Summary
Her beskriver vi utviklingen av en klinisk relevant murine modell av leverkreft recapitulating typiske immun funksjoner av lever Cancer (HCC).
Abstract
Fraværet av en klinisk relevant dyremodell som omhandler de typiske immun egenskapene til leverkreft (HCC), har i betydelig grad hindret elucidation av de underliggende mekanismene og utviklingen av innovative immunotherapeutic strategier. For å utvikle en ideell dyremodell recapitulating menneskelige HCC, immunkompetente mannlige C57BL/6J mus først motta en karbon karbontetraklorid (CCl4) injeksjon å indusere leveren fibrose, deretter motta histologisk-normal kreftfremkallende hepatocytter fra unge mannlige SV40 T antigen (TAg)-transgene mus (MTD2) ved intra-milt (ISPL) inoculation. Androgen generert i mottaker mannlige mus i puberteten initierer TAg uttrykk under kontroll av en lever-spesifikk promoter. Som et resultat, de overførte hepatocytter blir kreftceller og danne tumor masser i innstillingen av leveren fibrose/skrumplever. Denne romanen modellen etterligner menneskelige HCC innvielse og progresjon i sammenheng med leveren fibrose/skrumplever og reflekterer de mest typiske trekk ved menneskelige HCC inkludert immun dysfunksjon.
Introduction
Lever Cancer (HCC) er den raskest økende type kreft i USA (US)1,2,3. Hvert år, ca 850 000 nye tilfeller er diagnostisert4,5 og 700 000 pasienter dør av denne dødelige sykdommen6,7,8,9,10 , noe som gjør den til den nest høyeste årsaken til kreft relaterte dødsfall over hele verden. Behandling av HCC omfatter kirurgisk reseksjon, transplantasjon, ablasjon, chemoembolization eller systemisk behandling, for eksempel sorafenib11. Tidlig diagnose og ledelse med kirurgisk reseksjon eller transplantasjon har den høyeste totale overlevelse fordel4. Dessverre, de fleste pasientene til stede på et senere stadium og krever ledelse med ablasjon, chemoembolization eller sorafenib12. Sorafenib, en reseptor tyrosin kinase inhibitor (RTKI), ble godkjent av Food and Drug Administration i 2008 som den eneste systemiske legemiddel behandlingen som er tilgjengelig for behandling av inoperabel HCC. Selv om stoffet bare gir en beskjeden økning i total overlevelse, fra 7,9 til 10,7 måneder13, det gitt en ny terapeutisk strategi som kan utnyttes til å administrere HCC.
Manipulere immunforsvaret for å eliminere etablerte kreft er et raskt voksende felt i kreftforskning14. Immun kontrollpunktet studier har betydelig avansert immunotherapeutic narkotika utvikling i kreft behandling15,16. FDA godkjente bruken av antistoffer (ABS) mot cytotoksisk T-lymfocytter antigen 4 (CTLA-4), programmert celle død protein 1 (PD-1), og dens ligand PD-L1 for behandling av melanom, lungekreft, hode og nakke kreft, og blære kreft17, 18 av år , 19 andre priser , 20. kliniske studier av monoterapi eller Kombinasjonsbehandling ved bruk av én eller flere antistoffer mot PD-1, PD-L1 eller CTLA-4 for behandling av avansert HCC pågår21,22,23, og noen prøvelser har vist gunstige resultater. I 2017, FDA innvilget akselerert godkjenning for anti-PD-1 antistoff å behandle HCC pasienter, som er motstand mot sorafenib, men den generelle responsen rate av denne behandlingen er bare 14,3%. Andre strategier har ikke blitt oversatt til klinisk praksis på dette tidspunktet24,25. Overvinne tumor-indusert dyp immun toleranse å forbedre immun kontrollpunkt terapi26; forutsi effekten av immun kontrollpunkt terapi; forebygge immunrelaterte bivirkninger; optimalisere administrasjon rute, dosering, og frekvens; og finne effektive kombinasjoner av terapier27,28,29 alle er fortsatt ekstremt utfordrende oppgaver.
