Summary
Utmaningen med epilepsi forskning är att utveckla nya behandlingar för patienter där klassisk terapi är otillräcklig. Med hjälp av ett nytt protokoll-med hjälp av en implanterbara läkemedel leverans system-vi kan kontrol lera kramper i bedövade möss av den elektroforetiska leveransen av GABA i epileptiska fokus.
Abstract
Epilepsi är en grupp av neurologiska sjukdomar som drabbar miljon tals människor över hela världen. Även om behandling med medicinering är till hjälp i 70% av fallen, allvarliga biverkningar påverkar livskvaliteten för patienter. Dessutom, en hög andel av epileptiska patienter är läkemedels resistenta; i deras fall är neurokirurgi eller neurostimulering nödvändiga. Därför är det viktigaste målet för epilepsi forskning att upptäcka nya terapier som antingen kan bota epilepsi utan biverkningar eller förhindra återkommande anfall hos läkemedels resistenta patienter. Neuroengineering ger nya metoder genom att använda nya strategier och tekniker för att hitta bättre lösningar för att bota epileptiska patienter i risk zonen.
Som en demonstration av ett nytt experimentellt protokoll i en akut mus modell av epilepsi används ett direkt in situ-elektroforetiskt läkemedels leverans system. Nämligen, en neurala sond införliva en mikroflödessystem Ion pump (μfip) för on-demand läkemedel leverans och samtidig inspelning av lokala neurala aktivitet implanteras och visat sig kunna kontrol lera 4-aminopyridine-inducerad (4ap-inducerad) beslag-liknande aktivitet för händelse (SLE). Den γ-aminosmörsyra (GABA) koncentrationen hålls i det fysiologiska intervallet av den exakta kontrollen av GABA leverans att nå en antiepileptisk effekt i beslag fokus men inte orsaka överhämning-inducerad rebound skurar. Metoden tillåter både detektion av patologisk aktivitet och intervention för att stoppa anfall genom att leverera hämmande signal substanser direkt till det epileptiska fokus med exakt rumsotemporal kontroll.
Som ett resultat av utvecklingen av den experimentella metoden, SLEs kan induceras på ett mycket lokaliserat sätt som tillåter beslag kontroll av exakt trimmad GABA leverans vid beslag debut.
Introduction
Epilepsi är den fjärde vanligaste neurologiska sjukdomen: cirka 1% av befolkningen lider av epilepsi, och ungefär en tredjedel av de drabbade har återkommande anfall. I de flesta fall kan kramper kontrol leras med medicinering. Emellertid, läkemedels behandling måste fastställas för varje patient individuellt, där korrekt dosering kan ta år att hitta1,2. Dessutom har de flesta av medicineringen allvarliga biverkningar som minskar livskvaliteten3,4,5,6,7. Slutligen, i 30% av fallen patienter är resistenta mot medicinering, och i händelse av en konstant enda beslag generator Locus, endast resektiv neurokirurgi kan dämpa förekomsten av anfall8. Därför, ett stort initiativ i modern epilepsi forskning är att upptäcka nya strategier som kan förhindra återkommande anfall hos patienter i risk zonen, samtidigt minska behovet av starka läkemedels behandlingar och invasiva återförandeoperationer.
Epileptiska anfall uppstår när det finns en obalans i excitatoriska och hämmande kretsar antingen i hela hjärnan (generaliserad epilepsi) eller i en lokaliserad del av hjärnan (fokal epilepsi), så att nerv celler ansvars frihet i ett onormalt sätt9 , 10 , 11. Antiepileptiska läkemedel kan agera på två olika sätt i beslag Prevention: antingen minskar excitation eller öka hämning12. Specifikt, de kan antingen ändra den elektriska aktiviteten av neuronala celler genom att påverka Jon kanaler i cell membranet13 eller agera på kemisk överföring mellan nerv celler genom att påverka den hämmande neurotransmittorn GABA eller excitatoriska glutamat i synapserna14,15. För vissa mediciner, verkningsmekanismen är okänd18. Dessutom har läkemedels behandlingar en kontinuerlig effekt på patienterna och kan inte anpassa sig till prevalensdynamiken hos anfall. Helst skulle droger med specifika verkningsmekanismer agera på de bakomliggande epileptiska processerna. En optimal behandling skulle inte röra hjärnan interictally men skulle agera omedelbart när ett anfall börjar utvecklas. I motsats till det, i alla fall av epilepsi, medicinering innebär nu en systematisk behandling, som påverkar hela hjärnan och hela kroppen av patienten9.
