Summary
Epilepsi araştırmalarının zorluk klasik tedavinin yetersiz kaldığı hastalarda yeni tedaviler geliştirmektir. Yeni bir protokol kullanarak-implante edilmiş bir ilaç teslim sistemi yardımıyla-epileptik odak içine GABA elektroforetik teslim tarafından anestezik fareler nöbetleri kontrol edebiliyoruz.
Abstract
Epilepsi dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen nörolojik bozukluklar grubudur. Hastaların% 70 ' inde ilaçlarla tedavi yararlı olsa da, ciddi yan etkiler hastanın yaşam kalitesini etkiler. Dahası, epileptik hastaların yüksek bir yüzdesi ilaç dirençli; onların durumunda, Nöroşirürji veya nöronörolojik gereklidir. Bu nedenle, epilepsi araştırmalarının önemli amacı, ilaç geçirmez hastalarda epilepsi tedavisine ya da yan etkilere gerek kalmadan tedavi edebilecek veya tekrarlayan nöbetleri önlemenin yeni terapileri keşfetmektir. Nöromühendislik, epileptik hastaları risk altında tedavi etmek için daha iyi çözümler bulmak üzere yeni stratejiler ve teknolojiler kullanarak yepyeni yaklaşımlar sağlar.
Epilepsi akut fare modelinde yeni bir deneysel protokol gösterisi olarak, doğrudan situ elektroforetik ilaç teslim sistemi kullanılır. Yani, mikrofluidik iyon pompası (Μfıp) içeren bir nöral prob, isteğe bağlı ilaç teslimi için ve yerel sinir aktivitesinin eşzamanlı kaydı implante edilir ve 4-aminopyridin kaynaklı (4AP kaynaklı) nöbet gibi kontrol edebilme yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir Etkinlik (SLE) etkinliği. Γ-aminobutirik asit (GABA) konsantrasyonu, nöbet odağı bir antiepileptik etkiye ulaşmak için GABA tesliminin hassas kontrolü ile fizyolojik aralıkta tutulur ama overinhibisyon kaynaklı rebound patlamaları neden değil. Bu yöntem, hem patolojik aktivitenin hem de müdahalenin tespiti ile doğrudan epileptik odaklamaya karşı inhibitör nörotransmitter sağlayarak nöbetleri durdurmayı sağlar.
Deneysel yöntemle gelişmelerin bir sonucu olarak, SLEs nöbet başlangıcında hassas ayarlı GABA teslimat tarafından nöbet kontrolü sağlayan bir son derece lokalize bir şekilde indüklenmiş olabilir.
Introduction
Epilepsi en yaygın dördüncü nörolojik bozukluktur: nüfusun yaklaşık% 1 ' i epilepsi muzdarip ve etkilenen kişinin üçte biri tekrarlayan nöbetlere sahiptir. Çoğu durumda, nöbetler ilaç ile kontrol edilebilir. Ancak, ilaç tedavisi, uygun dozajı1,2bulmak için yıllar sürebilir her hasta için ayrı olarak ayarlanması gerekir. Ayrıca, ilacın çoğu yaşam kalitesini azaltmak ciddi yan etkilere sahiptir3,4,5,6,7. Son olarak, olguların% 30 ' unda hastalar ilaçlara dayanıklıdır ve sürekli tek nöbet jeneratör Locus durumunda, sadece Resektif Nöroşirürji nöbetlerin oluşumunu zayıflatabilir8. Bu nedenle, modern epilepsi araştırmalarında önemli bir girişim, risk altındaki hastalarda tekrarlayan nöbetleri önleyebilen yeni stratejileri keşfetmektir, ancak güçlü ilaç terapilerinin ve invaziv rezektif ameliyatların ihtiyacını azaltıyor.
Epileptik nöbetler, beyin (Genelleştirilmiş epilepsi) veya beynin lokalize bir bölümünde (fokal epilepsi) uyarıcı ve inhibitör devreleri içinde bir dengesizlik olduğunda ortaya çıkar, nöromların anormal bir moda boşaltılması gibi9 , 10 ' dan fazla , 11. antiepileptik ilaçlar nöbet önleme iki farklı şekillerde hareket edebilir: ya azalan uyarılma veya inhibisyonu arttırmak12. Özellikle, onlar ya da inhibitör nörotransmitter GABA etkileyen tarafından nöronlar arasında kimyasal iletim üzerinde hücre membranı13 veya ACT iyon kanalları etkileyen nöronal hücrelerin elektrik aktivitesini değiştirebilir olabilir uyarıcı sinaps içinde glutamat14,15. Bazı ilaçlar için, eylem modu bilinmiyor18. Ayrıca, ilaç tedavileri hastalar üzerinde sürekli bir etkiye sahiptir ve nöbetlerin prevalansı dinamiklerine uyum sağlayamaz. İdeal olarak, belirli eylem mekanizmaları olan ilaçlar altta yatan epileptik süreçlerde hareket eder. Optimal bir tedavi beyin interictally dokunmaz ama bir nöbet gelişmekte başladığında hemen hareket edeceğini. Bunun aksine, epilepsi her durumda, ilaç şimdi sistematik bir tedavi anlamına gelir, tüm beyin ve hastanın tüm vücudu etkileyen9.