Det er flere konvensjonelle tilnærminger som brukes til å indusere HCC i musemodeller for tiden og benyttes avhengig av etterforsker spesielle spørsmål30. Kjemisk-indusert HCC mus modeller med gentoksisk forbindelser etterligne skade-indusert kreft. Xenograft modeller gjennom enten utenfor livmoren eller orthotopic implantation av HCC cellelinjer er egnet for narkotika screening. En rekke genmodifiserte mus er konstruert for å undersøke patofysiologi til HCC. Transgene mus uttrykker viral gener, oncogenes og/eller vekstfaktorer tillate identifisering av trasé involvert i hepatocarcinogenesis. På grunn av iboende begrensninger, disse modellene ikke recapitulate de typiske immun egenskaper sett i menneskets HCC, som har betydelig hindret elucidation av underliggende mekanismer og utvikling av innovative immunotherapeutic strategier14 ,15. Vi har nylig opprettet en klinisk relevant murine modell. Denne romanen modellen ikke bare etterligner menneskelige HCC innvielse og progresjon, men også reflekterer de fleste typiske trekk ved menneskelig sykdom, inkludert immun dysfunksjon. Vi har preget sine biologiske og immunologiske egenskaper. Utnytte denne romanen modellen, har vi utforsket ulike immunotherapeutic strategier for å behandle HCC31,32,33,34,35,36, 37. denne unike plattformen tillater oss å studere mekanismer av tumor-indusert immunotolerance og å utvikle proof-of-Concept terapeutiske strategier for HCC mot eventuell klinisk oversettelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: all prosedyren inkludert dyr har blitt godkjent av IACUC ved University of Missouri. Alle mus fikk Human omsorg i henhold til kriteriene skissert i "guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr". Følgende prosedyre for celle isolering og inoculation bør utføres i en hette. Alle utøvere bør bruke standard personlig verneutstyr for håndtering av mus og vev.
1. induksjon av leveren fibrose og skrumplever med IP-injeksjon av Carbon Karbontetraklorid (CCl4)
Merk: se figur 1. (CCl4 er svært farlig reagens, bør håndteres nøye og med bruk av kjemikaliebestandige hansker)
- Skaff mannlige C57BL/6J-mus som er seks til åtte uker gamle (se tabell over materialer).
- Forbered 10% CCl4 (v/v) løsning i mais olje i et sentrifugerør. Bestem totalt volum basert på antall mus som skal injiseres (se trinn 1,6).
- Bruk egnet mus håndterings teknikk for å velge en mus for injeksjon.
- Hold musen manuelt med rygg (buk) side opp.
- Rengjør injeksjonsstedet på bukveggen av musen ved å skrubbe med 70% alkohol.
- Injiser hann C57BL/6J mus med 160 μL av 10% CCl4 oppløsning ved INTRAPERITONEAL (IP) injeksjon ved bruk av en engangsnål med 25 gauge.
- Pass på at nålen trenger inn gjennom bukveggen (ca. 4-5 mm) med skråkant-side opp og litt vinklet ved 15-20 grader.
- Injiser mus to ganger i uken i totalt fire uker-hver mus får totalt åtte injeksjoner.
Merk: to uker etter siste injeksjon er behandlede mus klare for ISPL inoculation av kreftfremkallende hepatocytter fra MTD2 mus.
2. isolerende tag-transgene hepatocytter fra line MTD2 mus
Merk: se tabell 1 for løsnings oppskrifter.
| 10x Earle ' s balansert salt Solution uten ca eller mg (EBSS uten ca eller mg) | 4 g KCl 68 g NaCl 1,4 g NaH2PO4 · H2o 10 g druesukker Tilsett vann til 1 liter, pH til 4,32 Gå gjennom filter |
| Løsning 1 | 20 mL 10x EBSS uten ca eller mg 44 g NaHCO3 1,33 mL 1,5 M Hepes 10 mL 10 mL EGTA Tilsett vann til 200 mL |
| Løsning 2 | 100 mL 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes Tilsett vann til 1 liter |
| 0,75% kollagenase løsning | 15 mg kollagenase type 1 20 mL løsning 2 |
| Komplett medium | 2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100-Streptomycin |
Tabell 1: løsnings oppskrifter.
- Skaff linje MTD2 mus38 for å tjene som kilde til kreftfremkallende hepatocytter.
- Bedøve 5-ukers-gamle MTD2 mus bruker 2,5% isoflurane.
