Summary
Qui descriviamo un metodo per l'imaging multi-fotofilano ad alta risoluzione delle cellule tumorali cerebrali prima e dopo l'intervento chirurgico invasivo (ad esempio, biopsia) all'interno dello stesso animale vivente. Questo metodo consente di studiare l'impatto di queste procedure chirurgiche invasive sul comportamento migratorio, invasivo e proliferativo delle cellule tumorali a livello di singola cellula.
Abstract
Le biopsie sono standard di cura per il trattamento del cancro e sono clinicamente utili in quanto consentono la diagnosi di tumore solido, prognosi, e la determinazione del trattamento personalizzato. Tuttavia, la perturbazione dell'architettura tumorale mediante biopsia e altre procedure invasive è stata associata a effetti indesiderati sulla progressione del tumore, che devono essere studiati in profondità per migliorare ulteriormente il beneficio clinico di queste procedure. Gli approcci statici convenzionali, che forniscono solo un'istantanea del tumore, sono limitati nella loro capacità di rivelare l'impatto della biopsia sul comportamento delle cellule tumorali come la migrazione, un processo strettamente correlato alla malignità tumorale. In particolare, la migrazione delle cellule tumorali è la chiave nei tumori cerebrali altamente aggressivi, dove la diffusione del tumore locale rende praticamente impossibile la resezione totale del tumore. Lo sviluppo dell'imaging multifotonico e delle finestre di imaging cronico consente agli scienziati di studiare questo processo dinamico negli animali viventi nel tempo. Qui, descriviamo un metodo per l'imaging longitudinale ad alta risoluzione delle cellule tumorali cerebrali prima e dopo una biopsia nello stesso animale vivente. Questo approccio consente di studiare l'impatto di questa procedura sul comportamento delle cellule tumorali (migrazione, invasione e proliferazione). Inoltre, discutiamo i vantaggi e le limitazioni di questa tecnica, così come la capacità di questa metodologia di studiare i cambiamenti nel comportamento delle cellule tumorali per altri interventi chirurgici, tra cui la resezione tumorale o l'impianto di chemioterapia Wafer.
Introduction
Standard di cura per la maggior parte dei tumori solidi include biopsia tissutale per la diagnosi, prognosi, e la determinazione del trattamento personalizzato1,2. Nel complesso, queste procedure danno beneficio clinico, ma prove recenti indicano che la biopsia e altre procedure più invasive, come la resezione tumorale, possono anche influenzare negativamente la progressione del tumore3,4,5 , 6. Sebbene queste procedure rimangano indispensabili per l'assistenza all'in-paziente e i loro benefici ne superino gli effetti negativi, è necessario comprendere appieno i meccanismi alla base di questi effetti negativi al fine di massimizzare la sicurezza dei pazienti e la influenze positive di queste procedure e renderle ancora più clinicamente vantaggiose.
Gli effetti indesiderati mediati dalla biopsia sulla progressione del tumore sono innescati da alterazioni sistemiche e cambiamenti nel microambiente tumorale in risposta alla rottura dei tessuti4,5. Quindi, è necessario studiare questo processo negli animali vivi. Tuttavia, le conseguenze sottili di queste procedure minimamente invasive possono spesso essere mascherate da grandi variazioni tra gli individui. I metodi convenzionali basati sull'immunosofochimica o sull'analisi dell'espressione trascrizionale possono trascurare questi effetti o richiedere un gran numero di animali per identificarli. Inoltre, questi approcci statici non sono in grado di identificare i cambiamenti nel comportamento delle cellule tumorali come la migrazione e l'invasione, processi dinamici che correlano con la malignità tumorale. Queste caratteristiche delle cellule tumorali sono di particolare importanza per i tumori cerebrali altamente aggressivi, come il glioblastoma multiforme (GBM), dove la diffusione locale delle cellule tumorali limita la resezione chirurgica e diminuisce la sopravvivenza del paziente7. Per comprendere appieno in che modo le biopsie influenzano il comportamento delle cellule GBM, è necessario un approccio longitudinale che permetta la visualizzazione di queste cellule nel contesto fisiologico degli organismi viventi.
Il recente sviluppo dell'imaging intravitale ad alta risoluzione in combinazione con finestre di imaging cronico impiantate chirurgicamente consente agli scienziati di studiare il comportamento dinamico delle cellule tumorali nei topi viventi per più giorni8,9. Utilizzando questo potente approccio, possiamo studiare come il comportamento proliferativo, migratorio e infiltrativo delle cellule tumorali cambia nel corso di diversi giorni in risposta a una biopsia nello stesso topo. Rispetto ad altre tecniche che consentono il monitoraggio di più giorni dei tumori nei topi vivi, come la risonanza magnetica (RMI)10, la tomografia a emissione di positroni/tomografia computerizzata (PET/CT)11, o l'imaging bioluminescente12, questo approccio offre in modo unico la possibilità di studiare il comportamento delle cellule tumorali a livello di singola cellula e svelare sottili cambiamenti che si verificano all'interno del tumore.