Epileptik nöbetler, beyin travması gibi ilk hakaret sonrasında uzun yıllar görünebilir. İlk hakaret ve birinci spontan nöbetlerin oluşumu arasındaki dönem, nöronal ağ bağlantılarının ortadan kalkması ile nöronal ölüm de dahil olmak üzere, önemli moleküler ve hücresel reorganizasyonlar ile karakterize edilir ve akal yeni bağlantıların görünümü ile sprouting/neosynaptogenesis19,20,21. Nöbetler tekrarlayan hale gelince, onların frekansı ve şiddeti daha fazla beyin bölgeleri içeren, artış eğilimindedir. Nöbet Genesis ve yayılma kuralları farklı olabilir gibi, yayılım ağlarından nöbet başlangıcı (epileptojenik bölgeler) siteleri ayırt etmek önemlidir. Epilepsinin insan dokusu ve deneysel modelleri üzerinde yapılan araştırmalar, devrelerin yeniden yapılanma ve nöbetleri oluşturmak için yeteneklerini hakkında önemli veriler sağladı20,21,22, 23. ancak, bu yeniden yapıların adaptif tepkiler olup olmadığını veya epileptogenez veya nöbet Genesis ve yayılma12ile ilgili olup olmadıklarını belirlemek zordur.
Bu nedenle epileptik odağı lokalleştirme ve antiepileptik ilaçlar yerel olarak uygulanması, çağdaş epilepsi araştırmalarında başlıca zorluklardan biridir. Epilepsi hayvan modelleri ve bazı klinik çalışmalar kullanarak çeşitli deneyler nöbet olayların başlangıcını bulmak ve beyin temel mekanizmaları tanımlamak için amaçlanan24,25,26,27. Bu amaçla, 4ap kaynaklı epilepsi modeli28,29,30,31 kullanarak yeni bir deneysel protokol geliştirdik akut fare hazırlama, hangi üç kesin ekleme sağlar cihazlar, ağ aktivitesinin vivo olarak oldukça lokalize bir şekilde yönetildiği hipokampus 'un verilen alanına girer. Bir cam mikropipet tarafından lokalize 4AP enjeksiyon hipokampus lokalize bir noktada epileptik SLEs ikna etmek için yardımcı olurken, yeni polimer tabanlı μFIP prob yardımıyla nöbet aktivitesinin kontrolü aynı anda nöronal kayıt yoluyla elde edilir cihazın kayıt siteleri ile elektrik aktivitesi. Hipokampal yerel alan aktivitesi aynı zamanda korteks içinde ve hipokampus aynı anda katmana özgü bir şekilde çok kanallı silikon prob ile izlenir.
Yakın zamanda icat edilen μFIP probları, bir iyon değişimi membranı (IEM) boyunca mikrofluidik bir kanalda saklanan ve çevreleyen dokuya (Şekil 1) şarj edilen ilaçlar itmek için uygulanan bir elektrik alanı kullanılarak çalışır. IEM seçmeli olarak sadece bir tür iyon (kıt veya Anion) taşır ve böylece, "kapalı" durumunda hem pasif difüzyon sınırlamak için çalışır ve cihaz içine çevreleyen dokudan karşılıklı şarj türlerin taşınması. Elektrik alanı, mikrofluidik kanala dahili olan kaynak elektrot ve cihaza harici bir hedef elektrot (Bu durumda, hayvan modelinde kafa vidası) arasında küçük bir voltaj (< 1 V) uygulayarak talep üzerine oluşturulur. İlaç tesliminin oranı, uygulanan voltaj ve kaynak ile hedef elektrotlar arasındaki ölçülen akım ile orantılıdır. İlaç teslimatlarının kesin olarak ayarlanabilir olması, μFIP 'nin birincil avantajlarından biridir. Fluidik veya basınç bazlı ilaç teslim sistemlerine kıyasla başka bir kritik avantaj, μFIP 'de uyuşturucu taşıyıcı çözümü olmadan IEM genelinde ilaçlar teslim edildiği için ilaç teslim çıkışında sadece ihmal edilebilir bir basınç artışı bulunduğunu belirtir.
ΜFIP "kapalı" olduğunda GABA pasif sızıntı küçük bir miktar var, ama bu SLEs etkisi bulunamadı. Μfıp, daha önce31rapor ettiğimiz konvansiyonel mikroimalat yöntemlerinden sonra özel olarak yapılmıştır.