Epileptiska anfall kan visas många år efter den ursprungliga förolämpning såsom hjärn trauma. Perioden mellan den ursprungliga förolämpningen och förekomsten av de första spontana anfall kännetecknas av betydande molekyl ära och cellulära omorganiseringar, inklusive neuronala död med försvinnandet av neuronala nätverks anslutningar och axonal sprouting/neosynaptogenesis med uppkomsten av nya anslutningar19,20,21. När kramper blir återkommande, deras frekvens och svårighets grad tenderar att öka, involverar mer hjärn regioner. Det är viktigt att skilja platserna för kramp anfall (epileptogenic regioner) från spridningen nätverk, som reglerna för beslag uppkomst och utbredning kan variera. Forskning som utförs på mänsklig vävnad och experimentella modeller av epilepsi har lämnat viktiga uppgifter om om organisation av kretsar och deras förmåga att generera anfall20,21,22, 23. det är dock svårt att avgöra om dessa omorganiseringar är adaptiva svar eller om de är causally relaterade till epileptogenes eller beslag uppkomst och utbredning12.
Därför, lokalisera den epileptiska fokus och tillämpa antiepileptika lokalt är en av de största utmaningarna i samtida epilepsi forskning. Flera experiment med djur modeller av epilepsi och vissa kliniska studier syftade till att hitta uppkomsten av anfall händelser och definiera de bakomliggande mekanismerna i hjärnan24,25,26,27. För detta ändamål har vi utvecklat en ny experimentell protokoll med 4ap-inducerad epilepsi modell28,29,30,31 i en akut mus förberedelse, som gör det möjligt att exakt insättning av tre enheter i det givna området av hippocampus, där nätverks aktivitet in vivo manipuleras på ett mycket lokaliserat sätt. Lokaliserad 4AP injektion av en glasmikropipett hjälper till att inducera epileptiska SLEs i en lokaliserad plats i hippocampus, medan med hjälp av den nya polymerbaserade μFIP sond kontroll av beslag aktivitet uppnås samtidigt genom att registrera neuronala elektriska aktiviteten med enhetens inspelnings platser. Hippocampal lokala fält aktivitet övervakas också med en flerkanals kisel sond i ett lager-specifikt sätt i cortex och i hippocampus samtidigt.
Den nyligen uppfunna μfip sonder arbete genom att använda ett tillämpat elektriskt fält för att skjuta laddade läkemedel som lagras i en mikroflödessystem kanal över ett Jonbytarmembran (IEM) och ut till den omgivande vävnaden (figur 1). Den IEM transporterar selektivt endast en typ av Jon (Cation eller Anion) och därmed arbetar för att begränsa både passiv diffusion i "off" tillstånd och transport av oppositivt laddade arter från den omgivande vävnaden i enheten. Det elektriska fältet skapas på begäran genom att använda en liten spänning (< 1 V) mellan käll elektroden som är intern för mikrofluidic-kanalen och en mål elektrod som är extern till anordningen (i detta fall, huvud skruven på djur modellen). Andelen läkemedel leverans är proportionell mot den tillämpade spänningen och den uppmätta strömmen mellan källan och mål elektroderna. Den exakta möjligheten att leverera läkemedel är en av de främsta fördelarna med μFIP. En annan kritisk fördel, jämfört med fluidic eller tryck-baserade läkemedel leverans system, är att i μFIP finns det bara en försumbar tryck ökning vid läkemedels leverans utlopp som droger levereras över IEM utan deras bärare lösning.
Det finns en liten mängd passiv läckage av GABA när μFIP är "off", men detta konstaterades inte att verkställa SLEs. Μfip är skräddarsydda efter konventionella mikrofabrikation metoder som vi rapporterade tidigare31.
