapteur est sa capacité à distinguer les isomères trisaccharides. Le principe de conception est basé sur l’expression des fucosidases spécifiques chez e. coli qui libèrent le lactose de HMO, dont la présence est détectée par l’opéron lac , qui à son tour génère un signal fluorescent. Nous y parviendrons en construisant un système de deux-plasmide, on nourrissait la fucosidase de liaison spécifique et l’autre une protéine fluorescente journaliste. Cette plateforme de biocapteurs est adaptée pour le criblage à haut débit par cytométrie en flux ou micro-lecteur. Nous démontrons également l’utilisation du biocapteur pour quantifier la 2'-FL produite par une souche modifiée12. Dans cette étude, nous présentons trois stratégies sur l’élimination sélective de lactose qui peut entraîner des faux signaux positif depuis le biocapteur, étant donné que la souche producteur machiné est cultivée sur le lactose.

Pris ensemble, les biocapteurs codés génétiquement nous permettent de détecter et quantifier les HMO dans une manière de liaison spécifique, qui est difficile même avec chromatographique, MS ou NMR techniques. En raison de son haut rendement et facilité d’utilisation, cette méthode devrait avoir de nombreuses utilisations dans l’ingénierie métabolique et la synthèse des HMO.

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Protocol

1. cellules des conditions de culture et de l’induction

Remarque : Dans les expériences suivantes, trois souches sont utilisés : e. coli BL21 (DE3) avec un vecteur vide, e. coli BL21 (DE3) avec plasmides pAfcA14 et pET28:green protéine fluorescente (GFP) et e. coli BL21 (DE3) avec des plasmides pAfcB14 et pET28:GFP. Toutes les souches sont cultivées dans le bouillon Luria-Bertani (LB) ou un milieu minimal avec des antibiotiques appropriés. Préparer les solutions de 1 000 x kanamycine (50 mg/mL) et de la carbénicilline (100 mg/mL) dans désionisée (DI) l’eau.

  1. Préparation des médias
    1. Préparer les milieux LB en ajoutant 25 g de stock de poudre LB à 1 L de l’eau distillée. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min stériliser la solution de. Attendez que la température de médias LB stérilisée est inférieure à 60 ° C avant d’ajouter 1 µL d’antibiotique stock chaque 1 ml de médias LB.
    2. Pour préparer les plaques LB, ajouter 15 g de gélose aux médias avant la stérilisation LB. Attendez que la température de gélose LB stérilisée est inférieure à 60 ° C avant l’ajout d’antibiotique.
    3. 1.1.3 pour les cellules de biodétection, préparer les médias ou des plaques avec deux antibiotiques, kanamycine et carbénicilline.
  2. Inducteurs de glucides
    1. Préparer les solutions des inducteurs de glucides à molaires équivalents à 20 g/L de lactose : 29 g/L de 2'-FL et 3-FL.
      Remarque : Chaque 200 µL de cellules exigeront 20 µL de 2'-FL ou 3-FL.
    2. Induire des 200 µL de cellules avec une concentration finale de 2,0 g/L de lactose ou 2,9 g/L concentration finale de 2'-FL/3-FL. incuber à 37 ° C sous agitation continue et laisser pousser du jour au lendemain les cultures.
  3. Culture cellulaire
    1. La veille de la graine de l’expérience 5 mL de milieu LB additionné à la kanamycine et la carbénicilline provenant d’une colonie bactérienne fraîche, utilisant une technique stérile.
    2. Incuber à toutes les cultures à 37 ° C sous agitation et poussent les cultures du jour au lendemain.
    3. Transférer 50 µL de la culture au jour le jour dans 5 mL de supports LB/M9 neufs avec la kanamycine et la carbénicilline. Incuber à 37 ° C sous agitation continue et se développer jusqu'à ce que la culture a atteint une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,5 à 0,7. Lors de cette phase logarithmique, les cellules peuvent être induites.

