Summary
Her beskriver vi en metode for høyoppløselig tidsforløp multiphoton avbildning av hjernetumor celler før og etter invasiv kirurgisk intervensjon (f.eks. biopsi) i det samme levende dyret. Denne metoden gjør det mulig å studere virkningen av disse invasive kirurgiske prosedyrer på tumorceller ' trekk, invasiv, og proliferativ atferd på et enkelt cellenivå.
Abstract
Biopsier er standard omsorg for kreft behandling og er klinisk gunstig som de tillater solid tumor diagnose, prognose, og personlig behandling besluttsomhet. Men forstyrrelsene av tumor arkitekturen ved biopsi og andre invasive prosedyrer har blitt assosiert med uønskede effekter på tumorprogresjon, som må bli studert i dybden for å ytterligere forbedre den kliniske nytten av disse prosedyrene. Konvensjonelle statiske tilnærminger, som bare gir et øyeblikksbilde av svulsten, er begrenset i sin evne til å avdekke virkningen av biopsi på tumor celle atferd som migrasjon, en prosess nært knyttet til tumor kreft. Spesielt tumor celle migrasjon er nøkkelen i svært aggressive hjernesvulster, der lokale tumor formidling gjør total tumor reseksjon praktisk talt umulig. Utviklingen av multiphoton tenkelig og kronisk tenkelig Vinduer innrømmer Naturvitenskapelig å studere denne drivkraft forarbeide inne lever dyrene over tid. Her beskriver vi en metode for høy oppløsning langsgående avbildning av hjernetumor celler før og etter en biopsi i samme levende dyr. Denne tilnærmingen gjør det mulig å studere virkningen av denne prosedyren på tumor celle atferd (migrasjon, invasjon og spredning). Videre diskuterer vi fordeler og begrensninger av denne teknikken, samt evnen til denne metodikken å studere endringer i kreftcelle atferden for andre kirurgiske inngrep, inkludert tumor reseksjon eller implantation av kjemoterapi Wafere.
Introduction
Standard for omsorg for de fleste solide svulster inkluderer vev biopsi for diagnose, prognose, og personlig behandling bestemmelse1,2. Samlet disse prosedyrene gir klinisk nytte, men nyere bevis indikerer at biopsi og andre mer invasive prosedyrer, slik som tumor reseksjon, kan også negativt påvirke tumorprogresjon3,4,5 , 6. selv om disse prosedyrene forblir uunnværlig i-pasientbehandling og deres fordeler overvinne sine negative virkninger, er det nødvendig å fullt ut forstå mekanismene bak disse negative effektene for å maksimere pasientenes sikkerhet og positive påvirkninger av disse prosedyrene og gjøre dem enda mer klinisk fordelaktig.
Biopsi-mediert uønskede effekter på tumorprogresjon utløses av systemiske endringer og endringer i tumor mikromiljøet som svar på vevs forstyrrelser4,5. Således, det er en på krevd å studere denne forarbeide inne bo dyrene. Imidlertid kan de subtile konsekvensene av disse minimalt invasive prosedyrer ofte være forkledd av store variasjoner mellom individer. Konvensjonelle metoder basert på immunhistokjemi eller transcriptional uttrykks analyse kan overse disse effektene eller kreve et stort antall dyr for å identifisere dem. Videre disse statiske tilnærminger mangler evnen til å identifisere endringer i tumor celle atferd som migrasjon og invasjon, dynamiske prosesser som samsvarer med tumor kreft. Disse tumor celle funksjoner er av særlig betydning for svært aggressive hjernesvulster, slik som glioblastom multiforme (GBM), hvor den lokale spredningen av tumorceller begrenser kirurgisk reseksjon og reduserer pasient overlevelse7. For fullt ut å forstå hvordan biopsier påvirker atferden til GBM-celler, er en langsgående tilnærming som tillater visualisering av disse cellene i den fysiologiske konteksten av levende organismer nødvendig.
Den nylige utviklingen av høyoppløselig intravital Imaging i kombinasjon med kirurgisk implantert kronisk Imaging Windows tillater forskere å studere den dynamiske atferden til tumorceller i levende mus over flere dager8,9. Ved hjelp av denne kraftige tilnærmingen, kan vi studere hvordan tumorceller ' proliferativ, trekk, og infiltrerende atferd endringer over flere dager som svar på en biopsi i samme mus. Sammenlignet med andre teknikker som tillater flere dagers overvåking av svulster i levende mus, for eksempel magnetisk resonans imaging (MRI)10, positron utslipp tomografi/beregnet TOMOGRAFI (pet/CT)11, eller Puerto Mosquito Imaging12, dette tilnærming unikt tilbyr muligheten for å studere tumor celle atferd på enkelt cellenivå og unraveling subtile endringer som forekommer i svulsten.