Merk: riktig bedøvelsen vil bli kontrollert av toe knipe metoden. I korte trekk, ved hjelp av to fingre, gi musen tå/fot en god klem. Hvis det ikke er tilbaketrekking reaksjon, dyret er dømt dypt nok til å starte kirurgi. - Når tilstrekkelig bedøvet, plasserer mus i en liggende posisjon og fest ekstremiteter med tape for å gi tilstrekkelig eksponering av abdominal overflate.
- Utfør en midtlinjen laparotomy snitt ved hjelp av saks langs lengden av Linea Alba store nok til å gi en tilstrekkelig eksponering av leveren.
- Fortrenge tarmen til venstre for å gi bedre eksponering av leveren og Portal triaden.
- Analysere over leveren for å avdekke dårligere vena cava (IVC).
- Ombinde IVC over leveren ved hjelp av en arterie klemme.
- Tilbake til den underlegne grensen av leveren, bruk en sommerfugl nål (se materialer) for å få IV tilgang til portalen vene. Fest kateteret for hånd.
- Suksessivt perfuse musen leveren ved hjelp av en injeksjonssprøyte ved 8,9 mL/min med med 15 mL oppløsning 1, 15 mL 0,75% kollagenase løsning 2, og 15 mL løsning 2 via kateteret.
- Høste perfusert leveren ved å kutte og ta tumor massen fra MTD2 mus i en 50 mL konisk rør med 10-15 mL PBS.
- Fjern PBS og vask en ekstra tid med PBS; ikke sentrifuger på dette trinnet.
- Skjær leveren i mindre biter ved hjelp av saks og deretter vaske igjen med PBS 2x å fjerne gjenværende blod.
- Tilsett 5 mL komplett RPMI medium til konisk rør og kontinuerlig hakke leveren med saks til små biter (< 3 mm)-vev bør jevnt gå gjennom en 5 mL pipette.
- Legg komplett RPMI til et endelig volum på 30 mL og suspendere leveren ved hjelp av en 5 mL pipette.
- Filtrer den blandede løsningen med en 70 μm sil inn i et 50 mL konisk rør.
- Vask sil flere ganger med fullstendig RPMI og Juster det endelige volumet til 50 mL ved å legge til ekstra RPMI-medium.
- Raskt spinne suspensjonen ved sentrifuger til maksimalt 500 RPM; Når hastigheten er akselerert til 50 x g, bør sentrifuge stoppes.
- Dekanter supernatanten og suspendere pellets i 20 mL PBS.
- Telle celler ved hjelp Trypan blå eksklusjon og en hemocytometer, og juster deretter celle konsentrasjonen til 2,5 x 106/ml for følgende celle inoculation.
Merk: forventet utbytte fra 5 gram tumor vev er 80 000 000 hepatocytter med levedyktighet > 95%.
3. vaksinere hepatocytter fra MTD2 mus til leveren av vill type C57BL/6J mus ved ISPL injeksjon
- Aseptisk teknikk bør brukes i alle prosedyrene
- Bedøve den CCl4-BEHANDLEDE mannlige C57BL/6J mus med 2,5% isoflurane, bør musene behandles med øye smøremiddel for å hindre at øynene tørker ut.
- Forbered sprøyter med 200 μL av hepatocytter til injeksjon.
- Når det er tilstrekkelig bedøvet, posisjon mus med venstre side opp.
- Barbere hele venstre flanke av mus, deretter skrubbe området, alternerende mellom 70% alkohol og Betadine tre ganger.
- Administreres 5 mg/kg karprofen subcutaneouly før kirurgisk snitt.
- Lag en 1 cm snitt på venstre flanke parallelt med 13th rib fra rygg ekstreme begynnelsen like under ryggraden muskelen.
- Identifiser milten, deretter eksteriorisere den ved hjelp av Butt-spiss tang.
- Klem milten med to mellom store Titan klipp. Plasser begge klippene mellom milt arterie og vene, la rommet mellom klippene til å klippe senere etter inoculation.
Merk: målet er å isolere den underlegne pol av milten å redusere risikoen for seeding. - Injiser 200 μL (500 000) av den preparerte hepatocytter i den underlegne stangen på milten med en 27 G nål.
- Klipp den underlegne gren av pedicle (dårligere milt Pole fartøy) med ett mellomstort klipp.
- Skjær milten mellom de to først plasserte klipp.
- Fjern den underlegne pol av milten som ble direkte injisert med tumorceller.
- Bruk 3-0 polyglactin 910 avbrutt suturing å lukke indre muskelen lag.
