Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur hochauflösenden Zeitraffer-Multiphotonen-Bildgebung von Hirntumorzellen vor und nach invasiven chirurgischen Eingriffen (z.B. Biopsie) innerhalb desselben lebenden Tieres. Diese Methode ermöglicht es, die Auswirkungen dieser invasiven chirurgischen Eingriffe auf das wandernde, invasive und proliferative Verhalten von Tumorzellen auf einer einzelnen Zellebene zu untersuchen.
Abstract
Biopsien sind Standard der Behandlung von Krebs und sind klinisch vorteilhaft, da sie eine solide Tumordiagnose, Prognose und personalisierte Behandlungsbestimmung ermöglichen. Jedoch, Störung der Tumorarchitektur durch Biopsie und andere invasive Verfahren wurde mit unerwünschten Auswirkungen auf die Tumorprogression verbunden, die gründlich untersucht werden müssen, um den klinischen Nutzen dieser Verfahren weiter zu verbessern. Herkömmliche statische Ansätze, die nur eine Momentaufnahme des Tumors liefern, sind in ihrer Fähigkeit eingeschränkt, die Auswirkungen der Biopsie auf das Verhalten von Tumorzellen wie Migration aufzudecken, ein Prozess, der eng mit Tumormalignität zusammenhängt. Insbesondere die Tumorzellmigration ist der Schlüssel bei hochaggressiven Hirntumoren, bei denen die lokale Tumorverbreitung eine totale Tumorresektion praktisch unmöglich macht. Die Entwicklung von Multiphotonenbildgebung und chronischen Bildgebungsfenstern ermöglicht es Wissenschaftlern, diesen dynamischen Prozess bei lebenden Tieren im Laufe der Zeit zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Methode zur hochauflösenden Längsbildgebung von Hirntumorzellen vor und nach einer Biopsie bei demselben lebenden Tier. Dieser Ansatz ermöglicht es, die Auswirkungen dieses Verfahrens auf das Verhalten von Tumorzellen (Migration, Invasion und Proliferation) zu untersuchen. Darüber hinaus diskutieren wir die Vorteile und Grenzen dieser Technik sowie die Fähigkeit dieser Methode, Veränderungen im Krebszellverhalten für andere chirurgische Eingriffe zu untersuchen, einschließlich Tumorresektion oder die Implantation von Chemotherapien. Wafer.
Introduction
Der Standard der Pflege für die meisten soliden Tumoren umfasst Gewebebiopsie zur Diagnose, Prognose und personalisierte Behandlungsbestimmung1,2. Insgesamt bieten diese Verfahren klinischen Nutzen, aber neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Biopsie und andere invasivere Verfahren, wie die Tumorresektion, auch die Tumorprogression negativ beeinflussen können3,4,5 , 6. Während diese Verfahren nach wie vor unverzichtbar sind und ihre Vorteile ihre negativen Auswirkungen überwinden, ist es notwendig, die Mechanismen hinter diesen negativen Auswirkungen vollständig zu verstehen, um die Sicherheit der Patienten und die positive Einflüsse dieser Verfahren und machen sie noch klinisch vorteilhafter.
Biopsievermittelte unerwünschte Auswirkungen auf die Tumorprogression werden durch systemische Veränderungen und Veränderungen in der Tumormikroumgebung als Reaktion auf Gewebestörungen ausgelöst4,5. Daher ist es notwendig, diesen Prozess bei lebenden Tieren zu untersuchen. Die subtilen Folgen dieser minimalinvasiven Eingriffe können jedoch oft durch große Unterschiede zwischen Individuen verschleiert werden. Herkömmliche Methoden, die auf Immunhistochemie oder Transkriptionsanalyse basieren, können diese Effekte übersehen oder eine große Anzahl von Tieren erfordern, um sie zu identifizieren. Darüber hinaus fehlt es diesen statischen Ansätzen an der Fähigkeit, Veränderungen im Tumorzellverhalten wie Migration und Invasion, dynamische Prozesse, die mit Tumormalignität korrelieren, zu identifizieren. Diese Tumorzellmerkmale sind von besonderer Bedeutung für hochaggressive Hirntumoren wie Glioblastom multiforme (GBM), wo die lokale Ausbreitung von Tumorzellen die chirurgische Resektion einschränkt und das Überleben des Patienten verringert7. Um vollständig zu verstehen, wie Biopsien das Verhalten von GBM-Zellen beeinflussen, ist ein Längsschnittansatz erforderlich, der die Visualisierung dieser Zellen im physiologischen Kontext lebender Organismen ermöglicht.
Die jüngste Entwicklung einer hochauflösenden intravitalen Bildgebung in Kombination mit chirurgisch implantierten chronischen Bildgebungsfenstern ermöglicht es Wissenschaftlern, das dynamische Verhalten von Tumorzellen bei lebenden Mäusen über mehrere Tage zu untersuchen8,9. Mit diesem leistungsstarken Ansatz können wir untersuchen, wie sich das proliferative, wandernde und infiltrative Verhalten von Tumorzellen über mehrere Tage als Reaktion auf eine Biopsie in derselben Maus ändert. Im Vergleich zu anderen Techniken, die eine mehrtägige Überwachung von Tumoren bei lebenden Mäusen ermöglichen, wie Magnetresonanztomographie (MRT)10, Positronenemissionstomographie/Computertomographie (PET/CT)11oder biolumineszierende Ansatz bietet auf einzigartige Weise die Möglichkeit, das Verhalten der Tumorzelle auf Einzelzellebene zu untersuchen und subtile Veränderungen innerhalb des Tumors zu entwirren.
Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Durchführung biopsieähnlicher Verletzungen und einer prä- und postbiopsielichen Längs-Intravital-Bildgebung im Gehirn tumortragender Mäuse. Diese Methode kann möglicherweise angewendet werden, um andere chirurgische Eingriffe zu untersuchen, wie z. B. die partielle Tumorresektion oder die Implantation von Chemotherapie-Wafern.
Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Tierschutzkomitees der Königlich Niederländischen Akademie der Künste und Wissenschaften, Niederlande, durchgeführt. Die in diesem Manuskript verwendeten experimentellen Protokolle wurden von der Centrale Commissie Dierproeven (CCD) und der Instantie voor Dierenwelzijn (IvD) genehmigt.
1. Tumorzellimplantation und cranial imaging Fenstervorbereitung
- Chirurgische Präparation
- Verwenden Sie erwachsene Mäuse (>6 Wochen alt) einer Sorte oder eines Geschlechts. Sedate eine Maus durch Injektion (Fluanison [neuroleptisch] + Fentanyl [Opioid]) (0,4 ml/kg) + Benzodiazepin-Beruhigungsmittel (2 mg/kg) in einer Dosis von 1:1:2 in sterilem Wasser. Bewerten Sie den Sedierungszustand des Tieres durch Zehenprellung.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurden sowohl weibliche als auch männliche C57BL/6-Mäuse aufgrund des gleichen genetischen Hintergrunds der Tumorzelllinie verwendet, die in diesen Experimenten verwendet wurde (GL261). Die Maus bleibt 1,5 h vollständig sediert. Alternativ verwenden Sie Inhalationsanästhesie wie Isofluran (1,5%–2% Isofluran/O 2-Mischung). - Montieren Sie die Maus auf einem stereotaktischen Rahmen und sichern Sie den Kopf mit einer Nasenklammer und zwei Ohrstangen.
- Verwenden Sie eine Heizlampe, um die Körpertemperatur zu erhalten. Heizlampe sollte mit Vorsicht verwendet werden, alternativ Wasser umlaufende Heizkissen verwendet werden können.
- Tragen Sie augensalben auf, um die Hornhäuten der Maus vor dem Trocknen zu schützen.
- Verwenden Sie scharfe Schere, um das Fell auf dem Schädel zu rasieren (dorsaler Bereich von den Augen der Maus bis zur Basis des Schädels) und desinfizieren Sie die exponierte Haut mit 70% Ethanol.
- Schneiden Sie die Haut in einer kreisförmigen Weise mit scharfer Schere und kratzen Sie das Periost darunter mit einem Wattestäbchen weg. Tragen Sie einen Tropfen Lidocain 1% + Adrenalin 1:100,000 für 5 min auf, und entfernen Sie den Überschuss mit einem Wattestäbchen.
- Kleben Sie die Ränder der Haut mit Cyanoacrylatkleber an den Schädel.
- Platzieren Sie den stereotaktischen Rahmen unter einem Sezier-Stereomikroskop mit 4-facher Vergrößerung.
- Visualisieren Sie den Schädel durch das Seziermikroskop und bohren Sie eine kreisförmige Nut von 5 mm Durchmesser über den rechten Parietalknochen. Führen Sie diesen Schritt sorgfältig und nur oberflächlich aus, um jeglichen Druck auf den Schädel zu vermeiden.
- Tragen Sie einen Tropfen Kortexpuffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glukose, 10 mM HEPES Puffer, 2 mM MgSO4und 2 mM CaCl2 [pH 7.4]) auf und heben Sie die Knochenklappe mit dünnen Zangen an.
- Für die folgenden Schritte, halten Sie die Gehirnoberfläche mit Kortexpuffer bedeckt, sofern nicht anders angegeben.
- Visualisieren Sie unter dem Seziermikroskop die Gehirnoberfläche und entfernen Sie die Dura mater mit einer gekrümmten, verjüngten, sehr feinen Punkt-Pinzette. Wenn in diesem Stadium Blutungen auftreten, verwenden Sie einen resorbierbaren Gelatineschwamm, um ihn zu stoppen.
- Verwenden Sie erwachsene Mäuse (>6 Wochen alt) einer Sorte oder eines Geschlechts. Sedate eine Maus durch Injektion (Fluanison [neuroleptisch] + Fentanyl [Opioid]) (0,4 ml/kg) + Benzodiazepin-Beruhigungsmittel (2 mg/kg) in einer Dosis von 1:1:2 in sterilem Wasser. Bewerten Sie den Sedierungszustand des Tieres durch Zehenprellung.
- Tumorzellinjektion
- Setzen Sie die gewünschte Menge an fluoreszierenden Tumorzellen in 3 L PBS aus (z. B. wurden für die in diesem Protokoll gezeigten Experimente 1 x 105 GL261-Zellen injiziert).
HINWEIS: Während jeder fluoreszierende Marker verwendet werden kann, wird einem Kernmarker dringend empfohlen, einzelne Tumorzellen während der Analyse zu verfolgen. Zusätzlich kann ein histongebundener Fluoreszenzmarker, wie H2B, verwendet werden, um Chromosomenkondensation zu visualisieren und damit die Zellteilung zu überwachen. Die Verwendung eines fotoschaltbaren Markers, wie Dendra2, ermöglicht die Fotomarkierung und Verfolgung von Tumorzellen über mehrere Tage4,13. - Laden Sie die Tumorzellen in eine gasdichte Spritze im 10-L-L-Stil mit einer Point Style 2 Nadel und fixieren Sie sie am stereotaxic-Manipulatorarm.