Eftersom ett sätt att förhindra återkommande anfall är blockaden av nät utsläpp i början eller till och med innan den första beslag händelse, presenterade metoden för att leverera den hämmande neurotransmittorn GABA i den epileptiska fokus har stor terapeutiska potentialen för kramp anfall hos patienter med fokal epilepsi. Eftersom GABA är ett endogent substrat, det lämnar inneboende neuronala egenskaper oförändrade i fysiologiska koncentrationer. Den lokala tillämpningen av låga nivåer av GABA kommer bara att påverka celler naturligt lyhörd för hämning, och kommer bara att orsaka liknande effekter till fysiologiska hämning, i motsats till djup hjärna stimulering (DBS), som har ospecifika åtgärder genom att stimulera alla celler av neuronala nätverk i sin omgivning, orsakar en blandad respons med både excitation och hämning. Sammanfattnings vis ger den föreslagna metoden en mer specifik metod för beslag kontroll än DBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer utfördes enligt de etiska rikt linjerna från Institut de Neurosciences des Systèmes och godkändes av de lokala etiska kommittéerna och veterinär kontoren.
Anmärkning: Sjutton vuxna manliga OF1 möss användes för experimenten. Möss var omskolade till en 12 h ljus/mörker cykel med mat och vatten tillgängliga AD libitum.
1. anestesi
- Injicera intraperitonealt en blandning av Ketamin och xylazin (100 mg/kg kropps vikt och 10 mg/kg kropps vikt) för att bedöva djuret.
-
Kontrol lera nivån på anestesi genom att observera andnings frekvens och vispning och genom att kontrol lera musens svar på smärta.
Obs: när musens andning blir regelbunden, ingen vispning kan observeras, och djuret inte reagerar på svans pinches, anestesi är djupt nog att fortsätta.- Placera djuret på en elektriskt programmerbar värme dyna. Täck rektal temperatur sonden med en vaselin-baserad produkt (se tabell över material) och placera den försiktigt i änd tarmen (1-2 cm djup) av musen för att övervaka dess kropps temperatur. Upprätthålla en kropps temperatur mellan 36,5 och 37,5 ° c under kirurgiska ingrepp och experimentella inspelningar.
- Övervaka anestesi nivå genom att kontrol lera musens reflexer, morrhår rörelser, och dess frekvens av andning. Med hänsyn till den nivå av anestesi registreras minst var 30 min, ge en liten dos av en Ketamin-xylazine cocktail (20-50 μL, samma koncentration som används som tidigare) intramuskulärt.
2. kirurgi/kraniotomi
- Fäst huvudet på musen i en stereotaktisk ram. Använd en 30 G nål och injicera lokal analgetisk ropivacain (5 μL, 7,5 mg/mL, se tabell över material) subkutant på den planerade snitt platsen. Låt 5 min för att det ska träda i kraft.
- Gör en rak skuren mitt linje i huden ovanför skallen med en skalpell. Försiktigt dra huden mot sidorna med fina pincett och klämma den åt sidan med Bulldog serförfina klämmor för att lämna skallen exponeras för vidare arbete.
- Rengör skallen av fascian med en skalpell eller något liknande verktyg. I händelse av ytliga blödningar, ta bort blodet med bomulls pinnar eller små bitar av pappers hand duk.
- Ta en poly (3,5-ethylenedioxythiophene) polystyren sulfonate (PEDOT: PSS)-belagda jord skruv (storlek: #00, diameter: 0,047 i, längd: 1/8 i, se tabell över material) med en lödda tråd och Anslut den med en kontakt till förstärkaren headstage.
- Fukta skallen vid önskad hål plats och borra ett hål i hög hastighet med en fin, rund borr (med en diameter på 0,4 mm) på skallen ovanför lillhjärnan tills Dura är synlig. Sätt jord skruven i hålet och skruva in den med en precisionssskruvmejsel tills den når toppen av lillhjärnan.
Anmärkning: Huvud skruven var doppbelagd med en PEDOT: PSS-lösning innehåll ande 1% 3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GOPS) efter vikt följt av bakning vid 140 ° c för 90 min. PEDOT: PSS är en konjugerad polymer med en volymetrisk kapacitans som är känd för att vara biokompatibel. GOPS är en cross-Linker blandat med PEDOT: PSS för att öka stabiliteten i vattenhaltiga medier (figur 2). - Med hjälp av den stereotaxiiska ramen, mäta de stereotaxiiska koordinaterna för den önskade hjärn regionen. Till exempel, regionen av intresse är Hippocampus, anteroposterior (AP)-1,8 mm och mediolateral (ML) 1,8 mm från Bregma punkt baserat på hjärnan Atlas för möss32.