Qui, descriviamo un metodo dettagliato per eseguire lesioni biopsia e imaging intravitale longitudinale pre e postbiopsia nel cervello dei topi portatori di tumore. Questo metodo può essere potenzialmente applicato per studiare altri interventi chirurgici, come la resezione parziale del tumore o l'impianto di wafer di chemioterapia.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con le linee guida del Comitato per il benessere degli animali della Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences, nei Paesi Bassi. I protocolli sperimentali utilizzati in questo manoscritto sono stati approvati dalla Centrale Commissie Dierproeven (CCD) e dall'Instantie voor Dierenwelzijn (IvD).
1. Impianto delle cellule tumorali e preparazione della finestra di imaging cranico
- Preparazione chirurgica
- Utilizzare topi adulti (>6 settimane) di qualsiasi ceppo o genere. Sedare un topo con l'iniezione (fluanisone [neurolettico] , fentanil [oppioide]) (0,4 mL/kg) - sedativo benzodiazepine (2 mg/kg) a una dose di 1:1:2 in acqua sterile. Valutare lo stato di sedazione dell'animale per pizzico di dita dei dei dei iper.
NOTA: In questo protocollo, sono stati utilizzati sia topi C57BL/6 femminili che maschili a causa dello stesso background genetico della linea cellulare tumorale utilizzata in questi esperimenti (GL261). Il topo rimarrà completamente sedato per 1,5 h. In alternativa, utilizzare l'anestesia per inalazione come l'isoflurane (1,5%–2% miscela isoflurane/O2). - Montare il mouse su una cornice stereotassica e fissare la testa utilizzando un morsetto del naso e due barre auricolari.
- Utilizzare una lampada di riscaldamento per preservare la temperatura corporea. Lampada di riscaldamento deve essere utilizzato con cautela, in alternativa possono essere utilizzati cuscinetti di riscaldamento di ricircolo dell'acqua.
- Applicare l'unguento per gli occhi per proteggere le cornee del mouse dall'essiccazione.
- Utilizzare forbici affilate per radere la pelliccia sul cranio (area dorsale dagli occhi del topo alla base del cranio) e disinfettare la pelle esposta con il 70% di etanolo.
- Tagliare la pelle in modo circolare con le forbici affilate e raschiare via il periosteo sotto con un tampone di cotone. Applicare una goccia di lidocaina 1% - epinefrina 1:100,000 per 5 min, e rimuovere l'eccesso con un tampone di cotone.
- Incollare i bordi della pelle al cranio con colla cianoacrita.
- Posizionare il telaio stereotassico sotto un microscopio stereo di dissezione con ingrandimento 4x.
- Visualizza il cranio attraverso il microscopio di dissezione e trivella una scanalatura circolare di 5 mm di diametro sull'osso parietale destro. Eseguire questo passaggio con attenzione e solo superficialmente, evitando qualsiasi pressione sul cranio.
- Applicare una goccia di buffer di corteccia (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM di glucosio, 10 mM buffer HEPES, 2 mM MgSO4e 2 mM CaCl2 [pH 7.4]) e sollevare il lembo osseo utilizzando pinze sottili.
- Per i passaggi seguenti, mantenere la superficie cerebrale coperta con buffer di corteccia, a meno che non sia indicato diversamente.
- Sotto il microscopio di dissezione, visualizzare la superficie del cervello e rimuovere il dura mater utilizzando pinzette a punta curvo, affusolato, molto fine. Se si verifica sanguinamento in questa fase, utilizzare una spugna di gelatina assorbibile per fermarlo.
- Utilizzare topi adulti (>6 settimane) di qualsiasi ceppo o genere. Sedare un topo con l'iniezione (fluanisone [neurolettico] , fentanil [oppioide]) (0,4 mL/kg) - sedativo benzodiazepine (2 mg/kg) a una dose di 1:1:2 in acqua sterile. Valutare lo stato di sedazione dell'animale per pizzico di dita dei dei dei iper.
- Iniezione di cellule tumorali
- Risospendere la quantità desiderata di cellule tumorali fluorescenti in 3 gradi l di PBS (ad esempio, per gli esperimenti illustrati in questo protocollo, sono state iniettate 1 x 105 cellule GL261).
