Summary
在这里, 我们提出了一个单一粒子跟踪图像分析的协议, 允许定量评估扩散系数, 类型的运动和集群大小的单个粒子检测到的荧光显微镜。
Abstract
视频序列上的粒子跟踪及其轨迹的后验分析是当今许多生物学研究中常见的操作。以细胞膜受体簇分析为模型, 我们提出了一个详细的协议, 这个图像分析任务使用斐济 (ImageJ) 和 Matlab 例程: 1) 定义感兴趣的区域和设计适应这些区域的面具;2) 跟踪荧光显微镜视频中的颗粒;3) 分析所选轨道的扩散和强度特性。通过荧光显微镜和图像处理获得的扩散系数、运动类型和聚类尺寸的定量分析, 为客观地确定粒子动力学和改性的后果提供了宝贵的工具。环境条件。在本文中, 我们提供了用于分析这些功能的详细协议。这里描述的方法不仅允许单分子跟踪检测, 而且还自动估计细胞膜上的横向扩散参数, 对轨迹类型进行分类, 并允许进行完整的分析, 从而克服在细胞膜上的整个轨迹上量化光斑大小的困难。
Introduction
由于热扩散, 脂质双层中的膜蛋白连续运动。它们的动力学对于调节细胞反应是必不可少的, 因为分子间的相互作用允许从单体到低聚物大小不同的复合物的形成, 并影响信号复合物的稳定性。因此, 阐明控制蛋白质动力学的机制是细胞生物学中的一个新挑战, 是理解信号转导途径和识别意外细胞功能所必需的。
研究这些在活细胞1中的相互作用的光学方法已经发展起来。其中, 在20世纪80年代初发展起来的总内部反射荧光 (TIRF) 显微镜, 可以研究细胞膜2处或非常近的分子相互作用.为了研究从活细胞中 TIRF 数据获得的膜蛋白轨迹的动态参数, 需要一种单一的粒子跟踪方法 (SPT)。虽然有几种算法可用于此, 但我们目前使用 Jaqaman 等人3发布的算法, 通过在连续帧之间连接粒子以连接生成的轨道来解决密集粒子场中粒子运动的异质性问题段转化为完整的轨迹 (暂时的粒子消失)。该软件捕获聚合和离解事件3所产生的粒子合并和分裂。该软件的输出数据之一是通过定义粒子在每个帧中的 X 和 Y 位置来检测整个轨迹上的粒子。
一旦检测到粒子, 我们应用不同的算法来确定短时间格扩散系数 (d-11-4)4,5。通过应用动量缩放谱 (mss)6、7、8分析或通过将均方位移 (msd) 调整到曲线 9来拟合 "alpha" 值, 我们还根据以下方式对粒子进行了分类:轨迹的类型。
荧光图像中的点强分析是该领域 10、11 的科学家共同的目标。最常用的算法是所谓的数字和亮度。尽管如此, 这种方法不允许在移动分数中的粒子中进行正确的逐帧强度检测。因此, 我们产生了一种新的算法来逐帧评估这些粒子强度, 并确定它们的聚合状态。一旦使用 U-track2 软件3检测到每个粒子的坐标, 我们就会在整个轨迹上定义每个帧中的强度, 同时考虑每个帧中的单元格背景。该软件提供了不同的可能性来确定点强度和细胞背景, 并使用已知的单体和二聚蛋白质作为参考, 计算所检测到的粒子中的蛋白质的大致数量 (簇大小)。
在本文中, 我们描述了一个仔细的指南, 以执行这三个步骤: 1) 检测和跟踪单个粒子沿荧光显微镜的视频 u 轨;2) 通过 MSS 分析这些粒子的瞬时扩散系数 (d1-4) 以及具有长轨迹的粒子的运动类型 (限制、自由或定向);3) 测量点强度沿视频校正的估计背景荧光为每个点。这样就可以估计聚类尺寸并识别光漂白步骤。
使用本协议不需要专门的技能, 可以在任何实验室进行细胞培养、流式细胞仪和显微镜设施。该协议使用 ImageJ 或斐济 (ImageJ12的分布)、u-trak3和一些临时制作的例程 (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip)。U 轨和临时例程运行在 Matlab 上, 可以安装在任何兼容的计算机上。
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Protocol
1. 生物样品的制备
- 在 RPMI 1640 培养基中生长 Jurkat 细胞, 辅以10% 的 FCS、Nabir 和 l-谷氨酰胺 (完整 RPMI)。电孢菌素细胞 (20 x10 6 6 细胞/rpmi 1640 与 10% fcs), 具有单体 gfp 标记的趋化因子受体载体 (CXCR4-acgfp, 20μg), 可使用荧光显微镜进行检测。
请注意:可以使用其他单分子荧光蛋白, 如 mCherry、MCherry 等。 - 转染24小时后分析流式细胞仪中的细胞, 以确定细胞活力和 CXCR4-acgfp 表达。
- 通过 TRANSFECTED低阳性细胞的细胞分类 (图 1) 选择 cxcr4-acgp 水平较低的细胞 (图 1), 因为 tirfm 实验需要转染受体的低表达, 以确保跟踪个体的单个粒子跟踪轨迹9。
- 量化细胞表面受体的数量。
请注意:例如13、~ 8, 500-22, 000 acgfp 标记的受体细胞, 对应 ~ 2-4.5 五粒细胞. -
在完全 RPMI 中重新移植分类细胞, 在37°c、5% CO2 中孵育至少2小时。离心细胞 (300 x 克,5分钟), 并将其重新悬浮在 TIRF 缓冲液 (HBSS, 25 mm hepes, 2% Fcs, ph 7.3) 中。
- 板上35毫米玻璃底微井盘 (2-3 x10 5 Cell/dish) 涂上纤维连接蛋白 (20μgml, 1小时, 37°c), 在存在或不存在适当的配体 (即 CXCL12, 100 nm, 1小时, 37°c) 的情况下。在采集图像之前, 培养细胞 (37°c 时 20分钟, 5% CO2)。