Her beskriver vi en detaljert metode for å utføre biopsi-lignende skade og pre-og postbiopsy langsgående intravital Imaging i hjernen av tumor-bærende mus. Denne metoden kan potensielt brukes til å studere andre kirurgiske inngrep, for eksempel delvis tumor reseksjon eller implantation av kjemoterapi wafere.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjene i Animal Welfare Committee av Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences, Nederland. De eksperimentelle protokollene som ble brukt i dette manuskriptet ble godkjent av Centrale Commissie Dierproeven (CCD) og Instantie voor Dierenwelzijn (IvD).
1. tumor celle implantation og skallen Imaging vindu forberedelse
- Kirurgisk forberedelse
- Bruk voksen mus (> 6 uker gammel) av enhver stamme eller kjønn. Sedate en mus ved å injisere (fluanisone [nevroleptisk] + fentanyl [opioider]) (0,4 mL/kg) + benzodiazepin beroligende middel (2 mg/kg) med en dose på 1:1:2 i sterilt vann. Vurdere dyrets sedasjon tilstand ved tå knipe.
Merk: i denne protokollen ble både kvinnelige og mannlige C57BL/6-mus brukt på grunn av den samme genetiske bakgrunnen til tumor cellelinjen som ble brukt i disse eksperimentene (GL261). Musa vil holde fullt bedøvet for 1,5 h. Alternativt kan du bruke innånding anestesi som isoflurane (1,5%-2% isoflurane/O2 blanding). - Monter musen på en stereotactic ramme og fest hodet ved hjelp av en nese klemme og to øre stenger.
- Bruk en oppvarmings lampe for å bevare kroppstemperaturen. Oppvarming lampe bør brukes med forsiktighet, alternativt vann resirkulering varme pads kan brukes.
- Påfør øyen salve for å beskytte muse hornhinner mot tørking.
- Bruk skarp saks til å barbere pelsen på skallen (rygg området fra musen øyne til bunnen av skallen) og desinfisere eksponert hud med 70% etanol.
- Skjær huden i en sirkulær måte med skarpe saks og skrape bort periosteum under med en bomullsdott. Påfør en dråpe lidokain 1% + adrenalin 1:100000 i 5 min, og fjerne overflødig med en bomullspinne.
- Lim kantene av huden til skallen med Cyanoacrylate lim.
- Plasser den stereotactic rammen under et disseksjon stereo mikroskop med 4X forstørrelse.
- Visualiser skallen gjennom disseksjon mikroskop og bore en sirkulær Groove på 5 mm i diameter over høyre parietal bein. Utfør dette trinnet nøye og bare overfladisk, unngå press på skallen.
- Påfør en dråpe cortex buffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukose, 10 mM HEPES buffer, 2 mM MgSO4, og 2 mm CaCl2 [pH 7,4]) og løft bein klaffen ved hjelp av tynne tang.
- For følgende trinn, holde hjernen overflaten dekket med cortex buffer med mindre annet er angitt.
- Under disseksjon mikroskop, visualisere hjernen overflaten og fjerne Dura mater bruker buet, konisk, veldig fine punkt pinsett. Hvis blødning oppstår på dette stadiet, bruk en absorberbare gelatin svamp for å stoppe det.
- Bruk voksen mus (> 6 uker gammel) av enhver stamme eller kjønn. Sedate en mus ved å injisere (fluanisone [nevroleptisk] + fentanyl [opioider]) (0,4 mL/kg) + benzodiazepin beroligende middel (2 mg/kg) med en dose på 1:1:2 i sterilt vann. Vurdere dyrets sedasjon tilstand ved tå knipe.
- Tumor celle injeksjon
- Resuspend ønsket mengde av fluorescerende tumorceller i ~ 3 μL av PBS (for eksempel for eksperimentene som vises i denne protokollen, 1 x 105 GL261 celler ble injisert).
Merk: mens noen fluorescerende markør kan brukes, en kjernefysisk markør er sterkt anbefalt, å spore individuelle tumorceller under analyse. I tillegg kan en histone-koblet fluorescerende markør, slik som H2B, brukes til å visualisere kromosom kondens og dermed å overvåke celledeling. Bruk av en foto-valgbar markør, slik som Dendra2, tillater Foto-merking og sporing av tumorceller over flere dager4,13. - Legg tumorcellene i en gass tett sprøyte på 10 μL med en spiss stil 2 nål og fest den på stereotaxic manipulator arm.