NOTA: Mentre può essere utilizzato qualsiasi marcatore fluorescente, un marcatore nucleare è fortemente consigliato, per monitorare le singole cellule tumorali durante l'analisi. Inoltre, un marcatore fluorescente collegato agli itoni, come l'H2B, può essere utilizzato per visualizzare la condensazione cromosomica e, quindi, per monitorare la divisione cellulare. L'uso di un marcatore foto-commutabile, come Dendra2, consente la fotomarca e il tracciamento delle cellule tumorali per diversi giorni4,13. - Caricare le cellule tumorali in una siringa da 10 l a tenuta di gas con uno stile punto 2 ago e fissarlo sul braccio stereotaxic manipolatore.
- Rimuovere il buffer della corteccia. Posizionare la punta della siringa al centro della craniotomia e inserirla ad una profondità di 0,5 mm dalla superficie del cranio. Facoltativamente, creare un piccolo spazio nel cervello per ospitare la sospensione delle cellule tumorali. Per questo, inserire la siringa fino a una profondità di 1 mm e quindi recuperarla fino a 0,5 mm prima dell'iniezione.
- Applicare una goccia di buffer di corteccia.
- Iniettare lentamente la sospensione cellulare utilizzando un iniettore a pompa di microsiringa (250-400 nL/min). Rimuovere la siringa e utilizzare una spugna di gelatina assorbibile per fermare qualsiasi sanguinamento, se necessario.
- Risospendere la quantità desiderata di cellule tumorali fluorescenti in 3 gradi l di PBS (ad esempio, per gli esperimenti illustrati in questo protocollo, sono state iniettate 1 x 105 cellule GL261).
- Preparazione della finestra di imaging cranico
- Rimuovere il tampone della corteccia e posizionare una goccia di olio di silicone sul sito craniotomia per evitare bolle d'aria sotto la finestra.
- Sigillare il cervello esposto con un coverslip da 6 mm. Applicare la colla cianoacrilata tra il coperchio e il cranio. Premere delicatamente il coperchio contro il cranio con l'aiuto di pinzette sottili per garantire una distanza minima tra il cervello e il coperchio.
- Applicare il cemento acrilico dentale sulla superficie del cranio, coprendo il bordo della coverslip. Posizionare un sottile anello in acciaio inossidabile (1,5 mm di diametro esterno, 1 mm di diametro interno) intorno alla craniotomia e lasciare asciugare il cemento dentale. Facoltativamente, aggiungere un po 'di colla sul bordo per fissare l'anello sulla parte superiore della testa.
NOTA: Questo sistema di fissazione della testa è ottimale per l'imaging su un microscopio invertito: piccoli magneti incorporati nella scatola di imaging facilitano la fissazione della finestra di imaging cranico (CIW). Negli esperimenti illustrati in questo protocollo è stato utilizzato un microscopio invertito. Per i microscopi eretti, la fissazione può essere ottenuta tramite una barra o un anello con scanalature che possono essere attaccate al microscopio con l'aiuto di viti o di una piastra che si adatta all'anello. - Per la gestione del dolore, iniettare una singola dose di 100 g/kg di buprenorphine sottocutanea e consentire all'animale di recuperare su un pad di riscaldamento.
- Posizionare il mouse in una singola gabbia con carta triturata per arricchimento. Monitorare attentamente il mouse ogni giorno per i primi giorni e 2x a settimana, successivamente, per il normale comportamento, reattività e aspetto.
2. Imaging intravitale
NOTA: L'intervallo di tempo tra l'iniezione di cellule tumorali e la prima sessione di imaging intravitale dipende dal tipo di linea cellulare tumorale utilizzata. Per gli esperimenti illustrati in questo protocollo, 1x 105 cellule GL261 sono state iniettate e immagini 10 giorni dopo.
- Preparazione dell'imaging
- Sedare il topo utilizzando l'anestesia di inalazione isoflurano attraverso una maschera facciale (1,5%–2% miscela isoflurane / O2).
- Iniettare il topo sottocutaneamente con 100 l di tampone salina per prevenire la disidratazione.
NOTA: Per l'imaging a lungo termine, il mouse può essere idratato attraverso una pompa di infusione sottocutanea. - Posizionare il mouse a faccia in su in una casella di imaging. Utilizzare una piastra metallica con un foro di 1 mm e piccoli magneti incorporati intorno all'apertura per fornire la fissazione del CIW alla scatola di imaging. Introdurre l'isoflurane attraverso una maschera facciale e ventilare da una presa sull'altro lato della scatola (0,8%–1,5% miscela di isoflurane/O 2). Facoltativamente, utilizzare il nastro per fissare il corpo del mouse.
NOTA: A questo punto, è possibile iniettare per via endovenosa la dextran fluorescente per la visualizzazione dei vasi sanguigni o altri coloranti. - Facoltativamente, utilizzare un ossimetro a impulsi e una sonda di riscaldamento per monitorare i segni vitali del mouse.
