Summary
האתגר של מחקר אפילפסיה הוא לפתח טיפולים חדשניים עבור חולים שבהם הטיפול הקלאסי אינו מספיק. באמצעות פרוטוקול חדש-בעזרתו של מערכת העברת תרופות להשתלות-אנו מסוגלים לשלוט בהתקפים בעכברים מוחוקים על-ידי המסירה האלקטרופיניטית של נגבה לתוך המוקד האפילפטי.
Abstract
אפילפסיה היא קבוצה של הפרעות נוירולוגיות אשר משפיע על מיליוני אנשים ברחבי העולם. למרות שהטיפול בתרופות מועיל ב-70% מהמקרים, תופעות לוואי חמורות משפיעות על איכות החיים של המטופלים. יתר על כן, אחוז גבוה של חולים אפילפטי עמידים בפני סמים; במקרה שלהם, נוירוכירורגיה או גירוי נוירולוגי נחוצים. לכן, המטרה העיקרית של מחקר אפילפסיה היא לגלות טיפולים חדשים אשר מסוגלים לרפא אפילפסיה ללא תופעות לוואי או מניעת התקפים חוזרים בחולים עמידים בפני סמים. נוירוהנדסאים מספקת גישות חדשות באמצעות אסטרטגיות וטכנולוגיות הרומן כדי למצוא פתרונות טובים יותר לריפוי חולים אפילפטי בסיכון.
כהדגמה של פרוטוקול ניסיוני הרומן במודל העכבר החריף של אפילפסיה, מערכת ישירה של סמים באתרו האספקה החשמלית משמש. כלומר, בדיקה עצבית שילוב משאבת יון מיקרופלואידיסי (Μd) עבור מסירת סמים על פי דרישה והקלטה בו של פעילות עצבית מקומית מושתל והפגינו להיות מסוגל לשלוט 4-פמפרידין המושרה (4AP המושרה) תפיסה כמו פעילות אירוע. הריכוז הγ-עמינח של החומצה הבוטירית מוחזק בטווח הפיזיולוגי על ידי השליטה המדויקת של משלוח הנגבה כדי להגיע לאפקט אנטי-אפילפטי במוקד התפיסה, אך לא לגרום להתפרצויות של התפרצויות ריבאונד. השיטה מאפשרת הן זיהוי של פעילות פתולוגית והתערבות להפסיק התקפים על ידי אספקת נוירוטרנסמיטורים מעכבות ישירות המוקד אפילפטי עם שליטה מדויקת זמן.
כתוצאה מההתפתחויות לשיטה הניסיונית, ניתן להביא SLEs באופן מקומי מאוד המאפשר השתלטות על ידי משלוח בדיוק מכוון באמצעות מסירת התפיסה בתחילת ההתקף.
Introduction
אפילפסיה היא ההפרעה הנוירולוגית הרביעית הנפוצה ביותר: כ 1% מהאוכלוסייה סובלת מאפילפסיה, וכשליש מהמושפעות יש התקפים חוזרים. ברוב המקרים, התקפים יכולים להיות נשלט עם תרופות. עם זאת, טיפול בסמים צריך להיות מוגדר עבור כל מטופל בנפרד, שבו המינון הנכון יכול לקחת שנים כדי למצוא1,2. בנוסף, לרוב התרופות יש תופעות לוואי חמורות המקטינה את איכות החיים3,4,5,6,7. לבסוף, ב 30% מהחולים במקרים עמידים בפני תרופות, ובמקרה של מקור קבוע מחולל תפיסה אחת, רק כירורגי resective יכול להחליש את המופע של התקפים8. לכן, היוזמה העיקרית במחקר אפילפסיה המודרנית היא לגלות אסטרטגיות חדשות אשר יכולים למנוע התקפים חוזרים לחולים בסיכון, תוך הפחתת הצורך של טיפולים חזקים בתרופות וניתוחים פולשנית מחדש.
ויהיו אפילפסיה להתרחש כאשר יש חוסר איזון בתוך מעגלים המעכבות ושאיפה בכל רחבי המוח (אפילפסיה כללית) או בחלק מקומי של המוח (אפילפסיה מוקד), כך הנוירונים הפרשות בצורה נורמלית9 , מיכל עשור , 11. תרופות נוגדות אפילפסיה יכולות לפעול בשתי דרכים שונות במניעת תפיסה: הפחתת עירור או שיפור עיכוב12. באופן ספציפי, הם יכולים לשנות את פעילות החשמל של תאים עצביים על ידי השפעה על ערוצי יונים בתא קרום13 או לפעול על שידור כימי בין הנוירונים על ידי השפעה על הנוירוטרנסמיטר מעכבות נגבה או ההתרגשות גלוטמט ב הסינפסות14,15. עבור תרופות מסוימות, מצב הפעולה אינו ידוע18. כמו כן, טיפולים בתרופות יש השפעה רציפה על חולים ולא יכול להסתגל הדינמיקה השכיחות של התקפים. באופן אידיאלי, תרופות עם מנגנונים ספציפיים של פעולה יפעלו על התהליכים הבסיסיים אפילפסיה. טיפול אופטימלי לא ייגע באינטרפיקציה של המוח אך יפעל מיד כאשר התקף מתחיל להתפתח. בניגוד לכך, בכל המקרים של אפילפסיה, תרופות כיום משמעותה טיפול שיטתי, המשפיעים על המוח כולו ועל כל הגוף של החולה9.