- Fjern cortex buffer. Plasser tuppen av sprøyten i midten av kraniotomi og sett den inn i en dybde på 0,5 mm fra overflaten av skallen. Alternativt kan du opprette en liten plass i hjernen for å imøtekomme tumor celle suspensjonen. For dette, sett sprøyten opp til en dybde på 1 mm og deretter hente den opp til 0,5 mm før injeksjon.
- Påfør en dråpe cortex buffer.
- Injiser langsomt celle fjæringen ved hjelp av en microsyringe pumpe injeksjons (250 – 400 nL/min). Fjern sprøyten og bruk en absorberbare gelatin svamp for å stoppe eventuelle blødninger, om nødvendig.
- Resuspend ønsket mengde av fluorescerende tumorceller i ~ 3 μL av PBS (for eksempel for eksperimentene som vises i denne protokollen, 1 x 105 GL261 celler ble injisert).
- Skallen Imaging vindu forberedelse
- Fjern cortex buffer og plassere en dråpe silikon olje på kraniotomi stedet for å unngå luftbobler under vinduet.
- Forsegle eksponert hjernen med en 6 mm dekkglass. Påfør Cyanoacrylate lim mellom dekkglass og skallen. Trykk forsiktig dekkglass mot skallen ved hjelp av fin pinsett for å sikre minimalt med avstand mellom hjernen og dekkglass.
- Påfør Dental akryl sement på hodeskallen overflate, dekker kanten av dekkglass. Plasser en tynn ring i rustfritt stål (1,5 mm i ytre diameter, 1 mm i indre diameter) rundt kraniotomi og la tann sement tørke. Alternativt kan du legge litt lim på grensen for å sikre ringen på toppen av hodet.
Merk: Dette hode fikserings systemet er optimalt for bildebehandling på et omvendt mikroskop: små magneter som er innebygd i bildebehandlings boksen, gjør det lettere å feste skallen. I eksperimentene som vises i denne protokollen, ble det brukt et omvendt mikroskop. For oppreist mikroskop kan fiksering oppnås ved hjelp av en bar eller en ring med riller som kan festes til mikroskopet ved hjelp av skruer eller en plate som passer til ringen. - For smertebehandling, injiserer du en enkelt dose med 100 μg/kg buprenorfin subkutant og lar dyret komme seg på en varmepute.
- Plasser musen i en individuell bur med revet papir for berikelse. Nøye overvåke musen daglig for de første dagene og 2x per uke, deretter, for normal oppførsel, reaktivitet, og utseende.
2. Intravital avbildning
Merk: tidsintervallet mellom tumor celle injeksjonen og den første intravital bildebehandlings økten er avhengig av hvilken type tumor cellelinje som brukes. For eksperimenter vist i denne protokollen, 1x 105 GL261 celler ble injisert og avbildet 10 dager senere.
- Klargjøring av avbildning
- Sedate musen ved hjelp av isoflurane innånding anestesi gjennom en ansiktsmaske (1,5%-2% isoflurane/O2 blanding).
- Injiser musen subkutant med 100 μL av saltvann buffer for å hindre dehydrering.
Merk: musen kan være hydrert gjennom en subkutan infusjons pumpe for lang tids bildebehandling. - Plasser musen med forsiden opp i en bilde boks. Bruk en metallplate med et hull med 1 mm diameter og små magneter som er innebygd rundt blenderåpningen for å sørge for fiksering av veiviseren i bilde boksen. Introduser isoflurane gjennom en ansiktsmaske og ventiler av en stikkontakt på den andre siden av esken (0,8% – 1,5% isoflurane/O2 blanding). Alternativt kan du bruke tape for å fikse kroppen av musen.
Merk: Fluorescensmerkete merket dextran for blodkar visualisering eller andre fargestoffer kan injiseres intravenøst på dette punktet. - Alternativt, bruk en impuls oximeter og en oppvarming sonde å dataskjerm det musen ' vitals.
Merk: i dette eksperimentet var det ikke nødvendig å bruke en puls oximeter og en oppvarmings sonde siden musen var stabil gjennom hele bilde tidsperioden (2 – 3 timer). Imidlertid, for lengere tenkelig timene, flere grundig avlytting kanskje behøves. - Sett 25x (for eksempel HCX IRAPO NA 0.95 WD 2,5 mm) vann objektiv til lavest z-posisjon og Legg til en stor dråpe vann.