- Entfernen Sie den Kortexpuffer. Legen Sie die Spitze der Spritze in die Mitte der Kraniotomie und legen Sie sie in einer Tiefe von 0,5 mm von der Schädeloberfläche ein. Optional, erstellen Sie einen kleinen Raum im Gehirn, um die Tumorzellsuspension unterzubringen. Legen Sie die Spritze dazu bis zu einer Tiefe von 1 mm ein und holen Sie sie dann bis zu 0,5 mm vor der Injektion ab.
- Wenden Sie einen Tropfen Kortexpuffer an.
- Injizieren Sie die Zellsuspension langsam mit einem Mikrospritzenpumpeninjektor (250–400 nL/min). Entfernen Sie die Spritze und verwenden Sie einen resorbierbaren Gelatineschwamm, um ggf. Blutungen zu stoppen.
- Setzen Sie die gewünschte Menge an fluoreszierenden Tumorzellen in 3 L PBS aus (z. B. wurden für die in diesem Protokoll gezeigten Experimente 1 x 105 GL261-Zellen injiziert).
- Cranial Imaging Fenstervorbereitung
- Entfernen Sie den Kortexpuffer und legen Sie einen Tropfen Silikonöl auf die Craniotomie-Stelle, um Luftblasen unter dem Fenster zu vermeiden.
- Versiegeln Sie das freigelegte Gehirn mit einem 6 mm Coverslip. Cyanoacrylatkleber zwischen dem Coverslip und dem Schädel auftragen. Drücken Sie vorsichtig den Deckelrutsch gegen den Schädel mit Hilfe einer feinen Pinzette, um einen minimalen Abstand zwischen dem Gehirn und dem Coverslip zu gewährleisten.
- Tragen Sie Dental-Acrylzement auf die Schädeloberfläche auf und bedecken Sie den Rand des Deckels. Legen Sie einen dünnen Edelstahlring (1,5 mm Außendurchmesser, 1 mm Innendurchmesser) um die Kraniotomie und lassen Sie den Zahnzement trocknen. Optional fügen Sie etwas Kleber auf dem Rahmen hinzu, um den Ring auf der Oberseite des Kopfes zu sichern.
HINWEIS: Dieses Kopfbefestigungssystem ist optimal für die Bildgebung auf einem invertierten Mikroskop: Kleine Magnete, die in die Bildbox eingebettet sind, erleichtern die Fixierung des Schädelbildfensters (CIW). In den in diesem Protokoll gezeigten Experimenten wurde ein invertiertes Mikroskop verwendet. Bei aufrechten Mikroskopen kann die Fixierung durch einen Stab oder einen Ring mit Nuten erreicht werden, die mit Hilfe von Schrauben oder einer Platte, die zum Ring passt, am Mikroskop befestigt werden können. - Zur Schmerztherapie eine Einzeldosis von 100 g/kg Buprenorphin subkutan injizieren und das Tier auf einem Heizkissen erholen können.
- Legen Sie die Maus zur Anreicherung in einen individuellen Käfig mit geschreddertem Papier. Überwachen Sie die Maus täglich für die ersten Tage und 2x pro Woche, danach, auf normales Verhalten, Reaktivität und Aussehen.
2. Intravitale Bildgebung
HINWEIS: Das Zeitintervall zwischen der Tumorzellinjektion und der ersten intravitalen Bildgebungssitzung hängt von der Art der verwendeten Tumorzelllinie ab. Für die in diesem Protokoll gezeigten Experimente wurden 1x 105 GL261 Zellen injiziert und 10 Tage später abgebildet.
- Bildgebende Zubereitung
- Sedate die Maus mit Isofluran-Inhalationsanästhesie durch eine Gesichtsmaske (1,5%–2% Isofluran/O 2-Mischung).
- Injizieren Sie die Maus subkutan mit 100 L Saline-Puffer, um Eine Dehydrierung zu verhindern.
HINWEIS: Für die Langzeitbildgebung kann die Maus über eine subkutane Infusionspumpe hydratisiert werden. - Legen Sie die Maus nach oben in eine Bildbox. Verwenden Sie eine Metallplatte mit einem Loch mit 1 mm Durchmesser und kleinen Magneten, die um die Blende eingebettet sind, um die Fixierung des CIW an der Bildbox zu gewährleisten. Isofluran durch eine Gesichtsmaske einführen und durch einen Auslass auf der anderen Seite der Box belüften (0,8%–1,5% Isofluran/O 2-Mischung). Optional verwenden Sie Band, um den Körper der Maus zu fixieren.
HINWEIS: Fluoreszierend dextran zur Visualisierung von Blutgefäßen oder anderen Farbstoffen kann an dieser Stelle intravenös injiziert werden. - Optional verwenden Sie ein Pulsoximeter und eine Heizsonde, um die Vitalität der Maus zu überwachen.
HINWEIS: In diesem Experiment war es nicht notwendig, ein Pulsoximeter und eine Heizsonde zu verwenden, da die Maus während des gesamten Bildzeitraums (2–3 h) stabil war. Für längere Bildgebungszeiten kann jedoch eine gründlichere Überwachung erforderlich sein. - Stellen Sie das 25x (z.B. HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm) Wasserobjektiv auf die niedrigste z-Position ein und fügen Sie einen großen Tropfen Wasser hinzu.