התקפים אפילפטי יכולים להופיע שנים רבות לאחר העלבון הראשוני כגון טראומה מוחית. התקופה שבין העלבון הראשוני לבין התרחשות ההתקפים הספונטניים הראשונים מתאפיינת בארגונים מולקולריים וסלולאריים ניכרים, כולל מוות עצבי עם היעלמות חיבורי הרשת העצביים והאקאליות לבלוב/neosynaptogenesis עם הופעת קשרים חדשים19,20,21. פעם התקפים הופכים חוזרים, התדר שלהם ואת חומרת נוטים להגדיל, מעורבים באזורים המוח יותר. חשוב להבדיל בין האתרים של התפרצות התפיסה (אזורים epileptogenic) מרשתות הפצה, מאחר שכללי התפיסה הראשית וההפצה עשויים להיות שונים. מחקרים שבוצעו על רקמות האדם ומודלים ניסיוניים של אפילפסיה סיפקו נתונים חשובים לגבי התארגנות משנה של מעגלים ויכולתם לייצר התקפים20,21,22, 23. עם זאת, קשה לקבוע אם הארגונים האלה הם תגובות אדפטיבית או אם הם causally הקשורים epileptogenesis או להתקף בראשית והפצת12.
לכן, לוקליזציה של המוקד האפילפטי והחלת תרופות נוגדות אפילפסיה באופן מקומי הם אחד האתגרים העיקריים במחקר אפילפסיה עכשווית. מספר ניסויים באמצעות מודלים של בעלי חיים של אפילפסיה וכמה מחקרים קליניים שמטרתם למצוא את התחלתה של האירועים תפיסה ולהגדיר את המנגנונים הבסיסיים במוח24,25,26,27. למטרה זו, פיתחנו פרוטוקול ניסיוני חדש באמצעות המודל המושרה 4ap אפילפסיה28,29,30,31 ב הכנה לעכבר חריפה, אשר מאפשר הוספה מדויקת של שלושה התקנים לאזור נתון של ההיפוקמפוס, שבו פעילות הרשת ב vivo מניפולציות באופן מאוד מקומי. הזרקת 4AP מקומי על ידי מיקרופיפטה זכוכית מסייעת לגרום למחלת אפילפסיה במקום המותאם לשפות אחרות בהיפוקמפוס, בעוד בעזרת הרומן המבוסס על פולימר מבוססי לבדוק את השליטה בפעילות התפיסה מושגת בו על ידי הקלטת את האדם העצבי פעילות חשמלית עם אתרי ההקלטה של המכשיר. היפוקמאל פעילות השדה המקומי הוא גם מפוקח עם בדיקה סיליקון רב ערוצית באופן ספציפי לשכבה בקליפת ובהיפוקמפוס בו.
הבדיקות האחרונות Μi Fip פועלות באמצעות שדה חשמלי שהוחל על מנת לדחוף תרופות מוחסות המאוחסנות בערוץ microflu, לאורך קרום חילופי יונים (IEM) והחוצה אל הרקמה שמסביב (איור 1). ה-IEM מסיע סוג אחד בלבד של יון (קטיון או אניאון), ולכן פועל להגביל את הדיפוזיה הן במצב "off" והן בהובלה של מינים הטעונים באופן מקיף מהרקמה הסובבת לתוך המכשיר. השדה החשמלי נוצר על פי דרישה על ידי החלת מתח קטן (< 1 V) בין האלקטרודה המקור שהוא פנימי לערוץ microflu, האלקטרודה היעד שהוא חיצוני למכשיר (במקרה זה, בורג הראש על המודל של בעל חיים). קצב מסירת הסמים פרופורציונלי למתח המוחל ולזרם הנמדד בין אלקטרודות המקור והיעד. היכולת המדויקת של מסירת הסמים היא אחד היתרונות העיקריים של ה-μFIP. יתרון קריטי נוסף, לעומת פלואידיג או מערכות לאספקת סמים מבוססי לחץ, הוא כי ב-Μi יש רק להגדיל את הלחץ הזניח בשקע משלוח הסמים כמו סמים מועברים ברחבי IEM ללא פתרון הספק שלהם.
יש כמות קטנה של דליפה פסיבית של נגבה כאשר ה-Μpave הוא "off", אבל זה נמצא לא להשפיע SLEs. ה-Μi הם מותאמים אישית בעקבות שיטות מיקרו-ייצור קונבנציונליות שדווחו קודם לכן ב-31.