- Bruk sterilisert stål såret klipp for å lukke den ytre huden laget.
Merk: stål klips foretrekkes over sting for å unngå dyr tygge ut sting, etterlot et gapende sår. - Administreres 5 mg/kg karprofen subkutant etter Sutur.
- Plasser alle utvinne dyr på en temperatur-kontrollerte oppvarming pad og overvåke tett inntil fullt utvinnes fra anestesi.
- Gi mus fri tilgang til vann etter operasjonen. Hvis musen blir dehydrert under operasjonen, gi subkutan væsker (< 1 mL).
- Fjern hud klipp på 7-10 dager etter operativt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kreftfremkallende hepatocytter isolert fra TAg-transgene mus (figur 2) ble sådd i leveren av ville type mus ved intra-milt injeksjon (Figur 3). Den transplanterte hepatocytter vellykket og pålitelig vokste orthotopic HCC svulster (Figur 4) med tumor spesifikke antigen SV40 TAg (figur 5) i innstillingen av hepatic betennelser og fibrose (figur 1).
Figur 1: skjematisk for å forberede musemodell av HCC. Den eksperimentelle designen for å etablere en innovativ murine modell av HCC. C57BL/6J mus er først behandlet med IP-injeksjon av CCl4 to ganger ukentlig i fire uker for å indusere leveren fibrose. To uker etter den siste IP-injeksjonen mottar CCl4-behandlede mus hepatocytter isolert fra unge mannlige MTD2-mus via ISPL-inoculation. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: isolering og rensing av hepatocytter fra linje MTD2 mus. (A) hepatocytter ISOLERT fra MTD2 mus ble utarbeidet i henhold til protokoll og farget med trypan blå for å oppdage levedyktighet og renhet av celle isolasjon. Den venstre panel viser både hepatocytter (svart pil) og tumor infiltrere lymfocytter (røde piler) som er isolert under celle utvinning. Den høyre panel viser cellen befolkningen igjen etter lav hastighet sentrifugering, inkludert hepatocytter (svart pil) og betydelig færre tumor infiltrere lymfocytter. Forstørrelse = 10x objektiv, skala bar = 100 μm. (B) hepatocytter ISOLERT fra MTD2 mus er farget med trypan blå løsning før inoculation av vill type C57BL/6J mus. Celle isolasjon er fast bestemt på å lykkes hvis levedyktigheten er > 95%. Døde celler vil bli farget med trypan blå (røde piler), mens levedyktige celler vil ikke bli farget (svart pil). Forstørrelse = 10x objektiv, skala bar = 100 μm. Grafen til høyre viser resultatene av celle isolasjon med > 95% av hepatocytter er levedyktig, statistiske data kommer fra 5 forskjellige observerte feltet under mikroskop; feilfelt representerer +SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Intrasplenic inoculation av hepatocytter inn i leveren av vill type C57BL/6J mus. Det eksperimentelle designet for ISPL inoculation av hepatocytter for å indusere HCC i C57BL/6J mus. (1) milten er identifisert og exteriorized. (2) milten er klippet med to mellom store Titan klipp. (3) forberedt hepatocytter injiseres i den underlegne pol av milten. (4) den underlegne gren av pedicle (dårligere milt Pole fartøy) er avkuttet med en mellomstor klipp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: progressiv tumor utvikling i C57BL/6J mus etter inoculation med MTD2-hepatocytter. (A) leverkreft (HCC) orthotopic tumor modellen ble etablert i henhold til protokollen. Anatomiske bilder ble tatt før inoculation og på sub-sekvensiell tid kurs. (a) viser sunt leveren før inoculation med MTD2 hepatocytter. (b) Mouse leveren 3 måneder etter inoculation med bevis for grov tumor utvikling. (c) 3,5 måneder etter inoculation med økende tumor byrde. (d) 4,5 måneder etter inoculation. (e) 6 måneder etter inoculation med tegn på tumor gjennom hele leveren. (B) tumor knuter ble høstet og veid på den tiden punktene indikerte etter INOCULATION med MTD2 hepatocytter. Feilfelt representerer +SD. * * *P < 0,001, statistisk analyse ble utført av t-tester. (C) representative bilder av WILDTYPE og MTD2-inokulert lever seksjoner. Hematoksylin og eosin (H & E) farging viser