2. mesure de la fluorescence et les limites de détection

  1. Préparation des cellules pour la cytométrie en flux
    1. Transférer les cultures pendant la nuit pour tubes de 1,5 mL et centrifuger à 12 500 x g pendant 1 min.
    2. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 500 µL de solution saline tamponnée au phosphate 1 x (PBS ; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl dans l’eau distillée, pH 7,2) pour préparer une suspension monocellulaire et transférer la cellule unique suspension aux tubes de cytométrie de flux 5 mL.
    3. Garder les cellules dans l’obscurité à 4 ° C jusqu'à ce que les échantillons en cours d’exécution sur un cytomètre en flux. Pour de meilleurs résultats, analyser les cellules dès que possible.
    4. Choisissez les laser à 488 nm pour exciter la GFP. Recueillir des niveaux de fluorescence fluorescéine isothiocyanate (FITC) (20 000 – 40 000 événements dépendants pour scatter avant et latéraux pour éviter les débris et les cellules agrégées) avec un filtre passe-bande de 525/50 nm.
  2. Calibrer le biocapteur
    1. Pour faire une courbe d’étalonnage, préparer des dilutions de 8 à 10 de la norme 2'-FL dans la plage 0 – 2 500 mg/L.
    2. La culture des cellules de biodétection 2'-FL (contenant pAfcA et pET28:GFP) et amener avec les dilutions standards, tel que décrit précédemment dans la section 1.3. Effectuer trois réplicats biologiques pour chaque dilution.

3. détection et quantification de la 2'-FL chez une souche de producteur

  1. Culture de la souche de producteur
    1. Pour faire des médias un minimum, préparer des solutions distinctes de 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrate de sodium et 1 M thiamine-HCl. stériliser les solutions à l’aide d’un filtre de 0,22 µm. Mélanger M9 médias poudre de bouillon avec 1 L de l’eau distillée. Autoclave la solution M9 à 121 ° C pendant 15 min. laisser refroidir la solution jusqu'à 50 ° C. Ajouter MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, citrate de sodium et thiamine à la concentration finale de 2 mM, 0. 1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L et 7,5 µg/L, respectivement.
    2. Commencer une culture de la 2'-FL souche, par exemple, JM109 gwBC-F2, dans 5 mL de médias LB productrice et laisser pousser une nuit à 37 ° C, comme décrit dans Baumgartner et al.12.
    3. Repiquage à 1 % comme décrit précédemment dans l’étape 1.3.3 dans 250 mL des médias un minimum préparés à l’étape 3.1.1. Ajouter le glycérol à une concentration finale de 10 g/L et incuber la culture à 37 ° C.
    4. Lorsque la culture atteint une OD600 de 0,5 à 0,7, ajouter isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,5 mM et le lactose à une concentration finale de 2 g/L.
    5. Incuber à 37 ° C sous agitation continue et laissez les cultures à pousser pendant 24 h.
  2. Extraction de 2'-FL
    1. Transférer les cultures pendant la nuit à tubes stériles 50 mL et centrifuger à 900 x g pendant 15 min.
    2. 3.2.2 jeter le surnageant et remettre en suspension l’extrait concentré dans l’eau distillée. Répétez l’étape de lavage trois fois pour enlever au lactose résiduel et enfin remettre en suspension dans 5 mL de l’eau distillée.
    3. Pour lyser la suspension cellulaire, utilisez un sonicateur à 30 % de puissance, en 30 s Pulse. Garder les cellules sur la glace à tout moment.
    4. Centrifuger les cellules lysées pendant 25 min à 2 000 x g. Retirer le surnageant, passer à travers une solution stérile (par exemple, 0,22 µm) filtrer et conserver à 4 ° C jusqu'à l’analyse.
  3. Quantification avec biocapteur
    1. Ensemencer une culture de cellules de 2'-FL biodétection et phase logarithmique, induisent avec équivalent lysat cellulaire à des concentrations estimées de 2'-FL utilisé pour fabriquer la courbe d’étalonnage comme indiqué au point 2.2. Effectuer l’étalonnage dans le même milieu que l’échantillon à analyser (par exemple, lysat cellulaire) en ajoutant des dilutions de 2'-FL au contrôle (c'est-à-dire non producteurs) lysat avant d’induire les cellules biocapteur filtrée cellulaire.
    2. Exécuter les exemples sur un cytomètre en flux. Générer une courbe dose-réponse en traçant la sortie de fluorescence contre la concentration d’oligosaccharides. Comparer la réponse des normes pour le lysat cellulaire.