HINWEIS: Die Verwendung eines Wasser-Immersion-Mikrospenders ist für Langzeitexperimente sehr zu empfehlen, da er es Wissenschaftlern ermöglicht, während des Experiments Wasser hinzuzufügen. Alternativ kann ein trockenes Objektiv verwendet werden. - Übertragen Sie die Bildbox auf das Mikroskop, das mit einer dunklen Klimakammer ausgestattet ist, die bei 37 °C gehalten wird. Bringen Sie das Objektiv auf den CIW-Deckel, bis der Wassertropfen es berührt.
- Beobachten Sie den Tumor im Epifluoreszenzmodus durch das Okular und rücken Sie die Zellen in den Fokus.
- Zeitraffer-Bildaufnahme
- Wählen Sie mehrere Positionen aus, die für das Bild von Interesse sind, und zeichnen Sie deren Koordinaten in der Software auf. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Positionen repräsentative Positionen von verschiedenen Stellen des Tumors sind (jeder Tumor kann unterschiedlich sein, aber um Konsistenz zu gewährleisten, wählen Sie die gleiche Menge an Positionen, die für den Tumorkern und die Ränder über alle Mäuse zentral sind).
HINWEIS: Es kann ein Kachelscan eines Teils des Tumors oder des gesamten sichtbaren Tumors durchgeführt werden; Wenn der Tumor jedoch groß ist, erhöht diese Methode den Zeitraffer zwischen den Bildern. Darüber hinaus, wenn die Tumorzellen schnell bewegen, kann es schwierig sein, die gleichen Zellen im Laufe der Zeit zu verfolgen. - Wechseln Sie in den Multiphotonenmodus und stimmen Sie den Laser auf die richtige Wellenlänge ab. Beachten Sie, dass zur Vermeidung von Photoschäden höhere Wellenlängen gewünscht werden.
HINWEIS: Für die Dendra2-Bildgebung wurde eine Wellenlänge von 960 nm verwendet. Mit dem in diesen Experimenten verwendeten Ziel reichte ein Zoom von 1,3 aus, um eine gute Auflösung der Tumorkerne zu erhalten und einen repräsentativen Bereich des Tumors zu scannen. - Gehen Sie in den Live-Modus und definieren Sie einen z-Stack für jede Position, um das maximale Volumen von Tumorzellen zu erfassen, ohne die Auflösung der Tumorzelle zu beeinträchtigen. Definieren Sie die Schrittgröße zwischen den Bildern als 3 m.
- Verwenden Sie den bidirektionalen Modus, um die Scangeschwindigkeit zu erhöhen. Die Bildauflösung sollte mindestens 512 x 512 Pixel betragen.
- Erfassen Sie Bilder des Tumorvolumens an verschiedenen Positionen alle 20 min für 2 h. Fügen Sie dem Objektiv vor jeder Bildaufnahme Wasser hinzu.
HINWEIS: Zeitrafferbilder können automatisch erfasst werden, indem Sie den richtigen Zeitraffer in der Software einstellen. Die Maus kann sich jedoch bewegen, und die Position oder der z-Stack kann sich im Laufe der Zeit verschieben, was zu Datenverlusten führt. Daher wird empfohlen, den Zeitraffer manuell durchzuführen und xyz-Verschiebungen zwischen den Erfassungen zu überprüfen und anzupassen. - In diesem Schritt wechseln Sie optional den Dendra2-Leuchtstoffmarker fotoum.
HINWEIS: Im Gegensatz zur Zeitraffer-Bildgebung (die die Untersuchung der Eigenschaften einzelner Tumorzellen und ihrer Veränderung im Laufe der Zeit ermöglicht), wird dies die Untersuchung des Bereichs der Tumorzellinfiltration im Gehirn über mehrere Tage ermöglichen4. Eine ausführliche Erklärung dieses Schritts wird von Gligorijevic et al.13beschrieben. - Nachdem das letzte Bild aufgenommen wurde, entfernen Sie die Maus von der Bühne und lassen Sie sie auf einem Heizkissen erholen. Um eine Austrocknung zu verhindern, können 100 l Saline subkutan verabreicht werden. Legen Sie die Maus in ihren Käfig, bis die biopsieähnliche Verletzung durchgeführt wird.
- Wählen Sie mehrere Positionen aus, die für das Bild von Interesse sind, und zeichnen Sie deren Koordinaten in der Software auf. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Positionen repräsentative Positionen von verschiedenen Stellen des Tumors sind (jeder Tumor kann unterschiedlich sein, aber um Konsistenz zu gewährleisten, wählen Sie die gleiche Menge an Positionen, die für den Tumorkern und die Ränder über alle Mäuse zentral sind).
3. Biopsie-ähnliche Verletzungen und CIW-Ersatz
- Erstellen Sie eine biopsieähnliche Verletzung an der Tumorstelle 1 Tag nach der ersten Bildgebungssitzung.
HINWEIS: Alternativ kann ein anderes Verfahren, wie die partielle Tumorentfernung, durchgeführt werden.- Sedate die Maus mit Isofluran-Inhalationsanästhesie, wie zuvor in Schritt 2.1.1 beschrieben.
HINWEIS: Während injizierbare Anästhesie verwendet werden kann, ist dieses Verfahren kürzer als die CIW-Implantation, und inhalationsanästhesie ermöglicht es, genau zu steuern und die Zeit zu reduzieren, die die Maus sediert bleibt. - Legen Sie die Maus auf einen stereotaxic Rahmen und sichern Sie ihren Kopf mit zwei Ohrstangen und einer Nasenklemme. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch den Mangel an Pedalreflexen. Verwenden Sie eine Anästhesiemaske für stereotaxic Chirurgie, um die Maus während des Eingriffs sediert zu halten.