pseudogland formasjon (svarte piler). Det er kjernefysisk trengsel, og tumorceller er eosinofile med høy nucleus-til-cytoplasma prosenter (forstørret bilde). Forstørrelse = 20x objektiv, skala bar = 50 μm. De øvre høyre inn dataene forsterkes ytterligere manuelt. (D) Sirius Red farging indikerer unormal kollagen deponering, i samsvar med leveren fibrose. Forstørrelse: 40x objektiv, skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: spesifikk påvisning av SV40 T antigen-genet i tumor. (A) tumor vev og ytterligere vevsprøver gjennom mus ble samlet inn fra kreft-etablerte mus. Genomisk DNA ble isolert fra vev og primere for både SV40 T AG og P53 (kontroll) ble syntetisert for konvensjonell PCR. SV40 T antigen genet ble påvist i tumor vev, men er ikke til stede i enten normalt vev eller annet vev i mus. (B) tumor vev ble samlet inn fra tumor-bærende mus og beiset med anti-SV40 T antigen antistoff. Venstre panel er en negativ kontroll fra sunt leveren vev innhentet fra naive mus. Høyre panel viser betydelige SV40 T antigen farging av tumor vev innhentet fra tumor-bærende mus (brun farge). Forstørrelse = 40x objektiv, skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med denne protokollen har vi etablert en pålitelig og reproduserbar murine modell av HCC som etterligner menneskets HCC innvielse og progresjon. Klinisk, mange risikofaktorer suksessivt induserer leverskade, leveren fibrose, skrumplever og den siste fasen av HCC. I vår protokoll, IP-injeksjon av CCl4 brukes til å først produsere leveren fibrose i vill type mus, som gjør at den påfølgende kreftfremkallende hepatocytter å danne svulster i innstillingen av leveren fibrose. Vi fant at tumor formasjon skjedde mest vellykket i mus som fikk hepatocytter inoculation to uker etter CCl4 behandling, sammenlignet med mus som mottar injeksjoner på andre tidspunkt poeng. I tillegg fant vi leveren fibrose kan oppdages opptil fire måneder etter CCl4 injeksjon. Denne tilnærmingen resulterer i mer enn 90% av mus som utvikler HCC-svulster sammenlignet med musene uten eksponering for CCl4. I vår modell, hepatocytter overført fra linje MTD2 mus til C57BL/6J mus, trafikk til leveren hvor de blir innarbeidet som hepatocytter som uttrykker kode som et vev antigen. Isolering av hepatocytter fra MTD2 er et kritisk trinn i denne protokollen. MTD2 mus lever er perfusert grundig med løsningen 1 og 2 for å fjerne sirkulerende røde blodlegemer i leveren helt. Den kollagenase løsningen brukes til å perfuse leveren ved angitt konsentrasjon og hastighet for å generere riktig leveren fordøyelse å løslate hepatocytter. Bruk av lavere konsentrasjoner av kollagenase er utilstrekkelig for fordøyelsen, noe som resulterer i klumper av hepatocytter. I kontrast, høye konsentrasjoner er for harde på vevet, noe som resulterer i en betydelig reduksjon av levedyktig hepatocytter. Vi finner også at korte sentrifugering som beskrevet i vår protokoll er nødvendig for å forbedre renheten av hepatocytter. Den nedre spin vi brukte til sentrifugering kan utløse hepatocytter og etterlate leukocytter i supernatanten basert på tetthets forskjellen i disse to celle typene.
Det neste kritiske trinnet er ruten for vaksinere hepatocytter i vill type mus. I våre pilotstudier, utforsket vi ulike måter å gjennomføre hepatocytter inoculation. Den vellykkede orthotopic tumorveksten i leveren er sett best i mus mottar intrasplenic inoculation av kreftfremkallende hepatocytter på en dose av halv-en-million celler per mus, sammenlignet med musene mottar celler administreres via hale blodåre og intraperitoneal injeksjon ved ulike doser. Disse funnene tyder på at orthotopic HCC-vekst er rute-og dose avhengig. Ondartet transformasjon skjer gradvis og er begrenset til pasientpopulasjonen av transplantert hepatocytter snarere enn hele leveren parenchyma. Fortsatt celle spredning resulterer i tumor knuter som utvikler seg gjennom hele leveren.