Merk: bruk av en vann nedsenking mikro dispenser er sterkt anbefalt for langsiktige eksperimenter siden det tillater forskere å legge vann under eksperimentet. Alternativt kan et tørt objektiv brukes. - Overfør bilde boksen til mikroskopet som er utstyrt med et mørkt klima kammer holdt på 37 ° c. Bring målet til veiviseren for tilpasset dekkglass til vanndråpe berører den.
- Bruk epifluorescence modus, observere svulsten gjennom okularet og bringe cellene i fokus.
- Bildeinnhenting for tidsforløp
- Velg flere posisjoner som er interessante for bildet, og Registrer koordinatene i programvaren. Sørg for at de valgte stillingene er representative posisjoner fra ulike områder av svulsten (hver svulst kan være forskjellig, men for å sikre konsistens, velger du samme antall posisjoner som er sentrale i tumor kjernen og til kantene på tvers av alle mus).
Merk: en flis skanning av en del av svulsten eller av hele synlig svulst kan utføres; men hvis svulsten er stor, vil denne metoden øke tidsforløp mellom bildene. I tillegg, hvis tumorcellene beveger seg raskt, kan det være utfordrende å spore de samme cellene over tid. - Bytt til multiphoton modus og Juster laseren til riktig bølgelengde. Merk at for å unngå photoskade, er høyere bølgelengder ønsket.
Merk: for Dendra2 avbildning ble det brukt en 960 NM bølgelengde. Med målet som brukes i disse eksperimentene, en Zoom på 1,3 var tilstrekkelig til å få en god oppløsning av tumor kjerner og skanne et representativt område av svulsten. - Gå til live-modus og definere en z-stabel for hver posisjon for å erverve maksimalt volum av tumorceller uten å svekke tumor celle oppløsning. Definer trinn størrelsen mellom bildene som 3 μm.
- Bruk toveis modus for å øke skannehastigheten. Bildeoppløsningen bør være minst 512 x 512 piksler.
- Tilegne seg bilder av tumor volum på ulike posisjoner hver 20 min for 2 t. Legg vann til målet før hvert bilde oppkjøpet.
Merk: tidsforløpbilder kan anskaffes automatisk ved å angi riktig tidsforløp i programvaren. Imidlertid kan musen flytte, og plasseringen eller z-stakken kan skifte over tid, forårsaker tap av data. Derfor anbefales det å utføre tidsforløp manuelt og for å kontrollere og justere for XYZ Skift mellom oppkjøp. - På dette trinnet, eventuelt, foto-bytte Dendra2 fluorescerende markør.
Merk: i motsetning til time-lapse Imaging (som gjør det mulig å studere enkelte tumorceller egenskaper og hvordan de endres over tid), vil dette tillate studere området tumor celle infiltrasjon i hjernen over flere dager4. En detaljert forklaring av dette trinnet er beskrevet av Gligorijevic et al.13. - Etter det siste bildet er ervervet, fjerne musen fra scenen og la den komme på en oppvarming pad. For å forhindre dehydrering, kan 100 μL av saltvann gis subkutant. Plasser musen i buret til biopsi-lignende skaden er utført.
- Velg flere posisjoner som er interessante for bildet, og Registrer koordinatene i programvaren. Sørg for at de valgte stillingene er representative posisjoner fra ulike områder av svulsten (hver svulst kan være forskjellig, men for å sikre konsistens, velger du samme antall posisjoner som er sentrale i tumor kjernen og til kantene på tvers av alle mus).
3. biopsi-lignende skade og tilpasset installasjon
- Lag en biopsi-lignende skade på tumor stedet 1 dag etter den første bildebehandling økten.
Merk: Alternativt kan en annen prosedyre, som delvis fjerning av tumor, utføres.- Sedate musen ved hjelp isoflurane innånding anestesi som tidligere beskrevet i trinn 2.1.1.
Merk: mens injiserbare anestesi kan brukes, denne fremgangsmåten er kortere enn den veiviseren, og innånding anestesi gjør det mulig å nøyaktig kontroll og for å redusere tiden musen forblir bedøvet. - Plasser musen på en stereotaxic ramme og fest hodet med to øre stolper og en nese klemme. Sjekk dybden av anestesi ved mangelen på pedal reflekser. Bruk en anestesi maske for stereotaxic kirurgi for å holde musen bedøvet under inngrepet.
- Sug en bomullspinne i aceton og spre den rundt kanten av dekkglass for å myke opp limet som holder dekkglass mot hjernen.
- Skyv tynn spiss tang under dekkglass for å løfte den. Hvis dekkglass bryter på dette punktet, bruker tang for å fjerne biter av glass.