מאז אחת הדרכים של מניעת התקפים חוזרים הוא המצור של הרשת פולט בתחילת מאוד או אפילו לפני אירוע התפיסה הראשונה, השיטה המוצגת לאספקת נוירוטרנסמיטר מעכבות נגבה לתוך המוקד אפילפטי יש הרבה פוטנציאל תרפויטי לשליטה בחולים עם אפילפסיה מוקד. מכיוון שנגבה היא מצע אנדודוגני, הוא מותיר תכונות נוירואליות פנימיות ללא שינוי בריכוזים פיזיולוגיים. היישום המקומי של רמות נמוכות של נגבה רק ישפיע על התאים הקשובים באופן טבעי לעיכוב, ויהיה רק לגרום לתופעות דומות לעיכוב פיזיולוגי, בניגוד לגירוי מוחי עמוק (DBS), שיש לו פעולות בלתי מדויקות על ידי עירור כל התאים של הרשת העצבית בסביבתו, וגרמה לתגובה מעורבת הכרוכה בעירור ובעיכוב. לסיכום, השיטה המוצעת מספקת גישה ספציפית יותר לתפיסת שליטה מאשר DBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הניסיוניים נערכו על פי ההנחיות האתיות של מכון הנוירומדעי הSystèmes ואושרו על-ידי ועדות האתיקה המקומית ומשרדי וטרינרי.
הערה: 17 OF1 עכברים זכרים בוגרים שימשו לניסויים. עכברים היו מוהים ל 12 שעות מחזור אור/כהה עם מזון ומים זמין מודעה libitum.
1. הרדמה
- הכנס intraperitoneally תערובת של קטמין ו xylazine (100 מ"ג/ק"ג משקל הגוף 10 מ"ג/ק"ג משקל הגוף, בהתאמה) כדי ללגרד את החיה.
-
בדוק את רמת ההרדמה על ידי התבוננות בקצב הנשימה והקצפה, על ידי בדיקת תגובת העכבר לכאב.
הערה: כאשר נשימתו של העכבר הופכת לרגילה, לא ניתן להבחין בשום הקצפה, והחיה אינה מגיבה לפינובי הזנב, ההרדמה עמוקה מספיק כדי להמשיך.- מניחים את החיה על כרית חימום חשמלית לתכנות. מכסים את הטמפרטורה פי הטבעת עם מוצר המבוסס על ג'לי הנפט (ראה טבלת חומרים) ומניחים אותו בעדינות לתוך הרקטום (1 – 2 ס מ עמוק) של העכבר כדי לפקח על טמפרטורת הגוף שלו. שמרו על טמפרטורת גוף בין 36.5 ל-37.5 ° c במהלך הליכי הניתוח וההקלטות הנסיוניות.
- נטר את רמת ההרדמה על ידי בדיקת הרפלקסים של העכבר, תנועות הקצעות ותדירות הנשימה שלו. לקיחת בחשבון את רמת ההרדמה שנרשמה לפחות כל 30 דקות, לתת מנה קטנה של קוקטייל קטמין-xylazine (20 – 50 μL, אותו הריכוז בשימוש כמו קודם) הפנימי.
2. ניתוח/פתיחת גולגולת
- תקן את ראש העכבר במסגרת סטריאוטקלית. באמצעות מחט של 30 גרם, להזריק ropi, כאבים המקומי מקומי (5 μL, 7.5 mg/mL, ראה טבלת חומרים) תת-עורי באתר החתך המתוכנן. אפשר 5 דקות כדי שהוא ייכנסו לתוקף.
- הפוך את קו האמצע לחתוך ישר בעור מעל הגולגולת עם אזמל. בעדינות למשוך את העור לעבר הצדדים עם מלקחיים עדינים להדק אותו הצידה עם בולדוג הצבת מלחציים כדי להשאיר את הגולגולת חשוף לעבודה נוספת.
- נקה את הגולגולת של fascia עם אזמל או כל כלי דומה. במקרה של דימום שטחי, להסיר את הדם עם מטלית כותנה או חתיכות קטנות של מגבת נייר.
- לקחת פולי (3, 4-ethylenediophene) פוליסטירן סולופאט (PEDOT: PSS)-מצופה בורג הקרקע (גודל:00, קוטר: 0.047 ב, אורך: 1/8 ב, ראה את הטבלה של חומרים) עם חוט מולחם ולחבר אותו עם מחבר אל מגבר headstage.
- מויסטן את הגולגולת באתר החור הרצוי לקדוח חור במהירות גבוהה באמצעות בסדר, מקדחה עגול סיבית (עם קוטר 0.4 מ"מ) על הגולגולת מעל המוח הקטן עד דורא הוא גלוי. שים את בורג הקרקע לתוך החור ולהרוס אותו עם מברג דיוק עד שהוא מגיע לראש המוח העליון.