4. sélective enlèvement du lactose

Remarque : Les cellules de biodétection sont sensibles au lactose et il est souhaitable que le biocapteur à détecter de manière sélective ossi plus de lactose. Une stratégie comprendrait lavage de cellules tel que décrit dans la section 3.2. Trois autres stratégies sont décrites ci-dessous.

  1. Traitement avec commerciale purifiée β-galactosidase
    1. Dissoudre la β-galactosidase lyophilisé pour 1 000 (lactase FCC) unités/mL, dans 1 mM MgCl2 ou utilisation commerciale de β-galactosidase en solution.
    2. Pour déterminer la concentration optimum de l’enzyme nécessaire, cultiver un inoculum de 2'-FL biodétection cellules et provoquer avec lactose 2 g/L et 2,9 g / L 2'-FL au milieu de la phase logarithmique.
    3. Aux 100 µL cultures, ajouter des quantités variables de la β-galactosidase, jusqu'à 12 unités et laisser les cultures poussent en une nuit à 37 ° C sous agitation continue.
    4. Mesurer la fluorescence tel que décrit dans la section 2.1 et calculer les unités optimales des enzymes nécessaires par détermination de la concentration de l’enzyme minimum pour atteindre l’atténuation souhaitée du signal.
    5. 2'-FL produisant des cellules cultivées pendant 24 h, ajouter des unités optimales de la β-galactosidase et incuber une nuit à 37 ° C. Aller de l’avant avec le protocole permettant de déterminer le titre de la 2'-FL comme décrit à la section 3.3.
  2. Avant le traitement avec la souche LacZ +
    1. Commencer une culture de 25 mL de la souche de la 2'-FL produisant et une fois induite à la phase logarithmique, incuber la culture à 37 ° C pendant 24 h.
    2. Ensemencer une e. coli BL21 (DE3) culture en LB, développez-le à phase logarithmique à 37 ° C et ajouter 50 mL de la culture (2:1) dans la culture de 24 h.
    3. Incuber à 37 ° C pendant 3 h. procéder avec le protocole permettant de déterminer le titre de la 2'-FL comme décrit à la section 3.3.
  3. Précipitation au lactose à l’éthanol
    Remarque : Cette section est une adaptation de Matsuki et al.12.
    1. Commencer une culture de 25 mL de la souche de la 2'-FL produisant et une fois induite à la phase logarithmique, incuber à 37 ° C pendant 24 h.
    2. Ajouter deux volumes d’éthanol à 100 % à la culture, bien agiter et laisser incuber à 37 ° C pendant 4 h.
    3. Centrifuger la suspension à 900 x g pendant 15 min. à frais virés le surnageant et incuber une nuit à 4 ° C, ce qui précipite le lactose.
    4. Supprimer le lactose précipité en passant la solution à travers un filtre en papier (11 µm). Recueillir le filtrat qui est la cellule lysate contenant la 2'-FL, qui peut être quantifié en suivant l’article 3.3.