Anmärkning: Dessa är koordinater för den högra hjärn halvan (figur 2). - Tunn en ca 1 till 2 mm diameter område av skallen ovanför mål regionen med hjälp av en pålitlig tand borr (se tabell över material) inställd på en snabb hastighet tills en tunn, väl polerad, transparent ben membran kvar.
- Sedan, om tjock leken på ben membranet är tunn nog (< 200 μm), göra ett litet hål med tunna pincett och försiktigt ta bort det tunna skiktet av benet33. Använd skräddarsydda krok-tippade nål för att ta bort Dura. Minimera storleken på kraniotomi och durotomi för att förhindra utveckling av Edemas och för att minimera hjärt-och/eller respiratoriska pulseringar i hjärnan.
Anmärkning: Kraniotomin måste fyllas med en droppe saltlösning för att förhindra torkning och sedan regelbundet fyllas på under experimentet (figur 2).
3. införande av Multichannel Silicon Probe
- Använd stereotaxiliknande armar i en liten AP-vinkel (20 °) för kisel sonden för att lämna gott om plats för placeringen av de andra två implantaten och för att ha inspelningen och injektions ställena för elektroden, Jon pumpen och mikropipetten så nära som möjligt.
Anmärkning: Elektroder, sprutor och Jon pumpar täcktes med en droppe av DiI fläcken lösning (1, 1 '-dioctadecyl-3, 3, 3 ', 3 '-tetramethylindocarbocyanine perklorat [DiI]), för post hoc visualisering av implantation spår (0,5 mg/ml DiI i dimetylsulfoxid). - Placera kisel sonden på den stereotaxianslutna armen som är fäst vid en magnet hållare och placera den bredvid den stereotaxiiska ramen. Ställ in AP-vinkeln (20 °) och Anslut sedan sonden till headstage och till jord skruven.
-
Sakta sänka kisel sonden i hippocampus med hjälp av Micron-exakt stereotaktisk arm eller en motoriserad micromanipulator för att undvika laterala rörelser (figur 2 och figur 3).
- Initiera inspelnings program och spela in-med headstage, den anslutna förstärkaren, och en dator-elektriska neuronala signaler medan du flyttar den flerkanaliga kisel sonden från toppen av hjärn Barken tills den riktade dorsoventral (DV) position nås (- 1 800 μm från den kortikala ytan). Spela in och titta på det lokala fältet potentiell signal (LFP) under penetration på dator skärmen.
Anmärkning: Kontrol lera nedstigningen av sonden så att den rör sig långsamt och kontinuerligt under inspelningen, för att få bättre visuell kontroll för inträngning och för att nå mål zonen. - Använd rippel aktiviteten i det pyramidala skiktet av Hippocampus formation i den inspelade LFP som en markör för mål zonen.
Anmärkning: Rippel aktivitet är synlig på en eller två angränsande kanaler i flerkanals kisel (SI) sond med en 100 μm avstånd mellan inspelnings platser (figur 4). - Spela in LFP signaler från lagren av cortex och Hippocampus samtidigt genom flerkanals förstärkare program vara (se tabell över material) med hjälp av den flerkanaliga si sonder (figur 4).
- Initiera inspelnings program och spela in-med headstage, den anslutna förstärkaren, och en dator-elektriska neuronala signaler medan du flyttar den flerkanaliga kisel sonden från toppen av hjärn Barken tills den riktade dorsoventral (DV) position nås (- 1 800 μm från den kortikala ytan). Spela in och titta på det lokala fältet potentiell signal (LFP) under penetration på dator skärmen.
4. införande av μFIP
- Anslut rören (se tabell över material) till intaget av μFIP och fyll sonden med 0,05 M GABA lösning. Ta bort rören och stäng inloppet med paraffin Films omslag. Anslut elektriska ledningar till käll mätnings enheten.
- Sätt i μfip med hjälp av stereotaktisk armen på en mediolateral (MP) vinkel (20 °). SI-sonden sitter kvar under hela processen.