- Ein Wattestäbchen in Aceton einweichen und um den Rand des Coverslips verteilen, um den Kleber zu erweichen, der den Coverslip gegen das Gehirn hält.
- Schieben Sie dünne Punktzangen unter den Deckel, um ihn zu heben. Wenn der Deckelrutsch an dieser Stelle bricht, verwenden Sie die Zange, um die Glasstücke zu entfernen.
- Tragen Sie den Kortexpuffer auf, um das Gehirn feucht zu halten.
- Tauchen Sie eine 25 G Nadel in den Tumor bis zu einer Tiefe von 1 mm. Entfernen Sie die Nadel und stoppen Sie die Blutung, falls erforderlich, durch Auftragen einer Gelatine sterilen Schwamm.
HINWEIS: Dieser Schritt kann unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop durchgeführt werden, um den Tumorbereich genauer zu identifizieren (wenn der Tumor zu klein ist). Zusätzlich kann während der Punktion eine 1-L-Lösung aus fluoreszierendem Polystyrol mit 1 m injiziert werden, um den biopsied-Bereich zu identifizieren. - Versiegeln Sie die Hirnoberfläche mit Silikonöl und kleben Sie einen 6 mm Abdeckzettel auf die Oberseite.
- Sedate die Maus mit Isofluran-Inhalationsanästhesie, wie zuvor in Schritt 2.1.1 beschrieben.
4. Wiederholte Bildgebung
- Einen Tag nach der Biopsie-ähnlichen Verletzung (und an aufeinanderfolgenden Tagen, wenn nötig), wiederholen Sie intravitale Bildgebung, wie in Schritt 2 oben beschrieben, um zu beurteilen, wie sich das Verhalten der Tumorzelle im Laufe der Zeit ändert. Wählen Sie mehrere Positionen des Tumors aus, die für den gesamten Tumorbereich repräsentativ wären.
HINWEIS: Wenn fluoreszierende Perlen verwendet wurden, um das biopsied Gebiet zu identifizieren, lokalisieren Sie sie, um das Verhalten von Tumorzellen in den biopsied Regionen im Vergleich zu nicht-biopsied Regionen abzubilden.
5. Bildanalyse
- Wenn die Zeitrafferbilder manuell erfasst wurden, kombinieren Sie sie in einem Ordner.
- Öffnen Sie die Zeitraffer-LIF-Datei in der kommerziellen Software, die mit dem Mikroskop verbunden ist (z. B. LasX oder LAS AF). Wählen Sie die Registerkarte Prozess > Prozesswerkzeuge > Zusammenführenaus. Wählen Sie das erste Bild der Zeitsequenz aus, und klicken Sie auf Zuerst. Wählen Sie das zweite Bild der Zeitsequenz aus, und klicken Sie auf Zweite. Wählen Sie unter Dimensionen zusammenführen t für die Zeit aus. Klicken Sie auf Übernehmen. Es wird eine neue Datei mit zwei Zeitpunkten generiert. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Zeitpunkte, indem Sie die neu generierte Datei als erstes Abbild der Sequenz verwenden.
- Korrigieren Sie die erworbenen z-Stacks für jede xyz-Verschiebung.
HINWEIS: Für die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurde ein maßgeschneidertes Visual Basic-Softwareprogramm zur Korrektur verwendet. Alternativ kann auch andere verfügbare Software wie ImageJ oder Imaris verwendet werden.- Exportieren Sie die TIFF-Dateien aus der Software, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die zusammengeführte Zeitrafferdatei klicken. Wählen Sie RAW-Daten speichernaus. Die exportierten Dateien werden in einen Ordner exportiert, der nach Kanal, Zeit und z-Position benannt ist.
- Öffnen Sie die TIFF-Dateien im benutzerdefinierten Visual Basic-Softwareprogramm.
- Definieren Sie die Anzahl der Zeitpunkte, z-Stacks und Kanäle.
- Weisen Sie jedem Kanal eine Farbe nach der Reihenfolge der Darstellung zu.
- Korrigieren Sie im Formularanzeigefenster für jeden Zeitpunkt die Verschiebung im z, indem Sie auf die Schaltflächen nach oben (U) oder unten (D) klicken.
- Wählen Sie im Intravital-Bildbaufenster den Kanal aus, der für die Xy-Verschiebung korrigiert werden soll. Wählen Sie den grünen Kanal aus, der korrigiert werden soll, basierend auf dem Signal der Tumorzellen. Klicken Sie auf Automatisch für die xy-Korrektur.
- Exportieren Sie die korrigierten Bilder als maximale Projektion von drei aufeinanderfolgenden z-Stacks. Geben Sie im Bedienfeld Auswahldie Zahlen der ersten (Begin) und der letzten (Ende) z-Slices vor, die exportiert werden sollen. Wählen Sie Max. Wählen Sie Separate Ordner für Z. Klicken Sie auf Do. Für jeden von ihnen werden drei z-Stacks, Zeitrafferbilder, in einen separaten Ordner exportiert.
- Optional, richtig für die elastische Verformung des Gewebes.
HINWEIS: Für Gewebe-elastische Verformungsexperimente wurde ein Match-Motion-Kompensations-Softwareprogramm verwendet, um starre und elastische Gewebeverformungen zu korrigieren14. - Verfolgen Sie einzelne Zellen im gesamten z-Stack im Zeitrafferfilm.