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Representative Results

Nous avons conçu un biocapteur à germes entiers spécifique à 2'-FL qui peut être utilisé en conjonction avec la production biotechnologique de l’oligosaccharide. Celle-ci repose sur le clivage enzymatique spécifique de modifier des sucres terminaux générant au lactose et donc l’activation de l’opéron lac , conduisant à l’expression d’une protéine fluorescente journaliste sous un promoteur inductible au lactose, dans proportionnelle à la quantité de 2'-FL. Pour démontrer sa spécificité de liaison, 3-fucosyllactose (3-FL), un isomère, a également été testé. Le circuit génétique comprend deux parties : un gène fucosidase, afcA ou afcB, conduit par un promoteur constitutif ayant pour résultat l’expression constitutive cloné sur un vecteur avec une séquence de signaux de pelB codé en amont du gène fucosidase à faciliter l’exportation périplasmique, mais aussi un système fluorescent contenant le promoteur T7 conduite expression de GFP. La première partie s’exprime sur le plasmide pAfcA et le second système de reporter sur le plasmide pET28:GFP. La construction finale a été transformée en e. coli BL21 (DE3), une souche largement disponible qui a de l’ARN polymérase T7 intégré dans le génome sous contrôle du promoteur pLacUV5 sensibles au lactose. Figure 1 a montre la conception schématique afin que le lecteur peut suivre le principe de fonctionnement du biocapteur. Figure 1 b montre le signal fluorescent dans des conditions différentes d’induction telle qu’analysée sur un cytomètre en flux. Conformément à notre hypothèse, sur une augmentation de 100 fois en fluorescence a été observée avec le biocapteur de 2'-FL par rapport au contrôle vectoriel seule ou avec le biocapteur pour 3-FL. Cela montre la forte liaison-spécificité du biocapteur. Pour s’assurer que le signal est en effet due à defucosylation, nous avons couru un contrôle en ajoutant α-1, 2-fucosidase commercial à la culture durant l’induction, qui est confirmée, comme indiqué par les barres sur la droite. La sensibilité du dosage peut être déterminée en générant une courbe dose-réponse avec différents niveaux de glucides (Figure 2 a). De l’intrigue, le dynamique linéaire de détection de 2'-FL se situe entre 40 et 400 mg/L et la limite de détection est de 4 mg/L. Ce dosage peut effectuer au cours d’une journée de travail, comme en témoignent les mesures de capture instantanée de la dynamique de l’expression du rapporteur (Figure 2 b).

Enfin, nous présentons comment les cellules de biodétection peuvent être utilisées pour détecter et quantifier la 2'-FL d’une souche de producteur de génie 2'-FL. Étant donné que cette souche utilise le lactose comme substrat, nous avons développé des stratégies pour réduire le signal du lactose exogène afin que la lecture du signal directement correspond à la concentration de 2'-FL (Figure 3 a). Une stratégie consiste à enzymatiquement dégrader le lactose à l’aide d’une β-galactosidase qui n’agirait pas sur mis à jour le lactose. Ceci peut être réalisé à l’aide commerciale de β-galactosidase qui agit préférentiellement sur le lactose, réduisant le signal au lactose à 20 % de l’original (Figure 3 b) ou par l’intermédiaire d’incubation avec une souche LacZ +, sauvage BL21 (DE3), qui en trois heures tombe le lactose signal aux niveaux de fond (Figure 3). La dernière stratégie utilise l’éthanol, qui non seulement sélectivement précipite au lactose mais également lyse les cellules producteur, lyse cellulaire étant une condition nécessaire étape aval (Figure 3D). Il s’agit d’un procédé d’extraction simple, mais il faut faire attention en raison du plus faible récupération de 2'-FL, comparée aux autres méthodes, éventuellement à partir de pertes dues à une cristallisation de la 2'-FL. En dépit de l’ajout d’éthanol, nous n’avons pas observé une inhibition significative de la croissance des cellules biodétection, probables parce que les concentrations d’éthanol final sont faibles (< 2 %, v/v) dans les cultures. Enfin, la méthode plus efficace, mais fastidieuse, que nous démontrons est à pellet et laver les cellules avant de lyse cellulaire pour libérer l’intracellulaire 2'-FL (Figure 3E). Nous conseillons au lecteur de faire preuve de discrétion, de sélectionner la méthode appropriée pour l’enlèvement de lactose basé sur l’efficacité et la disponibilité de temps et de réactifs.

Figure 3E démontre également notre capacité à quantifier fiablement 2'-FL en contexte biotechnologique. Nous avons cultivé soit une machinés 2' FL-souche productrice de11 ou un fucosyltransférase négatif mutant (témoin négatif) avec du lactose pour surveiller la production de 2'-FL de lysat cellulaire. Après mise en culture des cellules, nous avons mesuré la concentration en utilisant le biocapteur et la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) pour validation (supplémentaire Figure 1). Les courbes de réponse de dose de lysat de producteur et de contrôle lysat additionné de 2'-FL sont très semblables, ce qui démontre la mesure quantitative de la 2'-FL dans le contexte du lysat cellulaire.