Obs: μfip är mycket flexibelt och kan dra nytta av stödet från en liten och ren pensel för att hålla den rakt tills den når hjärnans yta. Efter det steget kan μFIP sänkas försiktigt med axiella rörelser. - Sänk μFIP långsamt med axiella rörelser och låt den aldrig böja under banan tills den når dorsoventral (DV)-koordinaten (-1 200 μm från den kortikala ytan).
Anmärkning: Försök att sätta de två enheterna (μFIP och kisel sond) så nära varandra som möjligt, med tanke på 300 μm avstånd från utloppet från μFIP spetsen.
Varning: Undvik mekaniska problem mellan enheterna och deras kontakter under isättning (figur 2b och figur 3b).
5. beredning av anordningar för beslag induktion
- Ändra sprutans metallnål (10 μL) (se material tabell). Ta bort den nålhållande metall delen, placera och fixera mikropipetten (ytterdiameter [OD]: 1,2 mm, innerdiameter [ID]: 0,75 mm, spets diameter: 20 – 50 μm med ± 0,5 cm avsmalnande av skaftet), och byt sedan ut nålhållarelementet.
- Placera sprutan och den bifogade borosilikatmikropipetten i en 20 ° lateromedial (LM) vinkel för injektion av 4AP (50 mM i artificiell cerebrospinalvätska [ACSF]).
Var försiktig: Använd inte sprutans metallnål eller en mikropipett med ett spets större än 50 μm. - Rita 500 nL – 1 μL 50 mM 4AP med hjälp av en automatiserad mikroinjektionspump.
6. införande av Glaspipett fastsatt på en spruta för 4AP injektion
- Sänk glasmikropipetten fastsatt på sprutan i den riktade DV-positionen (-1 500 μm) och injicera sedan 250 nL i 4AP-lösningen (figur 2 och figur 3). Starta inspelningen med inspelnings programmet. Titta på skärmen och vänta tills den första interictal Spike visas.
- Starta GABA leverans av μFIP omedelbart med utseendet på den första interictal Spike. Leverera GABA genom att tillämpa 1 V mellan källa och mål för 100 s följt av 1 s off, för 30 cykler. Med hjälp av inspelnings program, spela in i minst 2 h.
Anmärkning: Den totala massan av den levererade GABA är runt 1 nmol (figur 5). - I slutet av experimentet, försiktigt bort de inmatade sonderna och jord skruven, och ta bort djuret från stereotaktisk utrustning. Djur var euthanized med en överdos av läkemedel (i. p. 100mg/kg pentobarbital). Döden bekräftades genom upphör ande av andetag och cirkulation.
7. utvärdering av implantatens placering
- Efter euthanizing djuret, parfymera det transcardially, först med 50 mL saltlösning och sedan med 150 mL av en Ice-Cold fixativ lösning som innehåller 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfatbuffert (PB)34.
Var försiktig: PFA är farligt och måste hanteras varsamt. - Decapitate djuret, och sedan ta bort huden och muskeln från toppen och sidorna av skallen. Från foramen magnum, göra laterala snitt i skallen mot öronen och en sagittal mitt linjen snitt, med stor omsorg för att inte skada hjärnan. Ta försiktigt bort skallen med en bentrimmer. Ta bort hjärnan, och sedan skära ett vävnads block från regionen av intresse (från Bregma punkt,-1 till-3 mm AP) med hjälp av en hjärna matris (se tabell över material).
- Limma vävnads blocket till preparat hållaren på en vibratome, Lägg stativet i det och Ställ in vibratomen till 40 μm tjocklek i en PB bad göra 40 μm koronalt sektioner.
- Tvätta i stor utsträckning med 0,1 M PB. Följ det histologiska protokollet för gliaceller fibrillärt surt protein (GFAP) färgning31.
- Montera avsnitt på dia bilder och täck dem med ett monterings medium som innehåller 2-(4-amidinophenyl)-1H-indol-6-carboxamidine (DAPI) (se tabell över material).
8. konfokalmikroskopi
- Placera bilderna med de färgade koronala avsnitten under ett 20x mål av en konfokal Mikroskop. Välj mål region.
- Välj den optimala excitation och utsläpp (Exc/EMS) filter uppsättningar för färg ämnen enligt följande: DAPI = 358/461 nm, DiI = 551/569 nm, och fluorescein (se tabell över material) = 490/525 nm.