הערה: בורג הראש היה מצופה מטבל עם הפתרון PEDOT: PSS המכיל 1% 3-גליצילולוקסיל) טרימתאוקסיסילאנה (GOPS) לפי משקל ולאחר מכן אפייה ב 140 ° c עבור 90 min. PEDOT: PSS הוא פולימר מצומת עם קיבוליות נפחי כי ידוע להיות ביולוגי. GOPS הוא חוצה מקשר מעורבב עם PEDOT: PSS כדי להגביר את היציבות בתקשורת מימית (איור 2). - בעזרת מסגרת סטריאוטקאית, יש למדוד את נקודות הציון הסטריאוטקאיות לאזור המוח הרצוי. לדוגמה, אזור העניין הוא ההיפוקמפוס, anteroposterior (AP)-1.8 מ"מ ו-mediolateral (ML) 1.8 mm מנקודת ברז מבוסס על אטלס המוח עבור עכברים32.
הערה: אלה נקודות ציון לאונה הימנית (איור 2). - דק a בערך 1 עד 2 מילימטר באזור של הגולגולת מעל אזור היעד באמצעות מקדחה שיניים אמין (ראה טבלה של חומרים) להגדיר במהירות מהירה עד רזה, היטב מלוטש, קרום עצם שקוף נשאר.
- אז, אם עובי של קרום העצם הוא דק מספיק (< 200 μm), לעשות חור קטן עם מלקחיים דקים בעדינות להסיר את השכבה הדק של העצם33. השתמשו במחט מותאמת אישית העשויה מהקרס כדי להסיר את השכבה הדורה. מזער את הגודל של פתיחת הגולגולת וכריתת המוח כדי למנוע את התפתחותם של האדמות וכלה למזער את הלב ו/או הנשימה של מוחו.
הערה: הפתיחת הגולגולת חייבת להיות מלאה ב-droplet של תמיסה מלוחים כדי למנוע ייבוש ולאחר מכן למלא בקביעות במהלך הניסוי (איור 2).
3. החדרת בדיקה סיליקון רב-ערוצי
- השתמש בזרועות סטריאוטקאית בזווית AP קלה (20 °) עבור בדיקה סיליקון להשאיר מקום מספיק למיקום של שני שתלים אחרים ולקבל את ההקלטה ואת אתרי ההזרקה של האלקטרודה, משאבת היונים, ו מיקרופיפטה קרוב ככל האפשר.
הערה: אלקטרודות, מזרקים, ומשאבות יונים היו מכוסות בטיפה של תמיסת דיאני כתם (1, 1 '-dioctadecyl-3, 3, 3 ', 3 '-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט [dii]), עבור הדמיית פוסט הוק של עקבות השרשה (0.5 mg/ml dii ב diמתיל סולפוקסיד). - מניחים את לווין הסיליקון על הזרוע הסטריאוטקאית המצורפת למחזיק מגנטי ומניחים אותה ליד המסגרת הסטריאוטקאית. הגדר את זווית AP (20 °) ולאחר מכן חבר את הגשוש לשלב הקדמי ולבורג הקרקע.
-
הורידו באיטיות את בדיקת הסיליקון לתוך ההיפוקמפוס בעזרת הזרוע הסטריאוטקמית מיקרון-מדויקת או מיקרומניפולציה ממונעת כדי להימנע מתנועות לרוחב (איור 2 ואיור 3).
- הפעל את תוכנת ההקלטה והרשומה-עם השלב הראשי, המגבר המחובר, ומחשב-אותות עצביים חשמליים תוך הזזת בדיקת הסיליקון הרב-ערוצית מראש הקליפת המוח עד למיקומה הייעודי (- 1,800 יקרומטר ממשטח קליפת האדמה). הקלט והצג את האות המקומי בשדה הפוטנציאלי (LFP) במהלך החדירה על מסך המחשב.
הערה: לשלוט על הירידה של החללית כך שהוא נע לאט וברציפות בזמן ההקלטה, כדי לקבל שליטה חזותית טובה יותר עבור חדירה ולהגיע לאזור היעד. - השתמש בפעילות הריפל בשכבת הפירמידה של היווצרות ההיפוקמאל במסגרת ה-LFP המוקלטת כסמן לאזור היעד.
הערה: הפעילות ריפל גלוי על אחד או שניים ערוצים שכנים של סיליקון רב ערוצי (Si) בדיקה שיש מרחק 100 יקרומטר בין אתרי הקלטה (איור 4). - רשומות LFP להקליט משכבות של קליפת המוח ואת ההיפוקמפוס במקביל דרך התוכנה של מגבר רב-ערוצי (ראה טבלת חומרים) בעזרת הבדיקות הרב רב-ערוצי (איור 4).
- הפעל את תוכנת ההקלטה והרשומה-עם השלב הראשי, המגבר המחובר, ומחשב-אותות עצביים חשמליים תוך הזזת בדיקת הסיליקון הרב-ערוצית מראש הקליפת המוח עד למיקומה הייעודי (- 1,800 יקרומטר ממשטח קליפת האדמה). הקלט והצג את האות המקומי בשדה הפוטנציאלי (LFP) במהלך החדירה על מסך המחשב.
4. החדרת הסמל Μi
- לחבר את הצינורות (לראות את הטבלה של חומרים) אל השקע של μi ו למלא את החללית עם 0.05 M הפתרון של נגבה. להסיר את הצינורות ולסגור את האוויר עם עטיפת הסרט פרפין. חבר הפניות חשמליות ליחידת המדידה של המקור.