- 使用配备了 EM-CCD 摄像机、100x 油浸目标 (HCX PL APO 100 x 1.4 na) 和488纳米二极管激光的 TIRF 显微镜进行实验。显微镜允许温度控制和孵化与二氧化碳.使用粗糙和精细的对焦旋钮定位和聚焦单元, 使用明亮的磁场, 最大限度地减少光漂白效果。对于 TIRF 模式下的精细对焦调整, 使用较低的激光强度, 不足以进行单粒子检测或诱导光漂白效应 (5% 激光功率, 28Μw)。
- 获取大约50秒的影片 (图像序列), 最大限度地减少帧之间的时间间隔。消失场的穿透应为70-90 纳米的深度。将每个实验条件中获得的影片保存为 ". lif" (视频. lif)。
请注意:所描述的例子中的电影在激光功率 (2 mW) 下获得了 49%, 曝光时间为90毫秒, 时间间隔为98毫秒, 为 49秒 (500 帧)。所选消失波的穿透率为90纳米。
2. 图像的选择和面具的创建
- 对于每个实验条件 (video. Lif), 创建一个新文件夹 (视频名称), 该文件夹必须包含每个系列的不同文件夹。每个文件夹将包含视频图像的 "视频 Seq" 文件夹和分析结果的 "结果" 文件夹。请确保此时的文件结构如下所示:
Videocamamame-chalev. lif
Videnoamame:series1/videseq
视频-Namame/系列 1/结果
请注意:从显微镜上获得不同的. lif 文件与几个视频的每一个处理条件 (即 FN, FN + SDF)。"video. lif" 对应于 input. lif 视频文件, 所有 TIRF 电影收购 (系列) 都在显微镜下进行。"视频 Seq" 文件夹将包含我们正在分析的电影的500帧。"结果" 文件夹将包含执行的分析所产生的所有文件。准确的命名和不同文件夹的本地化是算法正确功能的关键。上面列表中的粗体名称是固定的 (即, 它们必须以这种方式调用, 因为这些是脚本所寻求的名称)。不加粗的名称可以更改以反映所执行的实验。 - 通过在斐济菜单栏上拖放文件, 打开与斐济或 ImageJ 的 TIRFM 视频 (. lif 文件), 然后单击"确定" , 使用 Biop控节导入 lif 文件 (补充图 1)。
- 选择要处理的系列, 然后单击 "确定" (补充图 2a). 要设计用于分析此视频的掩码, 还可以导入具有不同色度的多通道图像 (例如, 系列1是多通道图像, 而系列2是相应的视频)。视频 (和多通道图像) 应作为 ImageJ 堆栈打开。在示例中 (补充图 2B), 图像位于左侧, 视频位于右侧。
请注意:如果不需要为视频创建遮罩, 请转到步骤2.5。 - 创建一个遮罩。创建一个图像与通道有用的设计的面具。在这种情况下, 有趣的通道是红色、绿色和灰色的。
- 从多通道图像中拆分通道 (补充图 3 a): 在条形图菜单中选择 "图像", 然后单击 "颜色"拆分通道。不同的通道将显示为单独的图像 (补充图 3B)。
- 在单个图像中再次合并三个通道 (补充图 4 a): 在条形图菜单中选择 "图像", 然后选择"颜色"合并通道。选择适当的通道, 然后按 ok(补充图 4b)。将生成一个新的非堆叠图像 (补充图 4c)。
- 使用"同步 windows " 工具同步两个窗口 (补充图 5a): 在栏菜单中选择"分析" 工具类同步窗口。将显示一个具有同步图像可能性的新窗口 (补充图 5B)。
- 同步两个窗口 (只有在没有多通道图像关联的情况下的视频), 可以裁剪两个窗口中的相同区域。使用 ImageJ 浮动菜单的矩形选择工具绘制感兴趣的区域。在条形图菜单中选择 "图像" , 然后选择 "裁剪" (补充图 6a)。两个裁剪的图像将单独显示 (补充图 6B)。
- 通过按同步 windows管理器中的"全部取消同步" 按钮来取消同步这两个窗口 (补充图 6b)。
- 如果未创建步骤2.4 中的掩码, 请使用 ImageJ 浮动菜单的矩形选择工具绘制感兴趣的区域。
- 将视频另存为相应视频目录下目录视频Seq 中的图像序列(补充图 7a): 在栏菜单中选择 "文件", 然后单击 "另存为"图像序列. 将视频序列的标签重命名为 video 0000. tif, video 000.1. tif,..., 视频 049. tif (补充图 7b): 在"名称" 框中, 重命名为视频, 然后单击"确定"。要使 U-track 成功使用序列, 该序列必须在其目录中单独使用。
请注意:如果不为视频设计遮罩, 请转到步骤2.8。 - 设计一个面具。选择多通道图像并打开分段编辑器插件 (补充图 8A): 在条形图菜单中选择 "插件", 然后选择 "分段"分段编辑器。通过右键单击分段编辑器的标签 (补充图 8B. c), 根据需要添加和重命名分段的标签。
- 在 ImageJ 浮动菜单中选择适当的选择工具 (此处, 使用 "徒手"), 选择标签 (绿色), 然后首先设计最外层的遮罩 (补充图 9a)。设计完成后, 按"复合" 窗口的 "选择" 选项中的"+ " 按钮, 所选遮罩将显示在查看器上 (补充图 9a)。使用下一个标签重复此步骤 (内部, 红色) (补充图 9B)。
请注意:在为绿色和内饰标签设计遮罩后, 外部遮罩将占据图像的其余部分。 - 掩码在图像中被编码为区域 0, 1, 2,..。根据 RGB 标签窗口中标签的顺序。设计不同标签的所有遮罩时, 请使用与视频相同的文件名保存蒙版. tif ( 补充图 9c): 在栏菜单中选择 "文件", 然后选择"另存为"蒂夫...