Anmärkning: Eftersom färgning varierar per sektion, måste ett lämpligt intervall av minimal och maximal excitation och detektion bestämmas för varje avsnitt, där de minst täta och mest täta regionerna båda uppvisar utsläpp. - Välj den minst täta regionen och Ställ in laserintensitet och detektion på höga värden, och kontrol lera sedan i de tätaste regionerna om dessa värden orsakar övermättnad av upptäckta utsläpp. Om så är fallet, Sänk värdena och kontrol lera dem igen med den minst täta regionen. Iterera dessa steg tills de anländer till högsta möjliga detektering vid låga Färgnings nivåer och korrekt, inte övermättade nivåer på starkt färgade områden. Upprepa denna process för alla färg ämnen.
- Använd panel skannings funktionen i Mikroskop med 512 x 512 pixlar per bricka för att få en stor överblick över sonden insättnings platser med en lämplig upplösning för post hoc-bearbetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av det förfarande som presenteras här med en 4AP epilepsi modell i bedövade möss, kontroll av epileptiska anfall kan uppnås i epileptiska fokus. Den exakta lokaliseringen av implantaten (figur 2) hjälpte till att spela in Hippocampus lokala potentialer (Lfps, figur 4), att inducera små Hippocampus anfall och att leverera GABA vid kramp anfall debut. Lokaliseringen av implantaten kontrollerades efter varje experiment med post hoc histologi (figur 3).
I fallet när SLEs var närvarande endast i hippocampus, epileptiska aktiviteten sattes under fullständig kontroll. Figur 5 visar ett representativt exempel på när SLEs kan stoppas med leverans av GABA av romanen neuronala sond införliva en μFIP. När 4AP injicerades i ett större område eller på toppen av cortex, epileptiska anfall blev generaliserad, så levererade GABA inte kunde ändra omfattningen av epileptiska anfall (figur 6). Leveransen av natrium joner hade ingen märkbar effekt på 4AP-inducerad aktivitet (figur 7).
Figur 1: översikt över μFIP-sonden. Schematisk vy och verklig storlek på μFIP-sonden. (a) Schematisk av den implanterade änden av en μFIP-sond som visar primära egenskaper. (b) Foto av en μFIP sond med en nål-liknande implanterad pekar uppåt. Den röda blocket är för fluidic anslutningar. Skalbar = 1 cm. (c) Mikroskop bild av en μFIP sond spets utan IEM. Skalbar = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Cranio-durotomi och lokalisering av implantaten i mus hjärnan. (A) Schematisk syn på operationen, kraniotomi, och målet för implantaten i mus hjärnan. (B) används stereotaktisk koordinater och vinklar för implantation av de tre enheterna. μFIP = 20 ° mediolateral (ML),-1 200 μm DV (grön). Multichannel kisel sond = 20 ° AP,-1 800 μm DV (blå). Mikropipett med spruta = 20 ° LM,-1 500 μm DV (röd). I mitten av kraniotomi är 1,8 mm ml,-1,8 mm AP för höger hjärn halva. Denna siffra har ändrats från Proctor et al.31 (Copyright distribueras under Creative Commons Erkännande Ickekommersiell licens 4,0 (CC by-NC). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: histologisk utvärdering av implantations placeringen. Panel (a) visar en schematisk 3D-figur på lokaliseringen av Hippocampus formation i mus hjärnan (grön). Paneler (B, C och D) visar spår av implanterade enheter-μfip, micropipett med spruta och Multichannel kisel sond (DiI, röd, pilar), respektive31. Paneler (BA, ca, da) visar en hög förstoring bild; paneler (BB, CB, db) Visa motsvarande sida av paxinos och Franklin Mouse Brain Atlas, medan (BC, CC, DC) visar en låg förstoring bild på hela koronala delen av höger Halvklotet. Scale bar = 500 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Multikanals inspelning från cortex och Hippocampus. LFP-inspelning med en multikanals kisel sond med ett avstånd på 100 μm mellan inspelnings platser, från lager av cortex (vit) och Hippocampus formation (lila, CA1 = Cornu Ammonis område 1; blå, DG = dentate gyrus. Notera rippel aktivitet CA1 stratum pyramidale. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: kontroll av en 4AP-inducerad kramp anfall av GABA. Representativa elektrofysiologi inspelningar från Hippocampus. (A) inspelning i avsaknad av μFIP-behandling med SLEs som börjar cirka 30 minuter efter en 4ap-injektion, följt av status epilepticus. B) registrering av ett fall där μFIP-behandlingen inleddes omedelbart efter första gången. Inspelningen visar inga ytterligare sjukdoms händelser efter att behandlingen har startat. (C) inspelning där μFIP-behandling initierades före en 4ap-injektion och som inte visade några patologiska händelser. De röda pilarna indikerar en 4AP-injektion. Fasta gröna pilar indikerar inledningen av μFIP-behandlingen och öppna gröna pilar markerar slutet på μFIP-behandlingen. Skarpa toppar på 100 s intervall efter en grön pil är artefakter från μFIP behandling31. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: underlåtenhet att kontrol lera en 4AP-inducerad beslag av GABA. Representativ Elektrofysiologisk inspelning från hippocampus i ett fall där 4AP injicerades med metallnålen på sprutan, så epileptiska anfall påverkade ett större hjärn område. Observera att GABA leverans inte påverkade beslag intensitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: fordons experiment. Kontroll experiment leverera en ekvivalent dos av natrium Jon (na+) i stället för GABA hade inte en märkbar effekt på 4ap-inducerad aktivitet, visar att det inte är den tillämpade strömmen från Jon pumpen som modulerar elektro fysiologiska utan de levererade molekylerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genom att utveckla ett nytt experimentellt protokoll i en akut mus modell av epilepsi, skulle SLEs kunna kontrol leras med hjälp av en μFIP implanterad i epileptiska fokus. Tack vare dess förmåga att leverera GABA med temporal och spatial precision, 4AP-inducerad SLEs kontrollerades vid uppkomsten av anfall. Behandling av epilepsi är teoretiskt möjligt om kontrollen av neurala nätverk urladdningar uppnås på platsen för beslag start. Det presenterade protokollet visade detta möjligt om lokaliseringen av den injicerade hämmande neurotransmittorn, GABA, är exakt tillräckligt för att nå epileptiska fokus i tid. Emellertid, i de fall där epileptiska anfall påverkar större områden i hjärnan, beslag kontroll av exakt lokaliserad GABA leverans är inte möjligt. Påverkans området för μFIP-sonden beräknades med en radie på cirka 550 μm från utloppet. Det visade sig att SLEs endast kunde påverkas om 4AP-injektionen lokaliserades till detta område31.
Därför är metoden användbar när epileptiska anfall är lokaliserade, men det var inte möjligt att kontrol lera eller stoppa epilepsi när beslag blev multifoci eller generaliserad. Också, metoden har bevisats i bedövade gnagare; hos fritt rörliga djur är kroniska tillämpningar fortfarande nödvändiga för att undersöka hur effektivt detta protokoll är.
Medan epilepsi har flera former och orsakas av olika bakomliggande mekanismer, det är bevisat att cirka 60% av patienterna har en enda epileptiska Bränn punkt35. Därför, fördelen med den lokala administrationen av en endogen hämmande signal substans ger ett användbart verktyg för ytterligare experimentella djur studier och presenterar en ny strategi för behandling av fokal epilepsi. Den beskrivna metoden visade nyttan av μFIP behandling i en akut mus studie och öppnade vägen för ytterligare teknisk utveckling för att säkerställa dess kroniska applicering. Vi tror att just riktade elektroforetiska läkemedel leverans enheter kan anpassas ytterligare för att behandla inte bara epilepsi men andra neurodegenerativa sjukdomar också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
C.M.P. erkänner finansiering från en Whitaker International Scholar stipendium administreras av Institutet för internationell utbildning. Arvidsson sponsras av Marie Curie IEF (nr 625372). A.W. erkänner finansieringen från Europeiska forsknings rådet (ERC) inom ramen för Europeiska unionens program för forskning och innovation inom Horisont 2020 (bidrags avtal nr 716867). A.W. erkänner dessutom Excellence Initiative av Aix-Marseille University-A * MIDEX, ett franskt "Investissements D' Avenir"-program. Författarna erkänner Dr. Ilke Uguz, Dr Sahika Inal, Dr. Vincenzo Curto, Dr Mary Donahue, Dr Marc Ferro, och Zsófia Maglóczky för deras deltagande i fruktbara diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Supertech Instruments | MH-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 | |
| Silicon probe | Neuromicrosystems Ltd | A1x32_dbl_5.0_50_0_176_50 |
References
- Kwan, P., Palmini, A. Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review. Epilepsy & Behavior. 73, 166-172 (2017).