- הכנס את ה-μFIP בעזרת הזרוע הסטריאוטקאית בזווית מדיה שצלעות (20 °). הבדיקה של סי. נותרה בכל התהליך
הערה: μi fip הוא גמיש מאוד והוא עשוי ליהנות מתמיכת מכחול קטן ונקי כדי לשמור על הסדר עד שהוא מגיע למשטח המוח. לאחר שלב זה, אתה יכול להוריד את Μi בעדינות עם תנועות צירית. - הנמך את ה-μfip באיטיות עם תנועות צירית ולעולם אל תיתן לו להתכופף במהלך המסלול עד שהוא מגיע לקואורדינטת הדורזובנגאני (-1,200 יקרומטר ממשטח קליפת המעיים).
הערה: נסה לשים את שני המכשירים (μfip ו הסיליקון בדיקה) קרוב זה לזה ככל האפשר, בהתחשב במרחק של 300 יקרומטר של השקע מקצה μfip.
התראה: הימנע מבעיות מכניות בין המכשירים והמחברים שלהם במהלך הכניסה (איור 2b ואיור 3b).
5. הכנת התקנים לצורך תפיסת האינדוקציה
- לשנות את מחט המתכת של המזרק (10 μL) (ראה טבלת חומרים). הסר את המחט מחזיק את החלק מתכת, למקם ולתקן את המיקרופיפטה (הקוטר החיצוני [OD]: 1.2 מ"מ, קוטר פנימי [ID]: 0.75 מ"מ, בקוטר העצה: 20 – 50 יקרומטר עם ± 0.5 ס מ של הסכין מתחדד של shank, ולאחר מכן להחליף את אלמנט מחזיק המחט
- מקמו את המזרק ואת הבורוסיליקט הצמוד בזווית של 20 ° (LM) להזרקה של 4AP (50 מ"מ בנוזל שדרתי מלאכותי [ACSF]).
זהירות: אין להשתמש במחט המתכת של המזרק או במיקרופיפטה עם טיפ גדול יותר מ-50 μm. - צייר 500 nL – 1 μL של 50 mM 4AP בעזרת משאבת מיקרוזרקת אוטומטית.
6. החדרת פיפטה זכוכית מוצמד למזרק 4AP הזרקת AP
- הנמך את מיקרופיפטה הזכוכית המצורפת למזרק למיקום ה-DV המיועד (-1,500 μm) ולאחר מכן הכנס 250 nL של פתרון 4AP (איור 2 ואיור 3). התחל להקליט עם תוכנת ההקלטה. צפה במסך ולחכות ספייק interictal הראשון להופיע.
- התחילו את משלוח הנגבה מאת Μi באופן מיידי עם הופעתו של ספייק interictal הראשון. לספק את הנגבה על ידי החלת 1 V בין המקור והיעד עבור 100 s ואחריו 1 off, עבור 30 מחזורים. בעזרתו של תוכנת ההקלטה, שיא למינימום של 2 h.
הערה: המסה הכוללת של הנגבה המועבר היא סביב 1 למול (איור 5). - בסוף הניסוי, להסיר בעדינות את הבדיקות שנוספו ואת בורג הקרקע, ולהסיר את החיה מהציוד הסטריאוטקאית. בעלי חיים הורדמים באמצעות מנת יתר של תרופה (i. p. 100mg/ק"ג פנטוברביטל). . המוות אושר ע י הפסקת נשימה ומחזור
7. הערכת מיקום השתלים
- לאחר המתת החסד של בעל החיים, הדבר הראשון עם 50 mL של תמיסת מלח ולאחר מכן עם 150 ml של פתרון קבע קר הקרח המכיל 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב 0.1 M פוספט מאגר (PB)34.
זהירות: . וחייבים לטפל בו בזהירות - ולאחר מכן להסיר את העור ואת השריר מלמעלה ומהצדדים של הגולגולת. החל מגנום foramen, לעשות חתכים לרוחב בגולגולת לכיוון האוזניים החתך משונן קו, לקחת טיפול גדול לא לפגוע במוח. להסיר בעדינות את הגולגולת עם קוצץ העצם. הסר את המוח, ולאחר מכן גזור בלוק רקמות מאזור העניין (מנקודת ברז, -1 עד 3 מילימטר AP) בעזרת מטריצת מוח (ראה טבלת חומרים).
- הדבק את בלוק הרקמה על מחזיק הדגימה של מערכת הרטט, לשים את העמדה לתוך זה, ולהגדיר את הרטט כדי 40 יקרומטר עובי באמבט PB להפוך 40 יקרומטר סעיפים ילתית.
- רוחצים בהרחבה עם 0.1 M PB. בצע את הפרוטוקול היסטולוגית עבור חלבון חומצי glibrillary (GFAP) צביעת31.
- מקטעי הר על שקופיות ולכסות אותם עם מדיום הרכבה המכיל 2-(4-amidinophenyl)-1H-אינדול-6-קרבוקמין (DAPI) (ראה טבלת חומרים).