HINWEIS: Tumorzellen können manuell verfolgt werden, z. B. mit einem ImageJ-Plugin (MTrackJ). Obwohl genau, ist dies auf die xy-Ebene beschränkt und sehr zeitaufwändig. Alternativ können Tumorzellen automatisch über das gesamte z-Volumen verfolgt werden, indem Tumorzellsegmentierung (z.B. Imaris-Software) verwendet wird. Bei hochdichten Tumoren ist die automatische Nachverfolgung jedoch weniger genau und kann zu mehr Tracking-Fehlern führen.- Öffnen und verfolgen Sie jede Zeitrafferserie (für drei aufeinander folgende Z-Stacks) separat. Ziehen Sie den Ordner mit den Zeitrafferbildern auf ImageJ.
- Wählen Sie die Registerkarte Plugins > Tracking > MtrackJ. Verfolgen Sie jede einzelne Zelle, indem Sie Hinzufügen auswählen und auf jede Zelle zu jedem Zeitpunkt klicken.
- Extrahieren Sie das Maß der Spuren, indem Sie auf Messen klicken und die Datei speichern.
Representative Results
Um die Auswirkungen der Biopsie auf das Verhalten von Hirntumorzellen zu bewerten, haben wir das in diesem Protokoll beschriebene Verfahren durchgeführt. Glioma–GL261-Zellen – die ein kernfluoreszierendes Protein (H2B-Dendra2) exprozissen, wurden in das Gehirn von C57BL/6-Mäusen injiziert und ein chronisches CIW implantiert. Die intravitale Bildgebung wurde an der gleichen tierisch-vor- und postbiopsieähnlichen Schädigung des Tumors durchgeführt (Abbildung 1A,B). Die Migration einzelner Tumorzellen wurde bestimmt, indem der Migrationspfad im Laufe der Zeit in verschiedenen Xy-Ebenen des z-Stacks (Abbildung 1C) verfolgt und als Prozentsatz der Migrationszellen vor und nach der Biopsie dargestellt wurde (Abbildung 1F). Die Proliferationsrate der Tumorzellen wurde auf der Grundlage der Mitdenkkondensation des H2B-markierten Dendra2 bei Mitose quantifiziert (Abbildung 1D) und als Prozentsatz der teilenden Zellen vor und nach der Biopsie dargestellt (Abbildung 1E). Wir verglichen die Verteilung der Migrationsgeschwindigkeit vor und nach der Biopsie im selben Tumor und stellten fest, dass die Anzahl der Wanderzellen (Geschwindigkeit > 4 m/h) nach der Intervention zunahm, mit einer damit verbundenen Abnahme der Anzahl von langsam-/nicht-wandernden Zellen ( Geschwindigkeit < 4 m/h) (Abbildung 2A). Im Durchschnitt pro Tumor beobachteten wir einen 1,75 (SD = 0,16)-fachen Anstieg des Prozentsatzes der Wanderzellen, wenn eine biopsieähnliche Verletzung durchgeführt wurde, im Vergleich zu Kontrollmäusen, die nicht biopsied waren (Abbildung 2B). Wir überwachten das Verhalten von Tumorzellen eine weitere Woche lang und stellten fest, dass, obwohl der Anteil der wandernden Tumorzellen schließlich sowohl bei der Kontrolle als auch bei den biopsied Mäusen abnahm, die biopsied Mäuse immer noch eine höhere Migrationskapazität aufwiesen als die Kontrollmäuse ( Abbildung 2C). Die Analyse des proliferativen Verhaltens von Tumorzellen im Laufe der Zeit zeigte eine 1,52 (SD = 0,26) -fache Zunahme der Anzahl der mitotischen Ereignisse bei der Biopsie, relativ zu nichtbiopsied Kontrollmäusen (Abbildung 2D).
Um zu testen, ob die beobachteten Auswirkungen der Biopsie auf das proliferative und wandernde Verhalten von Tumorzellen ein Artefakt aufgrund einer CIW-Ersatzoperation waren (erforderlich, um eine biopsieähnliche Verletzung durchzuführen), überwachten wir das Verhalten von Tumorzellen in einer Gruppe von Mäusen, die CIW Ersatz ohne Biopsie. In dieser Gruppe beobachteten wir keine Induktion der Migration oder Proliferation von Tumorzellen, was darauf hindeutet, dass der Anstieg der Tumorzellproliferation und der Migrationsraten speziell durch biopsieähnliche Verletzungen ausgelöst wurden (Abbildung 3A, B).
Die stabile Photokonvertibilität des fluoreszierenden Proteins Dendra2 ermöglicht die Untersuchung der Tumorzellinfiltration über mehrere Tage. Bei Deremdra2 wird bei uvviolettem/blauem Licht irreversibel von grün auf rot umgeschaltet. Mit dieser Eigenschaft wurde ein quadratischer Bereich des Tumors beleuchtet und die Dendra2-exezierenden Tumorzellen wurden vor der Biopsie fotomarkiert (Abbildung 4). Einen Tag nach der Biopsie lokalisierten wir den fotovermittelten Bereich neu und maßen das Volumen der Tumorzellen, die in das umgebende Tumorgewebe eingedrungen waren. Wir fanden heraus, dass der Infiltrationsbereich bei Tumoren nach einer biopsieähnlichen Verletzung 1,72 (SD = 0,41) mal größer war als bei nichtbiopsied Kontrolltumoren (Abbildung 4). Obwohl dieser Ansatz nur Informationen über das infiltrative Verhalten von Tumorzellen und nicht auf einer einzelnen Zellebene liefert, ist er weniger zeitaufwändig als der Zeitraffer-Imaging-Ansatz und kann die Methode der Wahl für Forschungsfragen sein, die sich ausschließlich auf infiltratives Verhalten zu studieren.