Tekrarlayan nöbetleri önlemenin bir yolu, en başında veya hatta ilk nöbet olayından önce ağ boşaltma blokajı olduğundan, epileptik odaklanmaya inhibitör nörotransmitter GABA teslim etmek için sunulan yöntem büyük fokal Epilepsi hastalarında nöbet kontrolü için terapötik potansiyel. GABA endojen bir substrat olduğundan, fizyolojik konsantrasyonlarda değişmeden içsel nöronal özellikleri bırakır. GABA düşük düzeylerde yerel uygulama sadece inhibisyonu için doğal olarak duyarlı hücreleri etkileyecek, ve sadece fizyolojik inhibisyonu benzer etkilere neden olacak, derin beyin stimülasyon aykırı (DBS), tüm hücreleri uyararak spesifik olmayan eylemleri olan kendi ortamında nöronal ağ, hem uyarma ve inhibisyonu içeren karışık bir tepki neden. Sonuç olarak, önerilen yöntem DBS daha nöbet kontrolü için daha spesifik bir yaklaşım sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler Institut de Neurosciences des Systèmes 'in etik yönergelerine göre yapılmıştır ve yerel etik komiteler ve veteriner ofisleri tarafından onaylanmıştır.
Not: Deneylerde Seventeen yetişkin erkek OF1 fareler kullanıldı. Fareler, gıda ve su mevcut reklam libitum ile 12 h ışık/karanlık döngüsü için eğitildi.
1. anestezi
- İntraperitoneal ketamin ve xylazine karışımı enjekte (100 mg/kg vücut ağırlığı ve 10 mg/kg vücut ağırlığı, sırasıyla) hayvan anestezize.
-
Solunum hızını gözlemlemek ve fırçalayarak ve ağrıya fare tepkisi kontrol ederek anestezi seviyesini kontrol edin.
Not: fare nefes düzenli olur, hiçbir fırçalama görülebilir ve hayvan kuyruk pinches tepki vermez, anestezi devam etmek için yeterince derin.- Hayvanı elektriksel olarak programlanabilir bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin. Bir petrol jöle bazlı ürün ile Rektal sıcaklık prob kapak ( malzeme tablosunabakın) ve hafifçe rektum içine yerleştirin (1 – 2 cm derin) vücut sıcaklığını izlemek için fare. Cerrahi prosedürler ve deneysel kayıtlar sırasında 36,5 ile 37,5 °C arasında bir vücut sıcaklığını koruyun.
- Fare refleksleri, bıyık hareketleri ve nefes frekansı kontrol ederek anestezi seviyesini izleyin. En az her 30 dakikada bir kaydedilen anestezi seviyesini dikkate alarak, küçük bir doz ketamin-xylazine kokteyli (20 – 50 μL, daha önce olduğu gibi aynı konsantrasyon) intramüsküler olarak verin.
2. cerrahi/kraniyotomi
- Bir stereotaktik çerçevede farenin kafasını düzeltin. 30 G iğne kullanarak, yerel analjezik ropivakain enjekte (5 μL, 7,5 mg/ml, bkz. malzeme tablosu) planlanan kesi bölgesinde subkutan. Etkili olması için 5 dk izin verin.
- Bir neşter ile kafatası üzerinde deri düz kesim orta çizgi olun. Hafifçe ince forseps ile yan doğru cilt çekin ve daha fazla iş için maruz kafatası bırakmak için Bulldog ser, kelepçeler ile bir kenara kelepçe.
- Bir neşter veya benzer bir araç ile fasya kafatası temizleyin. Yüzeysel kanama durumunda, kan pamuk bezlerden veya kağıt havlu küçük parçalar ile çıkarın.
- Bir Poly (3, 4-etylenedioxythiophene) polistiren Sulfonat (PEDOT: PSS)-kaplanmış zemin vida (Boyut: #00, çap: 0,047 in, Uzunluk: 1/8 içinde, malzeme tablosunugörmek) bir lehimli tel alın ve amplifikatördeki bir bağlayıcı ile bağlayın.
- Kafatasını istenilen delik bölgesinde nemlendirin ve yüksek hızda ince, yuvarlak matkap biti (0,4 mm çap ile) kullanarak beyin üzerindeki kafatasının üzerinde dura görünür olana kadar bir delik açınız. Delik içine zemin vida koymak ve beyin üst ulaşıncaya kadar bir hassas tornavida ile vida.
Not: Kafa vidası bir PEDOT ile daldırma kaplı oldu: PSS çözüm içeren 1% 3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GOPS) ağırlığı ile 140 °C ' de pişirme izledi 90 min. PEDOT: PSS, biyouyumlu olduğu bilinen Volumetrik kapasitans ile konjueli bir polimerdir. GOPS, PEDOT ile karışık bir çapraz bağlayıcı: PSS, sulu ortamlarda istikrarı artırmak için (Şekil 2). - Stereotaktik çerçevenin yardımıyla, istenilen beyin bölgesi için stereotaktik koordinatlarını ölçün. Örneğin, ilgi bölgesi Hippocampus, anteroposterior (AP)-1,8 mm ve mediolateral (ML) 1,8 mm fare32için beyin Atlası dayalı bregma noktasından.