- Påfør cortex buffer for å holde hjernen fuktig.
- Dypp en 25 G nål i svulsten til en dybde på 1 mm. Fjern nålen og stoppe blødningen, om nødvendig, ved å påføre en gelatin steril svamp.
Merk: dette trinnet kan utføres under et fluorescerende stereomikroskopet for å mer nøyaktig identifisere tumor området (hvis svulsten er for liten). I tillegg kan en 1 μL løsning av fluorescerende polystyren 1 μm perler injiseres under punktering å identifisere biopsied området. - Forsegle hjerne overflaten med silikon olje og lim en 6 mm dekkglass på toppen.
- Sedate musen ved hjelp isoflurane innånding anestesi som tidligere beskrevet i trinn 2.1.1.
4. gjentatt bildebehandling
- En dag etter påførte biopsi-lignende skade (og på påfølgende dager om nødvendig), gjenta intravital Imaging som beskrevet i trinn 2 ovenfor for å vurdere hvordan tumor celle atferden endres over tid. Velg flere posisjoner av svulsten som ville være representativt for hele tumor området.
Merk: Hvis fluorescerende perler ble brukt til å identifisere biopsied området, lokalisere dem til bilde tumor celle atferd i biopsied regioner i forhold til ikke-biopsied regioner.
5. bildeanalyse
- Hvis tids forløps bildene ble anskaffet manuelt, kan du kombinere dem i én mappe.
- Åpne LIF-filen for tidsforløp i den kommersielle programvaren som er knyttet til mikroskopet (for eksempel LasX eller LAS AF). Velg kategorien prosess ≫ Behandle verktøy > fletting. Velg det første bildet av tids sekvensen, og klikk først. Velg det andre bildet av tids sekvensen, og klikk på andre. I Flett dimensjonervelger du t for tid. Klikk på Bruk. En ny fil med to tidspunkter vil bli generert. Gjenta denne prosessen for alle tidspunkter, ved hjelp av den nylig genererte filen som det første bildet i sekvensen.
- Korriger de oppnådde z-bunkene for et hvilket som helst XYZ -SKIFT.
Merk: for eksperimentene som beskrives i denne protokollen, ble et spesiallaget Visual Basic-program brukt til korrigering. Alternativt kan annen tilgjengelig programvare brukes, for eksempel ImageJ eller Imaris.- Eksporter TIFF-filene fra programvaren ved å høyreklikke på den sammenslåtte tidsforløp filen. Velg Lagre RAW-data. De eksporterte filene vil bli eksportert til en mappe med navn i henhold til kanal, tid og z-posisjon.
- Åpne TIFF-filene i det egendefinerte Visual Basic-programmet.
- Definer antall tidspunkter, z-stabler og kanaler.
- Tilordne en farge til hver kanal etter visningsrekkefølgen.
- Korriger forskyvningen i z ved å klikke knappene opp (U) eller ned (D) i skjemaet Vis panel for hver timepoint.
- Velg kanalen som skal brukes til å korrigere XY -skiftet, i Intravital -panelet. Velg den grønne kanalen for å korrigere, basert på signalet fra tumorceller. Klikk automatisk for XY -korrigering.
- Eksporter de korrigerte bildene som en maksimal projeksjon av tre påfølgende z-stabler. I panelet velgerdu å introdusere tallene for den første (Start) og de siste (end) z-sektorene som skal eksporteres. Velg Maks. Velg separate mapper for Z. Klikk på do. For hver av dem vil tre z-stabler, tidsforløpbilder bli eksportert til en egen mappe.
- Alternativt, riktig for vevet elastisk deformasjon.
Merk: for vev elastisk deformasjon eksperimenter, en kamp bevegelse kompensasjon programvare programmet ble brukt til å korrigere for stive og elastisk vev deformasjon14. - Spor enkeltceller i den komplette z-stakken i tidsforløp filmen.
Merk: tumor celler kan spores manuelt ved hjelp av for eksempel en ImageJ plugin (MTrackJ). Mens nøyaktig, er dette begrenset til XY flyet og er svært tidkrevende. Alternativt kan tumorceller spores automatisk gjennom hele z-volum, ved hjelp av tumor celle segmentering (f. eks Imaris programvare). Men i svært tette svulster, er automatisert sporing mindre nøyaktig og kan gi opphav til mer sporing feil.- Åpne og spor hver tidsforløp serie (for tre påfølgende z-stabler) separat. Dra mappen som inneholder tidsforløp bildene til ImageJ.