Abbildung 1: Experimentelles Setup für die längsinterne intravitale Bildgebung des Biopsieeffekts auf das Verhalten von Tumorzellen. (A) Diagramm, das die Konstruktion des Rings und des Magnethalters zeigt. (B) Schematische Darstellung des experimentellen Workflows. Tumorzellen werden in das Gehirn von Mäusen injiziert und ein CIW etabliert. Bei der Tumorentwicklung wird eine erste (Präbiopsie) Zeitraffer-Bildgebung durchgeführt. Am nächsten Tag werden die Biopsie und der CIW-Ersatz implementiert. Am Tag nach der Bildgebung (Postbiopsie) wird eine zweite Zeitraffer-Bildgebung durchgeführt. Für Langzeiteffekte können nachfolgende Bildgebungssitzungen durchgeführt werden. (C) Bilder zeigen repräsentative Schnappschüsse eines Zeitrafferfilms, in dem GL261 H2B-Dendra2 Tumorzellen verfolgt wurden. Rote Linien zeigen einzelne Tumorzellspuren. Die Skala bar = 50 m. (D) Repräsentative in vivo Zeitrafferbilder, die Teilzellen in GL261 H2B-Dendra2-Tumoren anzeigen. Verschiedene Stadien der Mitose sind indiziert: Prophase (P), Prometaphase (Pm), Metaphase (M), Anaphase (A) und Telophase (T). Der Maßstabsbalken = 50 m. Graphen geben den Prozentsatz der (E) Migration und (F) Teilungszellen vor und nach der Biopsie an. Jeder Punkt gibt den Prozentsatz der Wanderzellen in allen Positionen an, die in einem einzelnen Tier gemessen werden. Die Daten werden als Mittelwert von sechs Mäusen (**P < 0,01, gepaart t-test) dargestellt. Diese Zahl wurde von Alieva et al.4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse, die die Auswirkungen der Biopsie auf die Tumorzellmigration und die Proliferationsraten zeigen. (A) Wasserfalldiagramme, die die Veränderung der Zellgeschwindigkeitsverteilung relativ zur Basalmigration bei einzelnen Mäusen anzeigen. Die Daten werden als Mittelwert von fünf Mäusen dargestellt. (B) Die Anzahl der kontrollierten (blauen) und biopsied (roten) Tiere normalisierte sich auf die Anzahl der Vorinterventionen von Zugzellen (n = 6 Mäuse, ***P < 0,0001, Schüler-t-Test). (C) Das Verhalten der Tumorzellen wurde über mehrere Tage verfolgt. Gezeigt werden die normalisierte (relativ zur Vorintervention) Anzahl der Migrationszellen in einzelnen Mäusen im Laufe der Zeit(n > 4 Mäuse pro Bedingung, ***P < 0,0001, zweiseitig ANOVA). (D) Die normalisierte Anzahl der teilenden Zellen unter Kontrolle (blau) und biopsied (rot) Tiere. Pro einzelnem Tier wurden die Werte nach der Intervention auf die Werte vor Intervention normalisiert (n = 5 Mäuse, **P < 0,01, Schüler-t-Test). Diese Zahl wurde von Alieva et al.4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: CIW-Ersatz hat keinen Einfluss auf das Verhalten von Tumorzellen. Die längsinale intravitale Bildgebung zeigt, dass der Ersatz des CIW ohne Biopsie keinen Einfluss auf die Migrations- und Proliferationsraten hat. (A) Die Zunahme der Anzahl der Wanderzellen für die angegebenen Bedingungen. Jedes Symbol stellt den Mittelwert einer einzelnen Maus dar, und n4 Mäuse. (B) Die Zunahme der Anzahl der sich ausbreitenden Zellen für die angegebenen Bedingungen. Jedes Symbol stellt den Mittelwert einer einzelnen Maus dar (nx 4 Mäuse, **P < 0,01,***P < 0,001, ns = nicht signifikant, einwegig ANOVA mit Newman-Keuls Post-hoc-Test). Diese Zahl wurde von Alieva et al.4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Diagramm, das den Versuchsaufbau und die repräsentativen Ergebnisse zeigt, die mit dem Dendra2-Fotowechsel erzielt wurden. Um die Tumorzellinfiltration nach der Biopsie zu überwachen, werden Dendra2-exezierende Tumorzellen in einem quadratischen Bereich durch UV/Blaue Lichtbeleuchtung fotogeschaltet und 1 Tag vor der Biopsie abgebildet. Einen Tag nach der Biopsie wird die fotovermittelte Region neu lokalisiert und neu abgebildet. Gezeigt werden repräsentative Dendra2-Bilder der Tumorzellinfiltration, die mit Kanalsubtraktion korrigiert werden. Die weiße gepunktete Linie stellt den Infiltrationsbereich dar. Der Maßstabsbalken = 50 m. Die Grafik zeigt die vergrößerte Foto-Switched-Fläche, die für biopsied (rote) und Kontrollmäuse (blau) gezeichnet wurde. Jeder Punkt stellt den Mittelwert einer einzelnen Maus dar (n5 Mäuse, *P < 0,05, Schüler-t-Test). Diese Zahl wurde von Alieva et al.4geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Hier beschreiben wir eine Methode, um Veränderungen im Verhalten von Tumorzellen auf Einzelzellebene als Reaktion auf invasive chirurgische Eingriffe, wie eine Biopsie, im Gehirn eines lebenden Tieres zu untersuchen. Die Kombination von Längs-Multiphotonen-Bildgebung mit der chirurgischen Implantation eines chronischen CIW ermöglicht die Quantifizierung von Tumorzellmigration, Invasion und Proliferation vor und nach der Biopsie im selben Tier4. Im Vergleich zu anderen Ansätzen, die für die Mehrtagesüberwachung von Tumoren verwendet werden, wie z. B. biolumineszierende Bildgebung12, MRT10oder PET/CT11, visualisiert diese Methode Tumore auf einer einzelzelligen Ebene und bietet somit Einblicke in das zelluläre Verhalten. zugrunde liegende Tumorprogression.