Figure 1
Figure 1 : schéma 2'-FL biocapteur conception et représentant des données de. (A) 2'-Fucosyllactose (2'-FL) entre dans le périplasme bactérien et est converti en lactose par fucosidase exprimée de façon hétérologue. Lactose est transporté dans le cytoplasme et converti en allolactose. Ceci active le promoteur natif de LacUV5 dans e. coli BL21 (DE3), produisant RNAP T7, qui transcrit GFP sous le promoteur T7, conduisant à l’expression de la protéine fluorescente. (B) détection de 2'-FL et 3-FL. cellules contenant pET28:GFP et pAfcA (vert), pAfcB (magenta) ou un contrôle de vecteur vide (bleu) ont été induites du jour au lendemain sans sucre, la 2'-FL, la 2'-FL avec exogène α-1, 2-fucosidase, 3-FL ou au lactose. Toutes les données sont une moyenne de trois réplicats biologiques analysés en triple exemplaire, où les barres d’erreur représentent déviation standard de la moyenne. Signification statistique a été déterminée par le test de comparaison multiple de Tukey et ** est révélateur de p < 0,01.  Tout d’abord, ce chiffre est apparu à l’Enam et Mansell14 et est réutilisé avec l’autorisation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : caractérisation des biocapteurs pour la détection de la 2'-FL. (A) limites de fonctions de détection et de transfert des biocapteurs. Courbes de réponse dépeignant fluorescence moyenne pour pAfcA/2 ' FL (cercle vert) ou un contrôle vide vecteur (diamant bleu) à des quantités variables de 2'-FL cultivées. (B) évolution temporelle de l’expression du rapporteur. Souche pAfcA est incubé avec 2'-FL (carré vert) et la fluorescence a été suivie sur une période de 8 h d’induction. Souche pAfcA incubée avec du lactose est inclus dans un contrôle. Toutes les données sont une moyenne de trois réplicats biologiques analysés en triple exemplaire, où les barres d’erreur représentent déviation standard de la moyenne. Tout d’abord, ce chiffre est apparu à l’Enam et Mansell14 et est réutilisé avec l’autorisation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : détection et quantification de la 2'-FL d’une souche producteur. Les flux de travail (A) illustrant l’utilisation du biocapteur dans un protocole simple en clés mettant l’accent sur la suppression de bruit du lactose résiduel. (B) retrait du lactose par digestion enzymatique de β-galactosidase. Cultures contenant 0,3 % 2'-FL (carré vert) ou 0,2 % de lactose (cercle bleu) ont été incubées avec des cultures de biocapteur contenant des quantités variables de β-galactosidase exogène au temps d’induction ont été testées pour la fluorescence après incubation pendant la nuit. (C) retrait du lactose par incubation avec LacZ + souche sauvage. LB contenant 0,3 % 2'-FL (cercle vert), 0,2 % de lactose (carré bleu) ou un mélange de 1:1 (0,2 % de lactose équivalent, soit 0,1 % de lactose + 0,15 % 2'-FL, triangle magenta) a été incubé pendant diverses périodes avec BL21 (DE3) cellules, puis ajouté à des cultures de biocapteurs pour mesure de la fluorescence après incubation pendant la nuit. (D) précipitation de lactose et cellule lysis de prétraitement à l’éthanol. Fermentations JM109 gwBC-F2 (cercle magenta) ou JM109 gwBC (triangle bleu) cellules ont été incubées avec 2 volumes d’éthanol et filtrées avant l’incubation avec les cellules fluorescentes biocapteur et comparativement à fluorescence de JM109 non traitée, la culture gwBC-F2 ( carré vert). Quantification (E) de 2'-FL de lysat cellulaire. Le biocapteur a été évalué pour sa capacité à détecter les 2'-FL d’une souche métaboliquement machiné producteur. Mesures de fluorescence générées par l’addition d’un lysat de JM109 gwBC-F2 (cercle magenta, 2'-FL comme quantifiés par LC-MS), 2'-FL en quantités déterminées à souche nonproducer JM109 gwBC cell lysate (carré vert) ou brut lysat de JM109 gwBC souche (bleu brut diamant). Résultats ont été validés par quantification de HPLC de 2'-FL dans la souche de producteur. Toutes les données sont une moyenne de trois réplicats biologiques analysés en triple exemplaire, où les barres d’erreur verticales représentent les écart-type de la fluorescence de moyenne et barres d’erreur horizontale représentent l’écart à 2'-FL mesuré par HPLC dans le réanalysés. Tout d’abord, ce chiffre est apparu à l’Enam et Mansell14 et est réutilisé avec l’autorisation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 1 : l’analyse HPLC-MS de 2'-FL. (A) extraite des chromatogrammes ion de 2'-FL (m/z 511). Chromatogramme d’une norme commerciale est montré sur le dessus. Chromatogramme de la 2'-FL de la souche JM109gwBC-F2 (dilution 10 fois) est affiché dans le bas. Le pic à 511 m/z est le sodium adduit. (B) un élargissement du spectre de masse m/z de 300−800, où les signaux plus abondantes étaient concentrés est indiqué pour la norme commerciale (en haut) et la 2'-FL de la souche de producteur (en bas). (C) une courbe standard a été créé par LC-MS analyse ayant des niveaux de commerce 2'-FL. Barres d’erreur représentent les écarts-types de mesures en triple. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Nous présentons une stratégie haut-débit pour la détection de liaison spécifique de fucosylées oligosaccharides de lait maternel. Cela a été accompli en construisant des biocapteurs à germes entiers par génie génétique e. coli , qui, après induction par glycanes spécifiques, répondre avec un signal fluorescent. Le protocole détaille également sur comment le biocapteur peut être utilisé pour détecter et quantifier les HMO dans une souche bactérienne métaboliquement modifiée.