- Velg fanen Plugins > Tracking > MtrackJ. Spor hver enkelt celle ved å velge Legg til og klikk på hver celle på hver timepoint.
- Pakk ut mål på sporene ved å klikke på mål og lagre filen.
Representative Results
For å vurdere effekten av biopsi på hjernetumor celle atferd, utførte vi prosedyren som er beskrevet i denne protokollen. Glioma-GL261 celler-uttrykker et kjernefysisk fluorescerende protein (H2B-Dendra2) ble injisert i hjernen av C57BL/6 mus, og en kronisk veiviseren ble implantert. Time-lapse intravital Imaging ble utført på samme dyr pre-og post-biopsi-lignende skade på svulsten (figur 1a, B). Migrering av individuelle tumorceller ble bestemt ved å spore overføringsbanen over tid i forskjellige XY -fly av z-stakken (figur 1C) og plottet som en prosentandel av trekk celler pre-og postbiopsy (figur 1F). Tumor celle spredning rate ble kvantifisert basert på H2B-Tagged Dendra2 kondens på mitose (figur 1d) og plottet som en prosentandel av dele celler pre-og Postbiopsy (figur 1e). Vi sammenlignet fordelingen av migrasjon hastighet før og etter biopsi i samme svulst og fant at antall trekk celler (hastighet > 4 μm/h) økte etter intervensjon, med en tilknyttet nedgang i antall/nonmigratory celler ( hastighet < 4 μm/h) (figur 2a). I gjennomsnitt per svulst, observerte vi en 1,75 (SD = 0.16)-fold økning i prosentandelen av trekk celler når en biopsi-lignende skade ble utført, sammenlignet med kontroll mus som ikke var biopsied (figur 2b). Vi overvåket tumor celle adferd i en uke til, og fant ut at selv om prosentandelen av trekk tumorceller til slutt gikk ned i både kontroll-og biopsied musene, viste de biopsied musene fortsatt en høyere trekk kapasitet enn kontroll musene ( Figur 2C). Analysen av tumor celle proliferativ oppførsel over tid viste en 1,52 (SD = 0.26)-fold økning i antall mitotisk hendelser ved biopsi, i forhold til nonbiopsied kontroll mus (figur 2D).
For å teste om den observerte effekten av biopsi på tumor celle proliferativ og vandrende atferd var en gjenstand på grunn av veiviseren erstatning kirurgi (kreves for å utføre en biopsi-lignende skade), overvåket vi tumor celle atferd i en gruppe av mus som gjennomgikk veiviseren erstatning uten en biopsi. I denne gruppen har vi ikke observere noen induksjon av migrasjon eller spredning av tumorceller, noe som indikerer at økningen i tumor celle spredning og migrasjon priser ble spesielt utløst av biopsi-lignende skade (figur 3a, B).
Stabil Foto-convertibility av fluorescerende protein Dendra2 gir mulighet for å studere tumor celle infiltrasjon over flere dager. Ved eksponering for ultrafiolett/blått lys, er Dendra2 irreversibelt byttet fra grønt til rødt. Ved hjelp av denne egenskapen, var et kvadrat regionen av svulsten opplyst og ~ 200 Dendra2-uttrykker tumorceller var Foto-merket før biopsi (Figur 4). En dag etter biopsi, relocalized vi Foto-byttet region og målte volumet av tumorceller som hadde infiltrere inn i omkringliggende tumor vev. Vi fant at infiltrasjon området var 1,72 (SD = 0,41) ganger større i svulster etter en biopsi-lignende skade sammenlignet med nonbiopsied kontroll svulster (Figur 4). Selv om denne tilnærmingen bare gir informasjon om tumor celle bulk infiltrerende atferd og ikke på en enkelt cellenivå, er det mindre tidkrevende enn time-lapse Imaging tilnærming og kan være metoden for valg for forskning spørsmål fokusert utelukkende på studere infiltrerende oppførsel.