请注意:选定的掩码将用于计算扩散系数和轨迹分类 (见步骤 4.2)。
- 在 ImageJ 浮动菜单中选择适当的选择工具 (此处, 使用 "徒手"), 选择标签 (绿色), 然后首先设计最外层的遮罩 (补充图 9a)。设计完成后, 按"复合" 窗口的 "选择" 选项中的"+ " 按钮, 所选遮罩将显示在查看器上 (补充图 9a)。使用下一个标签重复此步骤 (内部, 红色) (补充图 9B)。
- 检查此时的文件结构是否如下:
Videocamamame-chalev. lif
Videonoamame-series1/mashk . tif
Videoamamameser1/videseq/vide00 . tif
Videoamamameser1/videseq/vide000-1 . tif
...
Videonoamameser1/videseq/vide049 . tif
视频-Namame/系列 1/结果
请注意:掩码. tif 是一个图像与面具设计在步骤2.4 和2.7。视频 *. tiff 是保存在2.6 步中的视频。如上所述, 上面列表中的粗体名称是固定的, 即必须以这种方式调用它们, 因为这些是脚本所寻求的名称。不加粗的名称可以更改以反映所执行的实验。
3. 跟踪粒子
- 使用 u 型轨道跟踪所选视频中看到的所有粒子。
- 打开 Matlab, 并使用"设置路径" 将 u 轨道目录添加到路径在菜单中使用子文件夹选项添加。保存路径, 以便在将来执行 Matlab u 轨的路径。此路径设置只需要执行一次。
- 将工作目录更改为包含要分析的系列的目录。通过在控制台中键入 (补充图 10) , 调用u 型轨道, 然后按 enter。将打开"影片选择" 窗口 (补充图 11a)。
- 按下"新建影片" 按钮, 将显示 "影片编辑"窗口 (补充图 11b)。
- 按"添加频道"可选择带有视频的目录 (videnoamame:series半), 然后填写影片信息参数。将 U-trach 的结果的输出目录设置为结果(视频-name:seriesine发送给结果)。
请注意:从显微镜和采集条件中可以获得电影信息参数。 - 按"高级通道" 设置并填充与采集相关的参数。查看示例中参数的值 (补充图 11c)。
- 按"高级频道设置 " 窗口上的 "保存" , 然后在"电影编辑"窗口中按 "保存"。该程序将要求确认在结果目录上写入名为肯定数据。确认。
-
创建影片后, 在影片选择窗口中按 "继续"。U 轨将询问要分析的对象的类型。选择单粒子 (补充图 12)。将出现 "控制面板" 窗口 (补充图 13A)。
- 选择第一步步骤 1: 检测并按"设置".将出现"设置高斯混合-模型组合组合"窗口 (补充图 13b)。在示例中, "用于与本地背景进行比较的 Alpha 值" 设置为 0.001, "滚动窗平均时间" 设置为 3 (补充图 13B)。
- 按"在设置中应用" 高斯混合模型组合窗口,然后在"控制面板" 中运行. 使用补充图 13中的配置, 只运行检测步骤。此步骤需要几 (2-5) 分钟。按步骤 1 (检测,补充图 14) 的"结果" 按钮检查结果。
请注意:如上所示, 影片在检测到的粒子上显示红色圆圈。如果未显示红色圆圈, 则此步骤无法正常工作。
- 执行轨道的标识, 即将上一步中检测到的粒子合并到跨越多个帧的轨道中。这是步骤 2: 跟踪u 轨, 其设置必须定义, 如补充图 15a-c所示。补充图 15b和 c 分别显示了示例中框架到框架链接和差距关闭、合并和拆分的步骤2成本函数设置。
- 设置步骤2的参数后, 按"控制面板" 中的"运行" , 然后仅运行步骤 2 (补充图 16)。
- 执行轨道分析, 步骤3。定义设置, 如补充图 17 (右面板) 所示。然后, 按 "设置运动分析" 面板中的"应用" , 然后在控制面板 u 型轨道中运行。此步骤需要几秒钟。
- 使用步骤3的"结果"按钮验证进程是否正确标识了所有轨道。为此, 请单击 "放映影片选项" 窗口的 "显示曲目编号", 并按帧检查每个曲目是否已正确识别 (补充图 18)。手动注释那些不是真实粒子的粒子。
请注意:如果不进行此手动选择, 则在计算扩散系数时, 可以在以后执行较弱的自动选择 (请参阅步骤 4)。
4. 扩散系数的计算和轨迹的分类
- 确保从要分析的视频目录中调用所有脚本 (在示例中, videonnamamesie1)。
- 阅读所有轨迹以计算扩散系数, 方法是在 Matlab 控制台中发出命令: trajectories=readTrajectories(0.1), 其中0.1 是两个连续帧之间的时间 (时间间隔, 显示在面板影片中信息,补充图 11b)。
- 排除对应于错误识别的点的轨迹。给出要排除的点的列表。例如, 要排除点4、5和 28, 请键入: trajectories=readTrajectories(0.1、[4、5、28])。