For HCC eller andre kreftformer for å gå videre må det unngå immunsystemet; Faktisk, unngå uimottakelig ødeleggelse er nå betraktet som et kjennetegn på kreft39. Mangelen på tumor spesifikke antigen er imidlertid en kritisk barriere for å Elucidating de underliggende mekanismene. I vår modell, er TAg uttrykt i svulster, ikke andre organer, som fungerer som en svulst-spesifikt antigen. Dessuten har TAg mange veldefinerte epitopes som kan gjenkjennes av CD8 T-celler i C57BL/6J mus. Angående TAg epitope-I, har vi generert linje 416 mus som transgenically uttrykke T celle reseptorer for denne epitope34. Målretting TAg å undersøke tumor antigen-spesifikk immunrespons tillater oss å undersøke tumor immun overvåkning under tumor initiering og progresjon, som ikke er mulig ved hjelp av modeller indusert av DEN eller genetisk manipulasjon. Elucidating de underliggende mekanismene gjør oss i til å identifisere kritiske celler og molekyler formidling tumor-indusert immun toleranse. Å målrette mot disse nøkkelfaktorene kan i betydelig grad fremme vår utvikling av innovative immunotherapeutic strategier mot HCC. Ved hjelp av denne unike HCC modellen og etablerte verktøy, har vi undersøkt mekanismene underliggende tumor-indusert toleranse25,35 og utforsket ulike immune-baserte antitumor immunterapi31,32 , 36 for alle , i 37.
Oppsummert reflekterer vår etablerte murine modell av HCC noen typiske trekk ved menneskelig sykdom. I vår tidligere publiserte artikkelen, var vi i stand til å etablere dette som en klinisk relevant tumor modell som hadde typiske trekk ved menneskelige HCC. Vi viste at musene som ble behandlet med CCl4 og MTD2 hepatocytter utviklet svulster som uttrykte HCC-assosierte ANTIGENER, AFP og GPC336. Patologi fastslått at lesjoner i vår murine modellen er lik både makroskopisk og patologisk til menneskelig HCC. Ved å utnytte denne pålitelige modellen og de utviklede verktøyene kan vi studere denne komplekse menneskelige sykdommen, inkludert innsikt i mekanismer for HCC-utvikling og klinisk tilgjengelig behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O ' Carroll, PI) og NIH/NCI R01CA208396 (Markus Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O ' Carroll).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | VETEQUIP | IMPAC6 | anesthesia machine for surgery |
| Butterfly needle | BD | 8122963 | Needle used for liver perfusion |
| C57BL/6 mice | Jackson Lab | 000664 | mice used in prototol |
| Carprofen | CRESCENT CHEMICAL | 20402 | carprofen for pain release |
| Cell Strainer | CORNING | REF 431751 | Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-30R | centrifuge for cell isolation |
| Clips | Teleflex Medical | REF 523700 | Titanium Clips for spleen |
| Microscope | Zeiss | Primovert | microscope for cell observation |
| Mtd2 mice | N/A | Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab | |
| Needle | BD | REF 305109 | BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm) |
| Suture | ETHICON | J303H | coated VICRYL suture |
| SV40 T Ag antibody | Abcam | ab16879 | anti-SV40 T-antigen antibody for IHC |
| Syringe | BD | REF 309626 | 1 mL TB syringe for cell injection |
| Trypan blue | SIGMA | T 8154 | Trypan blue solution for cell viability test |
| Wound clips | Reflex | reflex9, Part. No. 201-1000 | stainless steel wound clips for wound close |
References
- O'Connor, S., Ward, J. W. Hepatocellular carcinoma - United States. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59, 517-520 (2010).
- Petrick, J., Kelly, S., Altekruse, S., McGlynn, K., Rosenberg, P. Future of Hepatocellular Carcinoma Incidence in the United States Forecast Through 2030. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 34, 1787-1794 (2016).
- Greten, T., Lai, C., Li, G., Staveley-O'Carroll, K. Targeted and Immune-based Therapies for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology. 156, 510-524 (2019).
- Llovet, J., Zucman-Rossi, J., Pikarsky, E., Sangro, B., Schwartz, M., Sherman, M., Gores, G.
- Ding, X., et al. Precision medicine for hepatocellular carcinoma: driver mutations and targeted therapy. Oncotarget. 8, 55715-55730 (2017).
- Colombo, M., Maisonneuve, P. Controlling liver cancer mortality on a global scale: still a long way to go. Journal of Hepatology. 67, 216-217 (2017).