NOTA: In questo esperimento, non è stato necessario utilizzare un ossimetro a impulsi e una sonda di riscaldamento poiché il mouse era stabile per tutto il periodo di tempo di imaging (2-3 h). Tuttavia, per tempi di imaging più lunghi, potrebbe essere necessario un monitoraggio più approfondito. - Impostare l'obiettivo dell'acqua 25x (ad esempio, HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm) sulla posizione zpiù bassa e aggiungere una grande goccia d'acqua.
NOTA: L'uso di un micro dispenser ad immersione idrica è altamente consigliato per esperimenti a lungo termine in quanto consente agli scienziati di aggiungere acqua durante l'esperimento. In alternativa, è possibile utilizzare un obiettivo secco. - Trasferire la scatola di imaging al microscopio dotato di una camera climatica scura mantenuta a 37 gradi centigradi. Portare l'obiettivo alla coverslip CIW fino a quando la goccia d'acqua lo tocca.
- Utilizzando la modalità di epifluorescenza, osservare il tumore attraverso l'oculare e portare le cellule a fuoco.
- Acquisizione di immagini time-lapse
- Selezionare diverse posizioni di interesse per l'immagine e registrare le relative coordinate nel software. Assicurarsi che le posizioni selezionate siano posizioni rappresentative da diversi siti del tumore (ogni tumore può essere diverso, ma per garantire la coerenza, selezionare la stessa quantità di posizioni che sono centrali per il nucleo del tumore e per i bordi di tutti i topi).
NOTA: Può essere eseguita una scansione di piastrelle di una parte del tumore o dell'intero tumore visibile; tuttavia, se il tumore è grande, questo metodo aumenterà il time-lapse tra le immagini. Inoltre, se le cellule tumorali si muovono velocemente, può essere difficile tenere traccia delle stesse cellule nel tempo. - Passare alla modalità multifotone e sintonizzare il laser alla lunghezza d'onda corretta. Si noti che, per evitare fotodanni, si desidera lunghezze d'onda più elevate.
NOTA: per l'imaging Dendra2, è stata utilizzata una lunghezza d'onda di 960 nm. Con l'obiettivo utilizzato in questi esperimenti, uno zoom di 1.3 era sufficiente per ottenere una buona risoluzione dei nuclei tumorali e la scansione di un'area rappresentativa del tumore. - Vai alla modalità dal vivo e definire uno z-stack per ogni posizione al fine di acquisire il volume massimo delle cellule tumorali senza compromettere la risoluzione delle cellule tumorali. Definire la dimensione del passo tra le immagini come 3 m.
- Utilizzare la modalità bidirezionale per aumentare la velocità di scansione. La risoluzione dell'immagine deve essere di almeno 512 x 512 pixel.
- Acquisire immagini del volume del tumore in posizioni diverse ogni 20 min per 2 h. Aggiungere acqua all'obiettivo prima di ogni acquisizione dell'immagine.
NOTA: le immagini time-lapse possono essere acquisite automaticamente impostando il giusto time-lapse nel software. Tuttavia, il mouse può spostarsi e la posizione o z-stack può cambiare nel tempo, causando la perdita di dati. Pertanto, si consiglia di eseguire il time-lapse manualmente e di controllare e regolare per i turni xyz tra le acquisizioni. - In questa fase, opzionalmente, foto-scambiare il marcatore fluorescente Dendra2.
NOTA: Al contrario dell'imaging time-lapse (che consente di studiare le proprietà delle singole cellule tumorali e come cambiano nel tempo), questo permetterà di studiare l'area di infiltrazione delle cellule tumorali nel cervello per diversi giorni4. Una spiegazione dettagliata di questo passaggio è descritta da Gligorijevic et al.13. - Dopo aver acquisito l'ultima immagine, rimuovere il mouse dallo stage e lasciarlo recuperare su un pad di riscaldamento. Per prevenire la disidratazione, è possibile somministrare sottocutaneamente 100 gradi di salina. Posizionare il topo nella sua gabbia fino a quando non viene eseguita la lesione simile alla biopsia.
- Selezionare diverse posizioni di interesse per l'immagine e registrare le relative coordinate nel software. Assicurarsi che le posizioni selezionate siano posizioni rappresentative da diversi siti del tumore (ogni tumore può essere diverso, ma per garantire la coerenza, selezionare la stessa quantità di posizioni che sono centrali per il nucleo del tumore e per i bordi di tutti i topi).
3. Lesione simile alla biopsia e sostituzione CIW
- Creare una lesione simile a una biopsia nel sito del tumore 1 giorno dopo la prima sessione di imaging.
NOTA: In alternativa, può essere eseguita un'altra procedura, come la rimozione parziale del tumore.- Sedare il topo utilizzando l'anestesia di inalazione isoflurano come descritto in precedenza nel passaggio 2.1.1.