- 计算这个细胞的每一个轨迹的瞬时扩散系数。在这种情况下, 计算时滞 = 4 的扩散系数, 称为 D-11-4。为此, 在 Matlab 控制台中运行命令: d = 计算扩散 (轨迹, 113.88 e-3, 0.0015, ' alpha ' ), 其中轨迹是在步骤3中获得的轨迹, 1113.88 e-3 是获得的图像的像素大小 (微米, 0.0015 是 a以μm2/为单位测量的不动粒子扩散系数的上界, "alpha" 是拟合模型, 如下文所述。
请注意:当使用更快的相机, 需要更多的帧来计算扩散参数增加它, 例如到 20 , 由 d = 计算扩散 (轨迹, 113.88 e-3, 0.0015, ' alpha ', ", 20)。在前面的示例 "" 中, 20 之前的字符串参数是添加到输出文件中的后缀。此后缀可用于区分不同的分析。 - 通过使用不同的拟合模式 ("约束"、"自由" 或 "定向") 再次调用计算扩散函数, 使 MSD 具有不同的功能。在本例中, "约束": d = 微积分扩散 (轨迹, 113.88 e-3, 0.0015, "约束")。
- 获取定向模型的拟合结果, 如补充图 20所示。
- 将轨迹分解为短轨迹和长轨迹。使用命令: [轨迹, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) , 其中50是要被认为长的轨迹帧中的最小长度 (在所示示例中)。
- 使用步骤 4.3:d = 计算扩散中描述的相同拟合程序研究短轨迹 (短轨迹, 123.88 e-3, 0.0015, "定向", "短")。用命令分析短轨迹和异常轨迹: d =计算扩散 (轨迹, 113.88 e-3, 0.0015, "alpha", "短")。
- 分析长轨迹, 通过其动量缩放谱 (MSS)7对运动类型进行分类。命令: trajectoriesClassification=classifyLongTrajectories(longTrajectories,113.88e-3, 0.0015 ' long ')在屏幕上显示分析, 并生成一个名为"轨迹分类 < 后缀" 的文件, >. txt. txt.目录结果 \ trackingpackage \ 轨道.
5. 通过粒子密度计算集群规模
请注意:确保从要分析的视频目录中调用所有脚本 (在所示示例 videnoamameserie1 中)。
-
分析每个粒子沿其轨迹的强度。为此, 请通过在 Matlab 控制台中键入来调用脚本: 分析在第一节中以 u 轨迹计算的轨迹为输入的 "热点度"。在其最基本的形式中, 只需从所分析的视频目录中调用没有任何参数的脚本 (在所示示例中, Videnoamam/series1) 分析聚光灯 ()。通过向脚本提供参数, 以多种不同的方式配置此基本行为, 如: analyzeSpotIntensities('Arg1、Value1、"Arg2"、"Value2"、"Value2"、"...")。列出了具有相应变量值 ("ArgN"、ValueN) 的有效参数。
- ("射半径", 1)
使用1像素的点半径 (默认情况下) 分析荧光强度, 该半径对应于以点 (2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1) 为中心的3x3 大小的斑块。
请注意:对于以现场为中心的5x5 补丁, 选择2的点半径等。 - ("仅初始轨迹", 1)
如果给出了此参数 (true, 值为 1), 则只分析在视频的第一帧中开始的轨迹。这对于分析控件图像 (默认为 0, false) 很有用。 - ("轨迹", 0)
如果此参数设置为 0 (false), 则在第一个帧中保留所有帧的点的坐标 (这对于不动点很有用)。如果参数设置为 1 (默认情况下为 1, true), 则沿着 u 轨迹计算的坐标沿视频跟踪该点。 - ("排除轨迹", [4, 5, 28])
包括步骤4.3 中排除的轨道的轨迹数 (在示例4、5、28中)。 - ("扩展轨迹", 1)
如果此参数设置为 1 (true), 则分析到视频末尾的修补程序中的强度 (即使轨迹更早停止)。点的坐标可以是轨迹中的最后一个坐标 (如果轨迹为真), 也可以是轨迹中的第一个坐标 (如果轨迹是假的)。默认情况下, 此参数为 false (0)。 - ("下背景", 1)
如果设置了此参数, 则通过对每个点的背景荧光估计来校正在该点测量的原始荧光 (见下文)。默认情况下, 此参数为 true (1)。 - ("平均长度", 帧数)
如果设置了此参数, 则在指示的长度测量平均强度点。设置 "平均长度", 20 以测量前20帧的平均点强度。如果未设置参数, 则在整个轨迹 (默认情况下, 全长) 计算点强度。 - ("展示型配置文件", 1)
将此参数设置为 1 (默认为 0, false), 以沿不同的帧及其背景绘制强度分布。