- Belleudi, V., et al. Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review. Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).
- Chen, B., et al. Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 76, 24-31 (2017).
- Brodie, M. J., et al. Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review. Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).
- Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
- Hamed, S. A. The effect of epilepsy and antiepileptic drugs on sexual, reproductive and gonadal health of adults with epilepsy. Expert Review of Clinical Pharmacology. 9 (6), 807-819 (2016).
- Roff Hilton, E. J., Hosking, S. L., Betts, T. I. M. The effect of antiepileptic drugs on visual performance. Seizure. 13 (2), 113-128 (2004).
- Stafstrom, C. E., Carmant, L. Seizures and epilepsy: an overview for neuroscientists. Cold Spring Harbor Perspective in Medicine. 5 (6), (2015).
- Arzimanoglou, A., et al. A Review of the New Antiepileptic Drugs for Focal-Onset Seizures in Pediatrics: Role of Extrapolation. Paediatric Drugs. 20 (3), 249-264 (2018).
- Avoli, M., et al. Specific imbalance of excitatory/inhibitory signaling establishes seizure onset pattern in temporal lobe epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 3229-3237 (2016).
- Badawy, R. A., Freestone, D. R., Lai, A., Cook, M. J. Epilepsy: Ever-changing states of cortical excitability. Neuroscience. 222, 89-99 (2012).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Porter, R. J. Mechanisms of action of new antiepileptic drugs. Epilepsia. 30, Suppl 1. S29-34, discussion S64-28 (1989).
- Rogawski, M. A. Diverse mechanisms of antiepileptic drugs in the development pipeline. Epilepsy Research. 69 (3), 273-294 (2006).
- Czapinski, P., Blaszczyk, B., Czuczwar, S. J.
- Ye, H., Kaszuba, S. Inhibitory or excitatory? Optogenetic interrogation of the functional roles of GABAergic interneurons in epileptogenesis. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 93 (2017).
- Loscher, W., Klitgaard, H., Twyman, R. E., Schmidt, D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 757-776 (2013).
- Manchishi, S. M. Recent Advances in Antiepileptic Herbal Medicine. Current Neuropharmacology. 16 (1), 79-83 (2018).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., Miles, R. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (2002).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in Epilepsy: Heterogeneity and Hub Cells in Network Synchronization. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (11), (2015).
- Prince, D. A., Gu, F., Parada, I. Antiepileptogenic repair of excitatory and inhibitory synaptic connectivity after neocortical trauma. Progress in Brain Research. 226, 209-227 (2016).
- Nilsen, K. E., Cock, H. R. Focal treatment for refractory epilepsy: hope for the future. Brain Research: Brain Research Reviews. 44 (2-3), 141-153 (2004).
- Martinkovic, L., Hecimovic, H., Sulc, V., Marecek, R., Marusic, P. Modern techniques of epileptic focus localization. International Review of Neurobiology. 114, 245-278 (2014).
- Nagaraj, V., et al. Future of seizure prediction and intervention: closing the loop. Journal of Clinical Neurophysiology. 32 (3), 194-206 (2015).
- Osman, G. M., Araujo, D. F., Maciel, C. B.
- Slezia, A., et al. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiology of Disease. 16 (3), 490-499 (2004).
- Baranyi, A., Feher, O. Convulsive effects of 3-aminopyridine on cortical neurones. Electroencephalography Clinical Neurophysiology. 47 (6), 745-751 (1979).
- Szente, M., Baranyi, A. Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex. Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).
- Proctor, C. M., et al. Electrophoretic drug delivery for seizure control. Science Advances. 4 (8), eaau1291 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition. , Academic Press. (2012).
- Pinault, D. A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks. Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).
- Pati, S., Alexopoulos, A. V. Pharmacoresistant epilepsy: from pathogenesis to current and emerging therapies. Cleve Clinical Journal of Medicine. 77 (7), 457-467 (2010).