Figur 1: eksperimentell oppsett for langsgående intravital Imaging av biopsi effekt på tumor celle atferd. (A) diagram som viser utformingen av ringen og magnet holde ren. (B) skjematisk fremstilling av den eksperimentelle arbeidsflyten. Tumor celler injiseres i hjernen av mus og en veiviseren er etablert. Ved tumor utvikling, en første (prebiopsy) time-lapse Imaging Session er utført. Neste dag, biopsi og veiviseren erstatning er implementert. Dagen etter avbildning (postbiopsy), utføres en andre gang-lapse Imaging-økt. For lang-frist virkninger, etterfølgende tenkelig møter kan gjort. (C) bilder viser representative øyeblikksbilder av en tidsforløp film der GL261 H2B-Dendra2 tumorceller ble sporet. Røde linjer skildrer individuelle tumor celle spor. Skalaen bar = 50 μm. (D) representative in vivo tidsforløpbilder som viser dele celler i GL261 H2B-Dendra2 svulster. Ulike stadier av mitose er indikert: profase (P), prometaphase (PM), metafase (M), anaphase (A), og telophase (T). Skalaen bar = 50 μm. grafer indikerer prosentandelen av (E) trekk og (F) dividere celler pre-og postbiopsy. Hvert punkt indikerer prosentandelen av trekk celler i alle posisjonene målt i et enkelt dyr. Dataene vises som gjennomsnittet ± S.E.M. av seks mus (* *P < 0,01, sammenkoblet t-test). Dette tallet har blitt modifisert fra Alieva et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative resultater som viser virkningen av biopsi på tumor celle migrasjon og spredning priser. (A) foss plott som viser endringen i cellehastighet distribusjon i forhold til basal migrasjon i enkelte mus. Dataene vises som gjennomsnittet ± S.E.M. av fem mus. (B) antall trekk celler i kontroll (blå) og biopsied (røde) dyr normalisert til antall trekk celler preintervention (n = 6 mus, * * *P < 0,0001, studentens t-test). (C) tumor celle virkemåte ble sporet over flere dager. Vist er normalisert (i forhold til preintervention) antall trekk celler i enkelte mus over tid (n > 4 mus per betingelse, * * *P < 0,0001, toveis Anova). (D) normalisert antall dele celler i kontroll (blå) og biopsied (rød) dyr. Per individ dyr, verdiene postintervention ble normalisert til verdiene preintervention (n = 5 mus, * *P < 0,01, student t-test). Dette tallet har blitt modifisert fra Alieva et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: erstatning for tilpasset installasjon har ingen innvirkning på virkemåten til tumor cellen. Langsgående intravital Imaging viser at utskifting av veiviseren uten biopsi har ingen effekt på migrasjon og spredning priser. (A) økningen i antall trekk celler for de angitte forholdene. Hvert symbol representerer gjennomsnittet av en individuell mus, og n≥ 4 mus. (B) økningen i antall voksende celler for de angitte forholdene. Hvert symbol representerer gjennomsnittet av en individuell mus (n≥ 4 mus, * *P < 0,01, * * *p < 0,001, NS = nonsignificant, enveis Anova med Newman-Keuls post hoc test). Dette tallet har blitt modifisert fra Alieva et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: diagram som viser den eksperimentelle oppsett og representative resultater oppnådd med Dendra2 Foto-svitsjing. For å overvåke tumor celle infiltrasjon ved biopsi, er Dendra2-uttrykker tumorceller Foto-slått i en firkantet region av UV/blått lys belysning og avbildet, 1 dag før biopsi. En dag etter biopsi, foto-byttet regionen er relocalized og reimaged. Vist er representative Dendra2 bilder av tumor celle infiltrasjon, korrigert ved hjelp av kanal subtraksjon. Den hvite stiplede linjen representerer infiltrasjon området. Skalaen bar = 50 μm. Grafen viser det økte Foto-byttet området plottet for biopsied (rød) og kontroll (blå) mus. Hvert punkt representerer gjennomsnittsverdien for en individuell mus (n≥ 5 mus, *P < 0,05, student t-test). Dette tallet har blitt modifisert fra Alieva et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her beskriver vi en metode for å studere endringer i tumor celle adferd på enkelt cellenivå som svar på invasive kirurgiske prosedyrer, for eksempel en biopsi, i hjernen til et levende dyr. Kombinasjonen av langsgående multiphoton Imaging med kirurgisk implantation av en kronisk veiviseren muliggjør kvantifisering av tumor celle migrasjon, invasjon og spredning før og etter biopsi i samme dyr4. Sammenlignet med andre tilnærminger som brukes for tumor multiday overvåking, for eksempel Puerto Mosquito Imaging12, Mr10, eller pet/CT11, denne metoden unikt visualiserer svulster på en enkelt cellenivå og dermed gir innsikt i cellulære atferd underliggende tumorprogresjon.