请注意:这些图对于识别光漂白非常有用, 如补充图 21所示。对于每条路径, 例程都会自动分析是否有可能出现光漂白。这是通过将路径上的第一个和最后一个 N 帧中的强度值与学生 t 进行比较来完成的。默认情况下, N 为 10, 但可以通过参数 "Nbleach" 修改此值。 - ("背景方法", 值)
设置此参数以确定每个点的背景。这可以通过多种方式来完成, 并且可以选择要使用的方法更改 "值":- ("背景方法", 0)
使用此值可以手动标识整个视频的背景。允许在视频的第一帧中选择8点。通过对这些点周围的补丁进行了分析, 并选择了所有这些强度的95% 量化作为所有点的背景强度。 - ("背景法", 1)
使用此值可以手动标识每个帧的背景。为每个点和每个帧选择8分。这是一项耗时的任务, 但它为用户提供了大量的控制权。选择这些斑块中强度的95% 的定量作为该帧中这一部位的背景强度。 - ("背景法", 2)
使用此值可以计算每个点的背景, 估计每个点的背景, 估计来自于点周围的一个圆的 8点, 半径由参数 "背景半径" (默认情况下, 4*spotRadius) 控制。 - ("背景法", 3)
使用此值可以计算每个帧的背景, 方法是首先定位视频中的单元, 然后分析每个帧中的单元的强度 (补充图 22)。
请注意:选择背景作为此分布的给定数量的灰度值 (默认为 0.5 (= 50%), 尽管可以通过参数 "背景百分位数" 控制此参数, 但可以将此值设置得更高, 例如 0.9 (= 90%)如果想让大部分细胞被认为是背景。为了帮助识别单元格, 请使用参数 "最大背景" (例如, 在所有分析的视频中, 背景值通常永远不会超过 6000)13, 指示在帧上预期的最大背景值。默认情况下, 此选项设置为 0, 这意味着默认情况下不使用此帮助。通过将参数设置为 "展示图像" (按 Ctrl-c 随时停止执行), 查看哪一个是单元检测和为背景估计选择的区域。
- ("背景方法", 0)
- ("射半径", 1)
- 收集分别在步骤4和5.1 中计算的所有轨迹的扩散和强度信息, 使用集集. 和强度 ()。仅收集短轨迹的扩散和强度信息。为此, 请使用步骤4.7 中使用的后缀, 并键入: "短" 是步骤4.7 中使用的后缀的集合扩散强度 ("短") 。
- 通过键入收集动量频谱缩放和强度信息:集合轨迹分类强度 ("long") , 其中 "long" 是步骤4.7 中使用的后缀。图 2汇总了使用此协议生成的所有文件。
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Representative Results
使用该协议可以自动跟踪在荧光显微镜电影中检测到的粒子, 并分析其动态特性。最初, 细胞被转染与荧光耦合蛋白被跟踪。适当水平的受体出现在细胞表面, 允许 SPT 通过细胞分类获得 (图 1)。通过 TIRF 显微镜对选定的细胞进行分析, 该显微镜以可使用本协议中描述的工具 (补充视频 1) 进行研究的格式生成视频。
生成的视频无法直接分析, 每个视频都需要独立的帧。ImageJ 的使用会生成可以使用 Matlab 软件 (如. tiff 格式或掩码的视频帧) 进行解释的文件。U 轨跟踪所选视频中看到的粒子, 并将信息保存在 Matlab (. mat) 文件 (电影数据座垫、 Channel_1_detection_result.mat、channel_1.mat、Channel_1_tracking_result.mat)中, 请参见图 2。
如图 2所示, 扩散系数的计算和轨迹命令的分类, 生成不同的文件 (扩散系数. 扩散系数肖特, 轨迹分类本朗. txt等)。使用 excel 和 Prism 软件可以最好地管理这些文件中包含的信息。可从此分析中获得的信息包括:
- 不动点的百分比。您可以将 d1-4 值的95% 作为不动粒子的参考: 从固定细胞中的单个粒子获得的 d1-4 值的 95%, 以及从贴在盖板上的纯化荧光蛋白中获得的 (2) 值 (图 3a)。
- 长轨迹 (和 gt;50 帧) 的百分比 (图 3B)。
- 长轨迹的运动类型: 定向、自由、约束 (图 3c)。
- 不同刺激处理的细胞中流动颗粒的扩散系数 (d1-4) (图 4a)。
该协议的第5步分析了沿轨迹的每个粒子的强度。脚本分析聚光灯度将在屏幕上打印所分析的所有信息。对于每个点和帧, 脚本以像素单位显示该帧中斑点的坐标 (x, y)、背景荧光 (k0) 的估计、3x3 斑块中的原始点强度、校正强度 (计算为原始强度减去其背景), 在贴片中观察到的最大强度值, 以及此点位于此帧的掩码内的区域号。产生的输出类型的一个示例是
热点43帧
xcf 78.0397
y合72.5395
k0c31571
= 5550.1111
1. 选定的
已更正的 Spotity6243
Maskregion2
所有这些信息都存储在一个日志文件 (结果/Trackingpackgecletss\ trackslog. txt) 和一个可以从 excel (结果) tracking遍遍 Letrics/Trackssion-tracksectionbyframe. txt) 中。在分析了每个点的情况后, 脚本在掩模内打印出沿轨迹和多数区域的平均强度