Not: Bunlar Sağ Yarımküre için Koordinatlar (Şekil 2). - İnce, iyi cilalı, şeffaf bir kemik membranı olana kadar hızlı bir hızda ayarlanmış güvenilir bir diş matkap (bkz. malzeme tablosu) kullanarak kafatasının yaklaşık 1 ila 2 mm çap alanı ince.
- Sonra, kemik membranı kalınlığı yeterince ince ise (< 200 μm), ince forseps ile küçük bir delik yapın ve yavaşça kemik33ince tabakası çıkarın. Dura kaldırmak için özel yapılmış kanca uçlu iğne kullanın. Edemas gelişimini önlemek ve beynin kardiyak ve/veya solunum titreşimlerini en aza indirmek için kraniyotomi ve durotomi boyutunu minimize.
Not: Kraniyotomi, kurutmayı önlemek ve daha sonra deney sırasında düzenli olarak doldurulmuş bir tuz çözeltisi ile doldurulmalıdır (Şekil 2).
3. çok kanallı silikon sondasının yerleştirilmesi
- Silikon prob için hafif bir AP açısında (20 °) stereotaktik kollar, diğer iki implantın konumlandırılması için geniş alan bırakmak ve elektrotun, iyon pompasının ve mikropipetin kayıt ve enjeksiyon alanlarının mümkün olduğunca yakın olması için kullanın.
Not: Elektrotlar, şırıngalar, ve iyon pompaları dıı leke solüsyonu bir damla ile kaplanmıştır (1, 1 '-diokdecil-3, 3, 3 ', 3 '-tetramethylindocarbocyanine perklorat [dıı]), implantasyon izleri (0,5 mg/ml dıı dimetil sülfoxide) sonrası hoc görselleştirme için. - Silikon sondasını bir manyetik tutucuya bağlı stereotaktik kolun üzerine yerleştirin ve stereaks çerçevesinin yanına yerleştirin. AP açısını (20 °) ayarlayın ve ardından sondayı baş aşamaya ve zemin vidasına bağlayın.
-
Silikon sondasını, mikron hassas stereotaktik kol veya yan hareketlerden kaçınmak için motorlu bir Mikromanipülatör yardımıyla Hippocampus içine yavaşça indirin (Şekil 2 ve Şekil 3).
- Kayıt yazılımını ve kaydını başlatın — baş sahne, bağlı amplifikatör ve bir bilgisayar ile — elektrik nöronal sinyaller, çok kanallı silikon sondasını korteksin üst kısmına taşıyarak hedeflenen dorsoventral (DV) konumuna ulaşıncaya kadar (- 1.800 μm kortikal yüzeyden). Bilgisayar ekranında penetrasyon sırasında yerel alan potansiyel sinyalini (LFP) kaydedin ve izleyin.
Not: Kayıt sırasında yavaş ve sürekli hareket etmesi, penetrasyon için daha iyi görsel kontrole sahip olmak ve hedef bölgeye ulaşmak için prob inişini kontrol et. - Hedef bölgenin bir marker olarak kaydedilmiş LFP hipokampal oluşumunun piramit katmanında dalgalanma etkinliğini kullanın.
Not: Ripple aktivitesi, çok kanallı silikon (si) sondasının bir veya iki komşu kanalında, kayıt siteleri arasında 100 μm mesafeye sahip görünür (Şekil 4). - Çok kanallı si probları yardımıyla korteks ve hipokampus katmanlarından LFP sinyallerini aynı anda ( malzeme tablosunabakın) çok kanallı si sondaları ile kaydedin (Şekil 4).
- Kayıt yazılımını ve kaydını başlatın — baş sahne, bağlı amplifikatör ve bir bilgisayar ile — elektrik nöronal sinyaller, çok kanallı silikon sondasını korteksin üst kısmına taşıyarak hedeflenen dorsoventral (DV) konumuna ulaşıncaya kadar (- 1.800 μm kortikal yüzeyden). Bilgisayar ekranında penetrasyon sırasında yerel alan potansiyel sinyalini (LFP) kaydedin ve izleyin.
4. Μfıp 'nin yerleştirilmesi
- ΜFIP girişine tüpler ( malzeme tablosunabakın) bağlayın ve 0,05 M GABA çözeltisi ile prob doldurun. Tüpleri çıkarın ve parafin film sarma ile giriş kapatın. Elektrik yönlendirmesini kaynak ölçüm birimine bağlayın.