For å kunne utføre denne metoden, bør flere prosedyrer bli mestret. De mest kritiske trinnene i denne protokollen er implementering av veiviseren og utskifting. Den tekniske kompleksiteten i disse trinnene krever presisjon og kirurgiske ferdigheter som kan oppnås med jevn trening. Komplikasjoner under veiviseren for tilpasset installasjon, for eksempel blødning som kan dekke hjernens overflate, kan vise seg å være utfordrende for påfølgende bildebehandling. Mangel på sterile verktøy eller miljø, samt unnlatelse av å helt forsegle hjernens overflate, kan forårsake en infeksjon på hjernen overflaten (hvit væske under dekkglass), som vil gjøre Imaging problematisk og sterkt kompromiss den resulterende Tolkning. Et annet vanlig nummer av denne protokollen er dyr bevegelse i løpet av time-lapse Imaging. Mens noen XYZ Skift kan korrigeres etter eksperimentet, anbefales det å korrigere koordinaten til hver posisjon før hver gang-punkt for å hindre tap av informasjon. Tissue deformasjon er et ekstra problem funnet når Imaging på en invertert mikroskop. Hjernevevet lider av kompresjon når musen er plassert i liggende posisjon. Avhengig av graden av vev deformasjon, kan tumor celle sporing føre til en feilaktig kvantifisering av celle forskyvning. For å hindre dette, kan en programvare for stiv og elastisk deformasjon brukes14.
Selv om denne prosedyren tilbyr et bredt program for å studere endringer i tumor atferd, bør visse begrensninger vurderes. Denne metoden gjør det mulig for forskere å bilde opp til en dybde på 1,6 mm (med bruk av en optisk parametrisk oscillator); Dette betyr imidlertid at bildebehandling er begrenset til overfladiske hjerne cortex områder15. Således, noe hjernesvulst lokalisert inne dyp hjerne strukturer, inkluderer diffus iboende Pontine gliomas lokalisert inne det hjernestammen område, kan ikke være studert inne deres original hjerne omgivelsene med dette protokollen. En annen begrensning av denne protokollen er volumet av svulsten som kan bli avbildet. Selv om total svulst volum skanning er ønskelig å få maksimal informasjon, ofte, tumor størrelse og hastigheten på trekk celler kan være Begrensende faktorer. For hver tumor type må det vurderes en optimal tidsforløp for bildebehandling. Hvis tidsrammen mellom bildene er for lang, kan det være vanskelig å spore tumorceller. Bruken av en resonans skanner kan sterkt redusere skanningen tid, slik at Imaging av en større svulst16. Endelig kan den manuelle bildeanalyse av denne protokollen være svært tidkrevende, så i stedet, programmer for automatisert 3D-sporing kan brukes. Imidlertid bør utfallet av sporing alltid være visuelt overvåket siden algoritmer for automatisert celle sporing er sjelden utformet for å recapitulate nøyaktig migrering av cellene av interesse.
Små tilpasninger av protokollen beskrevet her kan aktivere et enda bredere spekter av applikasjoner. I stedet for å utføre biopsier, kan andre (kirurgiske) intervensjoner implementeres, slik som delvis tumor reseksjon eller levering av kjemoterapi wafere. Tilsetning av forbindelser gjennom en kirurgisk implantert microtube kan kombineres med denne protokollen for å farmakologisk målrette bestemte molekyler av interesse. Vi forventer at denne modellen vil være nyttig i studier som tar sikte på å analysere virkningen av en viss intervensjon på tumor celle atferd. Muligheten for å utføre gjentatte tiltak i samme dyret gir ikke bare mer nøyaktige data om endringer som forekommer i svulsten, men også i stor grad reduserer antall forsøksdyr som trengs per studie.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker anko de Graaff og Hubrecht Imaging Center for deres Imaging støtte og Ellen Wehrens og Hannah Johnson for korrekturlesing og redigering av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
- Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine. Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).
- van Malenstein, H., et al. Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma. Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).
- Kretschmer, L., et al. High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371). British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).
- Alieva, M., et al. Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior. Scientific Reports. 7, 7529 (2017).
- Hobson, J., et al. Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis. Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).
- Weil, S., et al. Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas. Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).
- Parsa, A. T., et al. Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults. Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31, 602-606 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4, 158ra145 (2012).
- Schreurs, T. J., et al. Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy. PLOS ONE. 11, e0165759 (2016).
- Nielsen, C. H., et al. PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide. Cancer Research. 70, 9022-9030 (2010).
- Alieva, M., et al. Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response. PLOS ONE. 7, e35148 (2012).
- Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window. Journal of Visualized Experiment. (28), e1278 (2009).
- Noordmans, H. J., Roode, R. d, Staring, M., Verdaasdonk, R. Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time. , Vol. 6081 PWB SPIE (2006).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16, 106014 (2011).
- Kirkpatrick, N. D., et al. Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment. IntraVital. 1, (2012).