聚光灯43
平均修正了沿框架的斑点强度
多数地区
此信息存储在上面的日志文件和可从电子表格中读取的表中 (结果报: Trackingpacgingtracks\ Tracks\ spotsitities. txt).例如, 图 4B显示了在不同条件下受刺激的细胞中沿着其轨迹的每个粒子的平均点强度 (msi)。我们现在可以使用此信息大致估计荧光群集的大小。由于一个点的平均校正强度与该点中存在的荧光蛋白数量有关, 因此可以通过类似但独立的实验来测量单体的荧光, 直接计算每个粒子受体的数量。以同一细胞中表达的单体蛋白的强度为参考的每个粒子受体数的频率分布如图 4C所示。
收集扩散和强度命令创建两个文件: 一个称为扩散系数和强度 cotiesshort和另一个称为log _ 扩散系数和集约化跟踪包/轨道。两个文件都包含 1) 点折射率, 2) 扩散系数, 3) 强度, 4) 掩模内的区域号。这些文件可以从电子表格中读取。
同样, 收集轨迹分类和强度命令将创建两个文件, 一个称为"轨迹" 分类. txt和另一个日志 _轨迹。目录结果跟踪包/轨道.第一个包含 1) 点对, 2) 运动类型, 3) 点的第一时刻, 4) 强度, 5) d 1-4 和 6) 掩码内的区域号。可以从 Excel 读取此文件。
图 2汇总了使用此协议生成的所有文件。使用该协议可以进行的其他分析包括比较小斑点与大斑点的动态参数, 即单体与低聚物, 这些动态参数的变化引起的配体, 抑制剂, 膜组成,信号通路的改变等。利用该协议13对 cxcr4 在不同实验条件下对其配体 CXCL12 的行为进行了全面分析。
图 1: 单元格排序.TRANSFECTED 在细胞分选前后转染 Jurkat 细胞中的表达。在 TIRF 实验中选择并使用了GFP 低水平较低的细胞。
图 2: 生成的文件摘要.该图显示了使用所描述的 Matlab 例程生成的所有文件。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 轨迹分类.不同刺激处理的细胞对应的不同类型的轨迹数。(A) 固定点的百分比、(b) 长轨迹的百分比和 (c) 长轨迹运动类型的百分比。
图 4: 扩散系数、平均点强度和每个粒子受体的数量.(A) 每个点的短扩散系数 (d1-4) 值的分布, 以应对不同的刺激 (i、II、ii 和 iv)。红线表示 d1-4 的中值.(B) 每个点的平均点强度 (msi) 值, 在其前20个帧上, 以应对不同的刺激 (i、II、II 和 iv)。红线表示平均强度值 (SD)。(C) 从单个颗粒的强度分布中提取的受体/颗粒的百分比, 以受体宽度为单分子蛋白强度值。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1: 在斐济或 ImageJ 中打开 tirfm 文件。拖放. lif 视频时出现在 bio 格式窗口上的选项。请点击此处下载图.
补充图 2: 选择系列。. Lif 视频中显示的图像。(A) 允许选择要分析的系列 (包括多通道图像) 的窗口。(B) 系列选择的结果示例, 包括多通道图像 (左) 和相应的视频 (右)。请点击此处下载图.
补充图 3:拆分通道。(A) 窗口捕获多通道图像的分割通道所需的 ImageJ 命令和通道分割的 (b) 结果示例。请点击此处下载图.
补充图 4:合并通道。(A) 将不同的通道合并到一个图像中。(B) 合并的通道选择。(C) 通道合并的结果示例。请点击此处下载图.
补充图 5:同步窗口。(A) 在 imagej 菜单中本地化图像同步所需的命令和 (b) 生成的窗口。请点击此处下载图.
补充图 6:选择感兴趣的区域。(A) 使用矩形选择工具和 (b) 图像裁剪结果选择感兴趣的窗口。请点击此处下载图.
补充图 7:保存视频。将感兴趣的区域另存为 "另存为图像" 序列窗口的图像序列和参数。请点击此处下载图.
补充图 8:分割。(A) 在 ImageJ 的插件菜单中打开分段编辑器插件。(B) 添加标签材料进行分割。请点击此处下载图.
补充图 9:面膜设计。(A) 选择适当的标签和绿色面罩的定义。(B) 选择红色面罩。与两个标签相对应的两个掩码的示例。(C) 将掩码另存为. tiff 文件。请点击此处下载图.
补充图 10:Matlab 工作目录。选择包含要分析的系列的正确目录。请点击此处下载图.
补充图 11:U 轨主菜单。(A) 电影选择、(b) 电影版和 (c) 频道设置菜单。请点击此处下载图.
补充图 12:选择要跟踪的对象的类型。选择单个粒子的跟踪。请点击此处下载图.
补充图 13:粒子的检测。(A) u 型轨道, 控制面板。(B) 粒子检测设置示例。请点击此处下载图.
补充图 14:粒子检测的结果示例。不同的窗口, 包括查看器菜单、影片选项菜单和影片。请点击此处下载图.