- ΜFIP 'yi stereotaktik kol yardımıyla mediolateral (MP) açıyla (20 °) takın. Si prob tüm süreç boyunca takılı kalır.
Not: μfip çok esnektir ve beyin yüzeyine ulaşıncaya kadar düz tutmak için küçük ve temiz bir fırça desteğinden yararlanabilir. Bu adımdan sonra, Μfıp eksenel hareketlerle hafifçe düşürebilir. - ΜFIP 'yi Aksiyel hareketlerle yavaşça indirin ve yörünge sırasında, dorsoventral (DV) koordinatına (-1.200 μm kortikal yüzeyden) ulaşıncaya kadar bükmeye asla izin vermeyin.
Not: ΜFIP ucuyla çıkışa 300 μm uzaklığı göz önüne alındığında, iki cihazı (Μfıp ve silikon prob) mümkün olduğunca birbirine yakın bir yere koymayı deneyin.
DIKKAT: ekleme sırasında cihazlar ve konnektörleri arasındaki mekanik sorunlardan kaçının (Şekil 2B ve Şekil 3B).
5. nöbet Indüksiyon için cihazların hazırlanması
- Şırıngadaki metal iğneyi (10 μL) değiştirin (bkz. malzeme tablosu). İğne tutarak metal parçasını çıkarın, yerleştirin ve mikropipet (dış çap [OD]: 1,2 mm, iç çapı [ID]: 0,75 mm, uç çapı: 20 – 50 μm ile ± 0,5 cm şaft konik) kaldırın ve sonra iğne tutma elemanı değiştirin.
- Şırınga ve bağlı borosilikat micropipet 20 ° lateromedial (LM) açı 4AP enjeksiyon için (50 mM yapay beyin omurilik sıvısı [ACSF]) yerleştirin.
Dikkat: Şırınga veya mikropipet metal iğnesini 50 μm ' den büyük bir ucu ile kullanmayın. - Çekme 500 nL – 1 μL 50 mM 4AP otomatik mikroenjeksiyon pompası yardımıyla.
6.4AP enjeksiyon için bir şırınga bağlı Cam Pipet ekleme
- Şırıngaya bağlı cam mikropipeti, hedeflenen DV konumuna (-1.500 μm) indirin ve ardından 4AP çözeltisi (Şekil 2 ve şekil 3) 250 nl enjekte et. Kayıt yazılımı ile kaydetmeye başlayın. Ekranı izleyin ve ilk interiktal başak görünmesini bekleyin.
- İlk interiktal Spike görünümünü hemen μfip tarafından GABA teslim başlayın. 100 s için kaynak ve hedef arasında 1 V uygulayarak GABA teslim 1 s kapalı, 30 döngüleri için takip. Kayıt yazılımı yardımıyla, en az 2 saat kayıt.
Not: Teslim edilen GABA toplam kütlesi yaklaşık 1 nmol (Şekil 5). - Denemenin sonunda, eklenen sondaları ve zemin vidasını yavaşça çıkarın ve hayvanı stereotaktik ekipmandan çıkarın. Hayvanlar ilaç (ı. p. 100mg/kg pentobarbital) aşırı doz kullanılarak ötenize edildi. Ölüm, nefes ve sirkülasyonun durdurulması ile doğrulandı.
7. IMPLANTLARIN yerleşiminin değerlendirilmesi
- Hayvan ötenenleştirdikten sonra, ilk olarak 50 ml serum ve sonra 150 ml ile 0,1 M fosfat tampon (Pb) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) içeren bir buz-soğuk fiksatif çözeltisi ile transcardially serpmek34.
Dikkat: PFA tehlikelidir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. - Hayvan decapitate ve sonra kafatası üst ve kenarlarından cilt ve kas çıkarın. Foramen magnum başlayarak, kulakları ve sagittal orta hat kesi doğru kafatası lateral kesikler yapmak, beyin zarar değil büyük özen. Kafatasını bir kemik düzeltici ile yavaşça çıkarın. Beyni çıkarın ve sonra ilgi bölgesinden bir doku bloğu kesip (bregma noktasından,-1-3 mm AP) bir beyin matrisinin yardımıyla (bkz. malzeme tablosu).
- Tutkal doku bloğu bir vibratome numune tutucusu, içine stand koymak ve 40 μm kalınlık için vibratome ayarlamak bir PB banyo 40 μm koronal bölümler yapmak.
- 0,1 M PB ile kapsamlı bir şekilde yıkayın. Glial fibril asidik protein (GFAP) boyama için histolojik Protokolü izleyin31.
- Slaytlar üzerinde bölümler monte ve 2-(4-amidinophenyl)-1H-Indole-6-karboxamidine (DAPI) (bkz. malzeme tablosu) içeren bir montaj ortamı ile kapak.