8. מיקרוסקופיה קונפוקלית
- מניחים את השקופיות עם סעיפים ילתית מוכתם תחת מטרה 20x של מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. בחר את אזור היעד.
- לבחור את העירור האופטימלי והפליטה (exc/ems) מסנן סטים עבור צבעים כדלקמן: DAPI = 358/461 nm, DiI = 551/569 nm, ו fluorescein (ראה טבלת חומרים) = 490/525 nm.
הערה: מאחר שהצביעת משתנה לפי מקטע, יש צורך לקבוע טווח מתאים של עירור מינימלי ומקסימלי של כל מקטע, שהאזורים הצפופים ביותר והצפופים ביותר מראים פליטה. - בחר את האזור הפחות צפוף והגדר את עוצמת הלייזר ואת הזיהוי לערכים גבוהים, ולאחר מכן אמת באזורים הצפופים יותר אם ערכים אלה גורמים לרוויית יתר של הפליטה שזוהתה. אם כן, הנמך את הערכים ובדוק אותם מתחת לאזור הפחות צפוף. חזר השלבים הבאים עד להגיע לזיהוי האפשרי הגבוה ביותר ברמות הכתמים הנמוכים וברמות המתאימות והלא רוויות באזורים מוכתמים במיוחד. חזור על תהליך זה עבור כל הצבעים.
- השתמש בפונקציה לסרוק אריח של המיקרוסקופ עם 512 x 512 פיקסלים לכל אריח כדי לקבל סקירה גדולה של אתרי ההכנסה בדיקה עם רזולוציה נאותה עבור עיבוד הודעה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך המוצג כאן עם מודל האפילפסיה 4AP בעכברים מושערים, השליטה של התקפים אפילפטי ניתן להשיג במוקד האפילפטי. הלוקליזציה המדויק של השתלים (איור 2) עזר להקליט היפוקמאל השדה פוטנציאל מקומי (lfps, איור 4), כדי לגרום להתקפים היפוקמאל קטן ולספק את הנגבה על התפרצות התפיסה. הלוקליזציה של השתלים אומת לאחר כל ניסוי על ידי היסטולוגיה-הוק (איור 3).
במקרה כאשר SLEs היו נוכחים רק בהיפוקמפוס, הפעילות אפילפטי הושם תחת שליטה מוחלטת. איור 5 מראה דוגמה מייצגת כאשר sles יכול להיעצר עם המסירה של נגבה על ידי בדיקה עצבית הרומן שילוב μfip. כאשר 4AP הוזרק לאזור גדול יותר או בחלק העליון של קליפת המוח, התקפים אפילפטי הפכו כללית, כך הנגבה הנמסר לא היה מסוגל לשנות את היקף ההתקפים אפילפטי (איור 6). המסירה של יוני נתרן לא היתה השפעה בולטת על 4 AP המושרה פעילות (איור 7).
איור 1: סקירה של הבדיקה של ה-μFIP. תצוגה סכמטית ובגודל הממשי של המחקר μFIP. (a) סכמטי של הקצה המושתל של הגשוש μi מציג תכונות ראשיות. (ב) תמונה של בדיקה בעלת מחטים עם קצה מושתל שהושתל כלפי מעלה. הבלוק האדום מיועד. לחיבור פלואידיסי סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (c) תמונת מיקרוסקופ של טיפ בדיקה μx4 ללא IEM. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כריתת הגולגולת והלוקליזציה של השתלים במוח העכבר. (א) השקפה סכמטית של הניתוח, פתיחת הגולגולת ומטרת השתלים במוח העכבר. (ב) השתמשו בקואורדינטות סטריאוטקאיות ובזוויות להשתלה של שלושת המכשירים. μfip = 20 ° שצלעות (ML),-1,200 יקרומטר DV (ירוק). בדיקה סיליקון רב ערוצית = 20 ° AP,-1,800 יקרומטר DV (כחול). מיקרופיפטה עם מזרק = 20 ° LM,-1,500 יקרומטר DV (אדום). מרכז הפתיחת הגולגולת הוא 1.8 מ"מ ML,-1.8 מ"מ AP עבור האונה הימנית. איור זה שונה מפרוקטור ואח '31 (הפצת זכויות יוצרים במסגרת רישיון הייחוס לא מסחרי מלאי creative 4.0 (CC BY-NC). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הערכה היסטולוגית של מיקום ההשתלה. פאנל (א) מציג את הדמות התלת-ממדית הסכמטית על ההתאמה של היווצרות ההיפוקמאל במוח העכבר (ירוק). פאנלים (ב, C ו -D) להראות את העקבות של המכשירים מושתל-μfip, מיקרופיפטה עם מזרק ובדיקה סיליקון רב ערוצית (dii, אדום, חיצים), בהתאמה31. פאנלים (Ba, Ca, Da) מציגים תמונה בעלת הגדלה גבוהה; פאנלים (Bb, Cb, Db) מציגים את הדף המתאים של המוח paxinos ופרנקלין עכבר אטלס, בעוד (לפנה ס, Cc, Dc) להראות תמונה הגדלה נמוכה על כל הקטע הקורילי של הזכות כדור. סרגל קנה מידה = 500 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הקלטה רב-ערוצי מקליפת המוח וההיפוקמפוס. Lfp הקלטה עם בדיקה סיליקון רב ערוצית עם מרחק של 100 יקרומטר בין אתרי ההקלטה, מן השכבות של קליפת המוח (לבן) ואת היווצרות היפוקמאל (סגול, CA1 = cornu האמפה באזור 1; כחול, DG = שלאטה gyrus. שימו לב לפעילות הריפל. של הרובד הCA1 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השליטה בהתקף של 4AP שנגרם על ידי נגבה. הקלטות האלקטונפיזיולוגיה. מההיפוקמפוס (א) הקלטה בהיעדר טיפול ב-μi עם sles החל כ -30 דקות לאחר הזרקת 4-ap, ואחריו אפילפטיקוס סטטוס. (ב) הקלטה של מקרה שבו הטיפול ב-μfip הופעל מיד לאחר הראשון. ההקלטה לא מראה אירועים פתולוגיים נוספים לאחר תחילת הטיפול. (ג) הקלטה שבה הטיפול μfip הופעל לפני הזרקת 4-ap, ואינו מראה אירועים פתולוגיים. החיצים האדומים מצביעים. על הזרקת 4-AP חיצים ירוקים מוצקים מציינים את התחלת הטיפול ב-μFIP, והחיצים הירוקים הפתוחים מסמנים את סוף הטיפול ב-μFIP. פסגות חדות במרווחי 100 s בעקבות חץ ירוק הם פריטים מתוך הטיפול ב-μFIP31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: כישלון השליטה בהתקף של 4AP שנגרם על ידי נגבה. הקלטה אלקטרופיזיולוגית הנציג מן ההיפוקמפוס במקרה שבו 4AP הוזרק עם מחט מתכתי של המזרק, ולכן התקפים אפילפטי השפיעו על אזור מוחי גדול יותר. שימו לב שמסירת הנגבה לא השפיעה על עוצמת התפיסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ניסוי ברכב. בקרת ניסויים המספקים מינון שווה ערך של נתרן יון (Na+) במקום של נגבה לא היה השפעה בולטת על 4ap המושרה פעילות, הוכחת כי זה לא הזרם המוחל ממשאבת היונים כי מודוללוגי אלקטרופיזיולוגיה פעילות אלא מולקולות מועברות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על ידי פיתוח פרוטוקול ניסיוני חדש במודל העכבר חריפה של אפילפסיה, SLEs יכול להיות נשלט בהצלחה בעזרת הצפק Μi מושתל במוקד האפילפטי. הודות ליכולתה לספק את העבודה עם הדיוק הזמני והמרחב, המושרה 4AP SLEs שלטו בתחילתה של ההתקפים. טיפול במחלת האפילפסיה אפשרי תיאורטית אם השליטה על הפרשות הרשת העצבית מושגת במקום התחלת ההתקף. הפרוטוקול המוצג הוכיחה את זה אפשרי אם לוקליזציה של נוירוטרנסמיטר מעכבות מוזרק, נגבה, הוא מספיק מדויק כדי להגיע למוקד אפילפטי בזמן. עם זאת, במקרים אלה שבהם ויהיו אפילפסיה להשפיע על אזורים גדולים יותר של המוח, תפיסת שליטה על ידי משלוח בדיוק מקומי נגבה לא אפשרי. אזור ההשפעה של הבדיקה μfip הוערך עם רדיוס של כ 550 יקרומטר משקע. זה הוכח כי SLEs יכול להיות מושפע רק אם הזרקת 4AP היה מקומי לאזור זה31.
לכן, השיטה היא שימושית כאשר ויהיו אפילפסיה מותאמים לשפות אחרות, אבל לא היה אפשר לשלוט או לעצור את האפילפסיה כאשר התקפים הפכו multifoci או מוכללת. כמו כן, השיטה הוכחה מכרסמים ממומנת; בחיות נעות בחופשיות, יישומים כרוניים עדיין נחוצים כדי לחקור את היעילות של פרוטוקול זה.