NOTA: Mentre l'anestesia iniettabile può essere utilizzata, questa procedura è più breve dell'impianto CIW, e l'anestesia per inalazione consente di controllare con precisione e ridurre il tempo in cui il topo rimane sedato. - Posizionare il mouse su una cornice stereotassica e fissare la testa con due barre auricolari e un morsetto naso. Controllare la profondità dell'anestesia con la mancanza di riflessi del pedale. Utilizzare una maschera di anestesia per la chirurgia stereotassica per mantenere il mouse sedato durante la procedura.
- Immergere un tampone di cotone in acetone e diffonderlo intorno al bordo del coperchio per ammorbidire la colla che tiene il coperchio contro il cervello.
- Far scorrere sottili pinze puntiformi sotto il coperchio per sollevarlo. Se il coperchio si rompe a questo punto, utilizzare le pinze per rimuovere i pezzi di vetro.
- Applicare il buffer di corteccia per mantenere il cervello umido.
- Immergere un ago 25 G nel tumore ad una profondità di 1 mm. Rimuovere l'ago e fermare l'emorragia, se necessario, applicando una spugna sterile di gelatina.
NOTA: Questo passaggio può essere eseguito sotto uno stereomicroscopio fluorescente per identificare con maggiore precisione l'area tumorale (se il tumore è troppo piccolo). Inoltre, durante la puntura può essere iniettata una soluzione di 1 ll di polistirolo fluorescente 1 m per identificare l'area biopsied. - Sigillare la superficie cerebrale con olio di silicone e incollare un coperchio 6 mm sulla parte superiore.
- Sedare il topo utilizzando l'anestesia di inalazione isoflurano come descritto in precedenza nel passaggio 2.1.1.
4. Immagini ripetute
- Un giorno dopo aver inflitto la lesione simile alla biopsia (e in giorni consecutivi se necessario), ripetere l'imaging intravitale come descritto nel passo 2 sopra per valutare come cambia il comportamento delle cellule tumorali nel tempo. Selezionare diverse posizioni del tumore che sarebbero rappresentative dell'intera area tumorale.
NOTA: Se sono state utilizzate perline fluorescenti per identificare l'area biopsied, localizzarle in base al comportamento delle cellule tumorali delle immagini nelle regioni sottoposte a biopsia rispetto alle regioni non biopsied.
5. Analisi delle immagini
- Se le immagini time-lapse sono state acquisite manualmente, combinarle in un'unica cartella.
- Aprire il file LIF time-lapse nel software commerciale associato al microscopio (ad esempio, LasX o LAS AF). Selezionare la scheda Processo > Strumenti processo > Unisci. Selezionare la prima immagine della sequenza temporale e fare clic su Prima. Selezionare la seconda immagine della sequenza temporale e fare clic su Seconda. In Unisci quoteselezionare t per il tempo. Fare clic su Applica. Verrà generato un nuovo file con due timepoint. Ripetere questo processo per tutti i punti temporali, utilizzando il file appena generato come prima immagine della sequenza.
- Correggere gli stack zacquisiti per qualsiasi spostamento xyz.
NOTA: per gli esperimenti descritti in questo protocollo, per la correzione è stato utilizzato un programma software Visual Basic personalizzato. In alternativa, è possibile utilizzare altri software disponibili, come ImageJ o Imaris.- Esportare i file TIFF dal software facendo clic con il pulsante destro del mouse sul file time-lapse unito. Selezionare Salva dati RAW. I file esportati verranno esportati in una cartella denominata in base al canale, al tempo e alla posizione z.
- Aprire i file TIFF nel programma software Visual Basic progettato su misura.
- Definire il numero di punti temporali, z-stack e canali.
- Assegnare un colore a ciascun canale in base all'ordine di visualizzazione.
- Nel pannello Presentazione moduli, per ogni timepoint, correggi lo spostamento nella z facendo clic sui pulsanti su (U) o giù (D).
- Nel pannello Costruzione di immagini intravitali, selezionare il canale da utilizzare per correggere lo spostamento xy. Selezionare il canale verde da correggere, in base al segnale proveniente dalle cellule tumorali. Fare clic su Automatico per la correzione xy.
- Esportare le immagini corrette come proiezione massima di tre z-stack consecutivi. Nel pannello Selezione, introdurre i numeri della prima (Begin) e dell'ultima sezione (Fine) zda esportare. Selezionare Max. Selezionare Separa cartelle per . Fare clic su Fai. Per ognuno di essi, tre z-stacks, le immagini time-lapse verranno esportate in una cartella separata.
- Facoltativamente, correggere la deformazione elastica del tessuto.
NOTA: Per gli esperimenti di deformazione elastica dei tessuti, è stato utilizzato un programma software di compensazione del movimento per correggere la deformazione del tessuto rigido ed elastico14. - Traccia singole celle nella z-stack completa nel filmato time-lapse.