8. Konfokal mikroskopisi
- Bir Konfokal mikroskop 20 x amacı altında lekeli koronal bölümler ile slaytlar yerleştirin. Hedef bölgeyi seçin.
- Aşağıdaki gibi boyalar için optimum uyarma ve emisyon (EXC/EMS) filtre setleri seçin: DAPı = 358/461 Nm, dıı = 551/569 Nm, ve floresan (bkz. malzeme tablosu) = 490/525 Nm.
Not: Boyama bölüme göre değiştiğinden, en az yoğun ve yoğun bölgelerin her ikisi de emisyonu gösterdiği her bölüm için uygun bir yelpazede minimal ve maksimal uyarma ve algılamanın belirlenmesi gerekir. - En az yoğun bölgeyi seçin ve lazer yoğunluğunu ve algılaması yüksek değerlere ayarlayın ve daha sonra bu değerlerin algılanan emisyonun aşırı doygunluğuna neden olup olmadığını en yoğun bölgelerde doğrulayın. Eğer öyleyse, değerleri azaltın ve en az yoğun bölge ile yeniden kontrol edin. Düşük boyama düzeylerinde mümkün olan en yüksek algılamaya ulaşana kadar bu adımları yineleyin ve yüksek derecede lekelenmiş alanlarda uygun değil, fazla doymamış seviyeleri. Tüm boyalar için bu işlemi tekrarlayın.
- Mikroskopun döşeme taraması işlevini kullanarak 512 x 512 pikseli döşeme başına, post hoc işleme için yeterli çözünürlüğe sahip prob ekleme sitelerinin büyük bir özetini elde edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anestezik farelerde 4AP epilepsi modeli ile burada sunulan prosedürü kullanarak, epileptik nöbetlerin kontrolü Sara odaklı olarak elde edilebilir. İmplantların kesin lokalizasyonu (Şekil 2) hipokampal yerel alan potansiyelleri (LFPS, Şekil 4) kaydetmeye, küçük hipokampal nöbetleri sağlamak ve nöbet başlangıcında GABA teslim etmek için yardımcı oldu. İmplantların lokalizasyonu, her denemenin ardından post hoc histolojiye göre doğrulanmıştır (Şekil 3).
SLEs sadece hipokampus varken, epileptik aktivite tam kontrol altına konuldu. Şekil 5 SLES bir Μfıp içeren yeni nöronal prob tarafından GABA teslimi ile durdurulabilir zaman temsili bir örnek gösterir. Ne zaman 4AP daha büyük bir alana enjekte edildi veya korteks üst, epileptik nöbetler Genelleştirilmiş oldu, böylece teslim GABA epileptik nöbetler ölçüde değiştirmek mümkün değildi (Şekil 6). Sodyum iyonlarının teslim edilmesi 4AP kaynaklı aktivite üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi (Şekil 7).
Şekil 1: Μfıp sondasına genel bakış. ΜFIP sondasının şematik görünümü ve gerçek boyutu. (a) Primer özellikleri gösteren bir μFIP sondasının implante edilen ucundaki şematik. (b) bir μFIP sondasının, iğne benzeri implante edilen bir ucunu gösteren fotoğrafı. Kırmızı blok, fluidik bağlantılar içindir. Ölçek çubuğu = 1 cm. (c) IEM olmadan bir μFIP prob ucunun mikroskop görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Resim 2: Kranio-durotomi ve fare beynindeki implantların lokalizasyonu. (A) ameliyatın şematik görünümü, kraniyotomi ve fare beynindeki implantların hedefi. (B) üç cihazın implantasyon için stereotaktik koordinatları ve açıları kullanılır. Μfıp = 20 ° mediolateral (ML),-1.200 μm DV (yeşil). Çok kanallı silikon prob = 20 ° AP,-1.800 μm DV (mavi). Şırınga ile mikropipet = 20 ° LM,-1.500 μm DV (kırmızı). Kraniyotominin Merkezi 1,8 mm ML,-1,8 mm AP Sağ Yarımküre için. Bu rakam Proctor ve al.31 ' den (Creative Commons Attribution noncommercial License 4,0 (CC BY-NC) altında dağıtılan telif hakkı ile değiştirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: implantasyon yerleşiminin histolojik değerlendirilmesi. Panel (a), fare beyninde (yeşil) hipokampal oluşumunun lokalizasyonu üzerinde bir şematik 3D rakam gösterir. Paneller (B, C ve D) implante edilen cihazların izlerini gösterir — μfip, şırınga ile mikropipet ve çok kanallı silikon prob (dıı, kırmızı, oklar), sırasıyla31. Paneller (ba, CA, da) yüksek büyütme görüntüsünü göster; paneller (BB, CB, DB) Paxinos ve Franklin fare beyin Atlası ilgili sayfasını göster, oysa (BC, CC, DC) sağ tüm koronal bölümünde düşük büyütme görüntü göstermek Yarımküre. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 4: Korteks ve Hippocampus 'Tan çok kanallı kayıt. , Korteks (beyaz) ve hipokampal oluşumu (mor, CA1 = Cornu amonyum alanı 1; mavi, DG = dentat gyrus katmanlarından kayıt siteleri arasında bir 100 μm mesafeye sahip çok kanallı silikon prob ile LFP kayıt. CA1 stratum pyramidale Ripple etkinliğini unutmayın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: GABA tarafından 4AP kaynaklı nöbet kontrolü. Hipokampus 'un temsilcilerinden Elektrofizyoloji kayıtları. (A) 4ap enjeksiyonu sonrasında yaklaşık 30 dakika başlayarak SLES Ile μFIP tedavisinin yokluğunda kayıt, sonra Status epilepticus. (B) μFIP TEDAVISININ ilk SLE 'nin hemen ardından başlatıldığı bir olgu kaydı. Kayıt, tedavi başladıktan sonra daha fazla patolojik olay gösterir. (C) 4 AP enjeksiyonu öncesinde μFIP tedavisinin başlatıldığı kayıt, patolojik olaylar göstermiyor. Kırmızı oklar 4AP enjeksiyonu gösterir. Düz yeşil oklar Μfıp tedavisinin başlangıclarını gösterir ve açık yeşil oklar μFIP tedavisinin sonunu işaret ediyor. Yeşil bir okun ardından 100 s aralıklarındaki keskin doruklarda μFIP tedavisinden eserler31' dir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: GABA tarafından 4AP kaynaklı nöbet kontrolünü başarısızlık. Hippocampus tarafından, 4AP 'in şırıngadaki metalik iğne ile enjekte edildiği bir durumda, epileptik nöbetlerin daha büyük bir beyin alanını etkilediğini temsil eden elektrofizyolojik kayıt. GABA teslim nöbet yoğunluğu etkilemez unutmayın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 7: araç deneyi. GABA yerinde bir eşdeğer doz Sodyum iyon (na+) sunan kontrol deneyler 4ap kaynaklı aktivite üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi, bu elektrofizyolojik modüler iyon pompası uygulanan akım olmadığını gösteren aktivite ama oldukça teslim moleküller. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epilepsi akut fare modelinde yeni bir deneysel protokol geliştirerek, SLEs, epileptik odaklanarak implante edilen bir Μfıp yardımıyla başarılı bir şekilde kontrol edilebilir. Temporal ve uzamsal hassasiyetle GABA teslim kabiliyeti sayesinde, 4 AP kaynaklı SLEs nöbetlerin başlangıcında kontrol edildi. Epilepsinin tedavisi teorik olarak mümkündür eğer nöral ağ deşarj kontrolü nöbet başlangıcı yerine elde edilir. Sunulan protokol bu mümkün olduğunu kanıtladı eğer enjekte inhibitör nörotransmitter lokalizasyonu, GABA, zamanında epileptik odaklama ulaşmak için yeterli kesin. Ancak, epileptik nöbetlerin beynin daha büyük alanlarını etkileyen bu durumlarda, tam lokalize GABA teslimatı ile nöbet kontrolü mümkün değildir. ΜFIP sondasının etkisi alanı, prizden yaklaşık 550 μm 'lik bir yarıçapla tahmin edildi. 4AP enjeksiyon bu alana lokalize ise SLEs sadece etkilenebilir kanıtlanmıştır31.
Bu nedenle, epileptik nöbetler lokalize olduğunda yöntem yararlıdır, ancak nöbet multifoci veya Genelleştirilmiş olduğunda epilepsi kontrol etmek veya durdurmak mümkün değildi. Ayrıca, yöntem anestezize kemirgenler kanıtlanmıştır; serbestçe hareketli hayvanlar, kronik uygulamalar hala bu protokol etkinliğini araştırmak için gereklidir.