补充图 15:"跟踪" 菜单。设置示例。(A) 跟踪, (b) 设置框架框架框架到框架链接和 (c) 差距关闭, 合并和拆分菜单。请点击此处下载图.
补充图 16:粒子跟踪的结果示例。请点击此处下载图.
补充图 17:跟踪分析菜单。设置示例。请点击此处下载图.
补充图 18:轨道分析的验证。跟踪分析后显示的屏幕, 包括显示检测到的粒子及其相应轨道的视频窗口。请点击此处下载图.
补充图 19:扩散系数的计算。计算的扩散系数 (左) 和平均平方位移 (MSD, 右) 的直方图。请点击此处下载图.
补充图 20:包括不同拟合模式在内的扩散系数的计算。为约束模型计算的扩散系数 (左) 和平均平方位移 (MSD, 右) 的直方图。请点击此处下载图.
补充图 21:强度配置文件。沿其轨迹 (蓝线) 和背景 (红线) 的点强度示例。请点击此处下载图.
补充图 22:每个帧的背景。左: 示例单元格图像。中间: 自动检测单元格。右: 区域自动选择为背景。请点击此处下载图.
补充视频 1:典型的 TIRF 视频显微镜示例, 显示不同强度和运动类型的粒子的存在。请点击此处下载视频.
补充材料 1:包含用于对轨迹进行分类和分析群集大小的临时例程中使用的所有协议脚本的文件。请按此下载资料.
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Discussion
即使没有任何以前使用 Matlab 的经验, 所描述的方法也很容易执行。但是, Matlab 例程需要非常精确的不同命令的命名和程序使用的不同文件夹的本地化。在跟踪分析例程 (步骤 3) 中, 可以修改多个参数。"设置高斯混合模型拟合" 窗口 (步骤 3.8) 控制 u 轨如何检测视频上的单个粒子。这是通过拟合高斯混合模型来完成的, 如3所述。此管接头的关键参数之一定义了一个筛选器, 以帮助识别局部最大值。此操作的成功取决于图像对比度和图像中存在的噪声。第一个参数 (用于与本地背景进行比较的 Alpha 值) 控制最大值是真实点的置信度, 而第二个参数有助于减少点识别过程中的噪声。"跟踪" 步骤 (3.9) 中的重要参数是要缩小间隙的帧数 (即跟踪可能跨越实际看不到粒子的帧, 但在这些帧之前和这些帧之后可以看到; 在示例中, 0), 以及轨道必须跨越的帧数才能被视为成功的轨道 (在我们的示例中, 20个; 此参数与摄像机采集速度和轨道中的数字帧必须具有这样的值, 以便能够计算扩散 co效率)。还必须决定是否合并和拆分段 (在示例中选择了这两种可能性)。然后, 必须设置成本函数 (帧到框架链接) 中的步骤1的参数。此函数控制如何沿帧跟踪粒子。此时最重要的参数是选择布朗搜索半径, 该半径控制下一帧中每个点的预期距离。在我们的示例中, 我们分别选择了0和5作为下限和上限。请注意, 这些参数非常具体地说明了所跟踪粒子的性质, 并且可能需要在每个特定情况下对其进行调整。特别重要的是布朗和线性搜索半径中的缩放功率。这些缩放力取决于粒子的运动类型 (自由或有限的扩散)。在该示例中, 选择了自由扩散的值 (0.5, 0.01)。有关这些参数的具体文档, 请参见3。
在扩散系数命令 (步骤 4.4) 的计算中, 不动粒子扩散系数的上限可以从以前的实验中知道, 也可以通过在一个不动的单独项目上运行计算扩散函数来知道颗粒 (纯化的单体荧光蛋白), 并看到所报告的扩散系数。此函数需要两个额外的参数: "Output后缀, 这是添加到输出文件名, 默认情况下采取空值, 和 ' 绘图长, 默认情况下是 13, 是在其中执行扩散计算的时滞数 (秒)。拟合模式 "alpha" 意味着将 MSD 调整到曲线
即偏移量 (MSD 0) 和时滞的电源函数。此功率函数的指数确定
运动是否受限 (0 < α < 0.6)、异常 (0.6 < α < 0.9)、自由 (0.9 < α < 1.1) 或定向 (α > 1.1)。关于这种分析的回顾, 读者请参考 Manzo 等人
扩散系数4的计算产生两个输出数字 (参见补充图 19)。第一个显示计算的扩散系数的直方图 (请注意, 此时, 每个轨迹都有一个独立的扩散系数)。这些系数的平均值和95% 的平均值显示在 Matlab 控制台中。第二个图显示了 MSD (红色曲线) 和计算它的步骤数, 作为那些被认为是移动的轨道 (其扩散系数高于命令行中给出的阈值的轨道) 的时滞函数。计算移动轨迹的平均值和标准偏差 (这些是单个单元中轨迹的值)。在该示例中, 指数为 0.59, 表示运动是受限的。对于此曲线拟合, 程序报告与每个参数相关的不确定性 (显示为每个参数的标准偏差) 和拟合的优度 (完美拟合将达到零)。此时, 在检查 alpha 值后, 我们可能会决定使用不同的函数来匹配 MSD:
如果 0 < α < 0.6 (密闭)
如果 0.9 < α < 1.1 (免费)
如果α > 1.1 (定向)
异常轨迹不能具有不同的功能。在限制粒子的情况下, 你可以计算限制大小 (微米), 如在 Destainville 等人.