בעוד אפילפסיה יש מספר צורות והוא נגרם על ידי מנגנונים שונים בבסיס, זה מוכח כי כ 60% של חולים יש מוקד אפילפטי אחד הנקודה35. לכן, את היתרון של המינהל המקומי של נוירוטרנסמיני המעגניים מעכבות מספק כלי שימושי למחקרים נוספים בעלי חיים ניסיוני ומציג אסטרטגיה חדשה לטיפול באפילפסיה מוקד. השיטה המתוארת הוכיחה את השירות של הטיפול ב-μFIP במחקר העכבר חריפה ופתח את הדרך עבור פיתוחים טכנולוגיים נוספים כדי להבטיח יישום כרונית שלה. אנו מאמינים כי בדיוק ממוקד התקן התרופה אלקטרופיניטית משלוח יכול להיות מותאם עוד יותר לטפל לא רק אפילפסיה אלא גם מחלות נוירוניווניות אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
C.M.P. מודה במימון המענק הבינלאומי של ויטאקר שמנוהל על ידי המכון לחינוך בינלאומי. A.K. בחסות מארי קירי (מס ' 625372). A.W. מודה במימון מועצת המחקר האירופית (ERC) תחת אופק 2020 תוכנית המחקר והחדשנות של האיחוד האירופי (הסכם הענקת מס ' 716867). A.W. בנוסף מכיר ביוזמת המצוינות של אוניברסיטת אקס-מרסיי-A * MIDEX, "הצרפתים" התוכנית של "מדעי הבית". המחברים מכירים את ד ר אילקה Uguz, ד ר Sahika לאלה, ד ר וינצ Curto, ד ר מרי דונהיו, ד"ר מארק פרו, ו Zsófia Maglóczky על השתתפותם בדיונים פוריים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Supertech Instruments | MH-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 | |
| Silicon probe | Neuromicrosystems Ltd | A1x32_dbl_5.0_50_0_176_50 |
References
- Kwan, P., Palmini, A. Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review. Epilepsy & Behavior. 73, 166-172 (2017).
- Belleudi, V., et al. Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review. Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).
- Chen, B., et al. Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 76, 24-31 (2017).
- Brodie, M. J., et al. Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review. Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).
- Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
- Hamed, S. A. The effect of epilepsy and antiepileptic drugs on sexual, reproductive and gonadal health of adults with epilepsy. Expert Review of Clinical Pharmacology. 9 (6), 807-819 (2016).
- Roff Hilton, E. J., Hosking, S. L., Betts, T. I. M. The effect of antiepileptic drugs on visual performance. Seizure. 13 (2), 113-128 (2004).
- Stafstrom, C. E., Carmant, L. Seizures and epilepsy: an overview for neuroscientists. Cold Spring Harbor Perspective in Medicine. 5 (6), (2015).
- Arzimanoglou, A., et al. A Review of the New Antiepileptic Drugs for Focal-Onset Seizures in Pediatrics: Role of Extrapolation. Paediatric Drugs. 20 (3), 249-264 (2018).
- Avoli, M., et al. Specific imbalance of excitatory/inhibitory signaling establishes seizure onset pattern in temporal lobe epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 3229-3237 (2016).
- Badawy, R. A., Freestone, D. R., Lai, A., Cook, M. J. Epilepsy: Ever-changing states of cortical excitability. Neuroscience. 222, 89-99 (2012).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Porter, R. J. Mechanisms of action of new antiepileptic drugs. Epilepsia. 30, Suppl 1. S29-34, discussion S64-28 (1989).
- Rogawski, M. A. Diverse mechanisms of antiepileptic drugs in the development pipeline. Epilepsy Research. 69 (3), 273-294 (2006).
- Czapinski, P., Blaszczyk, B., Czuczwar, S. J.
- Ye, H., Kaszuba, S. Inhibitory or excitatory? Optogenetic interrogation of the functional roles of GABAergic interneurons in epileptogenesis. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 93 (2017).
- Loscher, W., Klitgaard, H., Twyman, R. E., Schmidt, D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 757-776 (2013).
- Manchishi, S. M. Recent Advances in Antiepileptic Herbal Medicine. Current Neuropharmacology. 16 (1), 79-83 (2018).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., Miles, R. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (2002).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in Epilepsy: Heterogeneity and Hub Cells in Network Synchronization. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (11), (2015).
- Prince, D. A., Gu, F., Parada, I. Antiepileptogenic repair of excitatory and inhibitory synaptic connectivity after neocortical trauma. Progress in Brain Research. 226, 209-227 (2016).
- Nilsen, K. E., Cock, H. R. Focal treatment for refractory epilepsy: hope for the future. Brain Research: Brain Research Reviews. 44 (2-3), 141-153 (2004).
- Martinkovic, L., Hecimovic, H., Sulc, V., Marecek, R., Marusic, P. Modern techniques of epileptic focus localization. International Review of Neurobiology. 114, 245-278 (2014).
- Nagaraj, V., et al. Future of seizure prediction and intervention: closing the loop. Journal of Clinical Neurophysiology. 32 (3), 194-206 (2015).
- Osman, G. M., Araujo, D. F., Maciel, C. B.
- Slezia, A., et al. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiology of Disease. 16 (3), 490-499 (2004).
- Baranyi, A., Feher, O. Convulsive effects of 3-aminopyridine on cortical neurones. Electroencephalography Clinical Neurophysiology. 47 (6), 745-751 (1979).
- Szente, M., Baranyi, A. Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex. Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).
- Proctor, C. M., et al. Electrophoretic drug delivery for seizure control. Science Advances. 4 (8), eaau1291 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition. , Academic Press. (2012).
- Pinault, D. A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks. Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).
- Pati, S., Alexopoulos, A. V. Pharmacoresistant epilepsy: from pathogenesis to current and emerging therapies. Cleve Clinical Journal of Medicine. 77 (7), 457-467 (2010).