Epilepsi çeşitli formları vardır ve farklı altta yatan mekanizmalar neden olduğu, yaklaşık% 60 hastaların tek bir epileptik odak noktası35olduğunu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, endojen inhibitör nörotransmitter yerel yönetiminin avantajı daha deneysel hayvan çalışmaları için yararlı bir araç sağlar ve fokal epilepsi tedavisinde yeni bir strateji sunar. Açıklanan yöntem, akut bir fare çalışmasında μFIP tedavisinin yarar gösterdi ve kronik uygulama sağlamak için daha fazla teknolojik gelişmeler için yol açtı. Biz tam olarak hedeflenen elektroforetik ilaç teslim cihazları daha da sadece epilepsi değil, diğer nörodejeneratif hastalıklar da tedavi etmek için adapte olabilir inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
C.M.P. Uluslararası Eğitim Enstitüsü tarafından yönetilen bir Whitaker uluslararası akademik hibe fon kabul eder. Ak, Marie Curie ıEF (No. 625372) tarafından desteklenmektedir. A.W., Avrupa Birliği 'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı (Grant anlaşması No. 716867) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) ' den finansman kabul ediyor. A.W. Ayrıca Aix-Marseille Üniversitesi-A * MıDEX, Fransız "ınvestissements d 'Avenir" programının mükemmellik girişimi 'nin de kabul edildiğini belirtiyor. Yazarlar, Dr. Ilke uguz, Dr. sahika Inal, Dr. Vincenzo curto, Dr. Mary Donahue, Dr. Marc Ferro ve Zsófia Maglóczky 'yi verimli tartışmalara katılmaları için onaylar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Supertech Instruments | MH-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 | |
| Silicon probe | Neuromicrosystems Ltd | A1x32_dbl_5.0_50_0_176_50 |
References
- Kwan, P., Palmini, A. Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review. Epilepsy & Behavior. 73, 166-172 (2017).
- Belleudi, V., et al. Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review. Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).
- Chen, B., et al. Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 76, 24-31 (2017).
- Brodie, M. J., et al. Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review. Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).
- Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
- Hamed, S. A. The effect of epilepsy and antiepileptic drugs on sexual, reproductive and gonadal health of adults with epilepsy. Expert Review of Clinical Pharmacology. 9 (6), 807-819 (2016).
- Roff Hilton, E. J., Hosking, S. L., Betts, T. I. M. The effect of antiepileptic drugs on visual performance. Seizure. 13 (2), 113-128 (2004).
- Stafstrom, C. E., Carmant, L. Seizures and epilepsy: an overview for neuroscientists. Cold Spring Harbor Perspective in Medicine. 5 (6), (2015).
- Arzimanoglou, A., et al. A Review of the New Antiepileptic Drugs for Focal-Onset Seizures in Pediatrics: Role of Extrapolation. Paediatric Drugs. 20 (3), 249-264 (2018).
- Avoli, M., et al. Specific imbalance of excitatory/inhibitory signaling establishes seizure onset pattern in temporal lobe epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 3229-3237 (2016).
- Badawy, R. A., Freestone, D. R., Lai, A., Cook, M. J. Epilepsy: Ever-changing states of cortical excitability. Neuroscience. 222, 89-99 (2012).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Porter, R. J. Mechanisms of action of new antiepileptic drugs. Epilepsia. 30, Suppl 1. S29-34, discussion S64-28 (1989).
- Rogawski, M. A. Diverse mechanisms of antiepileptic drugs in the development pipeline. Epilepsy Research. 69 (3), 273-294 (2006).
- Czapinski, P., Blaszczyk, B., Czuczwar, S. J.
- Ye, H., Kaszuba, S. Inhibitory or excitatory? Optogenetic interrogation of the functional roles of GABAergic interneurons in epileptogenesis. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 93 (2017).
- Loscher, W., Klitgaard, H., Twyman, R. E., Schmidt, D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 757-776 (2013).
- Manchishi, S. M. Recent Advances in Antiepileptic Herbal Medicine. Current Neuropharmacology. 16 (1), 79-83 (2018).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., Miles, R. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (2002).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in Epilepsy: Heterogeneity and Hub Cells in Network Synchronization. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (11), (2015).
- Prince, D. A., Gu, F., Parada, I. Antiepileptogenic repair of excitatory and inhibitory synaptic connectivity after neocortical trauma. Progress in Brain Research. 226, 209-227 (2016).
- Nilsen, K. E., Cock, H. R. Focal treatment for refractory epilepsy: hope for the future. Brain Research: Brain Research Reviews. 44 (2-3), 141-153 (2004).
- Martinkovic, L., Hecimovic, H., Sulc, V., Marecek, R., Marusic, P. Modern techniques of epileptic focus localization. International Review of Neurobiology. 114, 245-278 (2014).
- Nagaraj, V., et al. Future of seizure prediction and intervention: closing the loop. Journal of Clinical Neurophysiology. 32 (3), 194-206 (2015).
- Osman, G. M., Araujo, D. F., Maciel, C. B.
- Slezia, A., et al. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiology of Disease. 16 (3), 490-499 (2004).
- Baranyi, A., Feher, O. Convulsive effects of 3-aminopyridine on cortical neurones. Electroencephalography Clinical Neurophysiology. 47 (6), 745-751 (1979).
- Szente, M., Baranyi, A. Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex. Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).
- Proctor, C. M., et al. Electrophoretic drug delivery for seizure control. Science Advances. 4 (8), eaau1291 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition. , Academic Press. (2012).
- Pinault, D. A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks. Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).
- Pati, S., Alexopoulos, A. V. Pharmacoresistant epilepsy: from pathogenesis to current and emerging therapies. Cleve Clinical Journal of Medicine. 77 (7), 457-467 (2010).