Um diese Methode erfolgreich auszuführen, sollten mehrere Prozeduren gemastert werden. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind die CIW-Implantation und der Austausch. Die technische Komplexität dieser Schritte erfordert Präzision und chirurgische Fähigkeiten, die mit stetiger Ausbildung erworben werden können. Komplikationen während der CIW-Operation, wie Blutungen, die die Gehirnoberfläche bedecken können, können sich als Herausforderung für die nachfolgende Bildgebung erweisen. Ein Mangel an sterilen Werkzeugen oder Umgebung, sowie das Versäumnis, die Gehirnoberfläche vollständig zu versiegeln, kann eine Infektion auf der Gehirnoberfläche verursachen (weiße Flüssigkeit unter dem Deckel), die die Bildgebung problematisch macht und die resultierenden auslegung. Ein weiteres häufiges Problem dieses Protokolls ist die Bewegung von Tieren während der Zeitraffer-Bildgebung. Während jede Xyzverschiebung nach dem Experiment korrigiert werden kann, wird empfohlen, die Koordinate jeder Position vor jedem Zeitpunkt zu korrigieren, um Informationsverluste zu verhindern. Die Gewebeverformung ist ein zusätzliches Problem, das bei der Bildgebung auf einem invertierten Mikroskop gefunden wird. Hirngewebe leidet unter Kompression, wenn die Maus in Supine-Position platziert wird. Je nach Grad der Gewebeverformung kann die Tumorzellverfolgung zu einer fehlerhaften Quantifizierung der Zellverschiebung führen. Um dies zu verhindern, kann eine Software für starre und elastische Verformung verwendet werden14.
Während dieses Verfahren eine breite Anwendung für die Untersuchung von Veränderungen im Tumorverhalten bietet, sollten bestimmte Einschränkungen in Betracht gezogen werden. Diese Methode ermöglicht es Wissenschaftlern, Bis zu einer Tiefe von 1,6 mm abzubilden (mit einem optischen parametrischen Oszillator); Dies bedeutet jedoch, dass die Bildgebung auf oberflächliche Hirnrindenbereiche beschränkt ist15. Daher können einige Hirntumoren, die sich in tiefen Gehirnstrukturen befinden, einschließlich diffuser intrinsischer Pontingliome, die sich in der Hirnstammregion befinden, mit diesem Protokoll nicht in ihrer ursprünglichen Gehirnumgebung untersucht werden. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist das Volumen des Tumors, der abgebildet werden kann. Obwohl das gesamte Tumorvolumenscannen gewünscht wird, um maximale Informationen zu erhalten, können Tumorgröße und die Geschwindigkeit von Migrationszellen oft einschränkende Faktoren sein. Für jeden Tumortyp muss ein optimaler Zeitraffer für die Bildgebung in Betracht gezogen werden. Wenn der Zeitrahmen zwischen den Bildern zu lang ist, kann es schwierig sein, die Tumorzellen zu verfolgen. Die Verwendung eines Resonanzscanners kann die Scanzeit stark verringern und die Bildgebung eines größeren Tumors ermöglichen16. Schließlich kann die manuelle Bildanalyse dieses Protokolls sehr zeitaufwändig sein, so dass stattdessen Programme für die automatisierte 3D-Verfolgung verwendet werden können. Das Ergebnis der Nachverfolgung sollte jedoch immer visuell überwacht werden, da Algorithmen für die automatisierte Zellverfolgung selten so konzipiert sind, dass sie genau die Migration der von Interesse interessierten Zellen rekapitulieren.
Leichte Anpassungen des hier beschriebenen Protokolls können ein noch breiteres Anwendungsspektrum ermöglichen. Anstelle von Biopsien können andere (chirurgische) Eingriffe durchgeführt werden, wie z. B. eine partielle Tumorresektion oder die Lieferung von Chemotherapie-Wafern. Die Zugabe von Verbindungen durch ein chirurgisch implantiertes Mikrorohr kann mit diesem Protokoll kombiniert werden, um spezifische Moleküle von Interesse pharmakologisch anzusprechen. Wir erwarten, dass dieses Modell in Studien nützlich sein wird, die darauf abzielen, die Auswirkungen eines bestimmten Eingriffs auf das Verhalten von Tumorzellen zu analysieren. Die Möglichkeit, wiederholte Maßnahmen am selben Tier durchzuführen, liefert nicht nur genauere Daten über Veränderungen im Tumor, sondern reduziert auch die Anzahl der Pro-Tier-Experimente, die pro Studie benötigt werden, erheblich.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Anko de Graaff und dem Hubrecht Imaging Center für ihre bildgebende Unterstützung und Ellen Wehrens und Hannah Johnson für das Korrekturlesen und Bearbeiten des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
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