NOTA: Le cellule tumorali possono essere tracciate manualmente utilizzando, ad esempio, un plug-in ImageJ (MTrackJ). Anche se preciso, questo è limitato al piano xy e richiede molto tempo. In alternativa, le cellule tumorali possono essere tracciate automaticamente per tutto l'intero volumez, utilizzando la segmentazione delle cellule tumorali (ad esempio, il software Imaris). Tuttavia, nei tumori altamente densi, il tracciamento automatico è meno preciso e può dare origine a più errori di tracciamento.- Aprire e tracciare ogni serie time-lapse (per tre z-stack consecutivi) separatamente. Trascinare la cartella contenente le immagini time-lapse su ImageJ.
- Selezionare la scheda Plugin > Tracciamento > MtrackJ. Tieni traccia di ogni singola cella selezionando Aggiungi e facendo clic su ogni cella ad ogni punto temporale.
- Estrarre la misura delle tracce facendo clic su Misura e salvando il file.
Representative Results
Per valutare l'impatto della biopsia sul comportamento delle cellule tumorali del cervello, abbiamo eseguito la procedura descritta in questo protocollo. Leoma -cellule GL261 - che esprimono una proteina fluorescente nucleare (H2B-Dendra2) sono state iniettate nel cervello dei topi C57BL/6, e una CIW cronica è stata impiantata. L'imaging intravitale time-lapse è stato eseguito sullo stesso infortunio al tumore pre e post-biopsia del caso (Figura 1A, B). La migrazione delle singole cellule tumorali è stata determinata tracciando il percorso di migrazione nel tempo in diversi piani xy dello z-stack (Figura 1C) e tracciata come percentuale di cellule migratorie pre e postbiopsia (Figura 1F). Il tasso di proliferazione delle cellule tumorali è stato quantificato in base alla condensazione Dendra2 con etichettata con H2B sulla mitosi (Figura 1D) e tracciata come percentuale di divisione delle cellule prima e postbiopsia (Figura 1E). Abbiamo confrontato la distribuzione della velocità di migrazione prima e dopo la biopsia nello stesso tumore e abbiamo scoperto che il numero di cellule migratorie (velocità > 4 m/h) è aumentato dopo l'intervento, con una diminuzione associata del numero di cellule slow/non migratorie ( velocità < 4 m/h) (Figura 2A). In media per tumore, abbiamo osservato un aumento di 1,75 (SD - 0,16) di altezza della percentuale di cellule migratorie quando è stata eseguita una lesione simile alla biopsia, rispetto ai topi di controllo che non sono stati biopsiati (Figura2B). Abbiamo monitorato il comportamento delle cellule tumorali per un'altra settimana e abbiamo scoperto che, sebbene la percentuale di cellule tumorali migratorie sia diminuita sia nei topi di controllo che in quelli biopsiati, i topi biopsiati mostravano ancora una maggiore capacità migratoria rispetto ai topi di controllo ( Figura 2C). L'analisi del comportamento proliferativo delle cellule tumorali nel tempo ha mostrato un aumento di 1,52 (SD - 0,26) di fold nel numero di eventi mitotici su biopsia, rispetto ai topi di controllo non biopizzati (Figura 2D).
Per verificare se gli effetti osservati della biopsia sul comportamento delle cellule tumorali proliferative e migratoria era un artefatto dovuto alla chirurgia di sostituzione CIW (richiesto per eseguire una lesione simile alla biopsia), abbiamo monitorato il comportamento delle cellule tumorali in un gruppo di topi che hanno subito CIW sostituzione senza biopsia. In questo gruppo, non abbiamo osservato alcuna induzione della migrazione o proliferazione delle cellule tumorali, indicando che l'aumento della proliferazione delle cellule tumorali e dei tassi di migrazione sono stati specificamente innescati da lesioni simili alla biopsia (Figura 3A, B).
La fotoconvertibilità stabile della proteina fluorescente Dendra2 consente di studiare l'infiltrazione delle cellule tumorali per diversi giorni. Dopo l'esposizione alla luce ultravioletta/blu, Dendra2 è irreversibilmente commutato dal verde al rosso. Utilizzando questa proprietà, una regione quadrata del tumore è stata illuminata e le cellule tumorali che esprimono Dendra2 da 200 dollari sono state fotomarcate prima della biopsia (Figura 4). Un giorno dopo la biopsia, abbiamo rilocalizzato la regione foto-commutata e misurato il volume delle cellule tumorali che si erano infiltrate nel tessuto tumorale circostante. Abbiamo scoperto che l'area di infiltrazione era 1,72 (SD - 0,41) volte più grande nei tumori dopo una lesione simile a una biopsia rispetto ai tumori di controllo non biopsiati (Figura 4). Sebbene questo approccio fornisca solo informazioni sul comportamento infiltrativo delle massa tumorali e non su un singolo livello di cellula, è meno dispendioso in termini di tempo rispetto all'approccio di imaging time-lapse e può essere il metodo di scelta per domande di ricerca incentrate esclusivamente su studiare il comportamento infiltrativo.