正确拟合的一个很好的指标是, 拟合的优度应该从 alpha 管接头减少到最终管接头 (在示例中, 最佳拟合从0.30474 下降到 0.30474,补充图 19-20)。在名为 "扩散系数. Txt" 和 "扩散系数. mobilt" 的系列目录中创建两个文件.这些文件包含三列: 1) 每个输入轨迹的索引, 2) 它们对应的扩散系数, 3) 此轨道所属的掩码中的多数区域 (区域是从我们在步骤中生成的文件 "mask. tif" 中获得的2.7;如果此文件不存在, 则此列不存在)。您可以使用此文件和为其他单元格生成的类似文件来分析在类似实验条件下一组单元的扩散系数的分布。
在计算短轨迹的扩散系数 (步骤 4.7-4.8) 时, 最后一个参数 "短" 是添加到输出文件名中的后缀, 因此您可以分析不同的轨迹子集, 而不会覆盖文件.输出文件的实际名称是 "扩散系数 < 后缀 >. txt" 和 "扩散系数 ≪ 移动电话 >. txt"。如果没有给出后缀, 如上面执行的一般分析中所示, 则假定为空后缀。模型参数 (D、v 和 MSD 0) 可能不同于安装到所有轨迹的参数。最值得注意的是, 参数的标准偏差以及良好拟合通常都会增加。原因是短轨迹更不稳定, 可靠的拟合更困难。
对长轨迹 (步骤 4.9) 的分析将它们分为约束 (1)、自由 (2) 或定向 (3), 根据它们的第一时刻和位置相对于具有布朗运动的500个随机路径的第一时刻的2.5% 和97.5 百分位数, 与之相同。扩散系数和长度作为轨迹被蒙特卡罗分析和模拟。如果所分析路径的第一个时刻低于模拟中观察到的2.5% 的第一个时刻, 则将所研究的路径归类为受约束路径。如果它高于97.5 的模拟的第一个时刻, 它被归类为定向;否则, 路径被归类为布朗。在所使用的命令中, 113.88 e-3 是像素大小 (以μm 为单位), 0.0015 是以μm 2/为单位测量的不动点扩散系数的上限, "Long" 是输出文件名的后缀。此文件的第一列 ("轨迹分类朗. txt") 是轨迹数, 第二列是其分类 (1 = 约束, 2t 自由, 3直定向), 第三列是轨迹第一时刻。
计算每个粒子强度的脚本 (步骤 5.1) 非常灵活, 可以以许多不同的方式跟踪荧光强度 (每种方法都非常适合不同的情况, 如跟踪控制实验的不动点或在具有可变荧光背景的细胞上跟踪高度可移动的斑点)。该脚本将分析所有帧上的所有轨迹。对于每个帧中的每个点, 它将测量点周围像素的强度 (它分析点周围的正方形补丁, 默认情况下大小为3x3 像素), 估计点背景, 并计算点与背景。光漂白颗粒的百分比和单个星系团中荧光粒子的数量 (被视为单个点) 可以通过这种方式进行估计。
这种自动化方法 (采集轨迹分类强度) 产生关于多个参数 (点强、横向扩散、运动类型) 的信息, 这有助于研究点大小与其在基本条件下的动态之间的关系,以及不同的处理如何修改这些参数。
该方法的主要局限性在于, 它要求用荧光蛋白进行细胞转染。通常转染会导致蛋白质过度表达, 这一事实阻碍了单个蛋白质的跟踪。必须包括一个细胞分选步骤, 以选择表达多个受体的细胞, 允许通过 SPT-TIRF 显微镜检测和跟踪单个粒子。这种方法也可用于跟踪带有量子点或 Fab 碎片标记的生物分子。所描述的协议需要一些必须在以前进行分析的控件, 以确保分析所驱动的结论是正确的。首先, 确定允许检测和跟踪单个粒子的适当表达条件至关重要。采用密度 ~ 4.5 粒子μm 2 的薄膜, 对应于8500-22000 受体细胞,分析了细胞膜受体13的时空组织。
利用纯化的单体 AcGFP 蛋白或固定细胞建立可检测到的最小扩散系数是非常重要的。在这两种情况下, 都假定没有扩散, 因此我们估计在这些条件下分析的粒子的扩散值对应于固定化粒子, 并用于区分移动和不移动的轨迹13。
我们在这里介绍的分析是一个通用的轨迹分析工具, 可用于超分辨率受体扩散分析, 分析衍射有限的图像, 并通过标准显微镜分析细胞运动.这种方法与前面描述的其他方法 (如数字和亮度分析11) 的主要优点是, 它允许在考虑到光漂白前 AcGFP 单体蛋白的存活率。光漂白前分子的存活时间在很大程度上取决于激发条件。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢卡洛·曼佐和玛丽亚·加西亚·帕拉霍的帮助和扩散系数分析的源代码。这项工作得到了西班牙科学、创新和大学部 (SAF 2017-82940-r) 和 salud Carlos iii 研究所 (RD12\ 0009/00/PR-侵入 00/AG) 赠款的部分支持;里尔)。LMM 和 JV 得到了 CSIC 基金会 COMFUTURO 方案的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
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