Notre protocole offre des avantages par rapport aux autres méthodes en raison de son débit élevé en plus de sa liaison-spécificité par rapport aux méthodes chromatographiques/SM. La limite basse de détection et de la plage dynamique large permet la mesure directe du HMO.

Des étapes cruciales dans le présent protocole se produisent dans la préparation de la cellule de lysate de souches de producteur. Pour assurer le titre maximale de 2'-FL, il est essentiel d’offrir les conditions optimales. Variabilités dans les lots peuvent survenir en raison des paramètres de sonication ou temps d’induction. Il faut au cours de la caractérisation de la biocapteur. Il est également recommandé d’exécuter des contrôles appropriés pour toutes les étapes de l’expérience pour garantir des résultats cohérents.

Une des limites de notre protocole est sa dépendance au lactose pour l’induction, qui devient un goulet d’étranglement quand au lactose naturellement présents, comme dans le lait maternel, ou utilisé comme substrat dans la production biotechnologique de HMO. Nous avons abordé ce avec quatre stratégies distinctes pour supprimer le rapport signal sur bruit afin que le biocapteur peut détecter de manière sélective ossi plus de lactose.

Le biocapteur de germes entiers codé génétiquement présenté ici va permettre optimisation pour la fabrication des HMO, comme beaucoup de conditions de réaction ou de paramètres de bioréacteur peuvent être dosés en parallèle en quelques heures. Lorsque réalisés en plaques de 96 ou 384 puits, la méthode montre le potentiel à l’écran des milliers d’échantillons par jour.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par l’Iowa State University fonds de démarrage. F.E. a été partiellement financé par la NSF Trinect bourse et Manley Hoppe professorat. T a été partiellement prises en charge par le Karen et Denny Vaughn faculté Fellowship. Les auteurs remercient l’Iowa State University Flow Cytometry Facility et le laboratoire de recherche de métabolomique W.M. Keck d’assistance avec la fluorescence et SM-études.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

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References

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).

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Biochimie numéro 146 chimie des glucides des oligosaccharides de lait humain biocapteur biologie synthétique génie métabolique criblage à haut débit suppression sélective au lactose
Analyse des Trisaccharides lait Fucosylées homme dans contexte biotechnologique génétiquement encodé biocapteurs
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Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

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