Figura 1: Configurazione sperimentale per l'imaging intravitale longitudinale dell'effetto biopsia sul comportamento delle cellule tumorali. (A) Diagramma che mostra il design dell'anello e del supporto magnetico. (B) Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale. Le cellule tumorali vengono iniettate nel cervello dei topi e viene stabilito un CIW. Dopo lo sviluppo del tumore, viene eseguita una prima sessione di imaging time-lapse (prebiopsy). Il giorno successivo, vengono implementate la biopsia e la sostituzione del CIW. Il giorno dopo l'imaging (postbiopsy), viene eseguita una seconda sessione di imaging time-lapse. Per gli effetti a lungo termine, possono essere eseguite sessioni di imaging successive. (C) Le immagini mostrano istantanee rappresentative di un film time-lapse in cui sono state tracciate le cellule tumorali GL2B1 H2B-Dendra2. Le linee rosse raffigurano singole tracce di cellule tumorali. La barra della scala (50m. (D ) Rappresentante nelle immagini time-lapse vivo che mostrano le cellule che si dividono nei tumori GL2B1 H2B-Dendra2. Sono indicate diverse fasi della mitosi: profase (P), prometafase (Pm), metafase (M), anafase (A) e telofase (T). La barra della scala è di 50 m. I grafici indicano la percentuale di (E) migratoria e (F) che divide le celle prima e postbiopsia. Ogni punto indica la percentuale di cellule migratorie in tutte le posizioni misurate in un singolo animale. I dati vengono visualizzati come media di sei topi (SezioneP < 0,01, t-test accoppiati). Questa cifra è stata modificata da Alieva et al.4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi che mostrano l'impatto della biopsia sulla migrazione delle cellule tumorali e sui tassi di proliferazione. (A) Grafici a cascata che mostrano il cambiamento nella distribuzione della velocità cellulare rispetto alla migrazione basale nei singoli topi. I dati sono indicati come media: S.E.M. di cinque topi. (B) Il numero di cellule migratorie in animali di controllo (blu) e biopsiaed (rosso) normalizzato al numero di preintervento delle cellule migratorie (n : 6 topi,P < 0.0001, studente-test). (C) Il comportamento delle cellule tumorali è stato monitorato per diversi giorni. Sono mostrati il numero normalizzato (relativo al preintervento) di cellule migratorie nei singoli topi nel tempo (n > 4 topi per condizione, . (D) Il numero normalizzato di cellule divisorie negli animali di controllo (blu) e biopsiaed (rosso). Per ogni singolo animale, i valori postintervento sono stati normalizzati ai valori preintervento (n - 5 topi,P < 0,01, Student's t-test). Questa cifra è stata modificata da Alieva et al.4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La sostituzione della CIW non ha alcun effetto sul comportamento delle cellule tumorali. L'imaging intravitale longitudinale mostra che la sostituzione del CIW senza biopsia non ha alcun effetto sui tassi di migrazione e proliferazione. (A) L'aumento del numero di cellule migratorie per le condizioni indicate. Ogni simbolo rappresenta la media di un singolo topo, e n- 4 topi. (B) L'aumento del numero di cellule proliferazione per le condizioni indicate. Ogni simbolo rappresenta la media di un singolo topo (n - 4 topi, P < 0,01, s.l.m. ) P < 0.001, ns , ANOVA non significativi e unidirezionali con Newman-Keuls post hoc test). Questa cifra è stata modificata da Alieva et al.4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Diagramma che mostra la configurazione sperimentale e i risultati rappresentativi ottenuti con la commutazione foto Dendra2. Per monitorare l'infiltrazione delle cellule tumorali dopo la biopsia, le cellule tumorali che esprimono Dendra2 sono foto-commutate in una regione quadrata dall'illuminazione luminosa UV/blu e immagini, 1 giorno prima della biopsia. Un giorno dopo la biopsia, la regione foto-switched viene rilocalizzata e ri-fotografata. Mostrate sono immagini Dendra2 rappresentative di infiltrazione delle cellule tumorali, corrette utilizzando la sottrazione del canale. La linea tratteggiata bianca rappresenta l'area di infiltrazione. La barra della scala è di 50 m. Il grafico mostra l'aumento dell'area fotocommutata per i topi biopsied (rosso) e di controllo (blu). Ogni punto rappresenta il valore mediodi un singolo topo (n - 5 mouse,P < 0,05, test tdi Student). Questa cifra è stata modificata da Alieva et al.4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Qui descriviamo un metodo per studiare i cambiamenti nel comportamento delle cellule tumorali a livello di singola cellula in risposta a procedure chirurgiche invasive, come una biopsia, nel cervello di un animale vivente. La combinazione di imaging multifotolino longitudinale con l'impianto chirurgico di una CIW cronica consente la quantificazione della migrazione delle cellule tumorali, l'invasione e la proliferazione prima e dopo la biopsia nello stesso animale4. Rispetto ad altri approcci utilizzati per il monitoraggio multigiorno del tumore, come l'imaging bioluminescente12, la risonanza magnetica10, la PET/CT11,questo metodo visualizza in modo univoco i tumori a livello di singola cellula e, pertanto, fornisce informazioni sul comportamento cellulare progressione tumorale sottostante.