- Llovet, J., Burroughs, A., Bruix, J.
- Parkin, D., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. International Journal of Cancer. 94, 153-156 (2001).
- Thomas, M., Zhu, A. Hepocellular carcinoma: the need for progress. Journal of Clinical Oncology. 23, 2892-2899 (2005).
- Llovet, J., Bruix, J. Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 48, 1312-1327 (2008).
- Bruix, J., Sherman, M. Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology. 53, 1020-1022 (2011).
- Pang, T., Lam, V.
- Llovet, J., et al. Design and endpoints of clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of the National Cancer Institution. 100, 698-711 (2008).
- Mueller, K. Cancer immunology and immunotherapy. Realizing the promise. Introduction. Science. 348, 54-55 (2015).
- Gajewski, T., Schreiber, H., Fu, Y. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14, 1014-1022 (2013).
- Ribas, A., Wolchok, J. Combining cancer immunotherapy and targeted therapy. Current Opinion in Immunology. 25, 291-296 (2013).
- Postow, M., Callahan, M., Wolchok, J. Immune checkpoint blockade in cancer therapy. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33, 1974-1982 (2015).
- Gao, J., et al. VISTA is an inhibitory immune checkpoint that is increased in ipilimumab therapy in patients with prostate cancer. Nature Medicine. 23, 551-555 (2017).
- Hahn, A., Gill, D., Pal, S., Agarwal, N. The future of immune checkpoint cancer therapy after PD-1 and CTLA-4. Immunotherapy. 9, 681-692 (2017).
- Remon, J., Besse, B. Immune checkpoint inhibitors in first-line therapy of advanced non-small cell lung cancer. Current Opinion in Oncology. 29, 97-104 (2017).
- Kudo, M. Immune checkpoint blockade in hepatocellular carcinoma: 2017 update. Liver Cancer. 6, 1-12 (2017).
- Kudo, M. Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma: Basics and ongoing clinical trials. Oncology. 92, 50-62 (2017).
- Breous, E., Thimme, R. Potential of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 54, 830-834 (2011).
- Sprinzl, M., Galle, P. Facing the dawn of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 59, 9-10 (2013).
- Liu, D., Staveley-O'Carroll, K., Li, G. Immune-based therapy clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of Clinical Cell Immunology. 6, 376 (2015).
- Greten, T., Wang, X., Korangy, F. Current concepts of immune based treatments for patients with HCC: from basic science to novel treatment approaches. Gut. 64, 842-848 (2015).
- Koster, B., de Gruijl, T., van den Eertwegh, A. Recent developments and future challenges in immune checkpoint inhibitory cancer treatment. Current Opinion in Oncology. 27, 482-488 (2015).
- Johnson, D., Sullivan, R., Menzies, A. Immune checkpoint inhibitors in challenging populations. Cancer. 123, 1904-1911 (2017).
- Li, H., et al. Programmed cell death-1 (PD-1) checkpoint blockade in combination with an mTOR inhibitor restrains hepatocellular carcinoma growth induced by hepatoma cell-intrinsic PD-1. Hepatology. 66, 1920-1933 (2017).
- Heindryckx, F., Colle, I., van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Qi, X., et al. Development of inCVAX, in situ cancer vaccine, and its immune response in mice with hepatocellular cancer. Journal of Clinical and Cellular Immunology. 7, 438 (2016).
- Qi, X., et al. Development of a radiofrequency ablation platform in a clinically relevant murine model of hepatocellular cancer. Cancer Biology and Therapy. 16, 1812-1819 (2015).
- Liu, D., et al. Sunitinib represses regulatory T cells to overcome immunotolerance in a murine model of hepatocellular cancer. Oncoimmunology. 7, 1372079 (2017).
- Staveley-O'Carroll, K., et al. In vivo ligation of CD40 enhances priming against the endogenous tumor antigen and promotes CD8+ T cell effector function in SV40 T antigen transgenic mice. Journal of Immunology. 171, 697-707 (2003).
- Avella, D., et al. Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model. Hepatology. 55, 141-152 (2012).
- Li, G., et al. Successful chemoimmunotherapy against hepatocellular cancer in a novel murine model. Journal of Hepatology. 66, 75-85 (2017).
- Li, G., et al. Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice. Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).
- Held, W., et al. T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene. EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).
- Hanahan, D., Weinber, R.