Per eseguire correttamente questo metodo, è necessario padroneggiare diverse procedure. I passaggi più critici di questo protocollo sono l'impianto e la sostituzione CIW. La complessità tecnica di questi passaggi richiede precisione e abilità chirurgiche che possono essere acquisite con una formazione costante. Complicazioni durante l'intervento chirurgico CIW, come sanguinamento che può coprire la superficie del cervello, può rivelarsi impegnativo per l'imaging successivo. Una mancanza di strumenti sterili o ambiente, così come l'incapacità di sigillare completamente la superficie del cervello, può causare un'infezione sulla superficie del cervello (liquido bianco sotto il coperchio), che renderà l'imaging problematico e fortemente compromettere il risultante interpretazione. Un altro problema comune di questo protocollo è il movimento degli animali durante l'imaging time-lapse. Mentre qualsiasi spostamento xyz può essere corretto dopo l'esperimento, si consiglia di correggere la coordinata di ogni posizione prima di ogni punto temporale per evitare qualsiasi perdita di informazioni. La deformazione dei tessuti è un problema aggiuntivo riscontrato durante l'imaging al microscopio invertito. Tessuto cerebrale soffre di compressione quando il mouse è posizionato in posizione supina. A seconda del grado di deformazione dei tessuti, il tracciamento delle cellule tumorali può portare a una quantificazione errata dello spostamento cellulare. Per evitare questo, un software per la deformazione rigida ed elastica può essere utilizzato14.
Mentre questa procedura offre un'ampia applicazione per studiare i cambiamenti nel comportamento del tumore, alcune limitazioni dovrebbero essere considerate. Questo metodo consente agli scienziati di immaginare fino a una profondità di 1,6 mm (con l'uso di un oscillatore parametrico ottico); tuttavia, ciò significa che l'imaging è limitato alle aree superficiali della corteccia cerebrale15. Così, alcuni tumori cerebrali situati in strutture cerebrali profonde, tra cui gliomi pontine intrinseci diffusi situati nella regione del tronco encefalico, non possono essere studiati nel loro ambiente cerebrale originale con questo protocollo. Un'altra limitazione di questo protocollo è il volume del tumore che può essere imageta. Anche se la scansione totale del volume del tumore si desidera ottenere informazioni massime, spesso, la dimensione del tumore e la velocità delle cellule migratorie possono essere fattori limitanti. Per ogni tipo di tumore, è necessario considerare un time-lapse ottimale per l'imaging. Se l'intervallo di tempo tra le immagini è troppo lungo, potrebbe essere difficile tenere traccia delle cellule tumorali. L'uso di uno scanner risonante può ridurre notevolmente il tempo di scansione, consentendo l'imaging di un tumore più grande16. Infine, l'analisi manuale delle immagini di questo protocollo può richiedere molto tempo, quindi invece, è possibile utilizzare programmi per il monitoraggio 3D automatizzato. Tuttavia, il risultato del monitoraggio deve sempre essere sottoposto a supervisione visiva poiché gli algoritmi per il tracciamento automatico delle celle sono raramente progettati per ricapitolare esattamente la migrazione delle celle di interesse.
Piccoli adattamenti del protocollo qui descritto possono consentire una gamma ancora più ampia di applicazioni. Invece di eseguire biopsie, possono essere implementati altri interventi (chirurgici), come la resezione tumorale parziale o la consegna di wafer di chemioterapia. L'aggiunta di composti attraverso un microtubo impiantato chirurgicamente può essere combinata con questo protocollo per colpire farmacologicamente specifiche molecole di interesse. Ci aspettiamo che questo modello sarà utile negli studi che mirano ad analizzare l'impatto di un certo intervento sul comportamento delle cellule tumorali. La possibilità di eseguire misure ripetute nello stesso animale non solo fornisce dati più precisi sui cambiamenti che si verificano nel tumore, ma riduce anche notevolmente il numero di animali sperimentali necessari per ogni studio.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Anko de Graaff e l'Hubrecht Imaging Center per il loro supporto per l'imaging e Ellen Wehrens e Hannah Johnson per la revisione e la modifica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
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